CN102565270B - 3－氯－1，2－丙二醇及其脂肪酸酯含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3-氯-1，2-丙二醇含量的检测方法，包括如下步骤：1)氧化：将水溶液中的3-氯-1，2-丙二醇氧化为氯乙醛；2)衍生化：将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；3)检测：采用HPLC-FLD方法进行检测，即可得出3-氯-1，2-丙二醇含量。本发明与现有GC-MS方法相比，方法操作简单，设备投资大大降低，且无需昂贵的氘代标样，极大地降低了使用费用，为相关产品中增加3-氯-1，2-丙二醇检测指标扫清了障碍。本发明还可通过将3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯经酯交换为3-氯-1，2-丙二醇，从而检测出3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯的含量。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种3-氯-1，2-丙二醇及其脂肪酸酯含量的检测方法。
背景技术
3-氯-1，2-丙二醇及其脂肪酸酯是在食品加工过程中产生的、不易引起人们的注意、但会对广大消费者的健康产生危害的物质。其对人体的危害表现在：①3-氯-1，2-丙二醇的急、慢性毒性：3-氯-1，2-丙二醇的大鼠经口半数致死量LD50为150mg/kg.bw。雄性大鼠连续经口染毒3-氯-1，2-丙二醇1mg/kg/day以上剂量时，可以出现精子活动减弱和生殖力降低，剂量大于或等于10-20mg/kg/day，可见大鼠的精子有显著的形态学改变和附睾损伤；②3-氯-1，2-丙二醇的遗传毒性：目前大多数研究机构和学者认为3-氯-1，2-丙二醇属于非遗传毒性致癌物，暂定每日最大耐受量(TDI)为2μg/kg.bw；③3-氯-1，2-丙二醇的致癌性：英国致癌委员会(Committee on carcinoginicity)认为，3-氯-1，2-丙二醇在动物实验中会引起致癌；而英国致变异委员会(Committee on Mutagenicity)认为，3-氯-1，2-丙二醇在体内实验中，是一个非基因毒性的致癌物质；④3-氯-1，2-丙二醇的神经毒性：小鼠和大鼠对3-氯-1，2-丙二醇的神经毒性作用敏感性相同，尤其是对脑干的对称性损伤。当3-氯-1，2-丙二醇染毒剂量大于25mg/kg.bw/day时，实验动物中枢神经系统损伤呈现显著的剂量效应关系。
由于3-氯-1，2-丙二醇对人体健康的危害，欧盟在2001年制订了限量标准，规定不得超过每日20μg/kg.bw的摄入量；我国也建立了检测酱油中3-氯-1，2-丙二醇的国家标准。由于3-氯 -1，2-丙二醇的危害性较大，在食品中要求的安全限为ppb级，且食品中的含量一般也在此级别，因此目前一般都采用灵敏度高的GC-MS方法检测。虽然3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯的危害性还无定论，但它在一定条件下很容易水解生成3-氯-1，2-丙二醇，因此油脂样品除需检测游离的3-氯-1，2-丙二醇外，还需检测3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯的含量。常用的3-氯-1，2-丙二醇检测方法是先将3-氯-1，2-丙二醇进行衍生，衍生方法有酮类衍生、硼酸类衍生(苯基硼酸、丁基硼酸)、N，O-双三甲基-三氟乙酰胺(BSTFA)、酸酐类衍生、七氟丁酰咪唑(HFBI)等；衍生后再进行GC-MS检测。3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯可通过酯交换反应变成3-氯-1，2-丙二醇后进行检测。虽然GC-MS是目前采用的最主要的方法，但此方法存在着仪器昂贵、维护使用费用高、需氘代标样作为内标物、对使用者业务能力要求高等缺陷，极大地限制了此检测方法的推广应用，使得相关产品中增加3-氯-1，2-丙二醇残留量指标成为空谈。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种操作方便、成本较低的3-氯-1，2-丙二醇含量的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案包括以下步骤：
1)氧化：将水溶液中的3-氯-1，2-丙二醇氧化为氯乙醛；
2)衍生化：将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；
3)检测：采用HPLC-FLD方法进行检测，即可得3-氯-1，2-丙二醇的含量。
所述步骤1)中，可用但不限于用高碘酸钠作为氧化剂。优选地，所述高碘酸钠的浓度为0.01-0.1mol/L，添加量为所述3-氯-1，2-丙二醇水溶液体积的10-80％，反应温度为5-30℃，反应时间为10-120min。
所述步骤2)中的衍生试剂包括但不限于鸟嘌呤、腺嘌呤、巯基鸟嘌呤、胞嘧啶，其相应核苷及核苷酸。所述衍生试剂的浓度为 0.002-0.02mol/L，反应温度为37-100℃，反应时间为10-240min。
所述步骤3)中HPLC采用反相色谱模式，固定相包括但不限于反相ODS、C12或C8填料，流动相包括但不限于甲醇-水或乙腈-水体系，比例为5％：95％-100％：0％；FLD激发波长为260-320nm，检测波长为350-470nm。
所述3-氯-1，2-丙二醇水溶液可以是经如下步骤处理动植物油脂产品制得：
a)称取油脂产品质量；
b)加入己烷和含NaCl的乙酸溶液进行萃取，弃去上层有机相；
c)用己烷重复萃取一次，弃去上层有机相。
所述3-氯-1，2-丙二醇水溶液也可以是经如下步骤处理固态含油脂产品制得，所述固态含油脂产品包括但不限于油炸方便面、薯片、油条或油饼：
a)称取固态含油脂产品的质量并粉碎；
b)加入己烷进行萃取2次以上，合并萃取液；
c)加水于合并的萃取液中进行萃取，弃去上层有机相。
所述3-氯-1，2-丙二醇水溶液还可以是经固相萃取非油脂类产品制得，所述非油脂类产品包括但不限于酱油、水解植物蛋白。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯含量的检测方法。为解决该技术问题，本发明采用的技术方案包括以下步骤：
