CN103645263B - 人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法，包括：（1）、人血清样品前处理得到衍生化产物；（2）、对所述衍生化产物用气相色谱-质谱仪进行检测；（3）、根据所述衍生化产物的总离子流色谱图和质谱图对所述人血清样品中各极长链脂肪酸进行定性分析，根据选择离子色谱图计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量，所述极长链脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。相比于背景技术，本发明的前处理过程快速、灵敏、准确。
Description
技术领域
本发明涉及极长链脂肪酸检测的技术领域，特别是一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法。
背景技术
体内的超长链饱和脂肪酸VLCFA（very-long-chain fatty acids）主要包括二十二烷酸（C22:0）、二十四烷酸（C24:0）和二十六烷酸（C26:0）3种，它们只能在过氧化物酶体中进行β-氧化。VLCFA在体内主要以酯的方式存在，包括甘油三酯、磷脂、糖脂等，但是也有少部分以游离方式或游离方式结合血清白蛋白存在。
测定血清中VLCFA的含量，可以用来辅助诊断疑似过氧化物酶体代谢失调相关的遗传代谢性疾病，包括过氧化物酶体生源性失调、X-连锁肾上腺脑白质营养不良以及过氧化物酶体功能评价等。
目前，广泛使用的人血清中极长链脂肪酸的检测方法为气相色谱（GC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS），因为使用GC和GC-MS要求检测的化合物必须挥发性强，热稳定性好，因此，极长链脂肪酸在上机检测之前，必须进行相应的前处理，使其转化成为适合GC和GC-MS检测的化合物，这也就导致极长链脂肪酸的前处理过程复杂，分析时间较长，应用时具有一定的局限性。
目前，国内外使用最广泛的前处理方法就是将脂肪酸进行硅烷衍生化或甲酯化反应，生成硅烷化产物或者甲酯化产物，然后进GC或GC-MS检测。
硅烷衍生化的前处理步骤：首先进行水解，将在体内以酯化方式存在的极长链脂肪酸水解出来，采用非极性的溶剂萃取游离的脂肪酸，氮气吹干之后，加入衍生化试剂反应，衍生化产物上机测定。
甲酯化的前处理步骤分为两种：一种为采用有机溶剂将游离的脂肪酸及以酯化状态存在的脂肪酸使用非极性溶剂或者混合溶剂萃取之后，加入甲酯化试剂，其中游离的脂肪酸进行甲酯化反应，酯化状态的脂肪酸发生转甲酯化反应，然后采用正己烷萃取甲酯化的产物，氮气吹干，复溶后检测；另一种为直接在样品中加入甲酯化试剂，游离的脂肪酸进行甲酯化反应，结合状态的脂肪酸进行转甲酯化反应，然后采用有机溶剂萃取甲酯化的产物，氮气吹干，复溶后检测。
由于血清中含有大量非极性的甾醇类，在采用非极性的有机溶剂萃取脂肪酸时，会同时萃取到大量的甾醇类杂质，这些甾醇类化合物上机检测，所得的响应非常高，干扰到目标化合物在色谱柱上的分离分析，因此在前处理过程中去除甾醇类杂质的干扰必不可少。
针对甾醇类杂质的去除，在采用硅烷衍生化方法时，在水解之后将溶液加盐酸酸化，使用正己烷萃取，这一步同时将脂肪酸和非极性的甾醇类化合物萃取出来，然后再加入氢氧化钾，使脂肪酸发生皂化反应，以离子化状态存在于水相层，而没有羧基的甾醇类杂质由于没有发生皂化反应，仍然留在了有机相层，通过将有机相层弃除，来除掉大部分的甾醇类杂质，然后在水相层中再次加入盐酸，使离子化的脂肪酸呈现游离状态，加入正己烷萃取，氮气吹干，进行衍生化反应，该方法步骤繁琐，操作复杂，萃取效率低，不利于得到稳定的结果。而使用甲酯化反应的前处理方法中没有涉及到甾醇类化合物去除的步骤。
由于目前报道的测定血清中极长链脂肪酸的前处理方法都非常复杂，因此建立一种快速、灵敏、准确的前处理方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题是提供一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法，前处理过程快速、灵敏、准确。
