CN112946157B - 荧光硫脲衍生化试剂在3-氯-1,2-丙二醇检测中的应用 - Google Patents

荧光硫脲衍生化试剂在3-氯-1,2-丙二醇检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及荧光硫脲衍生化试剂在3‑氯‑1,2‑丙二醇检测中的应用。本发明的有益效果在于：1)本发明所采用的荧光硫脲类衍生化试剂荧光效率高，使得该方法检测灵敏度非常高；2)本发明所采用的荧光衍生化反应专一性好，转化率高，并且衍生化试剂与目标产物的疏水性差异较大，在反相高效液相色谱中极易分离，因而易于排除基质效应干扰，提高检测准确度；3)使用普通的液相色谱‑荧光法进行测定，设备投资较GC‑MS大为降低，且对操作者要求较低，易于推广应用。

Description

荧光硫脲衍生化试剂在3-氯-1,2-丙二醇检测中的应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，更具体地，涉及荧光硫脲衍生化试剂在3-氯-1,2-丙二醇检测中的应用。
背景技术
3-氯-1,2-丙二醇又称3-氯丙二醇或氯甘油，其英文名为3-monochloro-1,2-propanediol，简写3-MCPD，近年来的毒性研究表明，3-MCPD对人体健康具有较强的危害，主要表现为具有一定的急、慢性毒性；遗传毒性与神经毒性等，已成为一种国际公认的食品化学污染物。
最初，食品中氯丙醇的污染首先是在以酸水解植物蛋白(HVP)为原料的调味品(如鸡精和酱油等)中发现的，然后陆续在麦芽提取物、变性淀粉、肉类提取物、饼干、面包、香肠、谷物类中检出。2006年捷克的ZelinkováZ.等首先发现在食用油中存在氯丙醇脂肪酸酯。2007年Seefelder W.等研究发现在精炼油脂中氯丙醇脂肪酸酯的含量范围在0.2～20mg/kg之间，其中精炼植物油按照菜籽油、大豆油、葵花籽油、红花油、核桃油和棕榈油的数序递增。
环境水体中，由于工业废水的排放会导致一定程度的3-MCPD污染，如酸水解植物蛋白生产废水的排放、纸浆生产过程中湿强剂-聚酰胺聚胺表氯醇树脂的使用都是产生3-MCPD污染的重要来源，如不经处理会导致附近水体的污染；另外，在水处理过程中多胺絮凝剂的使用也会产生一定程度的3-MCPD污染。
正由于3-MCPD对人体危害严重，许多国家都制定了限量标准来控制食品及饮用水中的该项污染物，如欧盟在2001年制订了限量标准，规定不得超过每日20μg/kg.bw的摄入量；我国也建立了检测酱油中3-MCPD的国家标准。英国饮用水检查机构(Drinking WaterInspectorate)规定饮用水中3-MCPD的最大含量不得超过0.1mg/L。由于食品及饮用水中3-MCPD安全限均达到ppb级，故必须采用灵敏度高的检测方法才能达到监控要求，目前常用的手段主要为气相色谱(GC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)。由于3-MCPD的极性与沸点较高，测定过程中均需要将3-MCPD从基质中富集、萃取出来，然后进行衍生化。常用的萃取方法有液-液萃取(LLE)、基质固相分散萃取(MSPD)、固相微萃取(SPME)等；而衍生化方法则主要有酮类衍生、硼酸类衍生(苯基硼酸、丁基硼酸)、N,O-双三甲基-三氟乙酰胺(BSTFA)、酸酐类衍生(HFBA)、七氟丁酰咪唑(HFBI)等。然而，由于3-MCPD水溶性好，沸点较高，故基于气相色谱测定3-MCPD的分析方法具有前处理过程复杂、繁琐，衍生化条件苛刻、仪器使用维护成本高等缺点。
鉴于此，发展基于高效液相色谱(HPLC)的成本低、简便易行的高灵敏检测方法具有十分重要的现实意义，吴倩等将样品中的3-MCPD净化后叠氮化处理，并通过点击反应将其转换成具有生色团的三氮唑化合物，使用HPLC-紫外(UV)检测酱油中的3-MCPD；Chung等将净化后的3-MCPD通过微波-苯乙酮衍生化，采用HPLC-UV法检测酱油中的3-MCPD，基于HPLC-UV的方法总体来说检测限相对偏高。专利CN201210001681.4、CN201510020204.6报道了一种结合高碘酸氧化裂解、碱基、核苷(核苷酸)或邻氨基N杂二元环状荧光化合物衍生化的RP-HPLC-荧光(FLD)检测法，该方法测试成本低、操作简单、灵敏度高，可适用于油脂、酱油等食品中3-MCPD的测定。虽然衍生化试剂种类可选较多，但是荧光衍生化的反应机理是基本相同的，为了扩大衍生化反应的多样性与适应性，因此，开发新型荧光性能好、疏水性更强的荧光衍生化试剂将更加有利于发挥该方法的长处与优势。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一类新型反应基理的荧光硫脲类衍生化试剂，用于高效液相色谱-荧光检测3-氯-1,2-丙二醇，该类衍生化试剂可以与3-氯-1,2-丙二醇的氧化裂解产物-氯乙醛定量生成噻唑类荧光化合物。其制取方便、衍生化效率高、荧光性能优异，荧光衍生化试剂与衍生化产物极性差异较大，在反相液相色谱中分离效果好，有利于提高测试方法的准确度与灵敏度。
