CN110031558A - 植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能同时测定植物油中脂肪酸和角鲨烯的快速检测方法，包括以下步骤：制备试样，称取样品，加入氢氧化钠甲醇溶液，水浴中回流，至油滴消失，冷却至室温，加入三氟化硼甲醇溶液，煮沸，冷却至室温，加入正庚烷，煮沸，冷却至室温，加入饱和氯化钠溶液，静置，吸取上层清液，加适量无水硫酸钠制得试样；配制标准工作溶液；样品的仪器分析，将步骤（1）试样，采用气相色谱法进行分析检测，得样品色谱图，检测脂肪酸和角鲨烯；样品的定性定量分析。本发明的检测方法不必局限于植物油脂中游离脂肪酸的含量，适用范围广，能用于批量植物油脂样品的快速检测，将大大提高植物油脂中脂肪酸和角鲨烯这两种类营养成分的检测效率。

Description

植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的快速检测方法，属于植物油脂分析技术领域。

背景技术

植物油脂是从植物种子、果肉及其它部分提取所得的脂肪脂，是由脂肪酸和甘油化合而成的天然高分子化合物。植物油脂具有极高的营养价值和保健功能，是人们摄取能量和必需脂肪酸的重要来源，具有多种生理作用，如构成机体组织、提供机体所需要的脂肪酸、促进脂溶性维生素的吸收等。随着生活水平的提高，人们对油脂食用安全和营养问题日益重视，绿色、健康食用油已经成为各国消费者的新需求。植物油脂的化合物组成可以直观的反映出其成分构成和营养价值，其中脂肪酸组成、角鲨烯等指标含量是其重要质量指标，快速、准确地检测植物油脂中的脂肪酸组成和角鲨烯含量对鉴定植物油产品的质量和营养价值具有积极意义，是食品检测和油脂研究开发领域的重要课题。

脂肪酸是植物油的最基本组成部分，是由碳、氢、氧三种元素组成的一类化合物，指一端含有一个羧基的长脂肪族碳氢链。脂肪酸根据碳氢键饱和度不同可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸三类；按碳链长度不同可分成短链脂肪酸（含2～6个碳原子）、中链脂肪酸（含6～12个碳原子）和长链脂肪酸（含14个以上碳原子）三类。营养学和临床医学研究表明，脂肪酸在维持人体健康方面起着重要的作用，日常饮食中长链脂肪酸的组成及含量与各种疾病（如肿瘤、冠心病、心脑血管病和老年痴呆症等）的发病率呈正相关性。豆蔻酸比棕榈酸有更强的致高胆固醇血癌的作用；适量食用棕榈酸有利于脂肪代谢，而过量食用会使体内脂肪沉积；亚油酸能够降低血液胆固醇，有利于心血管疾病的防治。由以上研究可见，对植物油脂中脂肪酸成分和含量的分析研究，有助于科学评价植物油脂的营养价值，对指导人们合理安排膳食也具有重要意义。

角鲨烯又名鲨烯、三十碳六烯，是由6个异戊二烯单位构成的一种高度不饱和链状三萜化合物。分子式为C₃₀H₅₀，化学名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。角鲨烯为无色或黄色透明油状液体，略带特有的芳香气味，易溶于乙醚、石油醚、丙酮和四氯化碳，微溶于醇和冰醋酸，不溶于水，在常压下330℃分解。1935年首次在橄榄油中发现角鲨烯，随后研究发现苋菜籽油、大豆油、罗汉果种仁油、米糠油和棕榈油、南瓜籽油等植物种子油中均含有一定量角鲨烯。角鲨烯是植物油中的一种脂质不皂化物，在植物油加工过程中，通过有效保留，可增加植物油的营养价值。角鲨烯是一种自由基清除剂，在体内参与胆固醇的生物合成及多种生化反应，能预防及治疗因血液循环不良而引起的心脏病、高血压、低血压及中风等，具有抗氧化、抗辐射、携氧、解毒等多种良好生物活性。因此，对植物油脂中角鲨烯含量进行分析，可为科学评价植物油脂的营养价值和开发研究新的角鲨烯植物来源提供数据支持。