为了解决上述问题，本发明公开了一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法，所述方法包括：
（1）、人血清样品前处理得到衍生化产物，包括：
在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合内标溶液，再加入盐酸-乙腈溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中酸水解；
将酸水解后的溶液静置冷却至室温，加入氢氧化钠-甲醇水溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中碱水解；
将碱水解后的溶液静置冷却至室温，加入正己烷萃取甾醇类杂质，弃除上层溶液，加入盐酸至溶液的pH值显酸性；
加入正己烷并充分混匀，离心后取出上层溶液用氮气吹干，在残渣中加入衍生化试剂，置于70～90℃的烘箱中进行衍生化反应得到衍生化产物；
（2）、对所述衍生化产物用气相色谱-质谱仪进行检测；
其中，气相色谱条件包括：
色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm；
载气：氦气，99.999%；
载气流速：1.0mL/min；
进样方式：不分流进样；
进样体积：1μL；
进样口温度：300℃；
Post Run Temp：320℃；
Post Run Time：3min；
其中，质谱条件包括：
电离源：电子轰击离子源，70ev；
传输线温度：310℃；
离子源温度：280℃；
四极杆质量分析器温度：150℃；
溶剂延迟时间：6min；
扫描模式：全扫描和选择离子扫描，全扫描范围为m/z73.00-500.00；
（3）、根据所述衍生化产物的总离子流色谱图和质谱图对所述人血清样品中各极长链脂肪酸进行定性分析，根据选择离子色谱图计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量，所述极长链脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。
优选地，所述酸水解的时间为40～60min，所述碱水解的时间为40～60min。
优选地，所述人血清样品与所述盐酸-乙腈溶液的体积比为（1:20）～（1:40），所述人血清样品与所述氢氧化钠-甲醇水溶液的体积比为（1:20）～（1:40）；
所述将碱水解后的溶液静置冷却至室温，加入正己烷萃取甾醇类杂质，弃除上层溶液，加入盐酸至溶液的pH值显酸性的步骤中，所述正己烷与所述人血清样品的体积比为（40:1）～（60:1），所述盐酸与所述人血清样品的体积比为（5:1）～（10:1）；
所述加入正己烷并充分混匀，离心后取出上层溶液进行萃取的步骤中，所述正己烷与所述人血清样品的体积比为（40:1）～（100:1）。
优选地，所述十七烷酸和二十七烷酸的混合内标溶液包括十七烷酸和二十七烷酸，其中，所述十七烷酸和二十七烷酸的质量比为（8:1）～（15:1）。
优选地，所述衍生化试剂包括双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，所述双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与所述三甲基氯硅烷的比例为99:1。
优选地，气相色谱的色谱柱升温程序包括：
| 升温速率（℃/min） | 温度（℃） | 保持时间 | 运行时间 |
| 初温 | 60 | 1 | 1 |
| 30 | 240 | 3.5 | 10.5 |
| 10 | 270 | 3 | 16.5 |
| 4 | 290 | 0 | 21.5 |
| 20 | 310 | 2 | 24.5 |
优选地，选择离子扫描（SIM）模式参数包括：
优选地，所述根据所述衍生化产物的总离子流色谱图和质谱图对人血清样品中各极长链脂肪酸进行定性分析，根据选择离子色谱图计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量的步骤包括：
以所述衍生化产物中三种极长链脂肪酸分别与标准品的保留时间、全扫描所得的质谱图进行谱库检索以及与标准物质的质谱图进行比对作为定性依据；
