CN114441683A - 乳脂的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乳脂的测定方法，在分析技术手段的基础上，首次提出了一种基于多中心切割‑二维液相分离待测样品中甘油三酯和磷脂的方法，首次使用亲水作用色谱法(HILIC)结合反相色谱法对复杂成分分离方法，并结合柱后光衍生和离子淌度分析，以及飞行时间质谱定量，通过综合分析可鉴定出待测样品中全部的甘油三酯和磷脂，其中包括甘油三酯Sn‑1、2、3位置和磷脂R1、R2位置的脂肪酸组成，双键位置，顺反异构等信息。

Description

乳脂的测定方法
技术领域
本发明涉及食品领域，具体涉及一种食品领域营养物质的分析检测技术领域，更具体而言涉及乳脂的测定方法。
背景技术
乳脂是乳制品的重要组成部分，以大小不同的乳脂肪球形式稳定分散在乳中形成乳浊液。乳脂作为高质量的动物脂肪，具有构成人体成分、提供和储存能量、维持体温保护脏器、促进脂溶性维生素吸收及提供必需脂肪酸(亚油酸和亚麻酸等)的功能，人体对其消化率在95％以上。甘油三酯和磷脂是乳脂中重要的组成部分约占总乳脂95％以上，同时也是乳脂肪球膜蛋白(MFGM，立体结构见图1)的重要组成部分。目前还没有方法精准检测乳制品中的甘油三酯和磷脂的脂肪酸组成、双键定位及顺反构象等。
甘油三酯(Triacylglycerol，TAG或TG)是牛乳脂肪的主要组成成分，不仅是人体细胞组织以及体内各种重要生理活性物质的构成成分，也是各种生物功能的载体。由此可见，对甘油三酯进行深入研究的重要性。甘油三酯化学结构由一个甘油分子和三个脂肪酸分子缩合而成，脂肪酸占甘油三酯分子量构成的95％以上。如图2所示，在甘油(丙三醇)的Sn-1、2、3位，羟基可与脂肪酸中的羧基进行缩合反应，脂肪酸类型可以相同，也可以不同。研究表明，位于甘油三酯中Sn-1，3位的脂肪酸由于易被人体内的胰脂酶优先水解为游离脂肪酸而不能被吸收利用；而水解后剩余的Sn-1-脂肪酸单甘酯能与胆汁盐形成乳糜微粒而被机体有效吸收，因此处于Sn-2位脂肪酸的生物利用率更为有效。比如，当硬脂酸处于Sn-2位时具有升高血脂和胆固醇的作用，但当其位于sn-1，3位时则无此作用，Sn-2位连接的脂肪酸对于人体营养吸收程度的影响最大。因此甘油三酯的Sn位置异构对于乳脂的物理化学性质和营养品质也起着至关重要的作用。因此，乳制品中甘油三酯的结构、物理和化学性质及其对人体健康的影响成为乳脂的研究重点。
乳脂中含有几十种甚至上百种甘油三酯，并且存在大量的异构体。而具有功能的往往只是其中某一种异构体，例如1,3-油酸-2棕榈酸(rac OPO)和1,2-油酸-3-棕榈酸(rac-OOP)两种位置异构体中，只有rac-OPO具有生理功能，有利于脂肪的消化吸收。因此，乳脂中甘油三酯同分异构体的研究有利于进一步研究甘油三酯结构与功能的关系。
目前相对简单、易操作的甘油三酯结构分析方法是使用正相或反相色谱技术，根据甘油三酯侧链脂肪酸饱和度、含碳量等基本信息，从不同馏分色谱峰的保留时间对甘油三酯进行确定，即等价碳数原则(Equivalent carbon number,ECN)。例如，在使用反相色谱柱，如弱极性的C18固定相时，甘油三酯保留时间在非水流动相下，随ECN数量的增加而延长；而使用正向色谱柱时则正好相反。但此方法存在分离时间过长，有机溶剂消耗多和成本高等问题。另外，银离子交换住对甘油三酯也具有分离效果。银离子与碳碳双键的π电子可以发生相互作用，形成可逆的强极性复合物。基于这种可逆的相互作用，银离子修饰的硅胶固定相色谱柱，在弱极性流动相下，可分离不同ECN的甘油三酯。但双键数越多，甘油三酯在银离子色谱柱上的保留时间越长甚至根本不能被洗脱；且即使将多根银离子色谱柱串联使用，仍无法实现双键数大于7的LC-PUFA甘油三酯位置异构体的分离。有研究提出利用"槽式结构"和疏水相互作用的稠环芳烃(PAH)的色谱柱分析鱼油中长链多不饱和脂肪酸甘油三酯及其酰基位置异构体的液相色谱分析方法，但是无法定量检测。利用脂质分子与二价金属离子在紫外光解离下的特殊碎裂行为来对脂质分子中的Sn位置进行鉴定。但该方法仍难以实现脂质异构体的高通量结构解析。
磷脂(Phospholipid，PL)是一类含有磷酸基团的脂质，结构如图3。其广泛存在于植物油、大豆、蛋黄、乳制品、肉类中，具有多项生理活性功能。磷脂在乳中的存在形式为乳脂肪球滴，是乳脂肪球膜(MFGM)的主要组成物质(见图1)，由于其两亲性特征，磷脂在乳中起到了维持乳脂物理稳定性的作用。磷脂具有由磷酸相连的取代基团(含氨碱或醇类)构成的亲水头和由脂肪酸链构成的疏水尾，根据极性亲水头的组成不同，磷脂主要可分为磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)、神经鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)、磷脂酰甘油等几大类。
磷脂结构复杂、种类繁多，对磷脂的分析一直比较困难。现行的国家标准和国内外研究报道中，磷脂前处理方法通常使用传统的玻璃仪器进行液液萃取，有机试剂使用种类多，试剂消耗量大，实验成本大，工作效率低，且使用传统的玻璃仪器无法高速离心，造成磷脂回收率低，测定结果不准确，不适用于大批量样品的处理。磷脂检测方法以色谱法为主，高效液相色谱法可以对某单一组分磷脂进行检测，若样品中存在多种磷脂组分，则峰重合严重，分离度较差。气相色谱质谱联用(GC-MS)分析磷脂时，需要先对磷脂进行衍生化。GC-MS只能提供脂肪酰基的结构，不能对磷脂准确定性。有研究利用质谱技术被测定磷脂分量及分子种类，然而单纯的质谱手段存在同位素峰间干扰和结果再现性不稳定等问题，故而其检测受到限制。