为了实现上述目的，本发明提供荧光硫脲衍生化试剂在3-氯-1,2-丙二醇检测中的应用，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物具有式Ⅰ所示的结构；
所述R为H、CH3、CH2OH或CH2CH2OH。
根据本发明，式Ⅰ中的荧光体为具有荧光性能的结构，如苯环、吡啶、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、嘌呤、腺嘌呤等。
根据本发明，式Ⅰ中，当R为H时，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物可以是N-苯基硫脲、(4-甲氧基苯基)硫脲、2-吡啶基硫脲、3-喹啉硫脲、4-异喹啉硫脲、4-喹唑啉硫脲、6-嘌呤硫脲、5-喹啉基硫脲、腺嘌呤硫脲和6-喹喔啉基硫脲；当R为CH3时，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物可以是N-甲基-N'-(2,4-二甲基苯基)硫脲；当R为CH2OH时，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物可以是N-羟甲基-N'-(2-喹喔啉)硫脲；当R为CH3CH2OH时，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物可以是3-(N-羟乙基)吡啶基硫脲。
作为进一步的优选方案，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物选自N-苯基硫脲、(4-甲氧基苯基)硫脲、2-吡啶基硫脲、3-喹啉硫脲、4-异喹啉硫脲、2-喹喔啉硫脲、4-喹唑啉硫脲、6-嘌呤硫脲、3-(N-羟乙基)吡啶基硫脲、5-喹啉基硫脲、腺嘌呤硫脲和6-喹喔啉基硫脲中的至少一种。
作为进一步的优选方案，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物选自5-喹啉基硫脲、腺嘌呤硫脲、6-喹喔啉基硫脲、3-(N-羟乙基)吡啶基硫脲和2-吡啶基硫脲中的至少一种。
作为优选方案，所述3-氯-1,2-丙二醇检测的步骤包括：
1)将3-氯-1,2-丙二醇进行氧化裂解，获得氯乙醛；
2)将氯乙醛与荧光硫脲衍生化试剂化合物反应，生成具有荧光效应的目标物质；
3)HPLC-FLD测定：对目标物质进行分离，并根据其色谱峰面积对3-氯-1,2-丙二醇进行定量。
根据本发明，步骤3)中，对目标物质进行分离，并根据其色谱峰面积对3-氯-1,2-丙二醇进行定量为本领域常规技术手段，本领域技术人员可根据需要选择合适的对目标物质进行分离的手段。
作为优选方案，裂解的步骤包括：将含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样与过量氧化剂进行氧化反应，反应后除去未反应的氧化剂。
作为优选方案，所述氧化反应的温度为5℃-30℃，所述氧化反应的时间为10min-120min；
作为优选方案，所述氧化剂为高碘酸盐，更优选为高碘酸钠。
作为优选方案，除去未反应的氧化剂的试剂包括但不限于亚硫酸盐和/或铅盐，添加体积为待测水样体积的10％-80％，以去除过量未反应的高碘酸盐，消除副反应。
作为优选方案，除去未反应的氧化剂的试剂的添加量为所述氧化剂的1～2倍；
根据本发明，在一个具体的实施方式中，含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样可以是经过滤、离心处理的江水、河水、湖水、自来水、商品饮用水、地下水、工厂废水等多种环境水样。
作为一个优选方案，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样的步骤包括：将动植物油脂产品与分散剂分散均匀，加入NaCl溶液，搅拌、萃取、静置后取下层水相，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样。其中，分散剂可以是本领域技术人员常规采用的亲脂性溶剂，如己烷、正己烷、叔丁基甲醚/乙酸乙酯、正丙醇、正庚烷；搅拌可以是磁力搅拌；优选地，静置后还包括弃去上层有机相；其中，萃取过程可以是多次，以提高萃取率。
