JP4942380B2 - カルボン酸のアルキルエステル化方法及びキット - Google Patents
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Description
Ken'ichi Ichihara, Chiaki Yamaguchi, Hiroaki Nishijima, Kazumi Saito (2003) Preparation of fatty acid methyl esters from sterol esters. Journal of The American Oil Chemists' Society 80, 833-834.
項1. 有機酸を含む試料と炭素数1〜4の低級アルコールと炭素数1〜4のアルコキシドとを反応させることにより、有機酸をアルキルエステル化する第1工程と、
三フッ化ホウ素の存在下で、第1工程の反応混合物と炭素数1〜4の低級アルコールとを反応させることにより、遊離有機酸をアルキルエステル化する第2工程と
を含む有機酸のアルキルエステル化方法。
項2. 第1工程及び第2工程で使用する炭素数1〜4の低級アルコールがメタノールであり、炭素数1〜4のアルコキシドがメトキシドである項1に記載の方法。
項3. 第1工程の反応を、20〜60℃で行う項1又は2に記載の方法。
項4. 第1工程における炭素数1〜4のアルコキシドの使用量を、反応液中の最終濃度が0.05〜2Mとなるようにする項1〜3のいずれかに記載の方法。
項5. 第2工程の反応を、25〜65℃で行う項1〜4のいずれかに記載の方法。
項6. 第2工程における三フッ化ホウ素の使用量を、反応液の全量に対して5〜15重量%とする項1〜5のいずれかに記載の方法
項7. 第1工程において、疎水性有機溶媒の存在下で有機酸を含む試料と炭素数1〜4の低級アルコールと炭素数1〜4のアルコキシドとを反応させるか、又は第1工程に先立ち、有機酸を含む試料を疎水性有機溶媒で溶解する予備工程を含み、予備工程の反応混合物を第1工程における有機酸を含む試料とする項1〜6のいずれかに記載の方法。
項8. 疎水性有機溶媒としてプロピオン酸メチル又はトルエンを用いる項1〜7のいずれかに記載の方法。
項9. 炭素数1〜4の低級アルコール、炭素数1〜4のアルコキシド、及び三フッ化ホウ素を備える有機酸のアルキルエステル化用キット。
項10. さらに、疎水性有機溶媒を備える項9に記載のキット。
項11. 疎水性有機溶媒が、プロピオン酸メチル又はトルエンである項10に記載のキット。
(I)有機酸のアルキルエステル化方法
本発明の有機酸のアルキルエステル化方法は、脂質を含む試料と炭素数1〜4の低級アルコールと炭素数1〜4のアルコキシドとを反応させることにより、試料中に含まれる有機酸をアルキルエステル化する第1工程と、
三フッ化ホウ素の存在下で、第1工程の反応混合物と炭素数1〜4の低級アルコールとを反応させることにより、遊離有機酸をアルキルエステル化する第2工程とを含む方法である。
試料
本発明の対象となる試料の種類は特に限定されない。例えば、微生物、細胞、血液、動物や植物の組織、食品及びその原料などが挙げられる。微生物、細胞、動植物の組織は、そのまま本発明方法に供することができ、その全有機酸をアルキルエステル化することができる。このようにして得られた有機酸のアルキルエステルをガスクロマトグラフィー等で分析することにより、微生物や細胞の性質を定めたり、分類したりすることができる。また、血液又は血清は、好ましくは乾固して本発明方法に供することができ、その有機酸組成を分析することにより、健康状態のチェックや疾患の診断を行える。また、食品及びその原料はそのまま、又は液状食品は乾固して本発明方法に供することができる。
第1工程
第1工程では、脂質を含む試料と、炭素数1〜4の低級アルコールと、炭素数1〜4のアルコキシドとを混合することにより、試料と上記アルコールと上記アルコキシドとを反応させて、試料中の脂質などに含まれるエステル型の有機酸を上記アルコールと上記アルコキシドに相当するアルキルエステルに変換する。
