CN110596256A - 一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法 - Google Patents

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CN110596256A CN201910349646.3A CN201910349646A CN110596256A CN 110596256 A CN110596256 A CN 110596256A CN 201910349646 A CN201910349646 A CN 201910349646A CN 110596256 A CN110596256 A CN 110596256A
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Abstract

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法。包括如下步骤：(1)称取油脂样品并加内标液；(2)溴代反应：用溴化钠‑硫酸溶液对油脂样品中的缩水甘油酯进行溴代反应；(3)酸水解反应：用硫酸－甲醇溶液对溴代产物以及油脂/脂肪中原有的氯丙醇酯进行酸水解反应；(4)基质分散固相萃取净化：用装有硅藻土的固相萃取柱净化酸水解液(5)衍生化反应：用七氟丁酰基咪唑衍生净化后的酸水解液(6)色谱‑质谱检测分析。本发明将缩水甘油酯和氯丙醇酯分别转化成3‑溴‑1,2‑丙二醇和氯丙醇并用七氟丁酰基咪唑衍生，实现了缩水甘油酯和氯丙醇酯的一次性同时检测。相较于差量法计算缩水甘油酯的含量，本发明的检测方法准确度高，工作量小，检测成本低。

Description

一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法。
背景技术
食用油脂是人类日常生活中必不可少的食品加工和烹饪原料之一，在人们的饮食中占有重要地位。随着我国人民生活水平的提高，人们对食用油的品质和安全性要求也在逐步提高。近年来研究发现，在食用油脂中存在缩水甘油酯和氯丙醇酯类物质，可对人体健康产生潜在的危害。
缩水甘油酯和氯丙醇酯为是缩水甘油和氯丙醇类化合物分别与脂肪酸的酯化产物，它们在体内可代谢生成游离态的氯丙醇和缩水甘油。在过去的几十年，游离态的缩水甘油和氯丙醇引起了人们的广泛关注，二者具有基因毒性，啮齿动物口服摄入后可在不同组织内引发肿瘤。国家食品药品监督管理局发布的《关于“氯丙醇酯和缩水甘油酯”的风险解析》中建议加强分析研究，为这两种物质是否需要制定限量标准提供科学依据。欧盟在2018年率先在全世界实施了食用植物油、婴幼儿配方奶粉中缩水甘油酯的限量标准，进一步引起了全世界对此类污染物的进一步重视。
在油脂精炼过程中，缩水甘油酯通常会伴随氯丙醇酯一起形成，氯丙醇酯含量高，缩水甘油酯含量也高。公开号为CN106501390A的中国发明专利公开了一种同时检测食用油中3-氯丙醇酯和缩水甘油酯的方法，该方法通过差量法计算得出缩水甘油酯的含量，同一样品需要测定两次，工作量大，消耗试剂和耗材多，且测定的误差较大。公开号为CN107656077A的中国发明专利公开了一种同时检测食用油中3-氯丙醇酯和缩水甘油酯的方法，该法将3-氯丙醇酯和缩水甘油酯溴代、酸水解后用苯基硼酸溶液衍生水解产物并用气相色谱-质谱仪定量检测分析，以苯基硼酸为衍生剂的检测方法灵敏度较低，衍生反应后形成的干扰物不易在分析仪器中气化而污染仪器。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法，氯丙醇酯包括3-氯-1,2-丙二醇酯(3-MCPD酯)和2-氯-1,3-丙二醇酯(2-MCPD酯)。具体技术方案如下：
