CN102159228A - 含有萱草属植物热水提取物的具有抗抑郁样作用或基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含有萱草属植物的提取物作为活性成分的具有抗抑郁样作用或基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物。本发明还提供含有萱草属植物的热水提取物作为活性成分的具有抗抑郁样作用或基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物。

Description

含有萱草属植物热水提取物的具有抗抑郁样作用或基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物
技术领域
本发明涉及含有萱草属(Hemerocallis)植物提取物作为活性成分并具有抗抑郁样作用或基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物。
背景技术
常叶萱草(Hemerocallis fulva var.sempervirens)是亚热带地区及日本冲绳县和其它地区的野生植物。它属于百合目百合科的萱草属，在冲绳县亦称为Kuwanso(クワンソウ)。历来认为常叶萱草作为补血药或强壮药对失眠、兴奋、焦躁、黄疸、乳腺肿瘤、肿瘤疼痛等具有作用。例如，据报道，通过对常叶萱草整株植物进行发酵处理的产物具有延长睡眠时间的作用(参见日本特开No.2006-62998A)。还有报道指出，常叶萱草的花、白色叶部分(茎)、根的干粉或提取物减少夜间觉醒的次数，并具有针对觉醒的作用。然而，没有实验数据充分证明通过这类植物组成部分或提取物可改善睡眠质量(参见日本特开No.2007-6804A)。
还有报道指出常叶萱草的提取物用作抑制肝损害的药物(参见日本特开No.2001-10968A)。
发明内容
本发明的一个目的是提供含有萱草属植物的提取物作为活性成分并具有抗抑郁样作用或由睡眠改善产生的疲劳恢复作用的组合物。
历来认为常叶萱草对失眠症等具有作用，但是过这种作用从未得到证实。还已知下列有关常叶萱草的情况：常叶萱草叶坚硬，因此不适于食用；白色叶部分(茎)具有辛辣味；一些人在食用白色叶部分(茎)时可能会出现便溏；与睡眠效果相反，根还发挥强壮作用；花、叶、白色叶部分(茎)或根中的活性成分含量随季节、日照时间和栽培环境而变动。
本发明的发明人广泛研究了以下方面：存在于不同部位的活性成分的种类和常叶萱草植物部位、所述活性成分所发挥的作用的种类；以及如下方法：能够与季节性或植物栽培区的特征无关地以预定的高水平对活性成分进行品质控制，排除具有常叶萱草的前述不利作用的成分或杂质，并且将活性成分制成易加工的形式以作为食品或食品原料。
结果，本发明的发明人发现：
通过热水提取地上部分(主要为叶和白色叶部分)所得到的提取物中的成分，即有机溶剂不使之变性的水溶性热稳定成分为活性成分；
可以通过浓缩和提取获得弱酸性的芳香提取物，且主要从常叶萱草叶中获得的热水提取物具有抗抑郁样作用；和
这些活性成分通过改善睡眠质量而发挥疲劳恢复作用。因此，它们完成了本发明。
本发明如下。
[1]一种具有抗抑郁样作用的组合物，其含有萱草属植物的热水提取物作为活性成分。
[2][1]的具有抗抑郁样作用的组合物，其中所述萱草属植物是常叶萱草。
[3][1]或[2]的具有抗抑郁样作用的组合物，其中所述热水提取物是萱草属植物叶的热水提取物。
[4][1]-[3]中任一项的具有抗抑郁样作用的组合物，其是食品或饮料。
[5][4]的具有抗抑郁样作用的组合物，所述组合物标注有其预期用途，以使其用于缓解抑郁症状。