用内标标准曲线法定量，依据各极长链脂肪酸的峰面积分别与相应内标物峰面积的比值为纵坐标，各极长链脂肪酸的浓度分别与内标物的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线，计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量。
与背景技术相比，本发明实施例具有以下优点：
本发明实施例提供的检测方法采用的前处理方法，将以酯状态存在的脂肪酸同时进行酸碱水解，能够得到更好的水解效果；在水解之后，直接加入正己烷将人血清中含有的大量的甾醇类化合物萃取弃掉，纯化了目标化合物的同时，大大降低了甾醇类化合物对脂肪酸类化合物的干扰，与不去除甾醇类杂质的前处理方法比较，总离子流色谱图更加简单，干净，分离度更好；与使用皂化反应弃除甾醇类杂质的前处理方法比较，操作简单方便，过程易于控制，净化效果好，萃取效率高，同时节省了有机溶剂和处理时间，简化了样品的前处理过程。
本发明实施例的检测方法中前处理使用的碱解溶液为氢氧化钠/甲醇/水三者的混合溶液，相比于现有技术中文献报道的氢氧化钠/甲醇两者的混合溶液相比，萃取效率高，另外，甲醇的使用量减少，节约了成本。
本发明实施例的检测方法采用全扫描和选择离子扫描同时进行的扫描模式，能够得到样品的总离子流色谱图和选择离子色谱图，总离子流色谱图可以用于对化合物进行定性，用于检测过程中监测出峰时间处的化合物是否为目标化合物，以免出现其他干扰，另外，选择离子扫描对每个化合物的特征离子进行扫描，提高了检测灵敏度和方法的检测特异性。
本发明实施例的检测方法选用了耐高温的非极性色谱柱，特别适合沸点高的极长链脂肪酸的分离分析，色谱柱的低流失，大大降低了质谱的背景干扰，最低检出限达到了0.008mg/L，在0.15－103.20mg/L的浓度范围内，3种极长链脂肪酸线性良好，相关系数为0.987-0.998，回收率在87.40%－110.42%之间，RSD小于7%，提高了检测灵敏度。
本发明检测方法建立了气相色谱-质谱法检测人血清中3种极长链脂肪酸的检测方法，可以一次性分析3种极长链脂肪酸，方法针对性强、前处理操作简单、萃取效率高、方法稳定、灵敏度高、特异性强、易于推广应用。可用于医院、第三方医学检验机构、疾病预防控制中心检测人血清中3种极长链脂肪酸的含量，为过氧化物酶体疾病患者，特别是为x-性连锁肾上腺脑白质营养不良（X-ALD）患者提供生化指标检测结果，辅助诊断过氧化物酶体遗传代谢性疾病，做到早发现、早确诊、早治疗以及早预防，为遗传咨询和产前诊断提供依据。本发明的检测方法不仅可以对已经产生了相应临床症状的患者进行血清中极长链脂肪酸的检测，同时可以对新生儿血清、孕妇羊水和女性基因携带者进行检测，做到对新生儿早发现早治疗，以免对患儿造成不可逆的损伤，对孕妇羊水抽检和女性携带者进行检测，做相应的遗传咨询和产前诊断，以达到优生优育。
附图说明
图1是本发明实施例的一个示例中弃除甾醇类杂质样本与背景技术中没有弃除甾醇类杂质样本进行对比的总离子流色谱图；
图2是本发明实施例的一个示例中去除甾醇类杂质样本与背景技术中使用皂化反应弃除甾醇类杂质样本进行对比的总离子流色谱图；
图3-5分别是本发明实施例的一个示例中去除甾醇类杂质样本与背景技术中使用皂化反应弃除甾醇类杂质样本进行对比的选择离子色谱图；
图6-8分别是本发明实施例采用氢氧化钠/甲醇/水碱解液与现有技术中采用氢氧化钠/甲醇碱解液进行对比的选择离子色谱图；
图9-16分别是采用本发明实施例的方法对四例人血清临床样本进行检测的总离子流色谱图和选择离子扫描色谱图；
图17是本发明实施例的一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法实施例的步骤流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明实施例作进一步详细的说明。
测定血清中VLCFA的含量，具有重要的医学价值，例如：