(1)称取油脂样品并加内标液；(2)溴代反应：用溴化钠-硫酸溶液对油脂样品中的缩水甘油酯进行溴代反应；(3)酸水解反应：用硫酸－甲醇溶液对溴代产物以及油脂/脂肪中原有的氯丙醇酯进行酸水解反应；(4)基质分散固相萃取净化：用装有硅藻土的固相萃取柱净化酸水解液(5)衍生化反应：用七氟丁酰基咪唑衍生净化后的酸水解液(6)色谱-质谱检测分析。
一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取样品并加内标物：称取食用油脂样品溶解，并加入混合内标工作液，得到油脂溶液；
(2)溴代反应：将所述油脂溶液与溴化物-硫酸溶液充分混合并进行溴代反应，加入碱中和反应液后用有机物萃取，收集有机相并浓缩，复溶得到溴代反应液，该步骤的溴代反应使缩水甘油酯转化为3-溴-1，2-丙二醇酯(3-MBPD酯)；
(3)酸水解反应：将所述溴代液与硫酸－甲醇溶液充分混合并进行酸水解反应，加入碱中和反应液，得到酸水解液，该步骤的酸水解反应使3-溴-1，2-丙二醇酯和油脂溶液中原有的氯丙醇酯分别转化为3-溴-1,2-丙二醇(3-MBPD)和氯丙醇；
(4)基质分散固相萃取净化：将所述酸水解液倒入装有硅藻土的固相萃取柱中，淋洗后洗脱，将洗脱液脱水并浓缩，得到净化液；
(5)衍生化反应：将七氟丁酰基化试剂加入所述净化液中，混合均匀并进行衍生化反应，降至室温后将衍生反应液定容，与水充分混合后静置分层，收集有机相溶液得到待测溶液；
(6)检测分析：用气相色谱-三重四级杆串联质谱仪或气相色谱-质谱仪检测所述待测溶液，采用同位素内标标准曲线法定量。
进一步地，所述食品包括食用油脂、奶粉和油脂性食品，所述油脂性食品包括方便面、炸薯条、麻花、饼干、面包、油条、油饼。
进一步地，当所述食品为奶粉或油炸食品时，所述同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法还包括所述食品的预处理，所述预处理为脂肪的提取。所述奶粉的预处理为：称取适量奶粉于50ml离心管中，溶解后加入氨水震动破乳，分次加入乙醇、乙醚、石油醚萃取脂肪，分层后取上清液并移除有机溶剂，得到脂肪并称重。该预处理方法自动萃取，工作效率高，不会乳化，结果更准确。
进一步地，步骤(1)中所述食用油脂的质量为80-120mg，所述油脂溶液的溶剂为四氢呋喃；所述混合内标工作液包括氘代同位素d5-3-氯-1,2-丙二醇酯、氘代同位素d5-2-氯-1,3-丙二醇酯、氘代同位素d5-缩水甘油酯。
进一步地，步骤(2)中所述溴化物-硫酸溶液的加入量为10-50μL；所述溴代反应的温度45-60℃，所述溴代反应的时间10-25min；所述溴化物-硫酸溶液中溴化物质量浓度为0.5-1.0％，硫酸体积浓度为5-10％；用于萃取的所述有机物为正己烷，所述溴代反应液的溶剂为四氢呋喃。
进一步地，步骤(3)中所述硫酸－甲醇溶液的加入量为1-2.5mL；所述中酸水解反应的温度30-45℃，所述酸水解反应的时间12-18h；所述硫酸－甲醇溶液中硫酸体积分数为1-3％。
进一步地，步骤(4)中所述固相萃取柱用正己烷淋洗，用二氯甲烷、无水乙醚或者乙酸乙酯中的一种或多种混合洗脱。
进一步地，步骤(5)中所述七氟丁酰基化试剂的加入量为20-100μL，所述七氟丁酰基化试剂为七氟丁酰基咪唑或七氟丁酸酐；所述衍生化反应的温度60-85℃，所述衍生化反应的时间20-45min；所述衍生反应液定容于正己烷、异辛烷或壬烷中。
进一步地，步骤(6)中所述气相色谱-三重四级杆串联质谱仪或所述气相色谱-质谱仪的气相色谱条件为：色谱柱：弱极性毛细管色谱柱(固定液为5％苯基和95％二甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度260-300℃，程序升温：50℃保持1min，再以3℃/min的速度升至100℃，最后以40℃/min的速度升至300℃，保持3min；载气：高纯氦气，流速0.8-1.0mL/min；碰撞气：高纯氮气；进样方式：不分流进样；进样体积：1.0μL；