作为一个优选方案，由动植物油脂产品中的3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯水解获得含有3-氯-1,2-丙二醇待测水样的步骤包括：将动植物油脂产品均匀分散溶解于叔丁基甲醚/乙酸乙酯中，加入H2SO4/正丙醇溶液，漩涡混匀后水浴超声，随后加入甲醇钠溶液快速水解；水解完成后迅速加入正庚烷和冰醋酸，终止水解反应并萃取弃去上层有机相，加入正庚烷萃取多次，除去溶液中残留的非极性成分，然后将下层水相pH值调至中性。
作为另一个优选方案，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样的步骤包括：将非油脂类产品进行固相萃取，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样。其中，非油脂类产品包括但不限于酱油、水解植物蛋白。
作为优选方案，步骤2)中，所述反应的温度为37℃-100℃，所述反应的时间为10min-240min。
作为优选方案，步骤2)中，所述荧光硫脲衍生化试剂化合物的浓度为0.002-0.20mol/L。
作为优选方案，待测水样与荧光硫脲衍生化试剂化合物的体积比为0.8-2.5：1。
作为优选方案，步骤3)中，HPLC采用反相色谱模式。
作为优选方案，步骤3)中，固定相包括耐碱性的硅胶ODS、锆基质ODS或聚合物基质ODS填料。
作为优选方案，流动相包括pH＝7-14的甲醇-缓冲液或pH＝7-14的乙腈-缓冲液，比例为5％：95％-100％：0％。
作为优选方案，FLD激发波长为260nm-320nm，检测波长为350nm-470nm。
根据本发明，对于上述的荧光硫脲衍生化试剂化合物在3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)检测中的应用，其适用于在待测样品中仅有3-MCPD生成氯乙醛、而不适用于其他杂质也能生成氯乙醛的情况。
本发明的有益效果：
1)本发明所采用的荧光硫脲类衍生化试剂荧光效率高，使得该方法检测灵敏度非常高；
2)本发明所采用的荧光衍生化反应专一性好，转化率高，并且衍生化试剂与目标产物的疏水性差异较大，在反相高效液相色谱中极易分离，因而易于排除基质效应干扰，提高检测准确度；
3)使用普通的液相色谱-荧光法进行测定，设备投资较GC-MS大为降低，且对操作者要求较低，易于推广应用。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1示出了2-吡啶基硫脲作为荧光硫脲衍生化试剂测定自来水加标(25.0ng/mL)的色谱图。
图2示出了5-喹啉基硫脲作为荧光硫脲衍生化试剂测定造纸厂下游排水口附近水样的色谱图。
图3示出了腺嘌呤硫脲作为荧光硫脲衍生化试剂测定市售一级大豆油的色谱图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
实施例1：
取实验室自来水样，加入适量3-氯-1,2-丙二醇标准溶液，使加标浓度为25.0ng/mL，用0.45μm滤膜过滤，量取1mL处理后的水样，加入0.1mL高碘酸钠溶液(0.1mol/L)进行氧化反应，反应温度为20℃，反应时间为20min；反应完后加入0.1mL Na2SO3溶液(0.1mol/L)，混匀后在室温下反应20min以除去过量未反应的高碘酸钠。然后再加入1mL 2-吡啶基硫脲(0.200mol/L)进行衍生化反应，在70℃下反应180min；反应完成后定容至3mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为硅胶键合ODS填料，流动相为甲醇-PBS缓冲液(30：70，v/v)；激发波长为240nm，荧光检测波长为333nm；外标法定量。重复检测6次，加标试验结果表明回收率在97-103％之间。
图1示出了2-吡啶基硫脲作为荧光衍生化试剂测定自来水加标(25.0ng/mL)的色谱图，由图1可以看出，该衍生化试剂与目标产物色谱峰对称性好，分离度高，荧光检测器的优越选择性使得谱图中基本无干扰峰出现，保证了定量的准确度与重现性。按基线信号的3倍计算，其检测限可达0.5ng/mL，远低于英国饮用水检查机构(DWI)饮用水限量标准0.1mg/L。
实施例2：
取造纸厂下游水样并高速离心，上清液用0.45μm滤膜过滤，量取1mL处理后的水样，加入0.1mL高碘酸钠溶液(0.1mol/L)进行氧化反应，反应温度为30℃，反应时间为20min；反应完后加入0.1mL Na2SO3溶液(0.15mol/L)，混匀后在室温下反应20min以除去过量未反应的高碘酸钠。然后再加入1mL 5-喹啉基硫脲(0.010mol/L)进行衍生化反应，在70℃下反应240min；反应完成后定容至3mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为硅胶键合ODS填料，流动相为甲醇-PBS缓冲液(45：55，v/v)；荧光激发波长为335nm，荧光发射波长为494nm；外标法定量。重复检测6次，测得水样中3-氯-1,2-丙二醇含量为12.3±0.6μg/kg，加标试验结果表明回收率在97-103％之间。
