CN110455946B - 一种乳制品中1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种乳制品中1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的快速检测方法，具体为乳制品经盐酸水解后与乙醇混合，然后用乙醚石油醚等体积混合溶液进行提取，氮气吹干后正己烷溶解，气相色谱法进行测定。该方法整个操作过程均可以在50ml离心管内进行，操作更简便，更适合大批量检品的处理，目标物损失较低，方法准确度高，降低检测成本、环境友好，该方法重现性良好，准确可靠，可准确测定乳制品中1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的含量。
Description
技术领域
本发明属于食品分析检测领域，具体涉及一种乳制品中1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的快速检测方法。
背景技术
母乳是公认的婴儿生命初期最理想的食物，婴幼儿配方乳粉作为一种比较理想的母乳替代品，有效地为一些由于某些原因导致无法正常母乳的婴幼儿提供了生长发育所需的能量和营养物质。母乳中含有4％的脂肪，能提供婴儿活动所需约45％左右的能量，及一些婴儿生长发育所必需的脂肪酸等营养物质，其中甘油三酯含量约占其总脂肪酸含量的98％左右。人体代谢甘油三酯的产物为Sn-1和Sn-3位游离脂肪酸及Sn-2位棕榈酸，且Sn-2位棕榈酸占绝大多数；Sn-2位的棕榈酸可与胆汁盐形成乳糜微粒，促进脂肪和钙的吸收，增加骨骼矿物质含量，降低脂肪酸皂化和预防婴幼儿便秘。1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(简称OPO)是一种典型的Sn-2棕榈酸酯。目前市场上流通的配方乳粉通常是以牛乳或羊乳为原料，其脂肪酸结构与母乳存在显著差异，添加了OPO的乳粉较之一般的配方乳粉其组成成分更加接近母乳，更宜作为人乳脂替代品。
2012年国家卫生部发布的食品营养强化剂使用标准［GB14880-2012］明确规定了OPO在婴幼儿配方乳粉中的添加量为24~96g/kg。目前，越来越多的国内外大型婴幼儿配方乳粉生产企业在其婴幼儿配方配方奶粉中添加OPO，但国内尚无发布任何关于OPO的检测标准。对于婴幼儿配方乳粉中OPO含量的检测，实际上是对甘油三酯脂肪酸的分析与检测，其关键性制约因素即婴幼儿配方乳粉中脂肪酸的提取。GB 5413.3-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》中第一法给出碱水解后在抽脂瓶中用乙醚、石油醚分步提取脂肪的方法。此方法虽脂肪提取效率高，但同时也存在方法较为繁琐，有机溶剂使用量大，劳动强度大等缺点。
目前，关于1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的检测方法主要有：薄层色谱分离与气相色谱法、反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离与气相色谱法、蒸发光散射分离与气相色谱-质谱联用法、银离子交换柱分离与液相色谱法、胰脂肪酶与液相色谱法和毛氏提取-气相色谱内标法。经试验发现上述众多检测方法，在经济性、实用性和准确性等方面不能满足日常检验的需求。因此，亟需建立一种既能准确定量又能被大众实验室所普及的婴幼儿配方乳粉中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种乳制品中1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的快速检测方法，该方法以酸水解法处理乳制品，用乙醚石油醚混合溶液提取，准确度和精密度更好、无需添加内标、环境友好、操作简单、准确可靠。
本发明通过以下技术方案实现：
一种乳制品中1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的快速检测方法，具体为，乳制品经酸水解后与乙醇混合，然后用乙醚石油醚混合溶液进行提取，氮气吹干后正己烷溶解，气相色谱法进行测定。
由于乳制品中的脂类多以结合态脂肪球形式存在，而脂肪球的周围有一层膜以使脂肪球在乳中保持稳定，采用一定浓度的酸或氨水使非脂成份溶解，乳中酪蛋白钙盐转变成可溶性蛋白或蛋白铵盐，脂肪球膜被软化破坏，从而使结合态的脂类得以游离出来，使用盐酸水解法水解更彻底，加入有机试剂提取时在有机相与水相分层的界面处会形成一个蛋白质水解物的白色薄膜，使分层更为明显；而碱水解法由于水解不够充分，加入有机试剂提取时在有机相与水相分层的界面处会形成一定厚度的乳化层，不利于实验的进行。待测样品经酸水解后加入一定量的乙醇溶液，一方面使能溶于乙醇的物质进入水相，减少一些非脂成分进入有机层；另一方面能促使样品中的蛋白质变性沉淀，不易产生乳化。乙醚具有较强的溶解脂类物质的能力，除此之外还能溶解游离脂肪酸、醇、磷脂及色素等脂溶性物质。石油醚不溶于水，能溶解脂肪、游离脂肪酸，不易溶解醇、磷脂和色素。使用乙醚石油醚等体积混合溶液作提取溶剂时，石油醚的加入能有效降低乙醚的极性，促进乙醇进入水层，使溶于水相的部分乙醚被竞争出来，从而使有机相与水相更好的分层。
优选地，所述的酸为37.5wt%的盐酸。
优选地，所述的气相色谱条件：气相色谱仪：带氢火焰离子化检测器，温度为300℃；毛细管色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷耐高温色谱柱(柱长15m，内径0.25mm，膜厚0.1μm)；载气：氮气，恒线速度模式：33.1cm/s；进样口温度：300℃；程序升温：100℃，保持3min，以15℃/min的速率升温至380℃，保持10min；进样方式：分流进样，分流比为20:1；进样体积：1.0 μL。
