CN102323229B - 粮食加工副产物中脂肪氧化酶活力的快速测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种米糠脂肪氧化酶活力的快速检测方法，是先将米糠进行部分脱脂，然后以缓冲溶液浸提经部分脱脂米糠中的脂肪氧化酶，将该酶提取溶液加入到预先配置的磷酸盐-亚油酸-吐温20底物溶液中，在234nm、25℃下5min内测定吸光光度值的变化，测定酶提取液中蛋白含量，即可求得米糠中脂肪氧化酶的活力；该方法操作简便，结果准确，重现性好，可广泛应用于粮食加工企业、仓储企业及粮油检测机构的粮油品质检验与控制。
Description
技术领域
本发明涉及粮食精深加工领域，特指一种稻麦加工副产物米糠、麦胚中脂肪氧化酶活力的快速检测方法，可广泛应用于粮食加工企业、仓储企业及粮油检测机构的品质检验与控制。
背景技术
稻谷、小麦是人类主要食物资源，在加工过程中会产生大量的副产品――米糠、小麦胚芽、麸皮等，这些副产物含有丰富的营养成分，同时也富含脂肪酶、脂肪氧化酶等，在酶的催化作用下这些副产物很容易水解酸败，因而目前主要作为饲料出售，附加值较低。为了充分利用粮食资源，需要对粮食及其加工副产物的品质进行酶的钝化处理，其中脂肪氧化酶活力的准确测定是确定稳定化处理工艺的基础。
目前，脂肪氧化酶活力测定方法主要有紫外分光光度法、氧电极法等，其中紫外分光光度法应用比较普遍。分光光度法测定的是酶催化反应的初期产物，脂肪氧化酶催化底物亚油酸反应生成的初期产物具有共轭二烯的结构，通过测定反应体系在234nm 处的吸光度可以定量生成的共轭二烯量，并推算出酶活力。
底物溶液的透明是利用分光光度法精确测定脂肪氧化酶活性的一个重要前提，反应缓冲体系pH 则是影响测定准确度的关键因素。已有的研究表明，原料类型、反应温度、底物浓度、吐温浓度及反应缓冲体系pH 等多种因素均会对脂肪氧化酶活力测定结果准确性产生影响。
（1）在脂肪氧化酶活性测定体系中底物溶液的透明度是利用分光光度法精确测定脂肪氧化酶活性的一个重要前提。在pH9.0的条件下，往底物中加入吐温-20能够获得透明的底物溶液，然而使用缓冲溶液调整底物pH到所需范围时，一旦溶液pH处于中性或酸性，亚油酸的溶解度又逐渐降低、底物溶液重新开始混浊。同时，吐温-20过高还会对酶产生竞争性抑制。（2）反应体系的pH是决定脂肪氧化酶活性测定灵敏性和准确性的关键因素。它不仅影响底物的稳定性，也决定着脂肪氧化酶活力的大小。（3）原料类型。不同来源的脂肪氧化酶，酶的最适pH和最适温度范围有着较大差异。有些最适pH偏酸性，如大麦胚芽（6.0～6.3）和蚕豆（5.8）等，有些偏碱性，如英国豌豆Ⅰ型脂肪氧化酶（9.0～10.0）。绿豆和蚕豆的脂肪氧化酶最适温度为30℃，低于葵花籽（35℃）和甜玉米胚芽（50℃）。所以，应根据原料类型选择合适的缓冲体系pH和反应温度。（4）反应体系的浊度。分光光度法要求测定体系不能有浊度，现有的脂肪氧化酶活力测定方法均包含繁琐的酶纯化过程。
国外关于米糠脂肪氧化酶活力测定方法的研究也不多，主要有1961年Dixon、1975年Shastry、1987年Aurand等人报道了紫外分光光度法测定米糠脂肪氧化酶的方法，此后Ramezanzadeh等人和Malekian等人在米糠的稳定化研究中分别引用上述方法，并稍作修改。但实质上，以上学者所用的方法非常相近：均是首先以磷酸盐缓冲液提取米糠脂肪氧化酶，随后对粗酶液进行纯化处理，底物溶液均为“乙醇溶液+亚油酸+硼酸盐缓冲溶液”，然后以底物溶液为参比，在234nm、25℃下测定5min内吸光度值变化，最后计算米糠脂肪氧化酶活力。该法存在以下不足：首先米糠含油丰富，缓冲液浸提脂肪酶后，水相表层的脂肪层难以分离，有时需要反复离心才能使粗酶液澄清，导致结果重现性差；其次需要对粗酶液进行纯化处理，操作繁琐；在底物溶液的配制上，“乙醇溶液+亚油酸”溶液中加入数倍体积硼酸盐缓冲溶液（pH8.5）后，反应体系呈微乳白，透光性差。
发明内容
为了解决目前测定米糠脂肪氧化酶方法中存在的酶提取液中脂肪层难以去除、酶提取及纯化步骤繁杂、底物体系中底物溶液体系透光率差等缺陷，本发明通过部分脱脂操作来提升粗酶液清澈度，同时提高测定灵敏度；通过改变底物溶液组成及pH环境提高测定的重现性，从而为广大粮食生产企业及科研机构提供一种快速、准确测定米糠中脂肪氧化酶的方法。
本发明的技术方案是通过以下方式实现的：粮食加工副产物中脂肪氧化酶活力的快速测定方法，是先将米糠进行部分脱脂，然后以缓冲溶液浸提经部分脱脂米糠中的脂肪氧化酶，将该酶提取溶液加入到预先配置的磷酸盐-亚油酸-吐温20底物溶液中，在234nm、25℃下5min内测定吸光光度值的变化，测定酶提取液中蛋白含量，即可求得米糠中脂肪氧化酶的活力；其特征在于：包括以下步骤：