第2工程
第2工程では、三フッ化ホウ素の存在下で、第1工程の反応生成物と炭素数1〜4の低級アルコールとを反応させることにより、遊離有機酸をアルキルエステル化する。脂質中に最初から含まれる遊離有機酸であって第1工程ではアルキル化されなかったもの、及び第1工程のエステル交換反応で副成した遊離有機酸を、第2工程でアルキルエステル化することができる。
反応は、通常、25〜65℃程度の温度で、2〜60分間程度行えばよい。好ましくは、35〜50℃程度の温度で、5〜30分間程度行えばよい。さらにより好ましくは、35〜45℃程度の温度で、10〜30分間程度行えばよい。上記温度及び時間であれば、十分に遊離有機酸をアルキルエステル化することができる。
脂質の溶解
上記第1工程において、又は上記第1工程に先立ち、試料中の脂質を疎水性溶媒を用いて溶解する予備工程を行うことが好ましい。
アルキル基
アルキルエステル化された有機酸を分析に供するには、本発明方法の産物である有機酸エステルのアルキル基の種類を統一する必要がある。 従って、第1工程で使用する低級アルコールと、第1工程で使用するアルコキシドと、第2工程で使用する低級アルコールの炭素数は統一する。
炭素数が14以上の比較的長鎖の脂肪酸のような分子量の大きい有機酸を分析対象にする場合は、最も短鎖のアルコールであるメタノール及びメトキシドを用いて、有機酸のアルキルエステルの揮発性を高め、溶出時間を早くするのが好ましい。
有機酸アルキルエステルの抽出
本発明方法では、さらに、第2工程の反応生成物をヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、tert.-ブチルメチルエーテルのようなエーテルなどの有機溶媒で抽出してもよい。さらに、この有機溶媒層を水で洗浄し、再度有機溶媒層を回収してもよい。通常は、このようにして回収された有機溶媒層をガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等による分析に供する。
(II)有機酸アルキルエステル化用キット
本発明の有機酸アルキルエステル化用キットは、炭素数1〜4の低級アルコール、炭素数1〜4のアルコキシド、及び三フッ化ホウ素を備える。さらに、疎水性の高い有機溶媒を備えていてもよい。これらの試薬については、前述した通りである。
実施例
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例1(醸造酵母の細胞内有機酸の分析)
<試料>
脂質を含む試料として、月桂冠株式会社の保有菌株である、清酒酵母OSI-1103株(きょうかい701号酵母から一倍体株として分離)と、きょうかい701号酵母の変異処理により得たセルレニン耐性変異株である7-C-8株(FERM P-8452)との2株を用いた。7-C-8株は、脂肪酸合成阻害剤であるセルレニンに耐性を獲得した変異株であり、カプロン酸エチルを高生産し、その前駆体であるカプロン酸も親株OSI-1103の約10倍生産する。
<メチル化>
凍結乾燥酵母100mgとプロピオン酸メチル0.5mlとを混合し、室温で5分間vortexにて攪拌した。この混合物に1M CH3ONa/メタノール0.5mlを添加して、vortexで 1分間攪拌した後、37℃にて1時間反応させた。この混合物に、30重量%の三フッ化ホウ素/メタノール500μlを添加してvortexにて1分間攪拌した後、37℃にて20分間反応させた。
反応混合物にヘキサン1mlを添加し、vortexにて1分間攪拌した後、3000rpmで3分間遠心分離してヘキサン層を分取し、水1mlで洗浄し、3000rpmで3分間遠心分離してヘキサン層約1mlを得た。
<GC-MS分析>
ヘキサン層2mlをシリカカートリッジ(Cartridges for SPE, Silica Gel, 3 ml, 200 mg; SILYCYCLE社(カナダ))に注入し、ヘキサン5mlで洗浄し、酢酸メチル/ヘキサン(容量比1.5/98.5)6mlで溶出させることにより、脂肪酸メチルを精製した。分析条件を以下に示す。