血清中VLCFA的异常累积，可以反映过氧化物酶体中参与VLCFAβ-氧化过程相关的酶的功能异常，使得VLCFA的β-氧化受阻，引起VLCFA聚集。VLCFA在神经系统中聚集可破坏髓鞘的正常形成和髓鞘的稳定性，引起一系列的神经系统症状，主要表现为行为、认知、情绪异常及视力、听力减退等；在肾上腺皮质细胞中聚集可引起肾上腺皮质细胞膜表面的促肾上腺皮质激素（ACTH）受体功能下降，细胞内类固醇的合成受到抑制，而致肾上腺功能减退。
其中，对X-连锁肾上腺脑白质营养不良的诊断，是主要的生化指标。所有男性X-ALD患者均发现有VLCFA的增高，与年龄及病程无相关性；女性携带者中80%血清VLCFA水平增高，假阴性率为20%。
另外，过氧化物酶体生源性失调引起的Zellweger综合征、新生儿肾上腺脑白质营养不良、婴儿型Refsum病以及高哌可酸血症等遗传代谢性疾病患者，体内的VLCFA也存在异常聚集。
现有技术中对脂肪酸进行检测时，采用硅烷衍生化方法时，前处理的步骤繁琐，操作复杂，萃取效率低，不利于得到稳定的结果，而使用甲酯化反应的前处理方法中没有涉及到甾醇类化合物去除的步骤。本发明所要解决的技术问题是针对现有前处理技术存在的不足，提供一种前处理过程快速、灵敏、准确的脂肪酸检测方法。
参见图17，示出了本发明实施例的一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法实施例的步骤流程图，具体可以包括如下步骤：
步骤101、人血清样品前处理得到衍生化产物，包括：
子步骤S11、在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合内标溶液，再加入盐酸-乙腈溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中酸水解。
本发明实施例中，针对人血清样品中以酯状态存在的脂肪酸进行酸水解和碱水解，能够得到更好的水解效果，在进行酸水解之前，首先加入十七烷酸和二十七烷酸的混合内标溶液，混合内标溶液包括十七烷酸和二十七烷酸，其中，所述十七烷酸和二十七烷酸的质量比为（8:1）～（15:1），然后加入盐酸-乙腈溶液并充分混匀，再进行酸水解，酸水解在温度设定为80～120℃的烘箱中进行。
本发明实施例中，优选地，所述人血清样品与所述盐酸-乙腈溶液的体积比可以为（1:20）～（1:40）中的任一值，所述酸水解的时间可以为40～60min。
子步骤S12、将酸水解后的溶液静置冷却至室温，加入氢氧化钠-甲醇水溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中碱水解。
酸水解后可以进一步进行碱水解，优选地，所述碱水解的时间为40～60min。在碱水解时加入碱解溶液并充分混匀，碱解溶液为氢氧化钠-甲醇水溶液，即氢氧化钠/甲醇/水三者的混合溶液，相比于现有技术中文献报道的氢氧化钠-甲醇两者的混合溶液相比，萃取效率高，另外，甲醇的使用量减少，节约了成本。参见图6-8给出了采用氢氧化钠/甲醇/水碱解液与现有技术中采用氢氧化钠/甲醇碱解液进行对比的选择离子色谱图，其中，选择离子色谱图分别为：图6中为所有化合物的选择离子色谱图，图7为C22和C24的选择离子色谱图，图8中为C26的选择离子色谱图，采用本发明实施例的方法去除甾醇类杂质样本为Sample4-1，采用背景技术的使用皂化反应弃除甾醇类杂质样本为Sample4-2。图中可以看出，本发明方法所得的目标化合物的响应值明显高于氢氧化钠/甲醇碱解液水解所得的目标化合物的响应值，即水解和萃取效率更优。
在进行碱水解时，碱水解在温度设定为80～120℃的烘箱中进行，优选地，人血清样品与所述氢氧化钠-甲醇水溶液的体积比可以为（1:20）～（1:40）。
子步骤S13、将碱水解后的溶液静置冷却至室温，加入正己烷萃取甾醇类杂质，弃除上层溶液，加入盐酸至溶液的pH值显酸性。
本发明实施例中，在进行了酸水解和碱水解之后，直接加入正己烷将血清中含有的大量的甾醇类化合物萃取弃掉，纯化了目标化合物的同时，大大降低了甾醇类化合物对脂肪酸类化合物的干扰，与不去除甾醇类杂质的前处理方法比较，总离子流色谱图更加简单，干净，分离度更好。
参见图1，给出了本发明实施例的一个示例中弃除甾醇类杂质样本与背景技术中没有弃除甾醇类杂质样本进行对比的总离子流色谱图，其中，Sample1-1为没有弃除甾醇类杂质样本的总离子流色谱图，Sample1-2为本发明弃除甾醇类杂质样本的总离子流色谱图。图中可以看出，没有弃除甾醇类杂质样本的色谱图峰数目多且杂，峰形和分离效果差。与使用皂化反应弃除甾醇类杂质的前处理方法比较，本发明实施例的方法操作简单方便，过程易于控制，净化效果好，萃取效率高，同时节省了有机溶剂和处理时间，简化了样品的前处理过程。