[6]一种具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其含有萱草属植物的热水提取物作为活性成分。
[7][6]的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其中所述萱草属植物是常叶萱草。
[8][6]或[7]的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其中所述热水提取物是萱草属植物叶的热水提取物。
[9][6]-[8]中任一项的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其是食品或饮料。
[10][9]的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，所述化合物标注有其预期用途，以使其用于减轻疲劳。
[11]一种用于从萱草属植物制备具有抗抑郁样作用和基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物的方法，所述方法包括
将经干燥的萱草属植物用60℃-100℃的水加热30-90分钟，将由此得到的提取物过滤，然后将滤液浓缩至每克经干燥的萱草属植物为0.5ml-2m1。
[12][11]的方法，所述方法还包括将1-3体积的水溶性有机溶剂加入1体积的经过滤的提取物中，使得有机溶剂的浓度范围为55％-90％，将生成物过滤，然后将滤液浓缩至每克经干燥的萱草属植物为0.5ml-2ml。
本说明书包括日本专利申请第2008-143471号和第2009-035746号的说明书和/或附图所公开的部分或全部内容，所述专利申请是本申请的优先权文件。
附图简述
图1表示常叶萱草的热水提取物的感官试验结果。
图2表示常叶萱草的热水提取物的镇静效果。
图3表示常叶萱草的热水提取物与其它补充剂的镇静效果的比较。
图4表示常叶萱草的热水提取物的镇静效果和安全性。
图5表示常叶萱草的热水提取物的抗抑郁样作用。
图6表示常叶萱草的热水提取物的睡眠改善作用(关于睡眠量)。
图7表示常叶萱草的热水提取物的睡眠改善作用(关于脑电波信号的频率)。
图8表示常叶萱草的热水提取物的外周效果(末梢効果peripheral effects)。
图9表示常叶萱草的热水提取物的基于睡眠改善的疲劳恢复作用。
图10表示样品试食者(食用含有常叶萱草的热水提取物的胶状物的人)对匹兹堡睡眠质量指数(Pittsburgh Sleep Quality Index)(问卷)的回答。
图11表示根据对匹兹堡睡眠质量指数(问卷)的回答在过去一个月内每天的平均睡眠时间。
图12表示对有关困倦方面的回答。
图13表示常叶萱草叶的热水提取物对脑电图的影响(受试者1)。
图14表示常叶萱草叶的热水提取物对脑电波的影响(受试者2)。
图15表示确定抗抑郁样作用的方法。
图16表示常叶萱草叶的热水提取物和其它试验物质的抗抑郁样作用。
图17表示常叶萱草叶的热水提取物和其它试验物质的抗抑郁样作用。
图18表示常叶萱草叶的热水提取物和其它试验物质对深层体温的影响。
图19表示常叶萱草的热水提取物和其它睡眠改善·抗焦虑·抗抑郁相关物质的特征。
实施本发明的最佳方式
下面将更详细地说明本发明。