GC-MS分析(SCANおよびSIM)
機器 :6890 GC/5973i MSD (Agilent)
カラム :SP-2380 (30m×0.25mm ID,0.20μm film)
カラムオーブン:50℃で2 分間保った後、4℃/分で250℃まで昇温し、250℃で15分間保つ
検出 :MSD, 230℃
キャリアガス :He, 1.0 ml/分
注入 :2.0 μl, Split-less, 250℃
GC-MS分析の結果を図1に示す。7-C-8株では、OSI-1103株では検出されない炭素数6の低級脂肪酸に由来するピークが検出された。7-C-8株は、生成する脂肪酸の鎖長が短くなることにより香気成分の生成量が多くなることが知られているが、このことが本発明方法により実証された。本発明の方法では、37℃という低温で反応させるため、揮発し易い低級脂肪酸をも正確に検出できることが分かる。
実施例2(試料量の検討)
脂質を含む試料として、月桂冠株式会社の保有菌株である、清酒酵母OSI-1103株を用いた。この株をYPD10培地を用いて30℃で48時間静置培養し、定常期まで培養した。このようにして培養した酵母を、蒸留水で2回洗浄し、一晩凍結乾燥することにより乾燥酵母とした。
<メチル化>
凍結乾燥酵母10mg、50mg、100mgとプロピオン酸メチル0.5mlとを混合し、室温で5分間vortexにて攪拌した。この混合物に1M CH3ONa /メタノール0.5mlを添加して、vortexで30秒間攪拌した後、37℃にて1時間反応させた。この混合物に、30重量%の三フッ化ホウ素/メタノール500μlを添加してvortexにて30秒間攪拌した後、37℃にて20分間反応させた。
<GC-MS分析>
シリカカートリッジによる精製は実施例1と同様にして行った。分析条件は以下の通りである。
キャピラリーGC分析
機器 :Shimadzu GC-17A
カラム :SP-2380(30m×0.25mm ID,0.20μm film)
カラムオーブン:50℃で2分間, 10℃/分間で250℃まで昇温し、250℃で8分間保つ
検出 :FID, 260℃
キャリアガス :He, 1.0 ml/分
注入 :2.0μl, Split-less, 250℃
酵母菌体の使用量と合計脂肪酸濃度との関係を図2に示す。図2から、本発明方法は、定量性が良好であることが分かる。
実施例3(GC-FIDによる測定)
実施例1において、試料として清酒酵母OSI-1103株を用い、凍結乾燥酵母の使用量を50mgとし、GC-MSに代えてGC-FIDを用いた他は、実施例1と同様の操作を行った。
実施例4(メチル化反応温度の検討)
実施例3で用いた直鎖偶数炭素鎖脂肪酸キットEC10A-1KT(SUPELCO)を試料として、実施例1と同様の操作で脂肪酸をメチル化した。但し、反応温度は37℃、及び100℃の2通りとした。また、反応に供した脂肪酸量は、各脂肪酸濃度100ppmの脂肪酸混合液を100μlとした。
メチル化された試料を以下の条件でGC-MS分析した。
GC-MS分析条件(SCANおよびSIM)
機器 :6890 GC/5973i MSD (Agilent)
カラム :SP-2380 (30m×0.25mm ID,0.20μm film)
カラムオーブン:50℃で2 分間保った後、4℃/分で250℃まで昇温し、250℃で15分間保つ
検出 :MSD, 230℃
キャリアガス :He, 1.0 ml/分
注入 :2.0 μl, Split-less, 250℃
結果を以下の表1に示す。
実施例5(大腸菌の脂肪酸組成の測定)
<試料大腸菌>
摺り合わせ小試験管φ12.5 mm×165 mm に、大腸菌K-12株の対数増殖期の培養液を取り、遠心分離して沈殿させた大腸菌ペレットを1〜2時間減圧デシケータで乾燥させた。乾燥重量約 20 mgの大腸菌を試料として用いた。
<メチル化>
メチル化試薬として以下の試薬を準備または調製した。