因此，现有的研究集中于甘油三酯和磷脂单独分析，还没有一个可以系统检测乳制品甘油三酯和磷脂的方法。引用文献1提供了一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方法，其采用超高效液相色谱分离与电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)正、负离子扫描模式对样本中系列脂质成分检测分析，然而其仅用于不同磷脂的检测，而未应用于甘油三酯与磷脂的同时检测。引用文献2提供了一种基于超声单溶剂提取冻干食品中脂质的分析方法，其利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，提取冻干食品中脂质，并通过超高效液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱联用检测脂质。然而该方法仅能检测不同脂质的脂肪酸含量，无法进一步判断顺反异构体或双键位置等信息。而具体对于乳制品，如引用文献3，其提供一种食品脂质提取及检测食品脂质的方法，也仅能分析不同脂质的检测，而不能具体至顺反异构体或双键位置等。
近年来随着脂质组学在生物领域的发展为乳制品乳脂研究提供可能。目前针对脂质组学的分析手段主要近几年将Obitrap和TOF(Time of Flight)质谱分析仪器应用于脂质分析，其优点在于质量准确度高、离子获取速度快、分辨率和灵敏度高。但是，前人的研究中，定量分析是相对的，并且分析结果中有许多脂质缺失。虽然高分辨率质谱法很容易获得脂质分子的精确分子组成，确定脂质的种类，但串联质谱法仍然是脂质深层结构表征最直观确定的手段。为了解决脂质中Sn-1、2、3脂肪酸位置、双键位置，顺反异构体等问题，多种质谱(MS)方法和化学衍生化策略被设计和发展，如臭氧诱导离解(OzID)、紫外光解离(UVPD)、间氯氧化苯甲酸(m CPBA)环氧化反应与碰撞诱导解离(CID)MS/MS等。但是，受仪器修改和复杂性要求的限制，它们在脂质组学中的应用还不广泛。
引用文献
引用文献1：CN106093227A
引用文献2：CN110596260A
引用文献3：CN110243956B
发明内容
发明要解决的问题
目前大部分乳脂的检测方法均为单一检测，如引用文献1～3，无法获得同时获得甘油三酯及磷脂的具体信息，例如具体至顺反异构体、双键位置的确认。
针对上述问题，本发明在分析技术手段的基础上，首次提出了一种基于多中心切割-二维液相分离待测样品中甘油三酯和磷脂的方法，首次使用亲水作用色谱法(HILIC)结合反相色谱法对复杂成分分离方法，并结合柱后光衍生和离子淌度，以及飞行时间质谱定量，通过综合分析可鉴定出待测样品中全部的甘油三酯和磷脂，其中包括甘油三酯Sn-1、2、3位置和磷脂R1、R2位置的脂肪酸组成，双键位置，顺反异构等信息。
用于解决问题的方案
经过发明人潜心研究，发现通过以下方案能够解决上述技术问题：
[1].一种乳脂的测定方法，其中，所述的测定方法包括：
亲水/反相二维液相色谱分离的步骤：通过亲水/反相二维液相色谱的分离，从待测样品中，将具有不同脂肪酸组成的甘油三酯和/或磷脂彼此分离；
光衍生的步骤：对于各所述的具有不同脂肪酸组成的甘油三酯和/或磷脂，进行光衍生反应，获得光衍生反应物；
离子淌度分析的步骤：对各所述的光衍生反应物进行离子淌度分析，以将所述的光衍生反应物中具有不同顺反异构结构的甘油三酯和/或磷脂分离；
质谱检测的步骤：对已分离的各所述的具有不同顺反异构结构的甘油三酯和/或磷脂进行质谱检测，确定甘油三酯和/或磷脂的脂肪酸组成、脂肪酸位置以及双键位置。
[2].根据[1]所述的测定方法，其中，在所述的光衍生的步骤中，采用丙酮作为光衍生试剂，在紫外光激发下进行光化学反应。
[3].根据[2]所述的测定方法，其中，所述的紫外光的波长为254nm±50nm；反应温度为55±10℃；
优选地，所述的光衍生在衍生管中进行，衍生管内径为0.25±5mm、长度为24±5m；流速为0.30±0.1mL/min。
[4].根据[1]～[3]中任一项所述的测定方法，其中，所述的离子淌度分析的步骤包括以下条件：
a)惰性载气为N2；
b)淌度池气帘为He；
c)淌度池载气波高及波速：40±5V，600±100m/s；
d)淌度池Trap结构域入口电压、Transfer结构域入口电压：4±1V、5±1V；
e)离子释放时间：400±50ms；
f)离子延迟时间：300±50ms；
g)Transfer DC：10±2V。
[5].根据[1]～[4]中任一项所述的测定方法，其中，所述的质谱检测采用飞行时间质谱，电离方式为带电喷雾离子源ESI+；采集模式为灵敏度模式。
[6].根据[1]～[5]中任一项所述的测定方法，其中，所述的亲水/反相二维液相色谱包括第一维亲水液相色谱和第二维反相液相色谱；其中，
所述的第一维亲水液相色谱，将待测样品中的甘油三酯及具有不同极性亲水头的磷脂组分彼此分离；随后通过所述的第二维反相液相色谱，将分离的甘油三酯及具有不同极性亲水头的磷脂组分中具有不同脂肪酸组成的甘油三酯和/或磷脂进一步彼此分离。
[7].根据[6]所述的测定方法，其中，所述第一维亲水液相色谱采用亲水相互作用液相色谱法，流动相包括A相和B相，A相采用有机溶剂，B相采用离子交换剂的水溶液；和/或，
所述第二维反相液相色谱采用反相色谱法，流动相包括C相和D相，C相为包括盐离子交换剂的水溶液、酸离子交换剂和有机溶剂的混合液；D相为溶有盐离子交换剂的有机溶剂、酸离子交换剂和有机溶剂的混合液。
[8].根据[7]所述的测定方法，其中，在A相中，所述有机溶剂选自DMSO、乙腈、DMF、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸、异丙醇、吡啶中的一种或多种；和/或，