a)酯交换：将水溶液中的3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯经酯交换为3-氯-1，2-丙二醇；
b)氧化：将3-氯-1，2-丙二醇氧化为氯乙醛；
c)衍生化：将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；
d)检测：采用HPLC-FLD方法进行检测，可得出3-氯-1，2-丙二醇含量；
e)折算出3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯的含量。
本发明的有益效果在于：
1)本发明与现有GC-MS方法相比，可在普通的液相色谱-荧光检测器上进行，设备投资大大降低。
2)采用的试剂均为常规试剂，无需昂贵的氘代标样，价格低廉，极大地减低了使用费用。
3)方法操作简单，对操作者要求较低，容易推广应用。
4)本发明既可测定游离态的3-氯-1，2-丙二醇的含量，也可测定游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量，并据此折算出3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯的物质的量。
5)一般企业均有能力配置和使用检测仪器进行检测，为相关产品中增加3-氯-1，2-丙二醇检测指标扫清了障碍。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例一：称取2g一级大豆油，溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，然后加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.1mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10％，反应温度为30℃，反应时间为20min；浓缩至体积为1mL，然后加入2mL的0.002mol/L的鸟嘌呤进行衍生化反应，在37℃下反应240min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相ODS填料，流动相为甲醇-水(5∶95，v/v)；激发波长为260nm，荧光检测波长为350nm；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为532±21μg/kg。测定游离态的3-氯-1，2-丙二醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，2-丙二醇萃取过程，其它操作与上同，得到测定结果为47±6μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在97-102％之间。3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯的含量(物质的量)可通过总3-氯-1，2-丙二醇含量与游离态的3-氯-1，2-丙二醇的含量的差值经折算求得(实施例2-8中可同样通过该方法求得)。
实施例二：称取2g猪油，溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，然后加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的40％，反应温度为20℃，反应时间为50min；浓缩至体积为1mL，然后加入0.8mL的0.01mol/L的鸟嘌呤进行衍生化反应，在50℃下反应120min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相ODS填料，流动相为乙腈-水(10∶90，v/v)；激发波长为280nm，荧光检测波长为380nm；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为212±14μg/kg。测定游离态的3-氯-1，2-丙二醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，2-丙二醇萃取过程，其它操作与上同，得到测定结果为23±4μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在98-101％之间。
实施例三：称取2g一级菜籽油，溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，然后加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.01mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的80％，反应温度为5℃，反应时间为120min；浓缩至体积为1mL，然后加入0.5mL的0.02mol/L的腺嘌呤核苷进行衍生化反应，在100℃下反应20min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相C12填料，流动相为甲醇-水(15∶85，v/v)；激发波长为320nm，荧光检测波长为470nm；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为485±18μg/kg。测定游离态的3-氯-1，2-丙二醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，2-丙二醇萃取过程，其它操作与上同，得到测定结果为36±5μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在95-98％之 间。