参见图2给出了本发明实施例的一个示例中去除甾醇类杂质样本与背景技术中使用皂化反应弃除甾醇类杂质样本进行对比的总离子流色谱图，Sample2-1为使用皂化反应去除甾醇类杂质样本的总离子流色谱图，Sample2-2为本发明弃除甾醇类杂质样本的总离子流色谱图。图中可以看出，两者峰数目及出峰时间相近，但本发明方法所得色谱图有更高的峰面积响应，即本发明方法萃取效率更高。参见图3-5给出了本发明实施例的一个示例中去除甾醇类杂质样本与背景技术中使用皂化反应弃除甾醇类杂质样本进行对比的选择离子色谱图，选择离子色谱图分别为：图3中为所有化合物的选择离子色谱图，图4为C22和C24的选择离子色谱图，图5中为C26的选择离子色谱图，采用本发明实施例的方法去除甾醇类杂质样本为Sample3-1，采用背景技术的使用皂化反应弃除甾醇类杂质样本为Sample3-2，图中可以看出，本发明所得的目标化合物的响应值明显高于皂化反应弃除甾醇类杂质所得的目标化合物的响应值。
萃取后上层溶液可以弃除掉，加入盐酸，并通过测量保留的下层溶液的pH值调整溶液为酸性。
优选地，加入正己烷萃取甾醇类化合物时，正己烷与所述人血清样品的体积比可以为（40:1）～（60:1），加入的盐酸与所述人血清样品的体积比可以为（5:1）～（10:1）。
子步骤S14、加入正己烷并充分混匀，离心后取出上层溶液用氮气吹干，在残渣中加入衍生化试剂，置于80℃的烘箱中进行衍生化反应得到衍生化产物。
去除甾醇类化合物后，可以再次加入正己烷萃取其中的脂肪酸，具体可以先加入正己烷并充分混匀，然后离心将上层正己烷溶液转移出来，用氮气吹干得到残渣，进一步加入衍生化试剂得到脂肪酸的衍生化产物，衍生化反应在70～90℃的烘箱中进行。
本发明实施例中，优选地，衍生化试剂可以包括双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，得到的是脂肪酸的硅烷化衍生化产物，双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）与三甲基氯硅烷（TMCS）的比例可以为99:1。
其中，所述正己烷与所述人血清样品的体积比可以为（40:1）～（100:1）。
步骤102、对所述衍生化产物用气相色谱-质谱仪进行检测；
其中，气相色谱条件包括：
色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm，该色谱柱的填充料为低极性亚芳基相（类似5%联苯/95%二甲基聚硅氧烷），温度范围为-60℃～350℃；
载气：氦气，99.999%；
载气流速：1.0mL/min；
进样方式：不分流进样；
进样体积：1μL；
进样口温度：300℃；
Post Run Temp：320℃；
Post Run Time：3min。
本发明实施例的检测方法选用了耐高温的非极性色谱柱，特别适合沸点高的极长链脂肪酸的分离分析，色谱柱的低流失，大大降低了质谱的背景干扰，可以提高检测的灵敏度。
优选地，本发明实施例中，气相色谱的色谱柱升温程序可以包括：
| 升温速率（℃/min） | 温度（℃） | 保持时间 | 运行时间 |
| 初温 | 60 | 1 | 1 |
| 30 | 240 | 3.5 | 10.5 |
| 10 | 270 | 3 | 16.5 |
| 4 | 290 | 0 | 21.5 |
| 20 | 310 | 2 | 24.5 |
其中，质谱条件可以包括：
电离源：电子轰击离子源，70ev；
传输线温度：310℃；
离子源温度：280℃；
四极杆质量分析器温度：150℃；
溶剂延迟时间：6min；
扫描模式：全扫描和选择离子扫描，全扫描范围为m/z73.00-500.00。
本发明实施例的检测方法采用全扫描和选择离子扫描同时进行的扫描模式，能够得到样品的总离子流色谱图和选择离子色谱图，总离子流色谱图可以用于对化合物进行定性，用于检测过程中监测出峰时间处的化合物是否为目标化合物，以免出现其他干扰，另外，选择离子扫描对每个化合物的特征离子进行扫描，提高了检测灵敏度和方法的检测特异性。