所述气相色谱-三重四级杆串联质谱仪的质谱条件为：离子化方式：EI；离子源温度：200-250℃；传输线温度：270-300℃；四级杆温度：130-160℃；溶剂延迟：5.0min；多反应监测模式(MRM)。
所述气相色谱-质谱仪的质谱条件为：离子化方式：EI；离子源温度：200-250℃；传输线温度：270-300℃；四级杆温度：130-160℃；溶剂延迟：5.0min；选择离子监测模式(SIM)。
进一步地，步骤(6)中标准工作曲线的绘制由5-7份混合标准工作液经步骤(2-6)测试分析得到；所述混合标准工作液成分包括：3-氯-1,2-丙二醇二棕榈酸酯、2-氯-1,3-丙二醇二硬脂酸酯、缩水甘油棕榈酸酯；所述混合标准工作液中各成分浓度在0-3.00mg/kg(以醇计)范围内梯度分布。通过一次操作，实现了缩水甘油酯、3-氯-1,2-丙二醇二酯(3-氯丙醇酯)和2-氯-1,3-丙二醇酯(2-氯丙醇酯)三类污染物的同时测定。
本发明的一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法中，缩水甘油酯(Gly酯)经溴代反应转化为3-溴-1，2-丙二醇酯(3-MBPD酯)，3-MBPD酯和来自样品中的3-氯-1,2-丙二醇酯(3-MCPD酯)、2-氯-1,3-丙二醇酯(2-MCPD酯)经酸水解反应分别转化为游离态的3-溴-1,2-丙二醇(3-MBPD)、3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)、2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD)，酸水解产物经基质分散固相萃取法净化后用七氟丁酰基化试剂衍生，衍生产物供气相色谱-三重四级杆串联质谱仪(GC-MS/MS)或者气相色谱-质谱仪分析(GC-MS)，采用同位素内标标准曲线法定量，一次性同时检测食用油脂中Gly酯、3-MCPD酯、2-MCPD酯三类污染物的含量。
本发明的有益效果为：
1.由实验可知，以GC-MS/MS的MRM模式测定时方法的检出限为3～10μg/kg，SIM模式测定时方法的检出限为20～24μg/kg，线性良好，相关系数0.9996以上；并且，本发明方法以茶油、橄榄油或菜油为基质进行加标试验，加标回收率在86.7～108％之间，6次重复测定的相对标准偏差(RSD)为1.3～7.5％，说明本发明方法的检出限低、灵敏度高、回收率理想、重复性好。
2.将缩水甘油酯溴代为溴丙醇酯，在溴代、酸水解、衍生处理中缩水甘油酯和氯丙醇酯的转化路径相对独立，缩水甘油酯和氯丙醇酯的检测互不干扰，避免了差量法计算缩水甘油酯含量产生的误差，降低50％的工作量和检测成本。
3.采用常用于氯丙醇酯检测的七氟丁酰基咪唑衍生缩水甘油酯转化的溴丙醇，实现了缩水甘油酯和氯丙醇酯同时检测。七氟丁酰基咪唑大大增加了待测物的分子量，提高了方法的灵敏度和特异性；此外，七氟丁酰基咪唑的衍生条件温和，形成的衍生物具有挥发性，可通过气相色谱-质谱仪的谱库检索或标准品对照定性分析，衍生后的杂质也具有挥发性，可有效降低对色谱分析仪器的污染。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为本发明实施例1中3-MCPD衍生物的全扫描质谱图；
图2为本发明实施例1中3-MCPD衍生物的产物离子质谱图；
图3为本发明实施例1中2-MCPD衍生物的全扫描质谱图；
图4为本发明实施例1中2-MCPD衍生物的产物离子质谱图；