实施例四：称取2g一级大豆油，溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，然后加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的50％，反应温度为15℃，反应时间为40min；浓缩至体积为1mL，然后加入1mL的0.01mol/L的巯基鸟嘌呤进行衍生化反应，在50℃下反应140min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相C8填料，流动相为乙腈-水(50∶50，v/v)；激发波长为300nm，荧光检测波长为450nm；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为547±191μg/kg。测定游离态的3-氯-1，2-丙二醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，2-丙二醇萃取过程，其它操作与上同，得到测定结果为53±4μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在98-101％之间。
实施例五：称取2g一级菜籽油，溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，然后加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的50％，反应温度为25℃，反应时间为60min；浓缩至体积为1mL，然后加入0.5mL的0.02mol/L的胞嘧啶核苷酸进行衍生化反应，在80℃下反应40min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相C8填料，流动相为乙腈；激发波长为310nm，荧光检测波长为410nm；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为506±22μg/kg。测定游离态的3-氯-1，2-丙二醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，2-丙二醇萃取过程，其它操作与上同，得到测定结果为45±4μ g/kg。加标试验的测定结果表明回收率在97-104％之间。
实施例六：称取8g油炸方便面，粉碎后用己烷萃取3次，每次50mL，合并萃取液并脱除己烷；然后溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，再加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.1mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10％，反应温度为25℃，反应时间为100min；浓缩至体积为1mL，然后加入1mL的0.01mol/L的巯基鸟嘌呤核苷进行衍生化反应，在100℃下反应30min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相ODS填料，流动相为乙腈-水(50∶50，v/v)；激发波长为320nm，荧光检测波长为430nm；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为932±29μg/kg。游离3-氯-1，2-丙二醇的测定：己烷萃取出油脂后直接用水进行3-氯-1，2-丙二醇萃取，其它操作与上同，得到测定结果为15±2μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在93-96％之间。
实施例七：称取8g油炸薯片，粉碎后用己烷萃取3次，每次50mL，合并萃取液并脱除己烷；然后溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，再加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的80％，反应温度为35℃，反应时间为10min；浓缩至体积为1mL，然后加入150％(体积比)0.008mol/L的鸟嘌呤核苷酸进行衍生化反应，在80℃下反应60min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相C 12填料，流动相为乙腈-水(10∶90，v/v)；激发波长为260nm，荧光检测波长为350nm；外标法定量。重复测定10次， 得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为1179±37μg/kg。游离态的3-氯-1，2-丙二醇含量的测定：己烷萃取出油脂后直接用水萃取3-氯-1，2-丙二醇，其它操作与上同，得到测定结果为28±5μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在94-98％之间。
实施例八：称取8g油炸方便面，粉碎后用己烷萃取3次，每次50mL，合并萃取液并脱除己烷；然后溶于10mL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应10min，再加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙二醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0.03mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的30％，反应温度为5℃，反应时间为120min；浓缩至体积为1mL，然后加入2mL的0.009mol/L的腺嘌呤进行衍生化反应，在50℃下反应120min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相C8填料，流动相为甲醇；激发波长为280nm，荧光检测波长为405nm；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙二醇含量为979±32μg/kg。游离态的3-氯-1，2-丙二醇含量的测定：己烷萃取出油脂后直接用水萃取3-氯-1，2-丙二醇，其它操作与上同，得到测定结果为21±3μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在97-103％之间。