(1)1 M CH3ONa/メタノール
(2)プロピオン酸メチル
(3)30重量% 三フッ化ホウ素/メタノール
(4)ヘキサン
精製用試薬として以下の試薬を準備または調製した。
(5)シリカゲルカラム Silicycle
(6)ヘキサン
(7)1.5容量% 酢酸メチル/ヘキサン
上記乾燥試料に、プロピオン酸メチル 0.5 ml を加えた。次いで、CH3ONa/メタノール試薬 0.5 ml を加えた。反応液中のCH3ONa濃度は0.5Mである。この混合液を37℃で1時間放置し、グリセロ脂質とステロールエステルの脂肪酸をメチル化した。
GC分析
このようにして得た試料を少量のヘキサンに溶解し、以下の条件でGC分析を行った。
機器:Shimadzu GC-2014
カラム:SPELCOWAX 10 (30 m×0.53 mm×1μm)
カラム温度:185℃
検出器:FID
キャリアガス:窒素、4.8 ml/分
注入:1μl, split-less, 260℃
不安定なシクロプロパン脂肪酸と、熱に安定なパルミチン酸(C16:0)との比率について検討すると、以下の通りであった。
シクロプロパン環を持った炭素数17の脂肪酸/パルミチン酸=0.64
シクロプロパン環を持った炭素数19の脂肪酸/パルミチン酸=0.15
比較例1
実施例5と同様の大腸菌試料を用いて、以下の塩化水素−メタノール法で脂肪酸をメチル化し、実施例5と同様にしてGC分析した。
<メチル化>
メチル化試薬として以下の試薬を準備または調製した。
(1)5重量% 塩化水素/メタノール
(2)ヘキサン
精製用試薬として以下の試薬を準備または調製した。
(5)シリカゲルカラム Silicycle
(6)ヘキサン
(7)1.5容量% 酢酸メチル/ヘキサン
乾燥試料を耐圧ネジ口小試験管(φ16.5 mm×105 mm)にとり、5重量%塩化水素/メタノール試薬 1 ml を加え、100℃で1時間加熱し、大腸菌脂質の脂肪酸をメチル化した。
次いで、ヘキサン 1 ml を加えて、ボルテックスで混合し、遠心して2層に分離した後、上層のヘキサン層を別の試験管に取った。採取したヘキサン層に水 1 ml を加えて撹拌、洗浄し、ヘキサン層(上層)を別の小試験管に取った。
GC 分析にキャピラリーカラムを使用するため、実施例5と同様にして、即ち以下のようにして脂肪酸メチルを精製した。ヘキサン層をシリカゲルカートリッジ(Cartridges for SPE, Silica Gel, 3 ml, 200 mg; SILYCYCLE社(カナダ))に注入し、1.5容量%酢酸メチル/ヘキサン混合液 3 ml で脂肪酸メチルを溶出させた。1.5容量%酢酸メチル/ヘキサン溶出液を摺り合わせ試験管にとってロータリーエバポレータで濃縮し、GC カラムに注入した。
シクロプロパン環を持った炭素数17の脂肪酸/パルミチン酸=0.19
シクロプロパン環を持った炭素数19の脂肪酸/パルミチン酸=0.04
実施例5と比較例1との比較から、本発明方法では、不安定な脂肪酸が分解されることなく、その回収率が高いことが分かる。
実施例6(血液の脂肪酸組成の測定)
<試料>
実施例5において、大腸菌試料に代えて、ヒト血液 0.04mlを BHT 処理濾紙に着点吸収させ、減圧デシケータで 30分乾燥したものを用いた。
<メチル化>
脂肪酸のメチル化は、実施例5と同様にして行った。
<GC分析>
このようにして得た試料を少量のヘキサンに溶解し、以下の条件でGC分析を行った。
機器:Shimadzu GC-8A
カラム:10% SP-2340 on Chromosorb WAW (2 m×3 mm ガラスカラム)
カラム温度:175℃〜240℃、昇温3℃/分
検出器:FID
キャリアガス:窒素、30 ml/分
注入:1μl, 260℃
得られた脂肪酸組成は以下の通りである。
脂肪酸 組成(%)
C16:0 29.0
C18:0 11.7
C18:1 24.7
C18:2 15.2
C18:3 0.7
C20:4 5.1
C20:5 1.7