使用属于百合目百合科萱草属植物的热水提取物。这类植物的实例包括Akinowasuregusa(Homerocallis fulva L.var.sempervirens M.Hotta或Homerocallis sempervirens Araki)、本萱草(Hemerocallis fulva L.var.fulva)、野萱草(Hemerocallis fulva L.var.longituba Maxim或Hemerocallis longituba Miq.)和薮萱草(Hemerocallis fulva L.var.kwanso Regal)。这些实例中，优选天然生长在日本冲绳县的常叶萱草(Kuwanso)。热水提取物可以是整株植物的提取物或是植物部分的提取物，例如叶、茎和根。特别优选为叶。同样，叶包括其白色部分。
可以通过下列方法获得本发明的热水提取物。
(1)将植物干燥。可以将植物在阳光下干燥，或者使用干燥机在40℃-120℃下干燥。
(2)使用热水从干燥植物中进行提取。提取在60℃-100℃下进行，提取时间的范围为20-90分钟。这时，使用占干燥植物重量1％-5％的水。由于将用水提取，优选使用调整过矿物质的软水、去离子水等。通过热水提取可得到呈暗褐绿色的混浊中性提取物。利用粒径差异或重力，从混浊的热水提取物中除去100目以上或数十微米以上的固形物质。可以在100至几千×g下离心几分钟至数十分钟。生成物被称为通过热水提取得到的部分纯化的中性产物。
(3)接下来，在(2)中通过热水提取得到的部分纯化的中性产物用水溶性有机溶剂处理。作为水溶性有机溶剂，可以使用乙醇、丙酮、甲醇等，优选使用乙醇。对于在(2)中通过热水提取得到的部分纯化的中性产物，本文将使用的水溶性有机溶剂的浓度范围为30％(体积/体积)-90％(体积/体积)。当用水溶性有机溶剂处理时，优选将水溶性有机溶剂一次性加入通过热水提取得到的部分纯化的中性产物中，接着搅拌5-60分钟。在介于低温和室温之间的温度下搅拌6-24小时后，使生成物静置。进行水溶性有机溶剂处理和温度处理，使得通过热水提取得到的部分纯化的中性产物中的高分子凝固并沉淀。随后，用水溶性有机溶剂处理的产物中的凝固沉淀物通过过滤或离心除去。使用布料、专用柱体(dedicated cartridge)等进行过滤。离心可以在几百至数万×g下进行几分钟至数十分钟。经过滤或离心可以得到液体，该液体的透明高，并且是弱酸性、芳香性的红茶色至基于暗橙色的褐色。这被称为上清液。
(4)接下来，从已除去凝固物的上清液中除去水溶性有机溶剂，然后使提取物浓缩。这时，可采用真空蒸发器等进行浓缩。浓缩后，用薄膜滤器进行机械灭菌，然后可获得最终的弱酸性热水提取物。
通过热水提取，可以提取活性成分，可以除去具有大分子结构或植物色素(例如叶绿素)的植物化合物，并且可从提取物中除去辛辣味或苦味。
(5)将在(2)中通过热水提取得到的部分纯化的中性产物进行二次离心和二次过滤，从而还可以获得透明度高的弱酸性红茶色至基于暗橙色的褐色的芳香性液体。使用专用柱体或型号为几微米至数十微米的专用滤纸进行过滤。可在几百至几千×g下离心几分钟至数十分钟。接下来，将水溶液加热，并在60℃-90℃的温度范围内浓缩几小时。通过加热和浓缩步骤，最终得到弱酸性热水提取物，该热水提取物是透明的，有芳香性、呈弱酸性和基于橙色的褐色至暗红茶色。
本发明的萱草属植物的弱酸性热水提取物，例如常叶萱草叶、叶根白色部分等的热水提取物，含有不被水溶性有机溶剂改变的热稳定活性成分。
本发明的萱草属植物的热水提取物具有抗抑郁样作用，并可用于预防或治疗抑郁样症状或抑郁症状。本发明中的表述“具有抗抑郁样作用”是指减轻、改善或预防抑郁样症状。可根据主观症状、医生所做诊断等来确定组合物是否发挥这类“抗抑郁样作用”。同样，可通过使用小鼠的水迷宫试验来证实。本发明的提取物具有抗抑郁样作用，因此可以用作作为非处方药的抗抑郁药、或具有减轻压力作用或抗抑郁样作用的食品、饮料等。