在B相中，所述离子交换剂包括酸离子交换剂和盐离子交换剂，其中，盐离子交换剂包括甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种；酸离子交换剂包括甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上。
[9].根据[7]或[8]所述的测定方法，其中，在C相中，所述盐离子交换剂包括甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种；所述酸离子交换剂包括甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上；所述有机溶剂选自DMSO、乙腈、DMF、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸、异丙醇、吡啶中的一种或多种；和/或，
在D相中，所述盐离子交换剂包括甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种；所述酸离子交换剂包括甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上；所述有机溶剂选自DMSO、乙腈、DMF、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸、异丙醇、吡啶中的一种或多种。
[10].根据[1]～[9]中任一项所述的测定方法，其中，在亲水/反相二维液相色谱分离的步骤前，还包括从待测样品中抽提乳脂的步骤，其采用选自索氏提取法、酸水解法、罗兹-哥特里法、巴布科克法和盖勃法中的乳脂的抽提方法。
[11].根据[1]～[10]中任一项所述的测定方法，其中，所述的测定方法还包括标准曲线的构建的步骤，其包括：分别采用甘油三酯和/或磷脂的标准物质经由所述亲水/反相二维液相色谱分离的步骤、光衍生的步骤、离子淌度分析的步骤、质谱检测的步骤，并制作标准曲线。
[12].[1]～[11]中任一项所述的测定方法在乳或乳制品检测中的应用；优选的，所述乳制品为乳粉；更优选的，所述乳粉为婴幼儿配方奶粉。
发明的效果
通过以上技术方案的实施，本发明能够获得如下的技术效果：
本发明提供的乳脂的测定方法首次提出了一种基于多中心切割-二维液相分离样品中甘油三酯和磷脂的方法，首次使用HILIC结合反相色谱对复杂成分分离方法，并结合与柱后光衍生和离子淌度，飞行时间质谱定量，通过综合分析可鉴定出样品中全部的甘油三酯和磷脂，本发明提供的乳脂的测定方法可以一次处理样品得到甘油三酯和磷脂Sn-1、2、3位置的脂肪酸组成，双键位置，顺反异构等信息。结合质谱技术精准分析不同样品的脂质数据。
附图说明
图1为乳脂肪球膜(MFGM)立体结构示意图。
图2为甘油三酯化学结构示意图。
图3为磷脂类化合物结构示意图。
图4为本发明对比例1中的色谱图。
图5为本发明对比例2保留时间17.246min质谱图。
图6为本发明对比例3中磷脂酰胆碱质谱图。
图7为本发明实施例中甘油三油酸酯离子淌度拆分后子离子分布及结构鉴定。
图8为本发明实施例中磷脂酰丝氨酸质谱分析后子离子分布及结构鉴定。
图9为本发明实施例中采用的仪器的流路状态示意图。
图10为本发明实施例中HILIC/反相二维液相色谱示意图。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本发明提供的乳脂的测定方法，经多中心切割-二维液相法色谱分离后，与丙酮发生柱后光化学衍生反应后，通过淌度分析对甘油三酯及磷脂异构体进行拆分，飞行时间质谱定性与定量。本发明的方法可以一次处理样品得到甘油三酯和磷脂Sn-1、2、3位置的脂肪酸组成，双键位置，顺反异构等信息。结合质谱技术精准分析不同样品的脂质数据。
以下对本发明的乳脂的测定方法进行具体说明。
<样品来源以及乳脂抽提>
在本发明的测定方法中，对于测试样品没有特别的限制，例如可以为乳、乳制品或其他任何含有甘油三酯和/或磷脂的样品，例如食品样品。
在本发明中，“乳”指的是哺乳动物乳腺生产的液体，如牛(例如奶牛)、山羊、绵羊或骆驼。
在本发明中，“乳制品”是指其中主要成分之一是基于乳的任何食品。
本发明中对于“乳制品”来源没有特别的限制，其可以是指由动物如牛、山羊、绵羊、牦牛、马、骆驼以及其他哺乳动物生产的食物产品。
乳制品的示例是低脂乳(例如，0.1％、0.5％或1.5％的脂肪)、无脂乳、乳粉、全脂乳、全脂乳制品、黄油、酪乳、酪乳制品、脱脂乳、脱脂乳制品、高乳脂产品、炼生乳、鲜奶油、奶酪、冰淇淋和甜食产品、益菌饮料或益生菌酸奶型饮料。其中，“乳粉”是指通过蒸发奶至干燥而制成的人造乳制品。在本发明一些优选的实施方案中，本发明的测定方法中的样品来源于牛或羊的乳粉制品。
在本发明的一些实施方案中，在进行待测样品中乳脂的测定前，待测样品可以进行乳脂抽提的步骤，尤其是甘油三酯和磷脂的抽提。本发明对于抽提待测样品中的乳脂的方法没有特别的限制，例如可以采用索氏提取法、酸水解法、罗兹-哥特里法(Rose-Gottlieb)、巴布科克法和盖勃法中涉及的脂质的抽提。
在本发明的一些优选的实施方案中，可以采用罗兹-哥特里法对待测样品中的乳脂品进行抽提，简要地，其利用氨水溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨水-乙醇溶液中，从而将甘油三酯和磷脂游离出来，再用乙醚-石油醚提取出甘油三酯和磷脂，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂成分。