C22:6 2.7
未同定 9.2
GC分析のクロマトグラフィーチャートを図4に示す。
実施例6と同じヒト血液試料を用い、加熱ケン化−メチル化法で脂肪酸をメチル化し、さらに実施例6と同じ条件でGC分析を行った。
<抽出とケン化>
血液1 mlからクロロホルム 1 mlとメタノール2 mlの混合溶媒を用いて脂質を抽出し、水0.5 mlとクロロホルム2 mlを加えて撹拌、静置してクロロホルム層を摺り合わせ試験管に取った。水0.5 mlとメタノール0.5 mlの混合液で洗浄後、濃縮乾固し、血液脂質を調製した。この血液脂質全量に2 M KOH水性エタノール溶液2 mlを加えて2時間還流加熱した。2 M HClで酸性とし、ジエチルエーテル2 mlで脂肪酸を抽出した。水洗後、濃縮乾固した。
<メチル化>
得られた脂肪酸に、10重量% 三フッ化ホウ素/メタノール2 ml を加え、60℃で20分加熱し、メチル化した。ジエチルエーテルで抽出後、水洗、濃縮した。ヘキサンに溶解し、GC カラムに注入した。
実施例7(各鎖長の脂肪酸のメチル化)
実施例3で用いた直鎖偶数炭素鎖脂肪酸キットEC10A-1KIT(SUPELCO)から、カプリル酸(オクタン酸)(C8:0), カプリン酸(デカン酸)(C10:0),ミリスチン酸(C14:0), パルミチン酸(C16:0), ステアリン酸 (C18:0),炭素数20の飽和脂肪酸(C20:0)と、炭素数11の飽和脂肪酸(C11:0),炭素数21の飽和脂肪酸(C21:0)を試料として用いた。反応に供した脂肪酸量は、各脂肪酸最終濃度500ppmの脂肪酸混合液20μlを試料として用いた。
シリカゲルカートリッジ精製は、次のようにして行った。まずシリカゲルカートリッジに前洗浄液としてヘキサンを3ml注入して流し、洗浄した。次にメチル化をしたサンプルの溶液のうち約1mlをシリカゲルカートリッジに注入し、脂肪酸メチルを吸着させた。これにヘキサンを3ml注入して流し、洗浄した。次に溶出液(酢酸メチル/ヘキサン混合液)3mlを注入し、脂肪酸メチルをカートリッジから溶出させてGC/MSに供した。
機器 :6890 GC/5973i MSD (Agilent)
カラム :SP-2380(30m×0.25mm×0.20μm)
カラムオーブン:50℃で2分間保った後、 10℃/分で250℃まで昇温させ、250℃で8分間保つ
検出 :MSD, 230℃
キャリアガス :He, 1.0 ml/分
注入 :2.0 μl, Split-less, 250℃
各脂肪酸の回収率を図6に示す。図6から、C8とC10では回収率が40%から50%と低く、C14からC20では回収率が70%前後と、高かったことがわかる。また、図7に示すように、酵母は奇数鎖脂肪酸をほとんど含まないながらも、C15、C17の脂肪酸は多少含んでおり、C11とC21の脂肪酸は全く含んでいないことが分かる。そのため、酵母の脂肪酸組成を分析する場合は、短鎖脂肪酸ではC11、長鎖脂肪酸ではC21をIS(内部標準)として用いて脂肪酸量を計算するのが妥当であると言える。
実施例8(シリカゲルカートリッジへの吸着)
試料として、凍結乾燥酵母10mg(OSI-1103株)を用いた。これらの酵母は、YPD10培地にて30℃、48時間、静置培養したものを用いた。
反応混合物にヘキサン1mlを添加し、vortexにて1分間攪拌した後、3000rpmで3分間遠心分離してヘキサン層を分取し、水1mlで洗浄し、3000rpmで3分間遠心分離してヘキサン層約1mlを得た。
キャピラリーGC分析
機器 :Shimadzu GC-17A
カラム :SP-2380(30m×0.25mm×0.20μm)
カラムオーブン:50℃で2分間保った後、10℃/分間で250℃まで昇温度し, 250℃で8分間保つ
検出 :FID, 260℃
キャリアガス :He, 1.0 ml/分
注入 :2.0 μl, Split-less, 250℃
シリカカートリッジへの脂肪酸メチルの吸着を表2に示す。
実施例9(トルエンとメタノールの混合溶媒を用いたステロールエステルとトリアシルグリセロールの脂肪酸メチルエステル化)