已提出了用于抑郁的多种分类方法。本发明中的术语“抑郁”是指例如：在世界卫生组织(World Health Organization)出版的“International Classification of Diseases，Injuries and Causes of Death(国际疾病、损伤及死因分类).第10版(ICD-10)”中被归类为“抑郁相关病症”的疾病；或基于根据美国精神病学协会(American Psychiatric Association，APA)的“Diagnostic Statistic Manual of Mental Disorders(精神疾病诊断与统计手册，DSM)”的DSM-IV通过多轴诊断而评价的“抑郁”。
同样，本发明的萱草属植物的热水提取物具有睡眠改善作用，使得它们可用作睡眠改善的药物，或者例如具有睡眠改善作用的食品或饮料。
术语“睡眠改善”是指失眠或失眠症的改善。失眠症是具有以下4种症状的睡眠障碍：特征在于难以入睡的入眠障碍；特征在于夜间频繁醒来的觉醒；特征在于失眠之后过早觉醒的过早觉醒；以及特征在于虽然睡眠时间得到保证但不能获得熟睡感的深层睡眠缺乏。苯并二氮杂
Figure BPA00001309897200071
催眠药(例如硝西泮)一般用于睡眠障碍。当服用苯并二氮杂
Figure BPA00001309897200072
催眠药时，可促进入睡。然而，当在睡眠时检查脑电波信号的频率时，可获得特有的结果，包括具有δ波带0.75Hz-4Hz的深层非REM睡眠减少、具有θ波带6Hz-9Hz的REM睡眠减少以及出现异常快波，该快波类似于在峰值介于15Hz和20Hz的失眠状态的情况(Michi Sugano、Hirofumi Watanabe和Kazuko Fuchino等，Teikyo Medical Journal，第6卷，第311-320页，1983；Hiromi Kawasaki、Koichiro Takahashi：Folia pharmacol.Japon.第98卷，第259-272页，1991)。这就意味着睡眠质量下降。
例如，可以通过给予动物本发明的萱草属植物的弱酸性热水提取物，然后分析表示睡眠期间脑电波信号的频率(出现)和频率(出现(量))的波带，来证实所述弱酸性热水提取物是否对脑大具有疲劳恢复作用。必须获得深层睡眠以有效减轻颅神经的疲劳。
当睡前摄取本发明的萱草属植物的热水提取物时，深层体温由于镇静效果和外周血管舒张作用而降低，从而加快入眠。此外，在脑中，所述热水提取物增加入眠时在非REM睡眠的δ波带中观察到脑电波，减少在深层睡眠时间区带中观察到的具有11Hz-14Hzσ波带的浅层非REM睡眠，并具有保持深层睡眠的效果。同样所述热水提取物随后不仅延长非REM睡眠，而且还延长REM睡眠，抑制觉醒。而且，所述热水提取物延长睡眠时间。此外，热水提取物减轻起床时的疲倦，并减轻起床后的日间困倦。
常叶萱草植物的热水提取物的上述睡眠相关效果称为睡眠改善效果。
此外，本发明的萱草属植物的热水提取物具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用，因此，其可用作疲劳恢复剂、具有疲劳恢复作用等的食品或饮料等。在这点上，术语“疲劳”是指激烈运动等引起的生理变化，并且特别是指不能维持正常运动的状态或者通过例如改善营养状况或休息和/或睡眠得以恢复的状态。本发明的萱草属植物的热水提取物对于从这些类型的疲劳中恢复有效。同样，疲劳的实例包括中枢性疲劳和外周性疲劳。中枢性疲劳是颅神经系统中的精神疲劳，主要由压力等引起。另一方面，外周性疲劳由肌肉运动引起，一般认为主要是由能量消耗、疲劳物质的蓄积和内部环境的共济失调而引起。
本发明的术语“疲劳”是指“激烈运动等引起的生理变化和其中无法维持正常运动的状态”或“通过改善营养状况或休息和/或睡眠得以恢复的状态”。