优选地，所述的乙醚石油醚混合溶液为乙醚和石油醚等体积混合的混合溶液。
优选地，所述的乳制品为婴幼儿配方乳粉。
优选地，所述的婴幼儿配方乳粉的检测方法包括以下步骤：
（1）标准溶液的配置：准确称取10mg 1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯标准品加入适量正己烷使之溶解，并于10mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯标准储备液；以标准储备液分别配制浓度为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL的标准溶液；
（2）待测样品溶液的配制：将0.5g婴幼儿配方乳粉在5mL温水中溶解，溶解后加入1mL盐酸，于65±2℃的水浴锅中水解40min，水解后冷却至室温，加入5~10mL乙醇混合均匀，加入20mL乙醚和石油醚等体积混合溶液涡旋提取1min，静置20min后离心，取上层有机相作为提取液，下层水相重复提取一次，合并有机相并定容至50mL，取2mL提取溶液于40℃水浴中氮吹吹干，用正己烷溶解并定容至5mL，得待测样品溶液；
（3）标准样品分析：取步骤（1）中的系列标准溶液进行气相色谱测定，得到标准样品色谱图，以标准溶液峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程；
（4）待测样品测定：取步骤（2）的待测样品溶液进行气相色谱测定，得到待测样品色谱图，与标准样品色谱图进行比较，根据步骤（3）中得到的线性回归方程，计算待测样品中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量。
优选地，步骤（2）中所述的温水温度为40±5℃。
优选地，步骤（2）中所述的离心转速为8500r/min，离心时间为5min。
本发明建立了一种婴幼儿配方乳粉中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的快速测定方法。试样采用酸法水解后，乙醚石油醚混合溶液提取，氮气吹干后正己烷溶解，气相色谱法进行测定。本发明对水解方式、提取溶剂、提取时间和仪器测定条件等因素进行了研究，并进行了加标回收和精密度试验，结果表明：1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯在0.01~0.5mg/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数为0.9994，在高中低三个添加水平下，样品的回收率在96.4%-101.5%之间，测定结果均具有良好的重现性，相对标准偏差（RSD n=6）为0.704%，1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的方法定量限为0.2g/100g。本发明前处理操作简单快捷，实验环境友好，方法准确度与精密度良好，能极大提高婴幼儿配方乳粉中OPO的检测效率，降低检测成本。总乙醚石油醚有机试剂使用量仅为50ml，较CN201710891209.5法总有机试剂使用量至少节省50%，有机试剂使用量更低，环境更为友好。
本发明的方法以酸水解法对样品溶液进行水解后用乙醚、石油醚等体积混合溶剂提取脂肪，可将婴幼儿配方乳粉中的脂肪酸充分提取，利用毛细管色谱柱以程序升温的方式对目标化合物进行分离，氢火焰离子化检测器（FID）检测，实现了1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯同分异构体的分离，建立了一种适用于婴幼儿配方乳粉中OPO含量的快速检测技术。
有益效果
（1）操作简单：本发明采用酸水解法对样品溶液进行水解，以乙醚石油醚混合溶剂提取乳制品中的脂肪，氮气吹干并稀释至合适浓度，整个操作过程均可以在50ml离心管内进行，方法重现性良好，RSD 为0.704%，回收率为96.4~101.5%，准确可靠，可准确测定婴幼儿配方乳粉中OPO 的含量，与文献专利报道的利用碱法水解和抽脂瓶提取相比较操作步骤更为简便，更适合大批量检品的处理，目标物损失较低，方法准确度高。
（2）降低检测成本：本发明采用盐酸进行水解，较文献专利报道的利用胰脂酶相比其价格成本更低。
（3）环境友好：本发明采用乙醚石油醚等体积混合溶剂提取乳制品中的脂肪，总乙醚石油醚有机试剂使用量仅为50ml，有机试剂使用量更低，环境更为友好。
附图说明
图1为1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的标准样品色谱图；
图2为某品牌婴幼儿配方乳粉中的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯色谱图
图3为乙醇加入量对1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯提取效果的影响
图4为提取溶剂对1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯提取效果的影响
图5为提取溶剂体积及提取次数对样品中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯提取效果的影响。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
