CN102174191A - 聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，本发明将mPEG通过连接桥与甾体、三萜等多种脂溶性化合物相连接，合成了一类mPEG修饰的水溶性衍生物：OS-Z-mPEG，该类衍生物在不添加任何助溶剂的条件下，原本脂溶性的有机化合物完全溶于水中，进行均相生物转化或催化，反应结束后，通过mPEG聚合物的溶剂沉淀特性，将转化产物选择性从发酵液中沉淀过滤收集出来，达到解决脂溶性化合物溶解难题和简化转化产物分离的目的。

Description

聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用

技术领域

本发明属于助溶剂领域，尤其是一种聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用。

背景技术

OECD指出“生物催化技术是工业可持续发展最有希望的技术”。近年来，随着生物技术和有机合成化学的迅速发展和相互交叉渗透，生物催化技术已逐步成为一种标准的有机合成方法，与化学合成技术相比，生物催化具有选择性高、反应条件温和、对环境友好等特点，是生物技术和有机合成研究的热点和前沿方向，目前已广泛应用于医药、精细化工、食品添加剂、日用化学品、材料等领域。

生物催化剂包括生物酶和微生物细胞，具有工业应用价值的生物酶主要来源于微生物菌种，对于多酶系统和具有辅酶的生物催化，常常采用微生物的整细胞参与反应，又称微生物转化反应。应用微生物进行的生物转化，绝大多数的有机底物都是脂溶性的，在水中溶解度小，降低了底物的利用率和反应速率。因此，脂溶性化合物的微生物转化需要解决的关键问题是提高底物的溶解度，并保持生物催化剂的活性和稳定性。

介质系统是在水溶液中加入具有生物相溶性而本身不被降解的组分，创造出生物催化剂具有活性和稳定性的人工环境，达到增加底物溶解度和提高生物催化剂的催化效率的目的，这种组分主要包括水溶性有机溶剂，无机盐、多醇类添加剂，吐温、冠醚等表面活性剂。随着有机相生物催化技术的发现和发展，又逐渐出现了双水相系统、反胶束系统、浊点系统、超临界系统、离子液系统等非水相生物催化技术，这些系统均从不同角度和一定程度上解决了脂溶性化合物因底物难溶性而对反应速率产生的限制，添加水溶性的有机助溶剂(单一水相系统)或水不溶性的有机溶剂(与水组成了两相反应系统)主要从有机溶剂对底物的增溶来考虑，但存在较难克服的“溶剂抑制”现象，即有机溶剂对细胞的毒性和酶活性与稳定性的抑制。其中含有表面活性剂的反应体系，优势在于表面活性剂可以增加反应的比界面积，并延伸出来了反胶束系统、乳液或微乳液系统、浊点系统，利于提高反应速率，并降低底物/产物抑制，主要限制因素在这些非水相的两相反应系统中，酶的活性和稳定性。目前研究和开发的介质系统，绝大多数在底物溶解性和细胞/酶的活性和稳定性二者之间难以同时兼顾。浊点系统在上述两方面相对兼顾得较好，但在两相生物催化器和工程放大方面仍有许多要解决的新问题。

组合化学已成为化学家合成大量化合物的一项强有力方法，组合化学的主要技术是树脂支撑的合成，即“固相”有机合成和“液相”有机合成，其中“固相”有机合成获得了很大的成功，但由于非均相反应的本质限制其应用的范围，因此逐渐发展用可溶性树脂支撑代替不溶性交叉连接树脂，反应条件与经典的有机化学反应条件相类似，产品的纯化也可以利用大分子的性能，这种方法，称为液相合成(LPOS)，在本质上避免了固相合成的困难而保留了它积极的方面，这个过程最根本的原理是在溶液中可溶性聚合物和试剂进行化学反应，当反应结束后，聚合物载体通过沉淀从反应体系中分离出来，然后过滤收集。

发明内容

本发明的目的在于提供聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，将聚乙二醇(mPEG)与脂溶性化合物形成连接物后作为发酵底物，不仅增加溶液中底物浓度，提高反应效率，还能简化分离提纯方法。

本发明是通过以下技术方案实现目的的：

聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用。

而且，所述聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物的结构式OS-mPEG或OS-Z-mPEG，其中，OS是脂溶性化合物，PEG为聚乙二醇；Z为连接基，m为H、烷基、酰基。