优选地，本发明实施例中，选择离子扫描（SIM）模式参数包括：
步骤103、根据所述衍生化产物的总离子流色谱图和质谱图对所述人血清样品中各极长链脂肪酸进行定性分析，根据选择离子色谱图计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量。
本发明实施例中，对二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸这三种极长链脂肪酸（C≥22）进行检测，在进行定性分析时，以所述衍生化产物中三种极长链脂肪酸分别与标准品的保留时间、全扫描所得的质谱图进行NIST谱库检索以及与标准物质的质谱图进行比对作为定性依据。
本发明实施例采用内标标准曲线法进行定量分析，具体而言，依据各极长链脂肪酸的峰面积分别与相应内标物峰面积的比值为纵坐标，各极长链脂肪酸的浓度分别与内标物的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线，计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量。
综上所述，本发明方法建立了人血清中以游离态、与蛋白质结合以及脂质状态存在的总的三种极长链脂肪酸的水解方法、净化方法、提取方法、衍生化方法、色谱条件及质谱条件，一次性分析三种极长链脂肪酸，方法针对性强、前处理操作简单、萃取效率高、方法稳定、灵敏度高、特异性强、易于推广应用。可用于医院、第三方医学检验机构、疾病预防控制中心检测人血清中三种极长链脂肪酸的含量，为过氧化物酶体疾病患者，特别是为x-性连锁肾上腺脑白质营养不良（X-ALD）患者提供生化指标检测结果，辅助诊断过氧化物酶体遗传代谢性疾病，做到早发现、早确诊、早治疗以及早预防，为遗传咨询和产前诊断提供依据。本发明的检测方法不仅可以对已经产生了相应临床症状的患者进行血清中极长链脂肪酸的检测，同时可以对新生儿血清、孕妇羊水和女性基因携带者进行检测，做到对新生儿早发现早治疗，以免对患儿造成不可逆的损伤，对孕妇羊水抽检和女性携带者进行检测，做相应的遗传咨询和产前诊断，以达到优生优育。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下提供一个例子来说明本发明实施例人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法的具体实现过程。
（1）样品前处理：
移取100μL人血清，置于螺旋盖玻璃离心管中，加入十七烷酸（C17:0）和二十七烷酸（C27:0）混合内标溶液，再加入2mL盐酸-乙腈溶液，充分混匀，在设定为110的℃烘箱中酸水解45min。
取出静置冷却至室温，加入2mL氢氧化钠甲醇水溶液，充分混匀，在设定为110℃的烘箱中碱水解45min。
取出静置冷却至室温，将4mL正己烷加入离心管中，充分混匀，离心，弃除上层溶液，再加入0.5mL盐酸到下层，充分混匀，静置之后，测试PH值，显酸性即可。
将4ml正己烷加入离心管中，充分混匀，离心，将上层转移至另一支洁净的衍生化玻璃管中，萃取溶液氮气吹干，残渣中加入衍生化试剂，置80℃烘箱中进行衍生化反应。将衍生化产物转移至样品瓶中，得待测样品。
（2）待测样品用气相色谱－质谱仪进行测定。
色谱条件包括：
色谱柱：30mx0.25mm（ID）x0.25μm（film）；
载气：氦气（He）（99.999%）；载气流速：1.0mL/min；进样方式：不分流进样（Splitless）；进样体积：1μL；进样口温度：300；℃Post Run Temp：320；℃Post Run Time：3min。
柱温：升温程序见下表1；
质谱条件：
电离源：电子轰击离子源（EI），70ev；传输线温度：310；℃离子源温度：280；℃四极杆质量分析器温度：150；℃溶剂延迟时间：6min；扫描模式：全扫描（Scan）和选择离子扫描（SIM），全扫描范围：m/z73.00-500.00，选择离子扫描（SIM）模式参数见表2。
| 升温速率（℃/min） | 温度（℃） | 保持时间 | 运行时间 |
| 初温 | 60 | 1 | 1 |
