CN103575833B - 一种油脂中游离型及结合型3-氯-1,2-丙二醇检测中的样品预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇检测中的样品预处理方法，称取适量油脂并添加一定体积的极性溶剂，分层后将溶剂相转出，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，残渣用四氢呋喃溶解，分别进行下述处理：（1）游离型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理；（2）结合型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理。本发明能够通过简单的方法对用于检测油脂中游离型及结合型3-氯-1，2-丙二醇的样品进行预处理。
Description
技术领域
本发明涉及油脂样品的预处理方法，尤其涉及用于油脂中游离型及结合型3-氯-1，2-丙二醇（3-MCPD）检测中的样品预处理方法。
背景技术
3-氯-1,2-丙二醇酯（3-MCPDE）是油脂及含油脂食品在热加工过程中形成的副产物，以结合3-MCPD的形式存在于油脂中。由于3-氯-1,2-丙醇酯在特定的条件下可水解形成游离的3-MCPD从而表现其毒性，因此研究学者认为其是一种潜在的食品安全危害因子。油脂中3-MCPDE形成机理及影响因素是目前国内外的研究热点，为了探明这些问题，需要有方便可行的样品预处理方法做支持。
文献报道的检测油脂中游离及结合3-MCPD的方法中，根据所针对的目标化合物的种类，可以大体分为两类：间接法和直接法。间接法是通过将结合3-MCPD通过碱催化、酶催化或酸催化的方法进行醇解后生成游离3-MCPD，再对游离3-MCPD进行衍生化反应后通过GC-MS检测；直接法是将结合3-MCPD通过LC-MS进行分析，而不需进行醇解操作。由于油脂组成中脂肪酸的种类较多，按照植物油中主要的7种脂肪酸来计算，3-MCPDE在甘油骨架sn-1、sn-2位的排列组合的种类就有63种之多，若将其余种类的脂肪酸也统计进来，3-MCPDE的种类将更加繁多。直接测定方法的主要缺陷就在于可商品化供应的3-氯丙醇酯及相应的氘代3-氯丙醇酯的种类有限，无法从市场上购买到不同碳数脂肪酸组成的3-氯丙醇酯及相应的氘代3-氯丙醇酯化合物标准品，要想对油脂样品中的3-氯丙醇酯用3-氯丙醇酯及相应的氘代3-氯丙醇酯化合物标准品进行一一的对应非常困难。因此，目前研究学者多数采用间接法对游离及结合3-MCPD进行检测。
众所周知，油脂是一种混合物，主要成分为甘油三酯，此外还含有游离脂肪酸、磷脂、色素、VE、甘油一酯、甘油二酯等组分，为了准确测定油脂中游离及结合3-MCPD的含量，需要采取相应的措施去除这些组分对测定的干扰。目前文献报道的用于检测油脂中游离及结合3-MCPD的样品预处理方法主要采用硅胶柱层析和固相萃取柱萃取两类。
Zelinková采用硅胶柱层析的方法对乳脂样品进行前处理（Haines,T.D.,etal.,Direct Determination of MCPD Fatty Acid Esters and Glycidyl Fatty Acid Estersin Vegetable Oils by LC-TOFMS.Journal of the American Oil Chemists Society,2011.88(1):1-14.），具体步骤为：在200mg乳脂中加入7.26μg氘代3-氯丙醇二棕榈酸酯（3-MCPD-d5-1，2-dipalmitate）内标物，用1mL正己烷溶解后上样到330×20mm硅胶柱（silica gel60,70-230mesh;Merck,Darmstadt,Germany），用石油醚（沸点45～65℃）:乙醚=95:5（v/v）混合溶剂500mL以4mL/min的速率洗脱，收集含有3-氯丙醇酯的组分，旋蒸后，用200μL四氢呋喃溶解，准备进行GC-MS分析。Moravcova也采用了硅胶柱层析的方法从油脂样品中分离3-氯丙醇二酯（Moravcova,E.,et al.,Novel approaches to analysis of3-chloropropane-1,2-diol esters in vegetable oils.Anal Bianal Chem,2012.402(9):2871-83.），操作步骤为：称量8±0.1mg油样于2mL小瓶中，用30μL氘代内标溶液（3-MCPD-d5-1，2-dipalmitate的乙酸乙酯溶液，浓度300ng/mL）溶解，然后上样到装填了1.8g硅胶（用正己烷:乙醚=96:4，v/v混合溶剂溶胀）的180×4mm玻璃柱，用30mL正己烷:乙醚=96:4，v/v混合溶剂洗脱，流速0.8mL/min，收集5～25mL的部分（含有3-氯丙醇二酯），旋转蒸发溶剂，用200μL甲醇重新溶解准备进行U-HPLC-MS和DART-MS分析。硅胶柱层析方法的不足之处是整个预处理的周期较长，耗用溶剂量较大（有的甚至大于500mL），且柱子的装填效果直接影响样品预处理的效果，样品预处理结果的再现性受到很大影响。
Moravcova采用了固相萃取柱萃取的方法从油脂样品中分离3-氯丙醇单酯（Moravcova,E.,et al.,Novel approaches to analysis of3-chloropropane-1,2-diolesters in vegetable oils.Anal Bianal Chem,2012.402(9):2871-83.），详细过程如下：称量100±1mg油样于2mL小瓶中，用50μL正己烷和60μL同位素标记的标准溶液（3-MCPD-d5-monopalmitate的乙酸乙酯溶液，浓度60ng/mL）溶解，上样到已用2×2mL正己烷活化好的固相萃取柱（aminopropyl SPE cartridge,500mg）上，真空条件下，先用8mL正己烷:二氯甲烷:乙醚=89:10:1（v/v/v）混合溶剂洗脱并弃去，接着用2mL正己烷:乙酸乙酯=85:15（v/v）混合溶剂洗脱并弃去，最后用10mL正己烷:乙酸乙酯=85:15（v/v）混合溶剂洗脱并收集，旋转蒸发，用250μL甲醇重新溶解准备进行分析。