而且，所述聚乙二醇PEG的分子量为200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000或20000。

而且，所述连接基Z包括-CO(CH₂)_nCO-，其中n＝1-8的整数，或-NH(CH₂)_nCO-，其中n＝1-8的整数，或-NH(CH₂)_nX-，其中n＝1-10的整数，X＝O、S、NH，或-CO-Ar-CH₂-，其中Ar为芳基；脂溶性化合物包括甾体类化合物、三萜类化合物。

而且，所述甾体类化合物包括雌二醇、睾酮、黄体酮、甲羟孕酮、左炔诺孕酮、可的松、氢化可的松、皮质酮、地高辛、洋地黄毒苷和毒毛花苷、3α，7α，12α-三羟胆烷酸。

而且，所述三萜类化合物包括榔色酸、龙涎香醇、黄芪醇及其皂苷、灵芝酸，Iucidenicacid A，Iucidone A、人参皂苷、酸枣仁苷元及其皂苷、伊比林内酯、泽泻醇、羊毛甾烯、葫芦苦素、雪胆甲素及乙素、大戨醇、乳香酸、齐墩果酸、甘草次酸、柴胡皂苷元及皂苷、商路酸、地榆皂苷、积雪草酸及其皂苷、黑蔓醇、羽扇豆醇、白桦脂醇、白桦脂酸。

而且，所述聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物的制备方法如下：

(1)取mPEG和连接基Z溶于有机溶剂中，利用缩合方法进行缩合，减压蒸干有机溶剂，得到油状固体，加入乙醇溶解，加入无水乙醚析出沉淀，过滤收集沉淀，真空干燥；

(2)将步骤(1)所得干燥产物以及脂溶性化合物按不同的官能团，进行缩合方法进行缩合，减压蒸干有机溶剂，得到油状固体，加入乙醇溶解，加入无水乙醚析出沉淀，过滤收集沉淀，真空干燥；

(3)所得粗产物用重结晶溶剂进行重结晶，真空干燥即得OS-Z-mPEG，

步骤(1)中mPEG与连接基z的摩尔比为1∶2-8，催化剂与连接基z的摩尔比例为1-2∶1，所述有机溶剂为甲苯、1，4-二氧六环或氯仿；所述缩合方法包括：酰氯法，酸酐法，缩水剂脱水法；

步骤(3)重结晶溶剂为冰乙醇、无水乙醚、异丙醇之一或两种以上的混合物。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明中mPEG通过连接桥与甾体、三萜等多种脂溶性化合物相连接，合成了一类mPEG修饰的水溶性衍生物OS-Z-mPEG，该衍生物能使原本脂溶性的有机化合物在无需添加任何助溶剂的条件下完全溶解于水中，再利用mPEG聚合物的沉淀特性，将转化产物选择性地从发酵液中沉淀出来，不仅解决了脂溶性化合物难溶于水的问题，同时简化了产物的分离方法。

2、本发明将合成后的化合物应用到均相生物转化或催化反过程中，使脂溶性化合物和酶同处一相的均相转化系统，提高了底物的溶解度，提高了转化效率，反应结束后，再通过mPEG聚合物的溶剂沉淀特性，将转化产物选择性从发酵液中沉淀过滤收集出来，简化了分离纯化工序。

3、本发明首次将PEG等可溶性载体技术应用到生物转化中，来改善水不溶性有机底物/产物的水溶性，极大地提高了反应速率以及分离纯化效率。

附图说明

图1为本发明中制备实施例1中3-氧代齐墩果酸-28-(4-甲酸聚乙二醇单酯)-苄酯核磁共振氢谱；

图2为图1中A部放大示意图；

图3为本发明中制备实施例2中3-甲基聚乙二醇丁二酰齐墩果酸的磁共振氢谱；

图4为本发明中制备实施例3中3-(1-甲基聚乙二醇单酯-4-丁二酰)-胆固醇的磁共振氢谱；

图5为本发明生物催化实施例1中15β-羟基齐墩果酸的X-射线晶体衍射分析图；

图6为为本发明生物催化实施例2中3，4-开环-齐墩果-12-烯-4-醇-3，28-二酸的X-射线晶体衍射分析图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一、聚乙二醇(mPEG)与脂溶性化合物OS-Z-mPEG的合成简介