图5为本发明实施例1中3-MBPD衍生物的全扫描质谱图；
图6为本发明实施例1中3-MBPD衍生物的产物离子质谱图；
图7为本发明实施例3中菜籽毛油的3-MCPD酯衍生物的MRM色谱图；
图8为本发明实施例3中菜籽毛油的2-MCPD酯衍生物的MRM色谱图；
图9为本发明实施例3中菜籽毛油的Gly酯转化后衍生物的SIM色谱图；
图10为本发明实施例3中菜籽毛油的3-MCPD酯和2-MCPD酯衍生物的SIM色谱图；
图11为本发明实施例3中菜籽毛油的Gly酯转化后衍生物的MRM色谱图；
图12为本发明实施例3中加标菜籽毛油的3-MCPD酯的MRM色谱图；
图13为本发明实施例3中加标菜籽毛油的2-MCPD酯的MRM色谱图；
图14为本发明实施例3中加标菜籽毛油的Gly酯转化后衍生物的SIM色谱图；
图15为本发明实施例3中加标菜籽毛油的3-MCPD酯和2-MCPD酯衍生物的SIM色谱图；
图16为本发明实施例3中加标菜籽毛油的Gly酯转化后衍生物的MRM色谱图；
具体实施例
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
主要仪器：气相色谱/三重四级杆串联质谱仪或气相色谱/质谱仪，漩涡混合器，超声波清洗器，恒温干燥箱，马弗炉，电子天平(准确至0.01mg，用于称量标准品)，电子天平(感量为0.1mg，用于称量油脂样品)，旋转蒸发仪，自动氮吹仪，基质分散固相萃取架或固相萃取装置，电热恒温加热套，水浴锅。
试剂与材料：
缩水甘油酯和氯丙醇酯标准品：缩水甘油棕榈酸酯(纯度不低于95％)、3-氯-1,2-丙二醇二棕榈酸酯(纯度不低于98％)、2-氯-1,3-丙二醇二硬脂酸酯(纯度不低于98％)，氘代同位素d5-缩水甘油棕榈酸酯(纯度95％)、氘代同位素d5-3-氯-1,2-丙二醇二棕榈酸酯(同位素纯度为99％)、氘代同位素d5-2-氯-1,3-丙二醇二硬脂酸酯(同位素纯度为99％)；
3-溴-1,2-丙二醇、3-氯-1,2-丙二醇、2-氯-1,3-丙二醇及其氘代同位素的七氟丁酰基咪唑衍生物(10μg/mL，用于质谱调谐或者确定碎片离子)。
其它试剂：硫酸(95％～98％)，溴化钠，碳酸氢钠，四氢呋喃(色谱纯)，二氯甲烷(色谱纯)，七氟丁酰基咪唑(含量不低于97.5％，封口冷冻保存)，甲醇(色谱纯)，无水硫酸钠，正己烷或者异辛烷(色谱纯)，质控用植物油(未精炼的毛油或者不含缩水甘油酯、氯丙醇酯的食用植物油，50mL/瓶，供加标试验时使用)。
实施例1
一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法，具体实施方案如下：
1.1标准溶液的配制
1.1.1单一标准储备液的配制(50.0μg/mL，均以醇计)：分别准确称取适量(精确至0.01mg)上述标准品于编号的6支10mL容量瓶中，用正己烷溶解，加入5mL异辛烷定容至刻度线，充分混匀后，得到浓度为50.0μg/mL的单一标准储备液(均以其游离态3-MCPD、2-MCPD、Gly、d5-3-MCPD、d5-2-MCPD、d5-Gly表示，以下同)，酯类折算为对应醇的系数如表1。溶液于-20℃下中保存，密封良好的情况下一般可放置6个月。也可直接使用可溯源的商品化标准溶液。
表1缩水甘油酯和氯丙醇酯折算为对应氯丙醇和缩水甘油的换算系数
1.1.2混合标准中间液的配制(10.0μg/mL)：分别准确移取2.00mL上述3-氯丙酯、2-氯丙酯和Gly酯标准储备液于同一支10mL容量瓶中，加入异辛烷(也可用正己烷代替)稀释，定容至10mL，充分摇匀，得到氯丙醇酯(3-MCPD酯、2-MCPD酯)和Gly酯混合标准中间液，封紧后于-20℃左右保存。