目前报道的植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的检测方法主要有气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、液质联用法等，样品前处理需经过皂化、酯化、液液萃取或固相萃取净化，操作较为繁琐。

国家标准GB 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》检测植物油脂中脂肪酸采用酯交换和皂化酯化两种方法，其中酯交换法仅适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂样品，限制了方法的适用范围；皂化酯化法中样品前处理需要搭建回流冷凝装置，这样就限制了每次处理的样品数量，批量检测时需要耗费较长时间；粮油检验标准LS/T 6120-2017《粮油检验 植物油脂中角鲨烯的测定 气相色谱法》检测角鲨烯时需要长时间皂化以及多次液液萃取，耗时费力，并耗费大量有机溶剂。按以上标准在植物油检测和生产研究过程中检验这两个项目时，需要进行两次检验才能完成。因此，建立简便、快速并且能够同时检测植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的方法，将大大提高检测通量，降低检验成本，从而提高检验效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时测定植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的快速检测方法，且本发明的检测方法不必局限于植物油脂中游离脂肪酸的含量，适用范围广，能用于批量植物油脂样品的快速检测，将大大提高植物油脂中脂肪酸和角鲨烯这两类营养成分的检测效率，降低植物油脂企业和检验机构的检测成本。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的快速检测方法，包括以下步骤：

（1）制备试样

称取样品300mg（精确至0.1mg）于50mL容量瓶中，加入6mL氢氧化钠甲醇溶液，装上回流管，在60-65℃水浴中回流至油滴消失，回流时间通常需要5-10min；取出容量瓶并冷却至室温，加入7mL三氟化硼甲醇溶液，装上回流管，于水浴中煮沸2min；取出容量瓶并冷却至室温，加入5mL正庚烷，装上回流管，继续于水浴中煮沸1min；取出容量瓶并冷却至室温，取下回流管，加入约20mL饱和氯化钠溶液，剧烈振摇20s，继续加入饱和氯化钠至容量瓶颈部，静置，吸取上层清液约3mL于具塞试管中，加适量无水硫酸钠除水后即为试样；所述回流管为自制装置：000号橡胶塞连接1mL大肚移液管；所述氢氧化钠甲醇溶液为质量浓度为2%的氢氧化钠甲醇溶液；所述三氟化硼甲醇溶液为质量浓度为14%的三氟化硼甲醇溶液；所述水浴温度均为60-65℃。

（2）配制标准工作溶液

脂肪酸标准工作溶液：37种脂肪酸甲酯混标购买后直接使用，无需配制；

角鲨烯标准工作溶液：将角鲨烯标准储备溶液用正庚烷配制梯度标准工作溶液；所述角鲨烯标准储备液：以正庚烷为溶剂，浓度为1.0mg/mL。

（3）样品的仪器分析

将步骤（1）试样，采用气相色谱法进行分析检测，得样品色谱图，检测脂肪酸和角鲨烯；

（4）样品的定性定量分析

将步骤（2）配置的标准工作溶液采用气相色谱仪进行检测，得标准品色谱图，形成角鲨烯组分的标准曲线。根据标准品色谱图中保留时间确定步骤（3）试样中脂肪酸和角鲨烯种类，以面积归一化法计算步骤（3）试样中脂肪酸的含量，以外标法计算步骤（3）试样中角鲨烯的含量。

优选的，步骤（3）中，气相色谱仪色谱条件：

检测器：FID，温度为250℃；毛细管色谱柱：SP-2560，100m×0.25mm×0.2μm；载气及流速：氮气，1.0mL/min；进样口：温度为240℃；进样方式：分流进样，分流比为50:1；进样体积：1μL；程序升温：70℃保持2min，15℃/min升至150℃保持15min，2℃/min升至220℃保持10min，15℃/min升至240℃保持10min。