本部分已经存在相关文献的报道，为现有技术，其中聚乙二醇(mPEG)与脂溶性化合物通过化学反应连接到一起，形成结构式为OS-Z-mPEG的化合物，其中，OS是脂溶性化合物，选自但不限于甾体类化合物、三萜类化合物或其衍生物；Z是连接基，选自但不限于-CO(CH₂)_nCO-(n＝1-8的整数)、-NH(CH₂)_nCO-(n＝1-8的整数)、-NH(CH₂)_nX-(n＝1-10的整数，X＝O、S、NH等)、-CO-Ar-CH₂-(Ar为芳基)，或者没有连接基；mPEG为取代或不取代的聚乙二醇(

n＝整数)，优选是单取代的聚乙二醇，m选自但不限于H、烷基、酰基等，mPEG分子量选自但不限于200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000或20000；

其中，甾体类化合物选自但不限于雌二醇、睾酮、黄体酮、甲羟孕酮、左炔诺孕酮、可的松、氢化可的松、皮质酮、地高辛、洋地黄毒苷、毒毛花苷、3α，7α，12α-三羟胆烷酸等；

三萜类化合物选自但不限于榔色酸、龙涎香醇、黄芪醇及其皂苷、ganoderic acid C，Iucidenic acid A，Iucidone A、人参皂苷、酸枣仁苷元及其皂苷、伊比林内酯、泽泻醇、羊毛甾烯、葫芦苦素、雪胆甲素及乙素、大戨醇、乳香酸、齐墩果酸、甘草次酸、柴胡皂苷元及皂苷、商路酸、熊果酸、地榆皂苷、积雪草酸及其皂苷、黑蔓醇、羽扇豆醇、白桦脂醇、白桦脂酸；

制备上述聚乙二醇(mPEG)与脂溶性化合物及其衍生物的连接物的连接方法，具体包括下述步骤：

(1)取mPEG和连接基Z溶于有机溶剂中，利用常规缩合方法进行缩合，减压蒸干有机溶剂，得到油状固体，加入少量乙醇溶解，加入无水乙醚析出沉淀，常规方式过滤收集沉淀，真空干燥；

(2)将步骤(1)所得干燥产物以及脂溶性化合物按不同的官能团，进行常规缩合反应，减压蒸干有机溶剂，得到油状固体，加入少量乙醇溶解，加入无水乙醚析出沉淀，常规方式过滤收集沉淀，真空干燥；

(3)所得粗产物用冰乙醇、无水乙醚、异丙醇、或混合溶剂进行重结晶，真空干燥即得OS-Z-mPEG，

步骤(1)中mPEG与连接基z的摩尔比为1∶2-8，催化剂与连接基z的摩尔比例为1-2∶1，所述有机溶剂为甲苯、1，4-二氧六环或氯仿；常规缩合方法包括：酰氯法，酸酐法，缩水剂脱水法等；

步骤(2)中常规缩合方法包括：酰氯法，酸酐法，缩水剂脱水法等；

步骤(3)中所使用的重结晶溶剂可以单独使用冰乙醇、无水乙醚、异丙醇或两两混合；

二、本发明提供的三个具体制备实施例

实施例1

3-氧代齐墩果酸-28-(4-甲酸甲基聚乙二醇酯)-苄酯的制备

3-氧代齐墩果酸-28-(4-甲酸聚乙二醇单酯)-苄酯的合成路线

(1)4-溴甲基苯甲酰氯的制备：在烧瓶中加入4-溴甲基-苯甲酸(2.15g 10mmol)和甲苯(10ml)，缓慢滴加草酰氯(2.97ml 35mml)，室温搅拌10min，50℃加热搅拌3h。反应完成后减压蒸干备用。

(2)4-溴甲基苯甲酸聚乙二醇单酯的制备：加入mPEG(5g 2.5mmol)和甲苯(20ml)，回流24h。反应完成后，减压蒸干甲苯，得到黄色油状固体，用20ml无水乙醚洗涤三次，过滤，真空干燥后得白色粉末(4.97g 2.27mmol产率90.7％)；

(3)3-氧代齐墩果酸-28-(4-甲酸聚乙二醇单酯)-苄酯的合成：在烧瓶中加入mPEG-4-溴甲基苯甲酸酯(4.97g 2.21mmol)、3-氧代-齐墩果酸(4.1g 9mmol)、三乙胺(0.31ml 2.21mmol)和甲苯(20ml)，回流48h.反应完成后，减压蒸干溶剂，加入少量乙醇和100mL乙醚，过滤的固体，用无水50ml乙醚洗涤3次，真空干燥得浅黄色固体粉末，产率89％。