1.1.3混合标准工作液的配制(1.00μg/mL)：准确移取1.00mL氯丙酯和Gly酯混合标准中间液于10mL容量瓶中，加入正己烷稀释，定容至10mL，充分摇匀，得到氯丙酯和Gly酯混合标准工作液，于4～8℃保存，密封存放不超过2周。
1.1.4混合内标中间液(10.0μg/mL)：分别准确移取2.00mL内标储备液于同一支10ml容量瓶中，加入异辛烷稀释至10mL，充分摇匀，得到含d5-3-MCPD酯、d5-2-MCPD酯和d5-Gly酯的混合内标中间液，封紧后于－20℃保存。
1.1.5混合内标工作液(1.00μg/mL)：准确移取1.00mL上述混合内标中间液于10mL容量瓶中，加入正己烷或者异辛烷稀释定容至10mL，充分摇匀后于4～8℃保存。
1.2反应试剂溶液的配制：
1.2.1 0.70％溴化钠-硫酸溶液：准确称取1.00g溴化钠于15mL离心管中，加入10mL纯水，充分混匀；用移液枪准确取出1.00mL于另一支离心管中，准确加入1mL硫酸和12.28mL纯水，充分混匀，得0.70％NaBr溶液，其中硫酸的浓度为7.0％(V/V)。
1.2.2 1.8％硫酸－甲醇溶液：准确移取1.8mL硫酸于100mL甲醇中，充分混匀。
1.2.3 9.6％碳酸氢钠溶液：称取9.6g碳酸氢钠，加入100mL纯水溶解并混匀。
1.2.4 0.60％碳酸氢钠溶液：准确称取0.60g碳酸氢钠，加入100mL纯水溶解并混匀。
1.3缩水甘油酯和氯丙醇酯含量的测定
称样与加内标：准确称取0.100g食用油脂于15mL离心管中，加入2mL四氢呋喃；准确加入100μL混合内标工作液(1.00μg/mL)，涡旋混匀。
溴代反应：用移液器准确加入30μL 0.70％溴化钠溶液，涡旋混匀，于烘箱中50℃保温15min，然后加入3.0mL 0.60％碳酸氢钠溶液中和。加入3mL正己烷萃取，充分涡旋，待溶液分层后，将上层液体转移至另一支离心管中，氮吹至干，加入1.0mL四氢呋喃复溶。
酸水解：于复溶后的液体中加入1.8mL硫酸－甲醇溶液，涡旋混匀，于40℃下保温16h进行酸水解。结束后加入0.5mL9.6％碳酸氢钠中和。
基质分散固相萃取净化：将3000mg硅藻土倒入1500mg/50mL固相萃取柱中，再将上述中和后的水解液倒入萃取柱；先用25mL正己烷淋洗，弃去淋洗液；之后加入35mL二氯甲烷进行洗脱，并收集于50mL离心管中；将洗脱液用脱水剂充分脱水后，转入鸡心瓶或50mL离心管中，将此洗脱液于40℃减压或氮吹浓缩至0.5～1.0mL(不得蒸干)。将浓缩液转移至带刻度的5mL玻璃试管，用1.0mL正己烷分两次淋洗鸡心瓶或离心管，洗液一并转入试管中。
衍生：将50μL HFBI衍生剂快速加入试管中，盖塞后立即涡旋混匀。于烘箱中75℃保温30min。衍生结束后，放置室温后加入正己烷定容至0.5mL。加入2mL水，充分涡旋使上层溶液澄清，放置溶液分层后，将上层溶液转入含有内衬管的样品瓶中，供GC-MS/MS进样分析。
检测分析：气相色谱仪-用三重四级杆串联质谱仪检测分析。
气相色谱仪-三重四级杆串联质谱仪的色谱条件为：弱极性毛细管色谱柱(固定液为5％苯基和95％二甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：280℃；程序升温：50℃保持1min，再以3℃/min的速度升至100℃，最后以40℃/min的速度升至300℃，保持3min；载气：高纯氦气，流速0.8mL/min；碰撞气：高纯氮气；进样方式：不分流进样；进样体积：1.0μL。
三重四级杆串联质谱仪的质谱条件为：离子化方式：EI；离子源温度：230℃；传输线：280℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：5.0min；多反应监测模式(MRM)。监测离子对及质谱参数见表2。目标分析物的衍生物的全扫描质谱图和MRM质谱图见附图1-6。