在本发明的一些具体的实施方案中，在进行乳脂抽提的步骤前，还可以包括对待测样品的前处理的步骤，例如针对颗粒较大的待测样品，前处理可以为对待测样品的粉碎，以使颗粒大小合适。又如对于含水分的待测样品，前处理的步骤可以为干燥，优选例如冷冻干燥法。
<亲水/反相二维液相色谱>
在本发明中，使用亲水/反相二维液相色谱对抽提得到的乳脂中的不同脂肪酸构成的甘油三酯及磷脂分离。
在本发明中，亲水/反相二维液相色谱是基于二维高效液相色谱的“多中心切割模式”，混合物(抽提得到的乳脂)经过第一维亲水液相色谱柱分离后，将第一维洗脱馏分中感兴趣的一个或几个组分(第一维亲水液相色谱柱分离的甘油三脂及不同极性亲水头的磷脂，包括磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰肌醇PI、神经鞘磷脂SM、磷脂酰甘油等)通过在线切换转移到第二维反相液相色谱进行进一步分离，以将具有不同脂肪酸组成的甘油三酯及磷脂进一步分离。
在本发明的一些具体实施方案中，在进行测定前，一般需要对样品进行预实验，即在第一维亲水液相色谱后连接检测器，根据目标化合物的保留时间，确定柱切换的时间。“多中心切割模式”比较适合目标组分的分析，可以减少整个分析时间，提高分析效率。
在本发明中，亲水/反相二维液相色谱(2D-HILIC/RPLC)色谱柱可以采用强极性的固定相(如硅胶)，使用高比例的有机相(如乙腈)或者低比例的水相作为流动相，以适用于本发明的甘油三酯和磷脂亲水性强、极性较大化合物的分离。由于亲水/反相二维液相色谱具有复杂的分离机制，其在天然组分分离分析方面显示出较大的优势。因此构建2D-HILIC/RPLC可以用来分析复杂成分体系，系统分离能力及峰容量均得到较大提高。目前大部分研究在于分离蛋白及维生素，尚未有研究将此方法应用脂质组学的分离。乳脂中有上百种甘油三酯及磷脂，成分复杂，本发明提出用此方法对待测样品中的甘油三酯、磷脂进行分离。
(第一维亲水液相色谱)
在本发明的第一维亲水液相色谱可以采用适于分离脂质的色谱柱，例如适于亲水相互作用液相色谱法色谱柱，例如强极性的亲水相互作用液相色谱柱，其适合于甘油三酯和磷脂亲水性强、极性较大化合物的分离。优选地，可以采用基质为亚乙基桥杂化颗粒(BEH)的色谱柱，颗粒粒径在1～2μm，孔径为
Figure BDA0003493953420000101
适于亲水相互作用液相色谱法色谱柱可以商购获得，示例性的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC，2.1×100mm(内径×柱长)，1.7μm(颗粒粒径)。
在本发明的一些实施方案中，第一维亲水液相色谱的色谱条件包括：流动相包括A相和B相，其中，A相作为有机相，B相为水相。
在本发明的一些实施方案中，A相采用有机溶剂，可以选择的有机溶剂包括DMSO、乙腈、DMF、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸、异丙醇、吡啶中的一种或多种。
在本发明的一些优选的实施方案中，A相采用乙腈与异丙醇的组合，其中，按体积百分比，乙腈为85～99％，异丙醇为0.5～20％；更优选地，乙腈98％，异丙醇2％。
在本发明的一些实施方案中，B相采用离子交换剂的水溶液，离子交换剂为质谱兼容的酸和/或盐，盐有甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种，酸为甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上。离子交换剂一方面可以提高第一维亲水液相色谱的分离性，另一方面与质谱兼容增加电喷雾时的可电离性。
一些具体实施方案中，B相可以为1～100mmol/L甲酸铵水溶液，优选为5～15mmol/L甲酸铵水溶液，其pH值为4.0±0.5，优选4.0±0.3，更优选4.0±0.1。
在本发明的一些实施方案中，第一维亲水液相色谱采用梯度洗脱，流速：0.4±0.2mL/min，优选为0.4±0.1mL/min。色谱柱柱温：30±3℃，优选为35±2℃、35±1℃。
在本发明的一些具体实施方案中，所述梯度洗脱包括：
0min：A相85％～95％，B相5％～25％；
1.5min：A相80％～90％，B相10％～20％；
2.5min：A相80％～90％，B相10％～20％；
5min：A相80％～90％，B相10％～20％；
6min：A相85％～95％，B相5％～25％。
在本发明的一些更具体实施方案中，所述梯度洗脱包括：
0min：A相90％，B相10％；
1.5min：A相85％，B相15％；
2.5min：A相85％，B相15％；
5min：A相84％，B相16％；
6min：A相90％，B相10％。
经历上述的第一维亲水液相色谱，乳脂中的甘油三酯及磷脂组分分离，其中，磷脂包括磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰肌醇PI、神经鞘磷脂SM、磷脂酰甘油等。
(第二维反相液相色谱)
在本发明的第二维反相液相色谱采用适合于分离脂质的反相色谱柱，例如强极性的反相色谱柱，例如基质为表面带电杂化颗粒(CSH)的色谱柱，颗粒粒径在1～2μm，孔径为
Figure BDA0003493953420000111
适合于分离脂质的反相色谱柱可以市售获得，示例性的，ACQUITY UPLC CSH C18，2.1×100mm(内径×柱长)，1.7μm(颗粒粒径)。
在本发明的一些实施方案中，第二维反相液相色谱的色谱条件包括：流动相包括C相和D相。