图2示出了5-喹啉基硫脲作为荧光硫脲衍生化试剂测定造纸厂下游排水口附近水样的色谱图。由图2可以看出，该衍生化试剂得到的目标产物色谱峰对称性好，色谱分离度高，定量准确度高、重现性好。按基线信号的3倍计算，其检测限可达0.3ng/mL，远低于英国饮用水检查机构(DWI)饮用水限量标准0.1mg/L。
实施例3：
将10mL一级大豆油分散于20mL正己烷中，搅拌均匀后，加入6mL0.01g/mL的NaCl溶液，磁力搅拌20min，静置量取下层水相1mL，加入0.1mL高碘酸钠溶液(0.1mol/L)进行氧化反应，反应温度为30℃，反应时间为20min；反应完后加入0.1mL Na2SO3溶液(0.2mol/L)，混匀后在室温下反应20min，加入0.1mL醋酸铅溶液(0.2mol/L)，涡旋振荡混合均匀，5℃静置10min左右，3000rpm/min离心10min，除去过量未反应的高碘酸钠。取上层清液2.2mL，加入1mL腺嘌呤硫脲(0.002mol/L)进行衍生化反应，在80℃下反应180min；反应完成后定容至3mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为氧化锆键合ODS填料，流动相为甲醇-PBS缓冲液(28：72，v/v)；激发波长为236nm，荧光检测波长为405nm；外标法定量。重复检测6次，测得大豆油样中3-氯-1,2-丙二醇含量为15.8±0.2μg/kg，加标试验结果表明回收率在96-102％之间。
图3示出了腺嘌呤硫脲作为荧光硫脲衍生化试剂测定市售一级大豆油的色谱图。由图3可以看出，该衍生化试剂与目标产物色谱峰对称性好，分离度高，定量准确度高、重现性好。按基线信号的3倍计算，换算成大豆油样中3-氯-1,2-丙二醇的检测限可低至0.16ng/mL，远低于目前最严格的英国食品限量标准(≦0.01mg/kg)。
实施例4：
称取0.1g一级大豆油，均匀分散溶解于0.5mL叔丁基甲醚/乙酸乙酯(v/v 8：2)中，加入0.5mL H2SO4/正丙醇(v/v,0.5％)溶液，漩涡混匀后在45℃水浴下超声15min，随后加入1mL 0.5mol/L甲醇钠溶液快速水解3min；水解完成后迅速加入3mL正庚烷和3mL 3.3％的冰醋酸(溶解于0.01g/mL NaCl中)终止反应；充分萃取后除去上层有机相，用3mL正庚烷萃取两次，除去溶液中残留的非极性成分，然后将下层水相pH值调至中性。取下层水相1mL，加入0.1mL高碘酸钠溶液(0.1mol/L)进行氧化反应，反应温度为30℃，反应时间为20min；加入0.1mL醋酸铅溶液(0.2mol/L)，涡旋振荡混合均匀，5℃静置10min左右，3000rpm/min离心10min，除去过量未反应的高碘酸钠。取上层清液2.2mL，加入1.25mL 6-喹喔啉基硫脲(0.008mol/L)进行衍生化反应，在90℃下反应30min；反应完成后定容至3mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为硅胶键合ODS填料，流动相为甲醇-PBS缓冲液(45：55，v/v)；激发波长为318nm，荧光检测波长为367nm；外标法定量。重复检测6次，测得大豆油中游离态与结合态3-氯-1,2-丙二醇的总含量为695.2±9.6μg/kg，加标试验结果表明回收率在96-106％之间。
实施例5：
称取0.1g猪油，均匀分散溶解于0.5mL叔丁基甲醚/乙酸乙酯(v/v 8：2)中，加入0.5mL H2SO4/正丙醇(v/v,0.5％)溶液，漩涡混匀后在45℃水浴下超声15min，随后加入1mL0.5mol/L甲醇钠溶液快速水解3min；水解完成后迅速加入3mL正庚烷和3mL 3.3％的冰醋酸(溶解于0.01g/mL NaCl中)终止反应；充分萃取后除去上层有机相，用3mL正庚烷萃取两次，除去溶液中残留的非极性成分，然后将下层水相pH值调至中性。取下层水相1mL，加入0.1mL高碘酸钠溶液(0.1mol/L)进行氧化反应，反应温度为30℃，反应时间为20min；反应完后加入0.1mL Na2SO3溶液(0.2mol/L)，混匀后在室温下反应20min除去过量未反应的高碘酸钠。然后再加入0.4mL 3-(N-羟乙基)吡啶基硫脲(0.100mol/L)进行衍生化反应，在100℃下反应10min；反应完成后定容至3mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为聚合物键合ODS填料，流动相为甲醇-PBS缓冲液(37：63，v/v)；激发波长为235nm，荧光检测波长为342nm；外标法定量。重复检测6次，测得猪油中游离态与结合态3-氯-1,2-丙二醇的总含量为247.3±9.5μg/kg，加标试验结果表明回收率在97-102％之间。