表2缩水甘油和氯丙醇及其内标衍生物的质谱条件
注：带*的为定量离子对。
1.4标准工作曲线的制作
于5支离心管中，分别加入2.0mL四氢呋喃；每管准确加入100μl混合标准工作液(1.00μg/mL)，相当于100ng，涡旋混匀。分别准确加入10、50、100、200、300μL(见表3)1.00μg/mL混合标准工作液，以试样为0.1g计算，则分别相当于目标分析物(Gly酯、3-MCPD酯、2-MCPD酯)的含量分别为0.100、0.5.00、1.00、2.00、3.00mg/kg(均以醇计)。其余步骤按照1.4样品操作处理(自溴代反应开始的步骤)。并做空白对照试验，即不加样品，其他同样品操作。经衍生后，按浓度从低到高的顺序进样，内标标准曲线法定量。
表3氯丙醇酯/Gly酯标准工作曲线的制备
1.5缩水甘油酯或氯丙醇酯含量的计算
计算3-溴-1,2-丙二醇或氯丙醇的衍生物与对应同位素内标衍生物的峰面积比值，以各标准系列溶液中缩水甘油酯或氯丙醇酯质量(X,ng，均以醇计)与峰面积比值(Y)进行一次线性回归，即得标准工作曲线。按下式计算食用油脂或脂肪中缩水甘油酯和氯丙醇酯(3-MCPD酯、2-MCPD酯)的含量。
X，食用油脂中氯丙醇酯、缩水甘油酯的含量(均以醇计)，单位为μg/kg；
W，由标准曲线计算得到的油脂样品中的缩水甘油酯或氯丙醇酯的质量(均以醇计)，单位为纳克(ng)；
M，食用油脂或脂肪的质量，单位为g；
f，食用油脂取样前的稀释倍数(样品未稀释时为1.0)。
1.6质量控制
方法使用者在测定前应进行方法学指标的验证。进行实际样品测定时，应同步进行空白对照试验、平行试验、加标回收试验或者标准参考物(质控样)的测定。内标物的绝对回收率宜控制在50％～150％之间(与标准曲线5个浓度点内标峰面积的平均值比较)。空白对照试验测定值应小于检出限的1/2。平行对照试验：同批次样品中，宜按照10～20％的比例进行样品平行对照试验，同一样品平行测定结果的相对偏差应小于15％。必要时，对于Gly酯、3-MCPD酯、2-MCPD酯检出值含量异常高或者低者，应重新称样复测，排除样品或者实验操作受到污染、水解不成功或者内标加入不准确的可能。
实施例2
一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法，具体实施方案如下：缩水甘油酯和氯丙醇酯含量的测定采用气相色谱-质谱仪，其它处理步骤和条件同实施例1。气相色谱-质谱仪的气相色谱条件同实施例1中气相色谱-三重四级杆串联质谱仪的色谱条件；气相色谱-质谱仪的质谱条件为：离子化方式：EI；离子源温度：230℃；传输线：280℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：5.0min；选择离子监测模式(SIM)。监测离子见表4。
表4氯丙醇和缩水甘油及其内标的监测离子
注：带*的为定量离子对。
实施例3
本实施例对本发明方法的检出限与线性范围进行检测。基质效应是指相同浓度的目标物在纯溶剂和基质中的响应存在一定差异，不同目标物、不同基质、不同前处理方法以及不同的仪器状态下，其基质效应可能存在差别。以不含目标分析物的茶油毛油为空白基质，在空白基质中加入不同体积的混合标准工作液，配制混合基质标准工作溶液进行检测并回归分析，在本实施例中，以GC－MS/MS的MRM模式测定时方法的检出限为3～10μg/kg，SIM模式测定时方法的检出限为20～24μg/kg。缩水甘油酯和氯丙醇酯的线性范围在10～500ng之间，详见表5。
表5缩水甘油酯和氯丙醇酯的回归方程、检出限和定量限
实施例4