可通过本发明的发明人最新开发的实施例4中所描述的评价方法来证实本发明的萱草属植物的热水提取物是否具有基于睡眠改善的疲劳恢复的作用。
本发明的术语“疲劳恢复作用(效果)”是指对由强制游泳处置(forced swimming treatment)的诱发的身体疲劳的作用(Porsolt，R.D.等，Nature，266，730-732，1977)。强制游泳处置被公认是诱发抑郁状态的方法。这类抑郁状态定义为在强制游泳情况下不动反应的持续时间。根据不动反应持续时间的缩短来确定抗抑郁样作用(效果)。然而，一般认为强制游泳处置除抑郁反应(例如类似于精神疲劳的反应)外，还引起身体疲劳(即由激烈运动(游泳)所致与能量消耗有关的生理变化)。这类身体疲劳表现为在暗期(小鼠活动期)内自发性活动减少。这类自发性活动降低可与抑郁反应区分开来，因为它不能通过抗抑郁治疗而改善。同时，因为自发性活动降低通过诱导睡眠的地西泮而减轻，但不受诱导失眠的咖啡因的影响，一般认为降低的自发性活动水平是通过睡眠而改善但不受失眠影响的一种状态；即疲劳被诱发的状态。本发明的常叶萱草的热水提取物减轻由强制游泳处置诱发的自发性活动降低，与地西泮的情况一样。然而，因为地西泮缺乏抗抑郁样作用(效果)，因此两者的效果不同。常叶萱草的热水提取物还减轻由强制游泳处置诱发的抑郁状态。
例如，可以通过给予动物本发明的萱草属植物的热水提取物，然后分析睡眠期间的脑电波，来确定所述热水提取物是否具有基于睡眠改善的疲劳恢复的作用。
包含本发明的萱草属植物的热水提取物的具有抗抑郁样作用的组合物、具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物或具有睡眠改善作用的组合物可用于包括人的哺乳动物。非人类哺乳动物的实例包括例如猴的灵长类、例如大鼠和小鼠的啮齿动物、绵羊、猪、牛、猫和狗。
包含本发明的萱草属植物的热水提取物的具有抗抑郁样作用的组合物、具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物或具有睡眠改善作用的组合物可用作抗抑郁药、基于睡眠改善的疲劳恢复剂或是睡眠改善剂的药物组合物。可以通过静脉内注射、肌内注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药等，经口服或胃肠外给予这类组合物。这类具有抗抑郁样作用的组合物、具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物或具有睡眠改善作用的组合物还可含有赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、着色剂等。赋形剂的实例包括乳糖、葡萄糖、玉米淀粉、山梨醇和结晶纤维素。崩解剂的实例包括淀粉、藻酸钠、明胶粉、碳酸钙、柠檬酸钙和糊精。粘合剂的实例包括二甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯酯、甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯树胶、明胶、羟丙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。润滑剂的实例包括滑石粉、硬脂酸镁、聚乙二醇和氢化植物油。同样，必要时，可以通过加入缓冲剂、pH调节剂、稳定剂等来制备上述注射制剂。口服制剂的实例包括片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂和糖浆剂。胃肠外制剂的实例包括用于直肠给药的药物、脂肪和油栓剂、含水栓剂、经皮乳膏剂和经皮糊剂。本发明的萱草属植物的热水提取物在整个组合物中的含量随剂型而不同。萱草属植物的热水提取物一般占整个组合物的0.1％重量-50％重量，优选萱草属植物的热水提取物中的活性成分占整个组合物的约0.1％重量-20％重量。根据各个病例中患者的年龄、体重和性别、疾病、症状的程度等，来适当地确定热水提取物的剂量。每天可以给予一剂至多剂热水提取物。