实施例九：称取8g酿造酱油，用12mL的5mol/LNaCl溶液混合，上样固相萃取柱，先用80mL己烷-乙醚(90∶10，v/v)洗脱，然后改用250mL乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂；然后溶于60mL水，加入0.02mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10％，反应温度为5℃，反应时间为120min；浓缩至体积为1mL，然后加入1mL的0.01mol/L的腺嘌呤核苷进行衍生化反应，在37℃下反应240min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相C12填料，流动相为甲醇- 水(20∶80，v/v)；激发波长为300nm，荧光检测波长为410nm；外标法定量。重复测定10次，得到3-氯-1，2-丙二醇的含量为42±8μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在93-98％之间。
实施例十：称取8g配制酱油，用12mL的5mol/LNaCl溶液混合，上样固相萃取柱，先用80mL己烷-乙醚(90∶10，v/v)洗脱，然后改用250mL乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂；然后溶于60mL水，加入0.1mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10％，反应温度为30℃，反应时间为10min；浓缩至体积为1mL，然后加入的0.5mL 0.02mol/L的腺嘌呤进行衍生化反应，在100℃下反应10min；反应完成后定容5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相ODS填料，流动相为乙腈-水(10∶90，v/v)；激发波长为320nm，荧光检测波长为430nm；外标法定量。重复测定10次，得到3-氯-1，2-丙二醇的含量为86±7μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在95-104％之间。
实施例十一：称取8g水解植物蛋白，用12mL的5mol/LNaCl溶液混合，上样固相萃取柱，先用80mL己烷-乙醚(90∶10，v/v)洗脱，然后改用250mL乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂；然后溶于60mL水，加入0.05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的50％，反应温度为20℃，反应时间为50min；浓缩至体积为1mL，然后加入0.6mL的0.02mol/L的巯基鸟嘌呤核苷酸进行衍生化反应，在80℃下反应60min；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为反相C8填料，流动相为甲醇；激发波长为260nm，荧光检测波长为400nm；外标法定量。重复测定10次，得到3-氯-1，2-丙二醇的含量为157±11μg/kg。加标试验的测定结果表明回收率在93-102％之间。
Claims (7)
1.一种3－氯－1，2－丙二醇含量的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1）氧化：将水溶液中的3－氯－1，2－丙二醇氧化为氯乙醛；所述氧化剂为高碘酸钠；
2）衍生化：将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；所述衍生试剂为以下试剂的一种：
鸟嘌呤、腺嘌呤、巯基鸟嘌呤、胞嘧啶，其相应核苷及核苷酸；
3）检测：采用HPLC-FLD方法进行检测，即可得出3－氯－1，2－丙二醇含量；所述HPLC采用反相色谱模式，固定相为反相ODS、C12或C8填料，流动相为甲醇-水或乙腈-水体系，比例为5%:95%-100%:0%；FLD激发波长为260-320nm，检测波长为350-470nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，高碘酸钠的浓度为0.01-0.1mol/L，添加量为所述3－氯－1，2－丙二醇水溶液体积的10-80%，反应温度为5-30℃，反应时间为10-120min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述衍生试剂的浓度为0.002-0.02mol/L，反应温度为37-100℃，反应时间为10-240min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述3－氯－1，2－丙二醇水溶液经如下步骤处理油脂产品制得：
1）称取油脂产品质量；
2）加入己烷和含NaCl的乙酸溶液进行萃取，弃去上层有机相；
3）用己烷重复萃取一次，弃去上层有机相。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述3－氯－1，2－丙二醇水溶液经如下步骤处理固态含油脂产品制得：
1）称取固态含油脂产品的质量并粉碎；
2）加入己烷进行萃取2次以上，合并萃取液；
3）加水于合并的萃取液中进行萃取，弃去上层有机相。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述3－氯－1，2－丙二醇水溶液经固相萃取非油脂类产品制得。
7.一种3－氯－1，2－丙二醇脂肪酸酯含量的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）酯交换：将水溶液中的3－氯－1，2－丙二醇脂肪酸酯在甲醇钠的作用下经酯交换为3－氯－1，2－丙二醇；
2）氧化：将3－氯－1，2－丙二醇氧化为氯乙醛；所述氧化剂为高碘酸钠；
3）衍生化：将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；所述衍生试剂为鸟嘌呤、腺嘌呤、巯基鸟嘌呤、胞嘧啶，其相应核苷，或其相应核苷酸；
4）检测：采用HPLC-FLD方法进行检测，可得出3－氯－1，2－丙二醇含量；所述HPLC采用反相色谱模式，固定相为反相ODS、C12或C8填料，流动相为甲醇-水或乙腈-水体系，比例为5%:95%-100%:0%；FLD激发波长为260-320nm，检测波长为350-470nm；
5）折算出3－氯－1，2－丙二醇脂肪酸酯的含量。
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