本实施例对本发明方法的准确度和精密度进行检测，方法的准确度、精密度分别用回收率、相对标准偏差衡量。在优化条件下，以不含目标分析物的茶油毛油、菜籽油毛油和市售初榨橄榄油为空白基质分别进行加标试验，加标浓度在50～1000μg/kg之间，同一基质下同一浓度加标重复6次，并根据测定结果计算各基质中Gly酯、3-MCPD酯、2-MCPD酯的平均回收率及相对标准偏差(RSD)，结果详见表6。由表6中数据可知，各基质中目标分析物的回收率均值为86.7～108％，相对标准偏差(RSD)为1.3～7.5％，见表6。菜籽毛油本底和加标1.0mg/kg的MRM和SIM谱图见附图7-16。
表6植物油中氯丙酯和Gly酯的加标回收率和相对标准偏差结果
回收率测定是方法准确度评价的一种方式，但其存在不足，如当样品溶液配制不准确或者待测成分与基质结合紧密，用现有方法无法充分提取出来时，即使回收率理想，其结果也是错误的。通过测定被定值的基质标准参考物质来衡量方法的准确性则是最佳、最可靠的做法，用本方法测定英国FAPAS能力验证的质控植物油样品，三类物质的测定结果均落在定值范围内，且与均值较为接近，参加了2018年的FAPAS国际间的能力验证成绩均合格，说明该方法的准确度较好。
实施例5
本实施例提供一种同时检测婴幼儿奶粉中缩水甘油酯和氯丙醇酯含量的方法，包括预处理(脂肪提取)步骤，预处理(脂肪提取)的具体方法如下：
(1)称样：准确称取1.60g(精确到0.01g)奶粉于50ml塑料离心管；
(2)溶解及破乳：加5ml 65±5℃蒸馏水溶解奶粉，加3ml氨水，振摇，于65℃水浴震30min，每10min观察一次，适时放气；
(3)萃取和浓缩：水浴后冷却至室温，加8ml乙醇，混匀；加15ml乙醚，涡旋1min；加15ml石油醚，手振摇30s，静置10min。分层取出上清液于鸡心瓶(干燥)。重复上述乙醚，石油醚提取(第二次：15ml乙醚和15ml石油醚同时加于离心管中，手震摇1min,静置10min,取上层液于鸡心瓶)(若不分层可考虑超声、离心等)。合并两次上清液，40℃旋蒸至溶液较少时，增加到65℃下旋蒸至体积不变。
(4)将油脂转移至15ml具塞试管(干燥，事先称重)，每次用2ml乙醚/石油醚(1:1)洗鸡心瓶，重复3次，洗液一并转移至15ml具塞试管，将试管于60℃水浴至体积不再变化(不盖盖子。大概需30min，要防止温度过高出现沸腾)；
(5)称重：将试管于102±2℃烘箱烘1h至恒重后，冷却至室温，称试管连同脂肪质量，与空管的差值即为脂肪质量，计算出奶粉中脂肪含量。盛取的脂肪的试管盖塞后置于5℃冰箱中冷藏保存。
提取的脂肪用于缩水甘油酯和氯丙醇酯含量的测定，后续具体步骤(称取样品并加内标物、溴代反应、酸水解反应、基质分散固相萃取净化、衍生化反应、色谱-质谱检测分析)同实施例1。婴幼儿奶粉中缩水甘油酯和氯丙醇酯含量的检测结果如表7所示。
表7婴幼儿奶粉中缩水甘油酯和氯丙醇酯含量及加标试验结果

Claims (9)

1.一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取样品并加内标物：称取食用油脂样品溶解，并加入混合内标工作液，得到油脂溶液；
(2)溴代反应：将所述油脂溶液与溴化物-硫酸溶液充分混合并进行溴代反应，加入碱中和反应液后用有机物萃取，收集有机相并浓缩，复溶得到溴代反应液；
(3)酸水解反应：将所述溴代液与硫酸－甲醇溶液充分混合并进行酸水解反应，加入碱中和反应液，得到酸水解反应液；
(4)基质分散固相萃取净化：将所述酸水解液倒入装有硅藻土的固相萃取柱中，淋洗后洗脱，将洗脱液脱水并浓缩，得到净化液；
(5)衍生化反应：将七氟丁酰基化试剂加入所述净化液中，混合均匀并进行衍生化反应，降至室温后将衍生反应液定容，与水充分混合后静置分层，收集有机相溶液得到待测溶液；