1）、米糠部分脱脂：米糠过300目筛，取筛下物，加入5～10倍体积的弱极性有机溶剂，置于气浴摇床中，以100～250rpm振荡脱脂20～120min；
所述的有机溶剂为正己烷、乙醚、石油醚或乙酸乙酯。
2）、去溶风干：经米糠部分脱脂处理后，倾斜倒出脱脂的有机溶剂后，将米糠铺平在室温下自然风干，收集备用，冬季可置于烘箱中，20～40℃热风烘干20～60min，以去除残余溶剂；
3）、提取粗酶液：取处理后的米糠，加入1~5倍体积的0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5），在0~20 ℃下、用磁力搅拌器搅拌提取20~60min，悬浮液用两层洁净纱布过滤，滤液于4 ℃、5000～12000rpm离心直至提取液澄清为止，即为粗酶液；
4）、配制底物溶液：称取50～200μL亚油酸加入到10mL容量瓶中，以无水乙醇定容至10mL，取粗酶液1～5mL，加入10～50μL吐温-20；采用旋转蒸发器减压蒸发除去乙醇，剩余固形物溶解在50～100mL 0.05 mol/L的Na2HPO4缓冲溶液中，随后往其中滴加0.5mol/L NaOH，调节pH值至9.0，即为底物溶液；
所述的亚油酸浓度和吐温-20的浓度分别为2.53×10-3 mol/L和0.08% w/v。
所述的底物溶液需要隔次使用时，应以N2保护，4 ℃避光保存。
5）、制备酶测定液：取步骤3）中制得的粗酶液30μL，与2mL 0.05M、pH为7.5的磷酸盐缓冲液以1:1～4稀释，作为酶测定液；
6）、测定酶促反应速率：以2.0mL磷酸盐缓冲溶液、200μL底物溶液和在60℃水浴中加热处理15min的酶提取液10~50μL为参比；以2.0mL磷酸盐缓冲溶液、200μL底物溶液、10~50μL酶测定液，在紫外分光光度计中于234nm，15～45℃下检测5~15min内吸光度值的变化值，即为米糠脂肪氧化酶酶促反应速率△OD234/min；
7）、制作标准曲线：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL无水乙醇中，加入85%W/V磷酸100 ml，用蒸馏水定容至1 L；制作0～1000 μg/ml牛血清白蛋白液制作标准曲线；
8）、测定酶蛋白含量：吸取米糠脂肪氧化酶测定液0.01～0.1 mL放入具塞刻度试管中，加入5 ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2 min后在595nm波长下比色，记录吸光度值，通过步骤（7）中制得的标准曲线可测得酶测定液中蛋白含量mg/mL；
9）、求得米糠中脂肪氧化酶的活力：将步骤6）和步骤8）分别得到的△OD234/min和蛋白含量代入下式：
脂肪氧化酶相对活力=△OD234/min÷蛋白含量，其中△OD234/min单位=0.001AU/min，即可求得米糠中脂肪氧化酶的活力。
本发明的优点：采用弱极性有机溶剂对测试样品进行部分脱脂，降低了米糠这类粗脂肪含量较高的物料中的含油量，以利于在脂肪氧化酶提取过程中的固液分离；同时，对米糠脂肪氧化酶能起到激活作用，有效提高米糠脂肪氧化酶的检出限；本发明中采用“无水乙醇-亚油酸-吐温20体系，简单快速获得了透明的底物溶液；选用“缓冲溶液+底物溶液+钝化处理的粗酶液”为参比液，有效消除粗酶液的测量误差，省去了粗酶液纯化的繁杂步骤；本发明在获取米糠脂肪氧化酶酶学特性基础上，灵活选择pH为7.5的缓冲体系，保证了底物的相对稳定与测定结果的准确性。
附图说明
图1为具体的测定路线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述。
实施例1：
1、米糠部分脱脂：取新鲜米糠1kg，过300目筛子，取过筛后的米糠，加入5倍体积正己烷，置于气浴摇床中，室温下150rpm振荡脱脂30min。
2、去溶风干：经米糠部分脱脂处理后，倾斜倒出上层正己烷，将米糠铺平在室温下自然风干，收集备用。
3、提取粗酶液：取脱脂米糠3份，每份10g，分别加入40ml磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）于5℃下搅拌30min，随后过双层洁净纱布。滤液于4℃、12000rpm离心30min，获得澄清的粗酶液。