標準脂質としてトリアシルグリセロール(ダイズ油)とステロールエステル(コレステリルオレエート)を用いて、メタノールでは溶けにくいこれら疎水性の強い脂質に対するトルエン系の反応溶媒の効果を検討した。
<脂質試料>
摺り合わせ小試験管φ12.5 mm×165 mm に、ステロールエステルとしてコレステロールオレエート、トリアシルグリセロールとして大豆油をそれぞれ1mg取った。
(1)0.5 M CH3ONa/メタノール-トルエン(体積比は後述する)
(2)30重量% 三フッ化ホウ素/メタノール
(3)ヘキサン
精製用試薬として以下の試薬を準備又は調製した。
(4)シリカゲルカラム Silicycle 200 mg
(5)ヘキサン
(6)1.5容量% 酢酸メチル/ヘキサン
上記の脂質試料に、0.50 M CH3ONa のメタノール-トルエン溶液 1 ml を加え、37℃で1時間放置し、ステロールエステルとトリアシルグリセロールの脂肪酸をメチル化した。このとき、メタノールとトルエンの割合は600μl:400μl, 700μl:300μl, 800μl:200μl, 900μl:100μl, 950μl:50μl, 990μl:10μlとした。
・シリカゲルプレート:シリカゲル60(メルク(ドイツ))
・展開溶媒:ヘキサン/tert.-ブチルメチルエーテル/酢酸=85:15:0.5(体積比)
・検出:50重量%硫酸噴霧後、135℃、10分加熱発色。
実施例10(反応液のトルエンが脂肪酸メチルのカラム精製に及ぼす影響の検討)
実施例9で得られた反応液のうちトルエン400μl〜100μlを含んでいた試料を、シリカゲルカートリッジ(Cartridges for SPE, Silica Gel, 3 ml, 200 mg; SILYCYCLE社(カナダ))にアプライした後、ヘキサン3ml、次いで1.5容量%酢酸メチル/ヘキサン3mlで溶出した。得られたヘキサン溶出液と1.5容量%酢酸メチル/ヘキサン溶出液を濃縮後、シリカゲル薄層クロマトグラフィで分析した。シリカゲル薄層クロマトグラフィの分析条件は実施例9と同様である。
実施例11(大腸菌の脂肪酸組成の測定-トルエンとメタノールの混合溶媒を用いた脂肪酸のメチルエステル化)
実施例5では、乾燥大腸菌の脂質脂肪酸をCH3ONa/メタノール/プロピオン酸メチルによってメチルエステル化したが、本実施例では、CH3ONa/メタノール/トルエンを用いてメチルエステル化を行った。
<試料大腸菌>
摺り合わせ小試験管φ12.5 mm×165 mm に大腸菌K-12株の対数増殖期の培養液を取り、遠心で沈殿させた大腸菌ペレット約 20 mg を1〜2時間減圧デシケータで乾燥させた。
(1)0.5 M CH3ONa/メタノール-トルエン(3:1、体積比)
(2)30重量% 三フッ化ホウ素/メタノール
(3)ヘキサン
精製用試薬として以下の試薬を準備又は調製した。
(4)シリカゲルカラム Silicycle 200 mg
(5)ヘキサン
(6)1.5容量% 酢酸メチル/ヘキサン
乾燥試料を摺り合わせ小試験管(φ12.5 mm×165 mm)にとり、0.50 M CH3ONa のメタノール-トルエン(3:1、体積比)溶液 1 ml を加え、37℃で1時間放置し、 グリセロ脂質とステロールエステルの脂肪酸をメチル化した。
GC分析
GC分析条件は、実施例5と同様とした。得られた脂肪酸組成も実施例5と同様であった。
試料としてヒト血液0.04をBHT処理濾紙に着点吸収させ、減圧デシケータで30分間乾燥したものを用いた。
GC分析
GC分析は、カラム温度が215℃であることを除いて実施例5と同じ条件で行った。そのGC分析の結果を図10に示す。
試料として、脂肪酸標準溶液である直鎖偶数炭素鎖脂肪酸キットEC10A-1KIT(SUPELCO)から、カプリン酸(デカン酸)(C10:0),ミリスチン酸(C14:0),パルミチン酸(C16:0), ステアリン酸 (C18:0),炭素数20の飽和脂肪酸(C20:0)と、炭素数11の飽和脂肪酸(C11:0),炭素数21の飽和脂肪酸(C21:0)を試料として用いた。各脂肪酸量が100μgづつになるようにこれらの脂肪酸を混合した。