此外，Hori也利用固相萃取柱对油脂样品进行了前处理（Hori,K.,et al.,Simultaneous determination of3-MCPDfatty acid esters and glycidol fatty acid esters in edible oils using liquid chromatographytime-of-flight mass spectrometry.LWT-Food Science and Technology,2012.48(2):204-208.），过程如下：准确称量10mg油样于螺旋盖玻璃管中，加入2mL乙腈的正己烷饱和溶液、2mL正己烷的乙腈饱和溶液及20mL内标溶液，混合溶液振摇1min，于3500×g条件下离心10min，正己烷相上样到用4mL正己烷平衡好的固相萃取柱（Sep-Pak Plus SI cartridges，500mg），用4mL氯仿洗脱并收集；乙腈相上样到用1mL甲醇、2mL乙腈平衡好的固相萃取柱（Sep-Pak Plus C18cartridges，500mg），先后用2mL乙腈和2mL乙酸乙酯洗脱并收集，收集的正己烷相和乙腈相混合，并用氮气吹干，用1mL乙腈溶解，准备进行LC/TOF-MS分析。固相萃取柱萃取方法的不足之处是固相萃取柱的价格较高，使得样品预处理的成本增加，同时其对活化和洗脱过程中的流速有较高的要求，加上萃取柱本身易被污染，从而提高了对整个预处理过程的操作要求，操作过程中稍有不慎就会导致样品预处理的结果不理想。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有油脂中游离型及结合型3-氯-1，2-丙二醇检测中的样品预处理方法及应用中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是克服现有技术中的缺点，提供了一种操作简单、预处理成本低、适用性好的用于检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇的样品预处理方法，在食品、医药、环境等许多分析领域有着较高的应用价值。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种油脂中游离型及结合型3-氯-1,2-丙二醇检测中的样品预处理方法，称取适量油脂并添加一定体积的极性溶剂，分层后将溶剂相转出，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，残渣用四氢呋喃溶解，分别进行下述处理：
（1）游离型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理：
移取一定体积的上述四氢呋喃溶液，添加适量氘3-氯-1，2-丙二醇内标，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，残渣用适量超纯水溶解，添加适量正己烷，充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理；
（2）结合型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理：
移取一定体积的上述四氢呋喃溶液，添加适量硫酸甲醇混合液，加热一定时间后室温冷却，加适量饱和碳酸氢钠溶液中和，充分混匀，添加适量氘3-氯-1，2-丙二醇内标，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，残渣用适量超纯水溶解，添加适量正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理。
作为本发明所述预处理方法的一种优选方案，其中：所述的极性溶剂为乙腈。
作为本发明所述预处理方法的一种优选方案，其中：所述称取适量油脂并添加一定体积的极性溶剂，其油脂与极性溶剂的体积比为0.2:1～0.7:1。
作为本发明所述预处理方法的一种优选方案，其中：所述分层为高速离心分离或静置分层。
作为本发明所述预处理方法的一种优选方案，其中：所述游离型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理中，待分层后将正己烷相弃去后，再次添加适量正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理。
作为本发明所述预处理方法的一种优选方案，其中：所述结合型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理中，待分层后将正己烷相弃去后，再次添加适量正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理。
作为本发明所述预处理方法的一种优选方案，其中：所述添加适量硫酸甲醇混合液，其为98%浓度的硫酸与甲醇体积比1:100～1.8:100的混合液。
作为本发明所述预处理方法的一种优选方案，其中：所述加热一定时间，为30℃～50℃水浴加热16～24h。
与现有技术相比，本发明的优点在于：能够通过简单的方法对用于检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇的样品进行预处理。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
用于油脂中游离型及结合型3-氯-1,2-丙二醇检测中的样品预处理方法：
量取15mL油（准确称量其质量为13.68g）于50mL螺旋盖玻璃试管中，添加25mL乙腈，旋涡振荡，充分混匀1～3min→静置分层约1小时，用一次性吸管将上层乙腈相移入25mL量筒中，读取乙腈相的体积数并准确记录，然后将量筒中的乙腈相移入100mL圆底烧瓶中，并用适量乙腈（约3mL）清洗量筒，清洗用的乙腈并入100mL圆底烧瓶中，于55℃，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2.5mL四氢呋喃（THF）溶解，并移入5mL螺旋盖样品瓶中，用封口膜封口，4℃冰箱冷藏备用。
（1）游离型的3-氯-1,2-丙二醇测定的进一步处理：
移取1mL上述四氢呋喃溶液添加1mL内标3-MCPD-d5（浓度0.001mg/mL）移入25mL圆底烧瓶中，于55℃，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2mL超纯水重溶，用一次性吸管将水相移入10mL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。
（2）结合型的3-氯-1,2-丙二醇测定的进一步处理：
移取1mL上述四氢呋喃溶液添加1.8mL硫酸液（98%浓度，1.8mL溶在100mL甲醇中）移入10mL螺旋盖玻璃试管中，然后密闭，40℃水浴加热16h，室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液（5%浓度）中和，振荡混匀，加1mL内标3-MCPD-d5（浓度0.001mg/mL），将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF（约2mL）清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55℃，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2mL超纯水重溶，用一次性吸管将水相移入10mL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。