通过将提取物与食品或饮料混合，可以将本发明的萱草属植物的热水提取物用作食品或饮料组成成分。这时，可以将热水提取物混合，使得在单剂量的食品或饮料中，本发明的萱草属植物的热水提取物的含量等于1g-4g(重量)的干叶。本发明的萱草属植物的热水提取物还可用作用于食品或饮料的粉末、颗粒状、液体或膏状组成成分。食品和饮料的实例包括：饮料，例如软饮料、乳酸饮料、嗜好饮料(favorite beverage)、咖啡、绿茶、红茶和乌龙茶；甜食，例如糖果、巧克力、饼干、甜面包、蛋糕、糯米糖果和米糖果；蔬菜和/或水果加工产品，例如水果饮料、蔬菜饮料、果酱和酱；酒精饮料，例如米酒(清酒)、精馏酒精、葡萄酒、中国酒、威士忌酒、伏特加酒、白兰地酒、杜松子酒、朗姆酒、酒精饮料、啤酒、清凉酒精饮料、果酒和利口酒；乳制品，例如酸乳酪、冰淇淋、黄油、干酪、炼乳和奶粉；脂肪和油加工产品，例如佐料、蛋黄酱、天麸罗油和色拉油；调味品，例如酱油、调味汁、醋、甜料酒和佐料型调味品；干制食品和饮料，例如果汁粉、汤粉、速溶咖啡、方便面、速溶咖哩粉、速溶味噌、预制食品(調理すみ食品)、预制饮料和预制汤；以及谷物加工产品，例如小麦粉加工食品和淀粉加工食品。热水提取物本身也可用作健康食品，或者可用于片剂形式，或者与其它有用成分混合制成颗粒。此外，本发明的萱草属植物的热水提取物还可用作食品或饮料的原料。
食品或饮料的实例包括保健饮料、保健食品、特殊保健用食品、特殊保健用饮料、营养功能食品、营养功能饮料和保健补充剂(食品或饮料)。在此，术语“特殊保健用食品”是指在他或她的饮食习惯中为特定保健目的而摄入的食品，该食品标有其积极作用的标签，通过摄取该食品可以达到特定的保健目的。这些食品或饮料可标有以下作用：例如缓解压力、减轻挫折感、缓解抑郁症状、缓解精神抑郁、减轻疲劳、改善睡眠、解决睡眠不足、调整睡眠节奏、使起床时感觉良好、延长睡眠时间、降低起床时的疲倦感、减轻日间困倦、或调整每日生活节奏。
此外，本发明包括用于评价试验物质(test article)的疲劳恢复作用的方法。在此处，疲劳恢复作用包括基于睡眠改善的疲劳恢复作用。
实验动物常被用于评价各种药物的功效。例如，强制游泳试验被用来筛选抗抑郁药。例如已知Porsolt，R.D.等人披露的方法(Porsolt，R.D.，Nature，266，730-732，1977)。然而，目前没有用于评价药物的疲劳恢复作用的方法。本发明的发明人最新建立了一种用于评价基于睡眠改善的疲劳恢复作用的方法。
待用于上述方法的实验动物优选为啮齿动物，例如小鼠和大鼠，特别优选小鼠。按照所述方法，首先使动物适应12-12小时周期的明暗条件。接着，迫使动物在明期内游泳15分钟或更久，优选15分钟-1小时，更优选15分钟-30分钟。这时，强制游泳优选在暗期开始前6-8小时开始。随后，给予试验物质，然后测定暗期后自发性活动的量。
强制游泳的水温范围为20℃-30℃，优选范围为22℃-27℃，更优选为24℃±1℃。这时，将强制游泳的水箱放在可以隔音和遮光的实验室内。实验优选在遮光和隔音条件下进行。术语“强制游泳”是指强迫动物在无法逃离的条件下在水箱里游泳。这时，作为对照动物，将动物置于未装水的水箱中，时间与强制游泳的时间相同。