4、配制底物溶液：称取111μL浓度为2.53×10-3 mol/L的亚油酸加入到10mL容量瓶中，以无水乙醇定容至10mL，取粗酶液3.55mL，加入40μL浓度为2.53×10-3 mol/L和0.08% w/v的吐温-20；采用旋转蒸发器减压蒸发除去乙醇，剩余固形物溶解在50mL 0.05 mol/L的Na2HPO4缓冲溶液中，随后往其中滴加0.5mol/L NaOH，调节pH值至9.0，即为底物溶液。此时底物溶液清澈度高，当底物溶液需要隔次使用时，应以N2保护，4 ℃避光保存。
5、配制酶测定液：取步骤3中的粗酶液与磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）1:1稀释后，作为酶测定液，备用。
6、测定酶促反应速率：以2.0mL磷酸盐缓冲溶液、200μL底物溶液、30μL粗酶液为参比；在紫外分光光度计中于25℃、234nm下5min内吸光度值的变化率为：0.0325、0.0324、0.0326，酶测定蛋白含量为3.43mg/ml，则脂肪氧化酶活力值=0.0325 ÷（3.43×30×10-3）=0.319。即为米糠脂肪氧化酶酶促反应速率△OD234/min。
7）、制作标准曲线：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 ml无水乙醇中，加入85%W/V磷酸100 ml，用蒸馏水定容至1 L；制作0～1000 μg/ml牛血清白蛋白液制作标准曲线。
8）、测定酶蛋白含量：吸取米糠脂肪氧化酶测定液0.01～0.1 ml放入具塞刻度试管中，加入5 ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2 min后在595nm波长下比色，记录吸光度值，通过步骤（7）中制得的标准曲线可测得酶测定液中蛋白含量mg/mL。
9）、将步骤（6）和步骤（8）分别得到的△OD234/min和蛋白含量代入下式：
脂肪氧化酶相对活力=△OD234/min÷蛋白含量，其中△OD234/min单位=0.001AU/min，即可求得米糠中脂肪氧化酶的活力。
实施例2：
取新鲜米糠1kg，过300目筛子，取过筛后的米糠，加入10倍体积正己烷，室温下180rpm振荡脱脂40min。随后倒出上层正己烷，剩余脱脂米糠于室温下铺平自然风干。
准确称取111μL亚油酸加入到10mL容量瓶中，以无水乙醇定容至刻度，取上述溶液3.55mL，加入40μL吐温-20。减压蒸发除去乙醇，剩余固形物溶解在50mL 0.05 mol/L的Na2HPO4溶液中，随后往其中滴加0.5 mol/L NaOH，调节pH值至9.0，此时底物溶液清澈度高。该底物溶液中亚油酸浓度和吐温-20的浓度分别为2.53×10-3 mol/L、0.08%（w/v）。
取脱脂米糠3份，每份20g，加入80ml磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）于10℃下搅拌30min，随后过双层洁净纱布。滤液于4℃、10000rpm离心30min，获得澄清的粗酶液。此粗酶液与磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）1:1稀释后，作为酶测定液，备用。
测定体系组成：2mL 0.05M磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）＋200μL底物【亚油酸和吐温-20浓度分别是2.53mM、0.08％（w/v）】＋30μL粗酶液
20℃、234nm下5min内吸光度值的变化率为：0.0197、0.0199、0.0198，求得均值为：0.0198。酶测定蛋白含量为2.66mg/ml，则脂肪氧化酶活力值=0.0198÷（2.66×30×10-3）=0.248。
实施例3：
准确称取111μL亚油酸加入到10mL容量瓶中，以无水乙醇定容至刻度，取上述溶液3.55mL，加入40μL吐温-20。减压蒸发除去乙醇，剩余固形物溶解在50mL 0.05 mol/L的Na2HPO4溶液中，随后往其中滴加0.5 mol/L NaOH，调节pH值至9.0，此时底物溶液清澈度高。该底物溶液中亚油酸浓度和吐温-20的浓度分别为2.53×10-3 mol/L、0.08%（w/v）。
取新鲜米糠1kg，过300目筛子，取过筛后的米糠，加入8倍体积正己烷，室温下160rpm振荡脱脂20min。随后倒出上层正己烷，剩余脱脂米糠于室温下铺平自然风干。