本发明实施例中所述试剂为分析纯试剂，其中，盐酸、乙醇、乙醚和石油醚的纯度为分析纯，正己烷选用色谱纯，氮气(N2)：纯度≥99.9%，标准品1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯为加拿大trc公司生产，超纯水为实验用超纯水（由Millipore Milli-Q系统净化蒸馏水获得），本发明实施例所用试剂和原料均市售可得。
气相色谱条件，气相色谱仪：带氢火焰离子化检测器，温度为300℃；毛细管色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷耐高温色谱柱(柱长15m，内径0.25mm，膜厚0.1μm)；载气：氮气，恒线速度模式：33.1cm/s；进样口温度：300℃；程序升温：100℃，保持3min，以15℃/min的速率升温至380℃，保持10min；进样方式：分流进样，分流比为20:1；进样体积：1.0 μL。
实施例1
（1）标准溶液配制：准确称取10mg 1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯标准品加入适量正己烷使之溶解，并于10mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯标准储备液；以标准储备液分别配制浓度为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL的标准溶液；
（2）标准工作曲线的确定：对步骤（1）中不同浓度的标准溶液进行气相色谱测定，对结果进行分析，根据标准溶液的浓度和对应的色谱峰峰面积，绘制标准工作曲线，1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的标准工作曲线的线性方程为Y=553441X-1264.9，线性范围为0.01~0.5mg/mL，相关系数为0.9994，结果表明峰面积与1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的浓度呈良好线性关系,样品中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯检测的定量限为0.25g/100g；
（3）待测样品配制：将0.5g婴幼儿配方乳粉（某品牌婴幼儿配方乳粉）于50ml具塞离心管中，加入5mL温水，轻轻振摇，使样品完全分散，静置冷却，加入1mL质量百分浓度为37.5%的盐酸，于65±2℃的水浴锅中水解40min，期间每10分钟轻摇一次，水解后取出，静置并冷却至室温，加入10mL乙醇，涡旋混合，加入20mL乙醚和石油醚等体积混合的混合溶液涡旋提取1min，静置20min后于高速离心机上8500r/min离心5分钟，使上层有机层和下层水相完全分离，将上层有机层取出至50mL容量瓶中，下层水相重复提取一次；合并两次有机相并以乙醚和石油醚等体积混合的混合溶液定容至刻度，得到提取溶液，准确移取2mL提取溶液至15mL具塞离心管中，于40℃水浴中氮吹吹干，用正己烷溶解并定容至5mL，得待测样品溶液。
（4）样品检测：将步骤（3）中的待测样品溶液加入到色谱仪中进行气相色谱分析，得到的气相色谱图（如图2所示），根据标准品色谱图（）中保留时间确定步骤（2）中待测样品中的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯，根据步骤（2）中得到的标准工作曲线以外标法计算步骤（3）试样中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的含量，测得步骤（3）中婴幼儿配方乳粉（某品牌婴儿乳粉）中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的含量为（5.46g/100g）；
待测样品中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量计算公式如下：
式中，
X-待测样品溶液中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的含量，单位为(g/100g)；
C-待测样品溶液中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯浓度, 单位为(mg/mL)；
V-待测样品溶液定容体积，单位为(mL)；
f-稀释倍数；
m–待测样品的质量，单位为(g)；
实施例2
将实施例1中步骤（3）中的盐酸换为氨水，考察不同水解方法对OPO提取效果的影响，设置6组平行试验，结果见表1。
由表1可以看出，酸水解法的提取效率和精密度均优于碱水解法。另外，由于酸水解法水解更彻底，加入有机试剂提取时在有机相与水相分层的界面处会形成一个蛋白质水解物的白色薄膜，使分层更为明显；而碱水解法由于水解不够充分，加入有机试剂提取时在有机相与水相分层的界面处会形成一定厚度的乳化层，不利于实验的进行。
实施例3
研究乙醇的加入量对OPO提取效果的影响
样品经水解后加入一定量的乙醇溶液，本研究考察了不同乙醇添加量对OPO提取效果的影响，试验结果见图3。
由图3可以看出，当乙醇加入量在5 ~ 10ml能达到较为理想的提取效果。
实施例4
提取溶剂对OPO提取效果的影响
结合GB 5413.3-2010中脂肪的提取方法以及1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯易溶于烷烃类溶剂的特性，选取乙醚石油醚等体积混合溶液、正己烷和正庚烷三类提取溶剂进行比较分析，结果见图4。