GC-FID分析
機器 :Shimadzu GC-17A
カラム :SP-2380(30m×0.25mm ID, 0.20μm film)
カラムオーブン:50℃で2分間保ち、10℃/分間の速度で250℃まで昇温し、250℃で8分間保つ
検出 :FID, 260℃
キャリアガス :He, 1.0 ml/分
注入 :1.0 μl, Split-less, 250℃
各脂肪酸のメチル化率を図12に示す。偶数炭素数の脂肪酸と奇数炭素数の脂肪酸とでメチル化率がほぼ同じであった。このことから、一つの内部標準を使用するだけで補正できることが分かる。
実施例14(シリカゲルカートリッジへの吸着)
試料として、脂肪酸標準溶液である直鎖偶数炭素鎖脂肪酸キットEC10A-1KIT(SUPELCO)から、カプリン酸(デカン酸)(C10:0),ミリスチン酸(C14:0),パルミチン酸(C16:0), ステアリン酸 (C18:0),炭素数20の飽和脂肪酸(C20:0)と、炭素数11の飽和脂肪酸(C11:0),炭素数21の飽和脂肪酸(C21:0)を試料として用いた。反応に供した脂肪酸量は、各脂肪酸最終濃度500ppmの脂肪酸混合液20μlを試料として用いた。
GC分析条件
機器 :Shimadzu GC-17A
カラム :SP-2380(30m×0.25mm ID,0.20μm film)
カラムオーブン:50℃で2分間保ち、10℃/分間の速度で 250℃まで昇温し、250℃で8分間保つ
検出 :FID, 260℃
キャリアガス :He, 1.0 ml/分
注入 :1.0 μl, Split-less, 250℃
通過液及び洗浄液中からは脂肪酸メチルは検出されなかった。一方、溶出液には合計658.2μgの脂肪酸メチルが検出され、これはシリカゲルカートリッジにアプライした反応溶液中に含まれていた脂肪酸メチルの合計量である621.3μgに対して105.9(%)であり、シリカゲルカートリッジに全量が吸着したことが分かる。
実施例15(シリカゲルカートリッジへの吸着)
試料として、凍結乾燥酵母1103株の50mgを用いた。この酵母は、YPD培地にて30℃、48時間、静置培養したものを用いた。
Claims (17)
- 脂肪酸及び/又は脂肪酸エステルを含む試料とメタノールとナトリウムメトキシド又はカリウムメトキシドとを反応させることにより、脂肪酸エステルを脂肪酸メチルにする第1工程と、
三フッ化ホウ素の存在下で、第1工程の反応混合物とメタノールとを反応させることにより、遊離脂肪酸をメチル化する第2工程と
を含む脂肪酸及び/又は脂肪酸エステルのメチル化方法。 - カルボン酸及び/又はカルボン酸エステルを含む試料とメタノールとナトリウムメトキシド又はカリウムメトキシドとを反応させることにより、カルボン酸エステルをカルボン酸メチルにする第1工程と、
三フッ化ホウ素の存在下で、第1工程の反応混合物とメタノールとを反応させることにより、遊離カルボン酸をメチル化する第2工程と
を含むカルボン酸及び/又はカルボン酸エステルのメチル化方法。 - 炭素数が12より小さい脂肪酸及び/又は炭素数が12より小さい脂肪酸エステルを含む試料と炭素数2〜4の低級アルコールと炭素数2〜4のナトリウムアルコキシド又はカリウムアルコキシドとを反応させることにより、炭素数が12より小さい脂肪酸エステルを炭素数2〜4の低級アルコールとのエステルに変換する第1工程と、
三フッ化ホウ素の存在下で、第1工程の反応混合物と炭素数2〜4の低級アルコールとを反応させることにより、遊離した炭素数が12より小さい脂肪酸を炭素数2〜4の低級アルコールとのエステルにする第2工程と
を含む炭素数が12より小さい脂肪酸及び/又は炭素数が12より小さい脂肪酸エステルの炭素数2〜4の低級アルコールとのエステル交換及び/又はエステル化方法。 - 第1工程の反応液中におけるナトリウムメトキシド又はカリウムメトキシドの最終濃度が0.05〜2Mである請求項1又は2に記載の方法。