在强制游泳后给予试验物质以评价通过口服给药或静脉内注射、肌内注射、腹腔注射、皮下注射或真皮注射等胃肠外给药的疲劳恢复作用。可根据试验物质适当地确定剂量。这时，给予水、盐水等作为对照。
术语“自发性活动量”是指动物的自发性运动量，包括例如竖立和从一个位置移动到另一个位置。可以测定动物的竖立次数、从一个位置移动到另一个位置的次数等，来观察自发性运动量。可以采用利用红外线等的自动测定系统，测定自发性活动量。这类系统一个的实例是Super Mex(Muromachi Kikai Co.，Ltd.)。自发性活动量在暗期内测定。例如，连续测定12小时暗期的自发性活动量。
例如，可以测定每小时自发性活动量的平均值，然后进行分析。
当自发性活动量比对照显著高时，便可确定试验物质具有疲劳恢复作用。
准确地讲，本发明涉及用于评价试验物质的疲劳恢复作用的方法，所述方法包括在明期内迫使已适应12-12小时周期明暗条件的动物游泳15分钟以上，给予试验物质，然后在接下来的暗期测定自发性活动量。
本发明还涉及上述方法，该方法在暗期开始前6-8小时迫使动物游泳。
本发明还涉及上述方法，其中疲劳恢复作用是基于睡眠改善的疲劳恢复作用。
本发明还涉及上述方法，其中自发性活动量是运动量。
此外，本发明涉及上述方法，其中动物是小鼠。
下面将参考下列实施方案更具体地描述本发明，但是本发明不限于这些实施方案。
实施例1.常叶萱草热水提取物的制备和评价
1.使用有机溶剂提取
(1)热水提取
将干燥的常叶萱草叶(120g)加入不锈钢锅中，加入1600ml离子交换水，然后将锅在92℃下加热。这时的溶质百分比(干燥叶/离子还原水(体积)×100)为7.5％。干燥叶与离子交换水的重量比为3∶40。
当液体体积减半时，用12目不锈钢筛进行初次过滤，然后用一片50目棉布进行二次过滤。在两次过滤后，液体体积为300ml，滤液的颜色为暗褐绿色。该滤液称为部分纯化的水溶液。
(2)用有机溶剂提取
将60％乙醇(450ml)加入300ml(1)中所得到的部分纯化的水溶液中，接着搅拌5分钟。当使用锥形管作为容器时，将管上下重复转动来进行搅拌。当使用烧杯时，用玻璃搅拌器轻轻搅拌溶液。搅拌后，把生成物在室温下静置6小时。随后，溶液使用两层50目棉布过滤，以除去凝固物。滤液呈透明的暗橙色。
使用真空蒸发器使经过滤的上清液浓缩成300ml的体积，然后除去乙醇。加入去离子水(30ml-100ml)，然后重复两次使用真空蒸发器的浓缩以除去乙醇。
使用滤纸(whatman滤纸(Grade3))进行过滤。使用BTF 0.22-μm过滤器将上清液过滤灭菌。
由此得到的滤液称为常叶萱草热水提取物。
2.不使用任何有机溶剂的大量提取
将干燥的常叶萱草叶(7kg)加入容器中，加入250kg离子交换水，然后将容器在80℃-90℃下加热60分钟。将提取物用不锈钢过滤器过滤，然后用50目布进一步过滤。将滤液在7200rpm下离心5分钟-20分钟，然后使用10-μm薄膜滤器将生成物过滤。此外，使用2-μm 6层过滤器(Naigai Jyoki Kogyo Co.，Ltd.)过滤。再次将生成物加热并浓缩，然后最终得到14kg热水提取物。
3.感官试验
对由此得到的提取物(部分纯化的水溶液、使用有机溶剂提取的热水提取物和不使用任何有机溶剂(无机溶剂)提取的热水提取物)进行了感官试验。
试验项目为颜色、气味、透明度、味觉、甘味、味道(旨みumami)、酸味和辛辣味。同样，计算得到相同效果的摄取量，并测定pH。
图1表示结果。
实施例2.常叶萱草热水提取物的镇静效果