由图4可以看出，在选取乙醚石油醚等体积混合溶液作为提取溶剂时，对样品中OPO的提取效率明显优于正己烷和正庚烷组，乙醚具有较强的溶解脂类物质的能力，除此之外还能溶解游离脂肪酸、醇、磷脂及色素等脂溶性物质。石油醚不溶于水，能溶解脂肪、游离脂肪酸，不易溶解醇、磷脂和色素。使用乙醚石油醚等体积混合溶液作提取溶剂时，石油醚的加入能有效降低乙醚的极性，促进乙醇进入水层，使溶于水相的部分乙醚被竞争出来，从而使有机相与水相更好的分层。
实施例5
提取溶剂体积及提取次数对OPO提取效果的影响
将待测样品分为四组分别为
、②、③和④，每组样品三个平行，组
中待测样品经水解并加入乙醇后，先加入10ml乙醚涡旋提取2min，再加入10ml石油醚涡旋提取2min，静置分层后将有机层取出至100ml容量瓶中，水相重复上述提取步骤进行第二、三次提取，合并有机相至100ml容量瓶中并用乙醚石油醚等体积混合溶液定容至刻度，准确移取5ml有机相提取液，氮吹至干后以5ml正己烷复溶，待上机。组②以体积比为1:1的乙醚+石油醚混合溶液作为提取溶剂：待测样品经水解并加入乙醇后，先加入20ml体积比为1:1的乙醚+石油醚混合溶液涡旋提取2min，静置分层后将有机层取出至100ml容量瓶中，水相重复上述提取步骤进行第二、三次提取，合并有机相至100ml容量瓶中并用乙醚石油醚等体积混合溶液定容至刻度，准确移取5ml有机相提取液，氮吹至干后以5ml正己烷复溶，待上机。组③同组②，只不过不再进行第三次提取。组④也同组②，但只进行第一次提取，待测样品中OPO提取率见图5：
由图5知，对比组
和组②可以看出：乙醚和石油醚分步提取与乙醚石油醚等体积混合溶液提取两种提取方式对样品中OPO提取效率的影响无显著性差异；对比组2、组3和组4可以看出：使用乙醚石油醚等体积混合溶液提取两次既能达到较为理想的提取率。故本实例最终选用乙醚石油醚等体积混合溶液作为提取溶剂，提取次数为2次。
实施例6
精密度和加标回收率实验
通过上述方法对同一添加了OPO的婴幼儿乳粉样品进行6次平行实验，计算出OPO的含量，结果见表1：
由表2可知相对标准偏差RSD＝0.704％，表明其精密度良好。
加标回收结果：
在高中低三个添加水平下，样品的回收率在96.4%-101.5%之间，测定结果均具有良好的重现性。
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。
Claims (5)
1.一种乳制品中1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的快速检测方法，其特征在于，乳制品经37.5 wt%的盐酸水解后与乙醇混合，然后用乙醚石油醚混合溶液进行提取，氮气吹干后正己烷溶解，气相色谱法进行测定；
所述乳制品的检测方法包括以下步骤：
（1）标准溶液的配置：准确称取10mg 1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯标准品加入适量正己烷使之溶解，并于10mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯标准储备液；以标准储备液分别配制浓度为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL的标准溶液；
（2）待测样品溶液的配制：将0.5g婴幼儿配方乳粉在5mL温水中溶解，溶解后加入1mL盐酸，于65±2℃的水浴锅中水解40min，水解后冷却至室温，加入5~10mL乙醇混合均匀，加入20mL乙醚和石油醚等体积混合溶液涡旋提取1min，静置20min后离心，取上层有机相作为提取液，下层水相重复提取一次，合并有机相并定容至50mL，取2mL提取溶液于40℃水浴中氮吹吹干，用正己烷溶解并定容至5mL，得待测样品溶液；
（3）标准样品分析：取步骤（1）中的系列标准溶液进行气相色谱测定，得到标准样品色谱图，以标准溶液峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程；
（4）待测样品测定：取步骤（2）的待测样品溶液进行气相色谱测定，得到待测样品色谱图，与标准样品色谱图进行比较，根据步骤（3）中得到的线性回归方程，计算待测样品中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的气相色谱条件为，气相色谱仪：带氢火焰离子化检测器，温度为300℃；毛细管色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷耐高温色谱柱，柱长15m，内径0.25mm，膜厚0.1μm；载气：氮气；恒线速度模式：33.1cm/s；进样口温度：300℃；程序升温：100℃，保持3min，以15℃/min的速率升温至380℃，保持10min；进样方式：分流进样，分流比为20:1；进样体积：1.0 μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的乳制品为婴幼儿配方乳粉。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的温水温度为40 ±5℃。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的离心转速为8500 r/min，离心时间为5 min。
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