| 30 | 240 | 3.5 | 10.5 |
| 10 | 270 | 3 | 16.5 |
| 4 | 290 | 0 | 21.5 |
| 20 | 310 | 2 | 24.5 |
表1、色谱柱升温程序
表2、选择离子扫描（SIM）模式参数
（3）定性定量方法：以样品中各脂肪酸与标准品的保留时间、全扫描所得的质谱图进行谱库检索以及与标准物质的质谱图进行比对作为定性依据，各脂肪酸的保留时间见下表3；用内标标准曲线法定量，各脂肪酸的峰面积与相应内标物峰面积的比值为纵坐标，各脂肪酸的浓度与内标物的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线，计算血清中各脂肪酸的含量。
| 化合物名称 | 保留时间(min) |
| 十七烷酸 | 9.23 |
| 二十二烷酸 | 13.94 |
| 二十四烷酸 | 16.35 |
| 二十六烷酸 | 19.25 |
| 二十七烷酸 | 20.74 |
表3、各脂肪酸的保留时间
本发明实施例中可以在NIST谱库进行检索，NIST谱库保存了大量的权威质谱数据，以所述衍生化产物中三种极长链脂肪酸分别与标准品的保留时间、全扫描所得的质谱图进行谱库检索，并将样品与标准物质的质谱图进行比对作为定性依据，具体而言，质谱图比对是根据样品和标准品的所有质谱碎片离子是否一致，以及各碎片离子的相对丰度是否一致来确定。
基于本发明实施例中给出的实验条件，经过试验验证，本发明的检测方法最低检出限达到了0.008mg/L，得出人血清样品中二十二烷酸（C22:0）在0.80～101.88mg/L、二十四烷酸（C24:0）在0.81～103.20mg/L、二十六烷酸（C26:0）在0.15～7.45mg/L浓度范围内，线性良好，相关系数分别为0.994、0.987、0.998（0.987～0.998），回收率在87.40%～110.42%之间，RSD小于7%。
进一步，申请人对正常人和具有明显临床症状的患者进行了相应的血清中极长链脂肪酸的检测，参见图9-16给出了采用本发明实施例的方法对四例人血清临床样本进行检测的总离子流色谱图和选择离子扫描色谱图，其中，图9、图11、图13和图15为样品对应的总离子流色谱图，图10、图12、图14和图16为样品对应的选择离子扫描色谱图。
其中，通过采用与样品前处理一致的步骤对标准曲线各浓度点进行处理，进GC-MS分析；用内标标准曲线法定量，即采用标准曲线点的选择离子扫描色谱图中各脂肪酸的峰面积与相应内标物峰面积的比值为纵坐标，各脂肪酸的浓度与内标物的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线；对样本的选择离子色谱图进行定量，计算血清中各脂肪酸的含量。
通过上述图谱得出了三种脂肪酸各自的含量以及两个比值C24:0/C22:0、C26:0/C22:0。与参考值比较发现，正常人体内极长链脂肪酸的含量以及相应的比值均处于参考范围内（参考值及结果见下表，其中Y1、Y2、Y3为正常人，Y4为具有明显临床症状的患者），而具有明显临床症状的患者的C26:0的含量以及C24:0/C22:0、C26:0/C22:0的值均高于参考值。
以上对本发明实施例所提供的一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明实施例的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明实施例的限制。
Claims (7)
1.一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)、人血清样品前处理得到衍生化产物，包括：
在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合内标溶液，再加入盐酸-乙腈溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中酸水解；
将酸水解后的溶液静置冷却至室温，加入氢氧化钠-甲醇水溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中碱水解；