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)：0.906(s，3H，CH₃)，0.926(s，3H，CH₃)，1.007(s，3H，CH₃)，1.034(s，3H，CH₃)，1.079(s，3H，CH₃)，1.141(s，3H，CH₃)，1.255(s，3H，CH₃)，3.36(s，3H，OCH ₃ )，3.65(m，OCH ₂ CH ₂ O)，5.32(dt，1H，H-12)，7.46(dd，2H，Ph-2’，6’)，8.05((dd，2H，Ph-3’，5’).

实施例2

3-甲基聚乙二醇丁二酰齐墩果酸的制备

3-甲基聚乙二醇丁二酰齐墩果酸的合成路线

(1)1，4-丁二酸甲基聚乙二醇单酯的合成：在烧瓶中加入m-PEG(20g 10mmol)、丁二酸酐(10g 10mmol)、吡啶(8ml 10mmol)和三氯甲烷(50ml)，回流48h。反应完成后，减压蒸干三氯甲烷，沉淀物冰浴下溶于饱和碳酸氢钠溶液(200ml)，滤去不溶物，乙酸乙酯(20ml)萃取2次(除去吡啶)，滤液冷却到0-5℃用盐酸酸化，调节PH＝2，用二氯甲烷(100ml)萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸干二氯甲烷得油状固体，用无水乙醚(100ml)洗涤三次，过滤，将沉淀真空干燥得白色粉末(18.9g 9mmol产率90％)

(2)3-甲基聚乙二醇丁二酰齐墩果酸的合成：在烧瓶中加入1，4-丁二酸甲基聚乙二醇单酯(4.2g 2mmol)、齐墩果酸(4.56g 10mmol)和三氯甲烷(10ml)，缓慢滴加草酰氯(0.425mmol)，室温搅拌10min，加热回流10h。反应完成后，减压蒸干溶剂。

(3)沉淀物用饱和碳酸氢钠溶液(100ml)洗涤三次，再用无水乙醚(100ml)洗涤两次，过滤，所得粗产物用柱层析法(二氯甲烷∶石油醚＝1∶1)提纯，真空干燥得浅黄色固体。(3.05g1.2mmol产率60％)

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)：0.78-1.29(m，21H，7-CH₃)，2.63(m，丁二酸酐-OCH ₂ CH ₂ O)，3.78(s，3H，mPEG-OCH ₃ )，3.65(m，mPEG-OCH ₂ CH ₂ O)，5.30(dt，1H，H-12).

实施例3

3-(1-甲基聚乙二醇单酯-4-丁二酰)-胆固醇的合成

3-(1-甲基聚乙二醇单酯-4-丁二酰)-胆固醇的合成路线

(1)3-(1-甲基聚乙二醇单酯-4-丁二酰)-胆固醇的合成：在烧瓶中加入m-PEG-DA(4.2g2mmol)、胆固醇(3.87g 10mmol)和三氯甲烷(10ml)，缓慢滴加草酰氯(0.425mmol)，室温搅拌10min，加热回流10h。反应完成后，减压蒸干溶剂。

(2)沉淀物用饱和碳酸氢钠溶液(100ml)洗涤三次，再用无水乙醚(100ml)洗涤两次，过滤，

(3)所得粗产物用柱层析法(二氯甲烷∶石油醚＝1∶3)提纯，真空干燥得浅黄色固体。(3.45g1.4mmol产率70％)

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)：2.64(m，丁二酸酐-OCH ₂ CH ₂ O)，3.40(s，3H，mPEG-OCH ₃ )，3.65(m，mPEG-OCH ₂ CH ₂ O)，5.30(dt，1H，H-6)。

实施例1-3产物的水溶性实验如下：

水溶性实验表明，实施例1-3中3个产物在25℃时，水溶性由未连接mPEG时小于1mg/L提高到大于10⁶mg/L，水溶性提高了100万倍。

三、生物催化实施例

本发明提供的聚乙二醇(mPEG)与脂溶性化合物形成的连接物及其衍生物，上述化合物能应用到生物转化和催化反应中，增加溶液中底物浓度，同时还能简化分离提纯方法具体实施例如下：