本发明建立了同时测定植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的气相色谱分析方法。试样采用氢氧化钠甲醇溶液进行皂化，三氟化硼甲醇溶液进行酯化，正庚烷提取，气相色谱法进行测定。本发明考察和优化了水浴温度、提取溶剂、提取时间和仪器测定条件等因素，并进行了GBW(E)100122花生油脂肪酸标准物质的脂肪酸验证试验和角鲨烯加标回收试验。结果表明：GBW(E)100122花生油脂肪酸标准物质的脂肪酸测定结果都在其标示值范围内；角鲨烯在 2μg/mL-500μg/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数为0.9997，在高中低三个添加水平下，实际样品的回收率在93.2%-104.6%之间，测定结果均具有良好的重现性，相对标准偏差（RSD n=6）为3.7%，角鲨烯的方法定量限为4mg/kg。本发明检测通量高，适用范围广，前处理操作简单快捷，能极大提高植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的检测效率，降低检测成本。

有益效果

（1）适用范围广

本发明采用三氟化硼甲醇酯化法，先用碱中和游离脂肪酸，再用三氟化硼作为催化剂加速甲酯化反应，使油脂的甲酯化既快又完全，与文献专利报道的利用氢氧化钾甲醇直接酯交换法相比，本发明方法不必局限于植物油脂中游离脂肪酸的含量，样品适用范围广。

（2）检测通量高

本发明能同时检测植物油脂中的脂肪酸和角鲨烯，检验通量提高两倍以上。

（3）操作简单

植物油脂样品经氢氧化钠甲醇溶液皂化后，用三氟化硼甲醇溶液进行酯化，正庚烷提取制得试样，经气相色谱法进行分析测定。与GB 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》相比，更易于批量检验；与LS/T 6120-2017《粮油检验 植物油中角鲨烯的测定 气相色谱法》相比，至少省去六次液液萃取和旋转蒸发浓缩过程；与文献报道的利用凝胶色谱或固相萃取的测定方法相比，省去了需配备大型设备（如凝胶色谱仪）或SPE柱净化过程，具有操作简单的特点。

（4）降低检测成本

现有的脂肪酸和角鲨烯检测方法标准（GB 5009.168-2016、LS/T 6120-2017）需要回流冷凝器、长时间皂化、液液萃取至少6次以及旋转蒸发浓缩等多个步骤，而本发明只需氢氧化钠甲醇溶液皂化5-10min，三氟化硼甲醇溶液酯化2min，正庚烷提取1min，即可制得试样用于上机测试，该法具有时间短、能耗低、省溶剂等优点，可大大降低实验成本。

（5）定性定量准确

本发明采用100米毛细色谱柱分析测定脂肪酸和角鲨烯，37种脂肪酸甲酯和角鲨烯色谱峰分离良好，克服了用25米毛细色谱柱不能良好分离37种脂肪酸甲酯和角鲨烯的缺点，排除了定性定量可能存在的干扰问题，定性定量结果准确。本发明中角鲨烯检出限为4mg/kg，完全满足粮油标准对角鲨烯的要求；GBW(E)100122花生油脂肪酸标准物质中的脂肪酸测定结果都在其标示值范围内，且与GB 5009.168-2016脂肪酸测定结果一致。

附图说明

图1 37种脂肪酸甲酯混标的色谱图；

图2 角鲨烯标准溶液的色谱图；

图3 花生油标准物质GBW(E)100122脂肪酸色谱图；

图4 角鲨烯浓度为200mg/kg的花生油加标样品色谱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明。本实施例根据本发明技术方案进行实施，给出了相似的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下所述的实施例。

实施例1

橄榄油中脂肪酸和角鲨烯检测：

1. 材料与材料

色谱柱：SP-2560，100m×0.25mm×0.2μm（色谱科公司）；37种脂肪酸甲酯混标（纯度≥98.0%），购于安谱公司；角鲨烯标准物质（纯度≥99.0%），购于德国Dr.Ehrenstorfer公司；GBW(E)100122花生油脂肪酸标准物质，购于国家粮食局科学研究院；正庚烷、甲醇、氢氧化钠、氯化钠（分析纯）；氮气（>99.999%）。

2. 仪器与设备

气相色谱仪，配有FID检测器（安捷伦公司）；分析天平：感量为0.1mg；恒温水浴锅。

3. 橄榄油中脂肪酸和角鲨烯同时快速检测方法，步骤为：

（1）标准储备液的配制：准确称取10.0mg（精确至0.1mg）角鲨烯标准物质于10mL容量瓶中，用正庚烷进行溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的角鲨烯标准储备溶液，于4℃保存。