在本发明的一些实施方案中，C相为包括盐离子交换剂的水溶液、酸离子交换剂和有机溶剂的混合液，其中，盐离子交换剂的水溶液、酸离子交换剂和有机溶剂的体积比为(3～5)：(0.005～0.02)：(4～8)。在一些具体的实施方案中，盐离子交换剂的水溶液为甲酸铵的水溶液。更具体地，在C相中，甲酸铵浓度为5～15mmol/L。在一些具体的实施方案中，酸离子交换剂为甲酸。在一些具体的实施方案中，有机溶剂为乙腈。在一些更具体的实施方案中，C相为甲酸铵的水溶液、甲酸和乙腈的混合液。
在本发明的一些实施方案中，D相为溶有盐离子交换剂的有机溶剂、酸离子交换剂和另一种有机溶剂的混合液。其中，溶有盐离子交换剂的有机溶剂、酸离子交换剂和另一种有机溶剂的体积比为(7～9.5)：(0.005～0.02)：(0.5～2)。在一些具体的实施方案中，溶有离子交换剂的有机溶剂为甲酸铵的异丙醇溶液。更具体地，在D相中，甲酸铵的浓度为5～15mmol/L。在一些具体的实施方案中，酸离子交换剂为甲酸。在一些具体的实施方案中，另一种有机溶剂为乙腈。在一些更具体的实施方案中，D相为甲酸铵的异丙醇溶液、甲酸和乙腈的混合液。
在本发明的一些实施方案中，第二维反相液相色谱采用梯度洗脱，流速：0.4±0.2mL/min，优选为0.4±0.1mL/min。色谱柱柱温：55℃±5℃，优选为55±3℃、55±1℃。
在本发明的一些具体实施方案中，所述梯度洗脱包括：
0min：C相55～65％，D相35～45％；
2.0min：C相52～62％，D相38～48％；
2.1min：C相45～55％，D相45～55％；
12.0min：C相41～51％，D相49～59％；
12.1min：C相25～35％，D相65～75％；
18.0min：C相0.5～2.5％，D相97.5～99.5％；
18.1min：C相55～65％，D相35～45％；
20.0min：C相55～65％，D相35～45％。
在本发明的一些更具体实施方案中，所述梯度洗脱包括：
0min：C相60％，D相40％；
2.0min：C相57％，D相43％；
2.1min：C相50％，D相50％；
12.0min：C相46％，D相54％；
12.1min：C相30％，D相70％；
18.0min：C相1％，D相99％；
18.1min：C相60％，D相40％；
20.0min：C相60％，D相40％。
<柱后光衍生>
在本发明中，对于经过亲水/反相二维液相色谱分离的具有不同脂肪酸组成的甘油三酯及磷脂分离进行柱后光衍生反应的步骤。利用丙酮柱后光衍生技术，利用丙酮作为衍生试剂，样品在色谱柱流出后，进行Paternò-Büchi(PB)光化学反应，以在后续质谱检测中，通过进入质谱带电喷雾离子源ESI+下产生[M+58+H]+的离子，进而对[M+58+H]+做MS/MS，产生Δ26的诊断离子对，从而判断碳碳双键位置。
在本发明的一些实施方案中，对于经过亲水/反相二维液相色谱分离的不同甘油三酯及磷脂溶于光衍生试剂(例如丙酮)中，在紫外光激发下进行Paternò-Büchi(PB)光化学反应。
在本发明的一些优选实施方案中，光衍生试剂为丙酮，其对脂质具有良好的溶解性，并对紫外光呈惰性。同时，丙酮也为良好的电喷雾溶剂，便于后续的质谱检测。在本发明的一些优选实施方案中，紫外光为波长254nm±50nm的紫外光，优选254nm±30nm，更优选254nm±10nm。
在本发明的一些实施方案中，柱后光衍生反应可以在衍生管中进行，例如内径为0.25±5mm、长度为24±5m的衍生管，流速为0.30±0.1mL/min。在本发明的另一些实施方案中，也可以采用市售的柱后光衍生仪器。
在本发明的一些实施方案中，柱后光衍生反应的温度在55±10℃，优选55±5℃。
<离子淌度分析>
在本发明中，对于进行柱后光衍生反应的产物进一步进行离子淌度分析。
由于不同来源乳粉、油脂中所含脂类物质种类繁多，且化学结构多为相似的脂肪酸结构，在本发明的方法中也将首次尝试对乳脂使用离子淌度谱技术(Ion mobility，IM)，对甘油三酯及磷脂分子进行进一步分离。其主要依靠不同结构甘油三酯及磷脂在惰性载气中相互作用时，甘油三酯及磷脂碰撞横截面积(Cross-collision section，CCS)差异性导致相互作用力不同，从而依靠迁移时间对不同CCS值的甘油三酯及磷脂进行分离，得出脂质的顺反异构体。
在本发明的一些具体实施方案中，离子淌度分析的条件包括：
a)惰性载气：N2；
b)淌度池气帘：He；
c)淌度池载气波高及波速：40±5V，600±100m/s；
d)淌度池Trap结构域入口电压、Transfer结构域入口电压：4±1V、5±1V；
e)离子释放时间：400±50ms；
f)离子延迟时间：300±50ms；
g)Transfer DC：10V±2V。
本发明的方法中，采用上述条件可以有效分离甘油三酯及磷脂中的不同顺反异构体，并可用于后续质谱检测进行定量。
<质谱检测>
在本发明中，在进行离子淌度分析对后，对亲水/反相二维液相色谱中分离的具有不同脂肪酸组成的甘油三酯及磷脂基于其顺反异构体进行进一步的分离，进而进行质谱检测。
如前所述的，以在质谱检测中，样品由于进行了柱后光衍生，通过进入质谱ESI+下产生[M+58+H]+的离子，进而对[M+58+H]+做MS/MS，产生Δ26的诊断离子对，从而判断碳碳双键位置。同时，在本发明中，质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)为电离源的飞行时间质谱，即多中心切割-二维液相色谱-柱后衍生串联离子淌度飞行时间质谱法，其中，ESI在脂质分析中可以起到两方面重要作用：可使甘油三酯和磷脂分子解离成不同电荷的离子，并根据离子质荷比的不同，判断甘油三酯和磷脂的种类，用于甘油三酯和磷脂完整分子量的确证；利用MS-TOF获得甘油三酯和磷脂碎片离子峰，对甘油三酯和磷脂完成结构鉴定。
在本发明的具体实施方案中，利用飞行时间质谱对具有不同脂肪酸组成的甘油三酯及磷脂定性及定量。