实施例6：
称取8g配制酱油，用12mL的5mol/L NaCl溶液混合，上样固相萃取柱，先用80mL己烷-乙醚(90：10,v/v)洗脱，然后改用250mL乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂，加水1mL振荡均匀，然后加入0.1mL高碘酸钠溶液(0.1mol/L)进行氧化反应，反应温度为30℃，反应时间为20min；反应完后加入0.1mL Na2SO3溶液(0.2mol/L)，混匀后在室温下反应20min以除去过量未反应的高碘酸钠。然后再加入0.75mL 2-吡啶基硫脲(0.080mol/L)进行衍生化反应，在37℃下反应240min；反应完成后定容至3mL，采用HPLC-FLD方法检测：固定相为氧化钛键合ODS填料，流动相为甲醇-PBS缓冲液(30：70，v/v)；激发波长为240nm，荧光检测波长为333nm；外标法定量。重复测定10次，得到酱油样品中3-氯-1,2-丙二醇含量为123.6±2.4μg/kg，加标试验结果表明回收率在96-102％之间。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (13)

1.荧光硫脲衍生化试剂在3-氯-1,2-丙二醇检测中的应用，
所述荧光硫脲衍生化试剂选自5-喹啉基硫脲、腺嘌呤硫脲、6-喹喔啉基硫脲、3-(N-羟乙基)吡啶基硫脲和2-吡啶基硫脲中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述3-氯-1,2-丙二醇检测的步骤包括：
1)将3-氯-1,2-丙二醇进行裂解，获得氯乙醛；
2)将氯乙醛与荧光硫脲衍生化试剂反应，生成具有荧光效应的目标物质；
3)HPLC-FLD测定：对目标物质进行分离，并根据其色谱峰面积对3-氯-1,2-丙二醇进行定量。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，裂解的步骤包括：
将含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样与过量氧化剂进行氧化反应，反应后除去未反应的氧化剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，
所述氧化反应的温度为5℃-30℃，所述氧化反应的时间为10min-120min。
5.根据权利要求3所述的应用，其中，所述氧化剂为高碘酸钠。
6.根据权利要求3所述的应用，其中，除去未反应的氧化剂的试剂包括亚硫酸盐和/或铅盐。
7.根据权利要求3所述的应用，其中，除去未反应的氧化剂的试剂的添加量为所述氧化剂的1.0～2.0倍。
8.根据权利要求5所述的应用，其中，相对于所述待测水样的体积，高碘酸钠的添加量为10-80％。
9.根据权利要求3所述的应用，其中，待测水样与荧光硫脲衍生化试剂的体积比为0.8-2.5：1。
10.根据权利要求3所述的应用，其中，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样的步骤包括：
将动植物油脂产品分散于萃取剂中，搅拌均匀后，加入NaCl溶液，再经搅拌、静置后取下层水相，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样。
11.根据权利要求3所述的应用，其中，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样的步骤包括：
将非油脂类产品进行固相萃取，获得含有3-氯-1,2-丙二醇的待测水样。
12.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤2)中，
所述反应的温度为37℃-100℃，所述反应的时间为10min-240min；
所述荧光硫脲衍生化试剂化合物的浓度为0.002-0.20mol/L。
13.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤3)中，
HPLC采用反相色谱模式；
固定相包括耐碱性的硅胶ODS、锆基质ODS或聚合物基质ODS填料；
流动相包括pH＝7.0-14.0的甲醇-缓冲液或pH＝7.0-14.0的乙腈-缓冲液，比例为5％：95％-100％：0％；
FLD激发波长为260nm-320nm，检测波长为350nm-470nm。
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