（2）标准工作溶液的配制：准确移取角鲨烯标准储备液适量，用正庚烷稀释至浓度分别为2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL的标准工作液，配制角鲨烯标准工作溶液，备用。37种脂肪酸甲酯混标购买后直接用于脂肪酸的测定，无需配制；

（3）试样制备：称取试样300mg（精确至0.1mg）于50mL容量瓶中，加入6mL氢氧化钠甲醇溶液，装上回流管，在60-65℃水浴中回流至油滴消失，回流时间通常需要5-10min；取出容量瓶并冷却至室温，加入7mL三氟化硼甲醇溶液，装上回流管，于水浴中煮沸2min；取出容量瓶并冷却至室温，加入5mL正庚烷，装上回流管，继续于水浴中煮沸1min；取出容量瓶并冷却至室温，取下回流管，加入约20mL饱和氯化钠溶液，剧烈振摇20s，继续加入饱和氯化钠至容量瓶颈部，静置，吸取上层清液约3ml于具塞试管中，加适量无水硫酸钠除水后得待测试样，备用。

（4）样品的仪器分析：将步骤（3）待测试样，采用气相色谱法对待测组分进行分析检测，得样品色谱图，检测脂肪酸和角鲨烯；

气相色谱条件

检测器：FID，温度为250℃；毛细管色谱柱：SP-2560，100m×0.25mm×0.2μm；载气及流速：氮气，1.0mL/min；进样口：温度为240℃；进样方式：分流进样，分流比为50:1；进样体积：1μL；程序升温：70℃保持2min，15℃/min升至150℃保持15min，2℃/min升至220℃保持10min，15℃/min升至240℃保持10min。

4. 定量结果评价

4.1 角鲨烯标准曲线

将步骤（2）配制的2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL的角鲨烯标准工作液，按照上述方法步骤进行检测，获得标准品色谱图，标准品色谱图中角鲨烯的色谱峰面积y为纵坐标，以标准工作溶液相应的浓度值（μg/mL）x为横坐标，作标准曲线，获得角鲨烯的线性回归方程：y=0.7149x+0.6224，在2μg/mL-500μg/mL范围内，角鲨烯的浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数R²为0.9997。

4.2 方法中角鲨烯回收率、精密度和检出限

采用外标法定量，统计角鲨烯的回收率（回收率：实测值/加入量×100％），结果如表1所示。由表可见，角鲨烯的回收率在93.2%-104.6%范围内。

对不同样品重复测定6次，测定结果均具有良好的重现性，角鲨烯的RSD分别为3.7%。

采用在空白样品中添加目标化合物的方法，测得角鲨烯的检出限为4mg/kg。

表1 加标回收实验结果

4.3 GBW(E)100122花生油脂肪酸标准物质的脂肪酸验证试验

分别采用本发明方法及GB 5009.168-2016皂化酯化法两种前处理方法对GBW(E)100122花生油脂肪酸标准物质进行脂肪酸验证试验。结果表明：脂肪酸测定结果都在其标示值范围内，并且两种方法的结果一致，如表2所示。

表2 GBW(E)100122花生油脂肪酸标准物质两种前处理方法测定结果的比较

5. 样品检测

（1）定性分析

实施例1待测橄榄油样品预处理为待测样品溶液，用气相色谱仪，按照上述方法给出的步骤测定，获得样品色谱图。

若样品色谱图中存在与标准品色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明样品中含有相应的成分。相应的色谱峰是指：样品色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间比较，变化范围在±2.5％之内，且峰形一致；标准色谱峰是指标准品色谱图中的目标物的色谱峰。

（2）定量计算

脂肪酸采用面积归一化法定量：试样中某个脂肪酸占总脂肪酸的百分比，通过测定相应峰面积对所有脂肪酸成分峰面积总和的百分数来计算；角鲨烯采用外标法定量：根据样品色谱图中角鲨烯色谱峰的面积，采用4.1的回归方程，计算得到。