在本发明的具体实施方案中，质谱参考条件还包括：
a)采集模式：灵敏度模式；
b)毛细管电压：2.5kV；锥孔电压：40V；离子源温度：120℃；
c)雾化气温度：500；雾化气流速：800L/h；
d)锥孔气流速：50L/h；采集质量范围：m/z 50-1200；
e)扫描时间：0.2s；碰撞能量：Low CE 6eV，High CE 25-45eV；
f)Lock mass：亮氨酸脑啡肽LE 400ng/mL。
<标准曲线的构建>
通过标准曲线的建立以确定定量分析对比的依据，同时也可以确定检测体系或检测方法的检出限和定量限。
本发明的乳脂的测定方法还包括标准曲线的构建的步骤，具体地，分别采用不同乳脂的标准物质制备一系列不同浓度的标准物质工作溶液，经历上述的亲水/反相二维液相色谱、柱后光衍生、离子淌度分析和质谱检测的步骤，根据检测的标准物质工作溶液的各自目标化合物的色谱峰的峰面积对应浓度作图，得到标准曲线回归方程。
此外，在进行标准曲线的建立时，优选地通过同位素内标法对标准曲线的精度进行验证。
本发明中标准曲线的R值(线性相关系数)应当为0.99以上。
进一步地，根据构建的标准曲线回归方程，分别得到不同乳脂的浓度，进而确定乳脂在待测样品中的含量。
本发明以上提供的不同乳脂的测定方法，可以用于例如乳制品等终端商品的检测，也可以通过自动化设置而作为例如乳制品等生产在线检测监控方法。
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行具体的说明：
1试剂和材料
1.1试剂
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
1.1.1水，GB/T 6682，一级。
1.1.2乙腈(CH3CN，色谱纯)。
1.1.3丙酮(CH3COCH3，色谱纯)。
1.1.4异丙醇((CH3)2CHOH，色谱纯)。
1.1.5甲酸铵(HCOONH4，色谱纯)。
1.1.6甲酸(HCOOH，色谱纯)。
1.1.7氨水(NH4OH，色谱纯)。
1.1.8无水乙醇(CH3CH2OH，色谱纯)。
1.1.9乙醚[(CH3CH2)2O，色谱纯]。
1.1.10石油醚(沸程30～60℃，色谱纯)。
1.2试剂配制
1.2.1流动相A：量取乙腈(1.1.2)980mL，加入异丙醇(1.1.4)20mL。
1.2.2流动相B：称取0.63g甲酸铵(1.1.5)，用950mL水溶解，用甲酸(1.1.6)调pH至4.0±0.1后用水定容至1000mL。
1.2.3流动相C：称取0.63g甲酸铵(1.1.5)，加入400mL水溶解，加入1mL甲酸(1.1.6)，用乙腈(1.1.2)定容至1000mL。
1.2.4流动相D：称取0.63g甲酸铵(1.1.5)，加入900mL异丙醇(1.1.4)溶解，加入1mL甲酸(1.1.6)，用乙腈(1.1.2)定容至1000mL。
1.3标准物质
脂质标准品购自Avanti Polar Lipides，为同位素内标液，详细信息见表1所示。
表1：本实施例使用的标准物质信息
Figure BDA0003493953420000171
Figure BDA0003493953420000181
Figure BDA0003493953420000191
1.4标准溶液的配制
同位素内标工作液：取1.3所述同位素内标溶液0.5mL，用一维初始比例流动相A(1.2.1)和B(1.2.1)定容至10mL，4℃下避光保存。
1.5材料
1.5.1微孔滤膜：有机相，0.22μm。
1.5.2一维色谱：ACQUITY UPLC BEH HILIC，2.1×100mm,1.7μm。
1.5.3二维色谱：ACQUITY UPLC CSH C18，2.1×100mm,1.7μm。
2仪器和设备
2.1离子淌度飞行时间质谱：带电喷雾离子源。
2.2天平：感量0.01g、0.1mg。
2.3离心机：转速不低于10000转/min。
2.4定量移液器：10μL～1mL。
2.5旋转蒸发仪。
2.6恒温水浴摇床。
2.7多中心切割-二维液相色谱系统。
2.8光化学衍生器。
3样品前处理
称取婴幼儿配方奶粉(飞鹤乳业，星飞帆3段奶粉)1.0g至抽脂瓶中，加入60℃±2℃的水10mL溶解试样，振摇，使样品完全分散。于上述试样中加入2mL氨水(1.1.7)，置于60℃±2℃水浴加热15min～20min，不时取出震荡。取出后冷至室温。
脂质提取：在制备好的样品中加入10mL无水乙醇(1.1.8)，缓和但彻底地进行混合，避免液体太接近瓶颈。加入25mL乙醚(1.1.9)，塞上瓶塞，将抽脂瓶保持在水平位置，手动振摇1min。加入25mL石油醚(1.1.10)，加塞振摇1min，直到上层液澄清，并明显与水相分离。有机层转入磨口烧瓶中，再加入25mL乙醚(1.1.9)及25mL石油醚(1.1.10)，加塞振摇1min，静置，分层，有机层转入磨口烧瓶中，合并提取液于磨口烧瓶中。将磨口烧瓶置于旋转蒸发器上，在60℃±2℃的水浴条件下通入氮气旋转蒸发至近干。使用移液管按照一维初始比例准确加入10mL流动相A和B于烧瓶中，混匀溶解后使用移液管吸取5mL，加入1mL混合同位素内标工作液(1.4)，用一维初始比例流动相A和B定容至25mL，混匀后吸取2mL溶液，过0.22μm有机系滤膜后上机。
4液相色谱-串联质谱参考条件
4.1液相色谱参考条件
4.1.1一维色谱参考条件
a)色谱柱：参照1.5.2，或相当者。
b)流动相：流动相A(1.2.1)和流动相B(1.2.2)。
c)流速：0.4mL/min。
d)色谱柱柱温：30℃。
e)梯度洗脱：见表2。