(6)检测分析：用气相色谱-三重四级杆串联质谱仪或气相色谱-质谱仪检测所述待测溶液，采用同位素内标标准曲线法定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品包括食用油脂、奶粉和油脂性食品，当所述食品为奶粉或油脂性食品时，所述同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法还包括所述食品的预处理，所述预处理为脂肪的提取。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述食用油脂的质量为80-120mg，所述油脂溶液的溶剂为四氢呋喃；所述混合内标工作液包括氘代同位素d5-3-氯-1,2-丙二醇酯、氘代同位素d5-2-氯-1,3-丙二醇酯、氘代同位素d5-缩水甘油酯。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述溴化物-硫酸溶液的加入量为10-50μL；所述溴代反应的温度45-60℃，所述溴代反应的时间10-25min；所述溴化物-硫酸溶液中溴化物质量浓度为0.5-1.0％，硫酸体积浓度为5-10％；用于萃取的所述有机物为正己烷，所述溴代反应液的溶剂为四氢呋喃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述硫酸－甲醇溶液的加入量为1-2.5mL；所述中酸水解反应的温度30-45℃，所述酸水解反应的时间12-18h；所述硫酸－甲醇溶液中硫酸体积分数为1-3％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述固相萃取柱用正己烷淋洗，用二氯甲烷、无水乙醚或者乙酸乙酯中的一种或多种洗脱。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述七氟丁酰基化试剂的加入量为20-100μL，所述七氟丁酰基化试剂为七氟丁酰基咪唑或七氟丁酸酐；所述衍生化反应的温度60-85℃，所述衍生化反应的时间20-45min；所述衍生反应液定容于正己烷、异辛烷或壬烷中。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述气相色谱-三重四级杆串联质谱仪或所述气相色谱-质谱仪的气相色谱条件为：色谱柱：弱极性毛细管色谱柱(固定液为5％苯基和95％二甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度260-300℃，程序升温：50℃保持1min，再以3℃/min的速度升至100℃，最后以40℃/min的速度升至300℃，保持3min；载气：高纯氦气，流速0.8-1.0mL/min；碰撞气：高纯氮气；进样方式：不分流进样；进样体积：1.0μL；
所述气相色谱-三重四级杆串联质谱仪的质谱条件为：离子化方式：EI；离子源温度：200-250℃；传输线温度：270-300℃；四级杆温度：130-160℃；溶剂延迟：5.0min；多反应监测模式(MRM)。
所述气相色谱-质谱仪的质谱条件为：离子化方式：EI；离子源温度：200-250℃；传输线温度：270-300℃；四级杆温度：130-160℃；溶剂延迟：5.0min；选择离子监测模式(SIM)。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(6)中标准工作曲线的绘制由5-7份混合标准工作液经步骤(2-6)测试分析得到；所述混合标准工作液成分包括：3-氯-1,2-丙二醇酯、2-氯-1,3-丙二醇酯、缩水甘油酯；所述混合标准工作液中各成分浓度在0-3.00mg/kg(以醇计)范围内梯度分布。
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