取脱脂米糠3份，每份25g，加入100ml磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）于5℃下搅拌30min，随后过双层洁净纱布。滤液于4℃、12000rpm离心30min，获得澄清的粗酶液。此粗酶液与磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）1:1稀释后，作为酶测定液，备用。
测定体系组成：2mL 0.05M磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）＋200μL底物【亚油酸和吐温-20浓度分别是2.53mM、0.08％（w/v）】＋40μL粗酶液
35℃、234nm下5min内吸光度值的变化率为：0.0378、0.038、0.0376，酶测定蛋白含量为1.36mg/ml，则脂肪氧化酶活力值=0.0378÷（1.36×30×10-3）=0.926。
Claims (3)
1.粮食加工副产物中脂肪氧化酶活力的快速测定方法，是先将米糠进行部分脱脂，然后以缓冲溶液浸提经部分脱脂米糠中的脂肪氧化酶，将该酶提取溶液加入到预先配置的磷酸盐-亚油酸-吐温20底物溶液中，在234nm、25℃下5min内测定吸光光度值的变化，测定酶提取液中蛋白含量，即可求得米糠中脂肪氧化酶的活力；其特征在于：包括以下步骤：
1）米糠部分脱脂：米糠过300目筛，取筛下物，加入5～10倍体积的弱极性为正己烷、乙醚、石油醚或乙酸乙酯的有机溶剂，置于气浴摇床中，以100～250rpm振荡脱脂20～120min；
2）去溶风干：经米糠部分脱脂处理后，倾斜倒出脱脂的有机溶剂后，将米糠铺平在室温下自然风干，收集备用，冬季可置于烘箱中，20～40℃热风烘干20～60min，以去除残余溶剂；
3）提取粗酶液：取处理后的米糠，加入1～5倍体积的0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.5，在0～20 ℃下、用磁力搅拌器搅拌提取20~60min，悬浮液用两层洁净纱布过滤，滤液于4 ℃、5000～12000rpm离心直至提取液澄清为止，即为粗酶液；
4）配制底物溶液：称取50～200μL亚油酸加入到10mL容量瓶中，以无水乙醇定容至10mL，取粗酶液1～5mL，加入10～50μL吐温-20；采用旋转蒸发器减压蒸发除去乙醇，剩余固形物溶解在50～100mL 0.05 mol/L的Na2HPO4缓冲溶液中，随后往其中滴加0.5mol/L NaOH，调节pH值至9.0，即为底物溶液；
5）制备酶测定液：取步骤3）制得的粗酶液30μL，与2mL 0.05M、pH为7.5的磷酸盐缓冲液以1:1～4稀释，作为酶测定液；
6）、测定酶促反应速率：以2.0mL磷酸盐缓冲溶液、200μL底物溶液和在60℃水浴中加热处理15min的酶提取液10~50μL为参比；以2.0mL磷酸盐缓冲溶液、200μL底物溶液、10~50μL酶测定液，在紫外分光光度计中于234nm，15～45℃下检测5~15min内吸光度值的变化值，即为米糠脂肪氧化酶酶促反应速率△OD234/min；
7）制作标准曲线：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 ml无水乙醇中，加入85%W/V磷酸100 ml，用蒸馏水定容至1 L；制作0～1000 μg/ml牛血清白蛋白液制作标准曲线；
8）测定酶蛋白含量：吸取米糠脂肪氧化酶测定液0.01～0.1 ml放入具塞刻度试管中，加入5 ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2 min后在595 nm波长下比色，记录吸光度值，通过步骤（7）中制得的标准曲线可测得酶测定液中蛋白含量mg/mL；
9）求得米糠中脂肪氧化酶的活力：将步骤6）和步骤8）分别得到的△OD234/min和蛋白含量代入下式：脂肪氧化酶相对活力=△OD234/min÷蛋白含量，其中△OD234/min单位=0.001AU/min，即可求得米糠中脂肪氧化酶的活力。
2. 根据权利要求1所述的粮食加工副产物中脂肪氧化酶活力的快速测定方法，其特征在于：所述的步骤4）中的亚油酸浓度和吐温-20的浓度分别为2.53×10-3 mol/L和0.08% w/v。
3. 根据权利要求1所述的粮食加工副产物中脂肪氧化酶活力的快速测定方法，其特征在于：所述的步骤4）中的底物溶液需要隔次使用时，应以N2保护，4 ℃避光保存。
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