表2：一维色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0003493953420000211
f)进样体积：20μL；
g)阀切换时间：第一组阀切换时间为脂质起始出峰时间至结束时间，共6个片段；
第二组阀切换时间为每种组分起始出峰时间至结束时间。
4.1.2二维色谱色谱参考条件
a)色谱柱：参照1.5.3，或相当者。
b)流动相：流动相C(1.2.3)和流动相D(1.2.4)。
c)流速：0.4mL/min。
d)色谱柱柱温：55℃。
e)梯度洗脱：见表3。
表3：二维色谱梯度洗脱条件
序号 时间(min) C(％) D(％)
1 0 60 40
2 2.0 57 43
3 2.1 50 50
4 12.0 46 54
5 12.1 30 70
6 18.0 1 99
7 18.1 60 40
8 20.0 60 40
f)进样体积：20μL。
4.2柱后光衍生条件
a)光衍生溶剂：丙酮(1.1.3)；
b)流速：0.30mL/min；
c)柱温：55℃；
d)衍生管内径：0.25mm；
e)衍生管长度：24m；
f)紫外灯波长：254nm。
4.3离子淌度分析方法主要参数如下所示：
a)惰性载气：高纯N2；
b)淌度池气帘：高纯He；
c)淌度池载气波高及波速：40V，600m/s；
d)淌度池Trap结构域入口电压、Transfer结构域入口电压：4V、5V；
e)离子释放时间(Release time)：400ms；
f)离子延迟时间(Mobility delay)：300ms；
g)Transfer DC：10V。
4.4质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a)电离方式：ESI+；
b)采集模式：灵敏度模式；
c)毛细管电压：2.5kV；锥孔电压：40V；离子源温度：120℃；
d)雾化气温度：500；雾化气流速：800L/h；
e)锥孔气流速：50L/h；采集质量范围：m/z 50-1200；
f)扫描时间：0.2s；碰撞能量：Low CE 6eV，High CE 25-45eV；
g)Lock mass：亮氨酸脑啡肽LE 400ng/mL。
4.5试样溶液的测定
取3处得到的待测溶液进样，计算样品中待测物的含量。试液中待测物的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围应适当稀释后重新测定。
5试验数据处理
试样中各物质含量的质量分数X计，数值以微克每千克(μg/kg)表示，按下列公式计算：
Figure BDA0003493953420000231
式中：
X——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
C——标准溶液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
Ci——测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A——测定液中待测组分的峰面积；
Asi——标准溶液中内标物质的峰面积；
V——定容体积，单位为毫升(mL)；
Csi——标准溶液中内标物质的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
Ai——测定液中内标物质的峰面积；
As——标准溶液中待测组分的峰面积；
m——样品称样量，单位为克(g)。
计算结果保留两位有效数字。
5精密度
在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10％。
对比例
对比例1
重复实施例，除了不进行步骤4.1.2-4.4外，即只进行一维液相检测。
对比例2
重复实施例，除了不进行步骤4.2外。
对比例3
重复实施例，除了不进行步骤4.3外。
实施例的具体结果见下表4-1至表4-5。
Figure BDA0003493953420000251
Figure BDA0003493953420000261
Figure BDA0003493953420000271
Figure BDA0003493953420000281
Figure BDA0003493953420000291
图4、图5、图6分别显示了对比例1(只进行一维液相色谱法)、对比例2(不进行柱后光衍生)、对比例3(不进行离子淌度分析)测定的样品图谱。
由图4和图7-图8可以看出，图4显示对比例1只用一维液相只能对大类的磷脂和甘油三酯定性保留时间及峰面积定量无法保证准确性(即，只可获得表4-1至表4-5中“一维液相保留时间(min)”一列的数据)，本发明通过增加二维液相等技术，解决了脂质定量问题；解决了无法确定同分异构体和碳碳双键的缺陷，使异构体完美分离。
由图5和图7-图8可以看出，图5显示对比例2未经过柱后光衍生的能分辨异构体，但是无法确定双键位置(即无法获得表4-1至表4-5中“双键位置”和“碳碳双键位置及顺反异构结果”两列的数据)，本发明通过增加柱后光衍生技术，解决了无法定位碳碳双键的问题。
由图6和图7-图8可以看出，图6显示对比例3未进行离子淌度分析，无法分离脂肪酸顺反异构体情况(即无法获得表4-1至表4-5中“淌度质谱峰面积(n＝3)”、“脂肪酸化合物顺反异构”和“碳碳双键位置及顺反异构结果”三列的数据)，本发明通过增加离子淌度分析技术，解决了无法确定脂肪酸异构体的问题。
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。
产业上的可利用性
本发明提供的乳脂的测定方法在乳制品等生产中可以用于精确测定乳脂中全部种类的甘油三酯及磷脂的测定。

Claims (12)

1.一种乳脂的测定方法，其特征在于，所述的测定方法包括：