- 第1工程の反応液中における炭素数2〜4のナトリウムアルコキシド又はカリウムアルコキシドの最終濃度が0.05〜2Mである請求項3に記載の方法。
- 第1工程の反応を、20〜60℃で行う請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 第2工程の反応を、25〜65℃で行う請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 第2工程における三フッ化ホウ素の使用量を、反応液の全量に対して5〜15重量%とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法
- 第1工程において、疎水性有機溶媒の存在下で脂肪酸及び/又は脂肪酸エステルを含む試料とメタノールとナトリウムメトキシド又はカリウムメトキシドとを反応させるか、又は第1工程に先立ち、脂肪酸及び/又は脂肪酸エステルを含む試料を疎水性有機溶媒で溶解する予備工程を含み、予備工程の反応混合物を第1工程における脂肪酸及び/又は脂肪酸エステルを含む試料とし、
該疎水性有機溶媒がプロピオン酸の炭素数1〜4の低級アルコールエステル、トルエン、又はtert-ブチルメチルエーテルである、
請求項1に記載の方法。 - 第1工程において、疎水性有機溶媒の存在下でカルボン酸及び/又はカルボン酸エステルを含む試料とメタノールとナトリウムメトキシド又はカリウムメトキシドとを反応させるか、又は第1工程に先立ち、カルボン酸及び/又はカルボン酸エステルを含む試料を疎水性有機溶媒で溶解する予備工程を含み、予備工程の反応混合物を第1工程におけるカルボン酸及び/又はカルボン酸エステルを含む試料とし、
該疎水性有機溶媒がプロピオン酸の炭素数1〜4の低級アルコールエステル、トルエン、又はtert-ブチルメチルエーテルである、
請求項2に記載の方法。 - 第1工程において、疎水性有機溶媒の存在下で炭素数が12より小さい脂肪酸及び/又は炭素数が12より小さい脂肪酸エステルを含む試料と炭素数2〜4の低級アルコールと炭素数2〜4のナトリウムアルコキシド又はカリウムアルコキシドとを反応させるか、又は第1工程に先立ち、炭素数が12より小さい脂肪酸及び/又は炭素数が12より小さい脂肪酸エステルを含む試料を疎水性有機溶媒で溶解する予備工程を含み、予備工程の反応混合物を第1工程における炭素数が12より小さい脂肪酸及び/又は炭素数が12より小さい脂肪酸エステルを含む試料とし、
該疎水性有機溶媒がプロピオン酸の炭素数1〜4の低級アルコールエステル、トルエン、又はtert-ブチルメチルエーテルである、
請求項3に記載の方法。 - 疎水性有機溶媒としてプロピオン酸メチル、又はトルエンを用いる請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- メタノール、ナトリウムメトキシド又はカリウムメトキシド、及び三フッ化ホウ素を備える脂肪酸及び/又は脂肪酸エステルのメチルエステル化用キット。
- メタノール、ナトリウムメトキシド又はカリウムメトキシド、及び三フッ化ホウ素を備えるカルボン酸及び/又はカルボン酸エステルのメチルエステル化用キット。
- 炭素数2〜4の低級アルコール、炭素数2〜4のナトリウムアルコキシド又はカリウムアルコキシド、及び三フッ化ホウ素を備える炭素数が12より小さい脂肪酸及び/又は炭素数が12より小さい脂肪酸エステルのエステル交換及び/又はエステル化用キット。
- さらに、疎水性有機溶媒を備え、該疎水性有機溶媒がプロピオン酸の炭素数1〜4の低級アルコールエステル、トルエン、又はtert-ブチルメチルエーテルである、請求項13〜15のいずれかに記載のキット。
- 疎水性有機溶媒が、プロピオン酸メチル又はトルエンである請求項16に記載のキット。
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