实施例1

3-甲基聚乙二醇丁二酰齐墩果酸(实施例2中的化合物)的发酵及纯化方法：

(1)将4℃保存的亚麻次盘孢霉接种于斜面培养基上，28℃恒温培养，得到菌丝生长旺盛、孢子丰富的培养物，用无菌水洗下其孢子，配成10⁷cfu/mL孢子悬浮液；

(2)将2mL孢子悬浮液转移至250mL三角瓶(50mL液体培养基)，转速分别为210r/min，28℃培养24h后，加入底物3-甲基聚乙二醇丁二酰齐墩果酸，底物投料量为20g/L，，继续培养72h终止，同时设置两组空白对照：菌株培养基不加底物(空白对照1)和培养基加底物无菌种(空白对照2)。

(3)培养结束后，过滤发酵液，除去菌丝体，发酵液加入采用等体积的冰乙醇和乙醚(1∶10，v∶v)的混合溶液，冷却放置，抽滤析出固体，固体重新少量乙醇溶解，加入乙醚析出固体，得到产物，产物碱水解法脱除甲基聚乙二醇丁二酰基，产物结构式为21β-羟基齐墩果酸。

实施例2

亚麻次盘孢霉转化3-氧代齐墩果酸-28-(4-甲酸甲基聚乙二醇酯)-苄酯(实施例1中化合物)，转化产物为3，4-开环-齐墩果-12-烯-4-醇-3，28-二酸(3，4-seco-olean-12-en-4-ol-3，28-dioicacid)，方法同实施例1。

Claims (7)

1.聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，其特征在于：所述聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物的结构式OS-mPEG或OS-Z-mPEG，其中，OS是脂溶性化合物，PEG为聚乙二醇；Z为连接基，m为H、烷基、酰基。

3.根据权利要求2所述的聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，其特征在于：所述聚乙二醇PEG的分子量为200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000或20000。

4.根据权利要求1所述的聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，其特征在于：所述连接基Z包括-CO(CH₂)_nCO-，其中n＝1-8的整数，或-NH(CH₂)_nCO-，其中n＝1-8的整数，或-NH(CH₂)_nX-，其中n＝1-10的整数，X＝O、S、NH，或-CO-Ar-CH₂-，其中Ar为芳基；脂溶性化合物包括甾体类化合物、三萜类化合物。

5.根据权利要求4所述的聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，其特征在于：所述甾体类化合物包括雌二醇、睾酮、黄体酮、甲羟孕酮、左炔诺孕酮、可的松、氢化可的松、皮质酮、地高辛、洋地黄毒苷和毒毛花苷、3α，7α，12α-三羟胆烷酸。

6.根据权利要求4所述的聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，其特征在于：所述三萜类化合物包括榔色酸、龙涎香醇、黄芪醇及其皂苷、灵芝酸，Iucidenic acidA，Iucidone A、人参皂苷、酸枣仁苷元及其皂苷、伊比林内酯、泽泻醇、羊毛甾烯、葫芦苦素、雪胆甲素及乙素、大戨醇、乳香酸、齐墩果酸、甘草次酸、柴胡皂苷元及皂苷、商路酸、地榆皂苷、积雪草酸及其皂苷、黑蔓醇、羽扇豆醇、白桦脂醇、白桦脂酸。

7.根据权利要求4所述的聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物在生物催化中的应用，其特征在于：所述聚乙二醇和脂溶性化合物的连接物的制备方法如下：

(1)取mPEG和连接基Z溶于有机溶剂中，利用缩合方法进行缩合，减压蒸干有机溶剂，得到油状固体，加入乙醇溶解，加入乙醚析出沉淀，过滤收集沉淀，真空干燥；

(2)将步骤(1)所得干燥产物以及脂溶性化合物按不同的官能团，进行缩合方法进行缩合，减压蒸干有机溶剂，得到油状固体，加入乙醇溶解，加入乙醚析出沉淀，过滤收集沉淀，真空干燥；

(3)所得粗产物用重结晶溶剂进行重结晶，真空干燥即得OS-Z-mPEG，

步骤(1)中mPEG与连接基z的摩尔比为1∶2-8，催化剂与连接基z的摩尔比例为1-2∶1，所述有机溶剂为甲苯、1，4-二氧六环或氯仿；所述缩合方法包括：酰氯法，酸酐法，缩水剂脱水法；

步骤(3)重结晶溶剂为冰乙醇、无水乙醚、异丙醇之一或两种以上的混合物。

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