亲水/反相二维液相色谱分离的步骤：通过亲水/反相二维液相色谱的分离，从待测样品中，将具有不同脂肪酸组成的甘油三酯和/或磷脂彼此分离；
光衍生的步骤：对于各所述的具有不同脂肪酸组成的甘油三酯和/或磷脂，进行光衍生反应，获得光衍生反应物；
离子淌度分析的步骤：对各所述的光衍生反应物进行离子淌度分析，以将所述的光衍生反应物中具有不同顺反异构结构的甘油三酯和/或磷脂分离；
质谱检测的步骤：对已分离的各所述的具有不同顺反异构结构的甘油三酯和/或磷脂进行质谱检测，确定甘油三酯和/或磷脂的脂肪酸组成、脂肪酸位置以及双键位置。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，在所述的光衍生的步骤中，采用丙酮作为光衍生试剂，在紫外光激发下进行光化学反应。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的紫外光的波长为254nm±50nm；反应温度为55±10℃；
优选地，所述的光衍生在衍生管中进行，衍生管内径为0.25±5mm、长度为24±5m；流速为0.30±0.1mL/min。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述的离子淌度分析的步骤包括以下条件：
a)惰性载气为N2；
b)淌度池气帘为He；
c)淌度池载气波高及波速：40±5V，600±100m/s；
d)淌度池Trap结构域入口电压、Transfer结构域入口电压：4±1V、5±1V；
e)离子释放时间：400±50ms；
f)离子延迟时间：300±50ms；
g)Transfer DC：10±2V。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述的质谱检测采用飞行时间质谱，电离方式为带电喷雾离子源ESI+；采集模式为灵敏度模式。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述的亲水/反相二维液相色谱包括第一维亲水液相色谱和第二维反相液相色谱；其中，
所述的第一维亲水液相色谱，将待测样品中的甘油三酯及具有不同极性亲水头的磷脂组分彼此分离；
随后通过所述的第二维反相液相色谱，将分离的甘油三酯及具有不同极性亲水头的磷脂组分中具有不同脂肪酸组成的甘油三酯或磷脂进一步彼此分离。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述第一维亲水液相色谱采用亲水相互作用液相色谱法，流动相包括A相和B相，A相采用有机溶剂，B相采用离子交换剂的水溶液；和/或，
所述第二维反相液相色谱采用反相色谱法，流动相包括C相和D相，C相为包括盐离子交换剂的水溶液、酸离子交换剂和有机溶剂的混合液；D相为溶有盐离子交换剂的有机溶剂、酸离子交换剂和有机溶剂的混合液。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，在A相中，所述有机溶剂选自DMSO、乙腈、DMF、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸、异丙醇、吡啶中的一种或多种；和/或，
在B相中，所述离子交换剂包括酸离子交换剂和盐离子交换剂，其中，盐离子交换剂包括甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种；酸离子交换剂包括甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上。
9.根据权利要求7或8所述的测定方法，其特征在于，在C相中，所述盐离子交换剂包括甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种；所述酸离子交换剂包括甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上；所述有机溶剂选自DMSO、乙腈、DMF、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸、异丙醇、吡啶中的一种或多种；和/或，
在D相中，所述盐离子交换剂包括甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种；所述酸离子交换剂包括甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上；所述有机溶剂选自DMSO、乙腈、DMF、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸、异丙醇、吡啶中的一种或多种。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的测定方法，其特征在于，在亲水/反相二维液相色谱分离的步骤前，还包括从待测样品中抽提乳脂的步骤，其采用选自索氏提取法、酸水解法、罗兹-哥特里法、巴布科克法和盖勃法中的乳脂的抽提方法。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述的测定方法还包括标准曲线的构建的步骤，其包括：分别采用甘油三酯和/或磷脂的标准物质经由所述亲水/反相二维液相色谱分离的步骤、光衍生的步骤、离子淌度分析的步骤、质谱检测的步骤，并制作标准曲线。
12.权利要求1～11中任一项所述的测定方法在乳或乳制品检测中的应用；优选的，所述乳制品为乳粉；更优选的，所述乳粉为婴幼儿配方奶粉。
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