将碱水解后的溶液静置冷却至室温，加入正己烷萃取甾醇类杂质，弃除上层溶液，加入盐酸至溶液的pH值显酸性；
加入正己烷并充分混匀，离心后取出上层溶液用氮气吹干，在残渣中加入衍生化试剂，置于70～90℃的烘箱中进行衍生化反应得到衍生化产物；
(2)、对所述衍生化产物用气相色谱-质谱仪进行检测；
其中，气相色谱条件包括：
色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm；
载气：氦气，99.999％；
载气流速：1.0mL/min；
进样方式：不分流进样；
进样体积：1μL；
进样口温度：300℃；
Post Run Temp：320℃；
Post Run Time：3min；
其中，质谱条件包括：
电离源：电子轰击离子源，70ev；
传输线温度：310℃；
离子源温度：280℃；
四极杆质量分析器温度：150℃；
溶剂延迟时间：6min；
扫描模式：全扫描和选择离子扫描，全扫描范围为m/z 73.00-500.00；
(3)、根据所述衍生化产物的总离子流色谱图和质谱图对所述人血清样品中各极长链脂肪酸进行定性分析，根据选择离子色谱图计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量，所述极长链脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸；
其中，所述酸水解的时间为40～60min，所述碱水解的时间为40～60min，所述人血清样品与所述盐酸-乙腈溶液的体积比为(1∶20)～(1∶40)，所述人血清样品与所述氢氧化钠-甲醇水溶液的体积比为(1∶20)～(1∶40)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述将碱水解后的溶液静置冷却至室温，加入正己烷萃取甾醇类杂质，弃除上层溶液，加入盐酸至溶液的pH值显酸性的步骤中，所述正己烷与所述人血清样品的体积比为(40∶1)～(60∶1)，所述盐酸与所述人血清样品的体积比为(5∶1)～(10∶1)；
所述加入正己烷并充分混匀，离心后取出上层溶液进行萃取的步骤中，所述正己烷与所述人血清样品的体积比为(40∶1)～(100∶1)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十七烷酸和二十七烷酸的混合内标溶液包括十七烷酸和二十七烷酸，其中，所述十七烷酸和二十七烷酸的质量比为(8∶1)～(15∶1)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化试剂包括双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，所述双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与所述三甲基氯硅烷的比例为99∶1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，气相色谱的色谱柱升温程序包括：
。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选择离子扫描(SIM)模式参数包括：
。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据所述衍生化产物的总离子流色谱图和质谱图对人血清样品中各极长链脂肪酸进行定性分析，根据选择离子色谱图计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量的步骤包括：
以所述衍生化产物中三种极长链脂肪酸分别与标准品的保留时间、全扫描所得的质谱图进行谱库检索以及与标准物质的质谱图进行比对作为定性依据；
用内标标准曲线法定量，依据各极长链脂肪酸的峰面积分别与相应内标物峰面积的比值为纵坐标，各极长链脂肪酸的浓度分别与内标物的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线，计算所述人血清样品中各极长链脂肪酸的含量。
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