实施例1待测橄榄油样品中脂肪酸和角鲨烯含量见表1。

表1 橄榄油中脂肪酸和角鲨烯含量

对比例1

将实施例1中的橄榄油利用专利CN106568884A检测脂肪酸和角鲨烯。专利CN106568884A前处理耗时较长，其中皂化需45min，甲酯化需10min，而本发明中皂化仅需5-10min，甲酯化仅需2min；专利CN106568884A的前处理过程净化不充分，制备的样品放置会产生絮状沉淀，上机进样对仪器和色谱柱会造成损伤；专利CN106568884A中制备两份试样，需要分别进行仪器检测，所用条件差异很大。检测脂肪酸需用FFAP色谱柱（25m×0.25mm×0.25μm），检测其伴随成分需用DB-5柱（30m×0.32mm×0.25μm），其他参数如进样口温度、检测器温度、柱流速、升温程序、分流比等设置均不相同，如用同一台设备就需要更换色谱柱并采用两种不同的仪器分析方法才能完成一个植物油样品的检测，否则就需要占用两台设备，所有数据分别呈现在两张谱图上。而本发明样品前处理后试样只有一份，用一台设备、一根色谱柱、固定程序就可完成检测，所有数据在一张谱图中呈现。

对比例2

将实施例1中的橄榄油利用专利CN103149303A检测脂肪酸和角鲨烯。专利CN103149303A中样品前处理采用酯交换法，该方法仅适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂样品，具有局限性；专利CN103149303A提供的气相色谱条件不完整，程序升温的初始温度不明确，样品分析无法进行，需进一步优化仪器条件。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形在内。

Claims (4)

1.一种植物油脂中脂肪酸和角鲨烯的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备试样

称取样品，加入氢氧化钠甲醇溶液，水浴中回流，至油滴消失，冷却至室温，加入三氟化硼甲醇溶液，煮沸，冷却至室温，加入正庚烷，煮沸，冷却至室温，加入饱和氯化钠，静置，吸取上层清液，加适量无水硫酸钠制得试样；

（2）配制标准工作溶液

角鲨烯标准工作溶液：将角鲨烯标准储备溶液用正庚烷配制梯度标准工作溶液；所述角鲨烯标准储备液：以正庚烷为溶剂，浓度为1.0mg/mL；

（3）样品的仪器分析

将步骤（1）试样，采用气相色谱法进行分析检测，得样品色谱图，检测脂肪酸和角鲨烯；

（4）样品的定性定量分析

将步骤（2）配置的标准工作溶液采用气相色谱仪进行检测，得标准品色谱图，形成角鲨烯组分的标准曲线；根据标准品色谱图中保留时间确定步骤（3）试样中脂肪酸和角鲨烯种类，以面积归一化法计算步骤（3）试样中脂肪酸的含量，以外标法计算步骤（3）试样中角鲨烯的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的制备试样的步骤为：称取样品300mg于50mL容量瓶中，加入6mL氢氧化钠甲醇溶液，装上回流管，在60-65℃水浴中回流至油滴消失，回流时间通常需要5-10min；取出容量瓶并冷却至室温，加入7mL三氟化硼甲醇溶液，装上回流管，于水浴中煮沸2min；取出容量瓶并冷却至室温，加入5mL正庚烷，装上回流管，继续于水浴中煮沸1min；取出容量瓶并冷却至室温，取下回流管，加入20mL饱和氯化钠溶液，剧烈振摇20s，继续加入饱和氯化钠溶液至容量瓶颈部，静置，吸取上层清液3mL于具塞试管中，加适量无水硫酸钠除水后即为试样。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述氢氧化钠甲醇溶液为质量浓度为2%的氢氧化钠甲醇溶液；所述三氟化硼甲醇溶液为质量浓度为14%的三氟化硼甲醇溶液；所述回流管为自制装置：000号橡胶塞连接1mL大肚移液管；所述水浴温度均为60-65℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，气相色谱仪色谱条件：

检测器：FID，温度为250℃；毛细管色谱柱：SP-2560，100m×0.25mm×0.2μm；载气及流速：氮气，1.0mL/min；进样口：温度为240℃；进样方式：分流进样，分流比为50:1；进样体积：1μL；程序升温：70℃保持2min，15℃/min升至150℃保持15min，2℃/min升至220℃保持10min，15℃/min升至240℃保持10min。