实施例2
另一种用于油脂中游离型及结合型3-氯-1,2-丙二醇检测中的样品预处理方法：
量取5mL油（准确称量其质量为4.56g）于50mL螺旋盖玻璃试管中，添加25mL乙腈，旋涡振荡，充分混匀1～3min，于10000转/分离心分离5分钟，用一次性吸管将上层乙腈相移入25mL量筒中，读取乙腈相的体积数并准确记录，然后将量筒中的乙腈相移入100mL圆底烧瓶中，并用适量乙腈（约3mL）清洗量筒，清洗用的乙腈并入100mL圆底烧瓶中，于55℃，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2.5mL四氢呋喃（THF）溶解，并移入5mL螺旋盖样品瓶中，用封口膜封口，4℃冰箱冷藏备用。
（1）游离型的3-氯-1,2-丙二醇测定的进一步处理：
移取1mL上述四氢呋喃溶液添加1mL内标3-MCPD-d5（浓度0.001mg/mL）移入25mL圆底烧瓶中，于55℃，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2mL超纯水重溶，用一次性吸管将水相移入10mL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，于10000转/分离心分离5分钟，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，于10000转/分离心分离5分钟，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。
（2）结合型3-氯-1,2-丙二醇测定的进一步处理：
移取1mL上述四氢呋喃溶液添加2.5mL硫酸液（98%浓度，1mL溶在100mL甲醇中）移入10mL螺旋盖玻璃试管中，然后密闭，40℃水浴加热24h，室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液（5%浓度）中和，振荡混匀，加1mL内标3-MCPD-d5（浓度0.001mg/mL），将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF（约2mL）清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55℃，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2mL超纯水重溶，用一次性吸管将水相移入10mL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，于10000转/分离心分离5分钟，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀1～3min，于10000转/分离心分离5分钟，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。
本发明方法以极性有机溶剂提取油脂中的强极性和弱极性组分，挥干溶剂后的残渣用四氢呋喃重溶，并用超纯水提取游离3-MCPD，而结合3-MCPD则通过硫酸催化醇解后生成游离3-MCPD，通过此过程进行样品预处理后可进行进一步的衍生化处理，用GC-MS检测油脂中游离及结合3-氯-1,2-丙二醇的含量，其中，极性溶剂为乙腈，油脂与极性溶剂的体积比为0.2:1～0.7:1。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种油脂中游离型及结合型3-氯-1,2-丙二醇检测中的样品预处理方法，其特征在于，
称取适量油脂并添加一定体积的极性溶剂，分层后将溶剂相转出，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，残渣用四氢呋喃溶解，分别进行下述处理：
(1)游离型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理：
移取一定体积的上述四氢呋喃溶液，添加适量氘3-氯-1，2-丙二醇内标，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，残渣用适量超纯水溶解，添加适量正己烷，充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理；
(2)结合型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理：
移取一定体积的上述四氢呋喃溶液，添加适量硫酸甲醇混合液，加热一定时间后室温冷却，加适量饱和碳酸氢钠溶液中和，充分混匀，添加适量氘3-氯-1，2-丙二醇内标，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，残渣用适量超纯水溶解，添加适量正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理；
其中，
所述称取适量油脂并添加一定体积的极性溶剂，其油脂与极性溶剂的体积比为0.2:1～0.7:1；
所述添加适量硫酸甲醇混合液，其为98％浓度的硫酸与甲醇体积比1:100～1.8:100的混合液；
所述的极性溶剂为乙腈。
2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述分层为高速离心分离或静置分层。
3.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述游离型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理中，待分层后将正己烷相弃去后，再次添加适量正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理。
4.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述结合型的3-氯-1，2-丙二醇测定的进一步处理中，待分层后将正己烷相弃去后，再次添加适量正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续GC-MS分析的衍生化处理。
5.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述加热一定时间，为30℃～50℃水浴加热16～24h。
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