使用测定自发性活动量的系统，分析了Akino(由常叶萱草提取的水溶性成分)对小鼠自发性活动量日变化的作用。将二十四(24)只未经过实验的雄性ddY小鼠饲养在恒定温度和湿度的动物室内，室内设置为12-12小时明暗周期。使小鼠充分适应饲养环境，然后用作受试动物。在实验开始时，小鼠为10-16周龄，平均体重为44.0g(SD＝3.92)。将受试动物分成两组，每组12只小鼠，使得两组就平均体重和平均周龄而言几乎相同。一组称为Akino组，另一组称为对照溶媒组。在暗期开始前7小时，使用胃管以10ml溶液/kg小鼠体重口服给予Akino组Akino，口服给予溶媒组蒸馏水。随后，将受试小鼠放进丙烯酸饲养笼(20cm长×30cm宽×12cm高)内，然后放置约1小时。在暗期开始前6小时，连续测定自发性活动量48小时。本文使用的饲养笼事先已经灭菌。本文使用的所有的地板垫、饲料、供水瓶等均是新准备的。用测定实验动物运动量的系统(Muromachi Kikai Co.，Ltd.)，应用Super Mex传感器和专用软件(CompACT AMS ver.3)，测定了自发性活动量。将放置饲养笼的室内进行设定，使得室内的明暗周期与动物室内的同步。饲养笼装有供水管。Akino组的受试小鼠可随意摄取Akino，溶媒组的受试小鼠可随意摄取蒸馏水。
图2表示自发性活动量的转变。图2表示每组中每小时平均自发性活动量(±标准误差)的转变(每6小时)。紧接从暗期转变为明期后6小时，即在暗期的头半期中，Akino组的自发性活动量比溶媒组的显著较低。在其它测量时区内未观察到组间有显著差异。因此，表明从中常叶萱草提取的水溶性成分具有减少自发性活动量的效果；也就是说，镇静效果只发生在明期，这期小鼠的自发性活动量的相对较低。
此外，进行了比较常叶萱草热水提取物(θ)与其它试验物质(Gly：甘氨酸，GABA：γ-氨基丁酸，The：茶氨酸(teanin))的镇静效果的试验。图3表示结果。当使用相同剂量(例如0.8g/kg，口服)进行比较时，常叶萱草热水提取物(θ)发挥类似于甘氨酸(Gly)、GABA(γ-氨基丁酸)和茶氨酸(The)所发挥的镇静效果。
实施例3.干燥的常叶萱草叶的镇静效果和安全性
把未经过实验的雄性ddY小鼠(10-12周龄)饲养在具有恒定温度和湿度的动物室内，室内设置为12-12小时明暗周期。使小鼠充分适应饲养环境，然后用作受试动物。向灭菌丙烯酸饲养笼(20cm长×30cm宽×12cm高)提供地板垫、饲料和供水瓶。至于饲料，一周一次或多次准备常叶萱草干叶粉混合饲料(Akino组)，未混合饲料为对照(Cnt组)，然后给予受试小鼠。所述常叶萱草干叶粉混合饲料中，包含相当于小鼠日摄食量5g的有效浓度的常叶萱草弱酸性热水提取物。
应用Super Mex传感器(Muromachi Kikai Co.，Ltd.)和专用软件(CompACT AMS ver.3)，使用测定运动量的系统，通过实验动物，进行了6个月自发性活动量的测量。
图4表示1个月后测定自发性活动量的结果。图4表示2天的测定结果，并具体自左起表示明期的后半期(14-20点钟)、暗期的头半期(20-02点钟)、暗期的后半期(02-08点钟)和明期的头半期(08-14点钟)每6小时的平均累计值(±标准误差)。
暗期的头半期是期间小鼠最为活跃的时间段。发现在Akino组和Cnt组两组中自发性活动量都增加。发现与Cnt组相比，在所有时间段内Akino组的自发性活动量都减少，但是在明期的后半期(14-20点钟)、暗期的头半期(20-02点钟)和暗期的后半期(02-08点钟)，没有观察到统计学显著性差异。这种现象在给药6个月期间再次出现(数据未显示)。因此认为干燥的常叶萱草叶不包含发挥抵抗性和蓄积能力的组成成分。
同时，与Cnt组的相比，Akino组在明期的头半期(08-14点钟)的自发性活动量呈统计显著性地降低，这就表明小鼠呈镇静状态。次日也观察到这种显著性降低，在6个月给药期间都重现。因此认为在休息时间段(明期的头半期)开始之前小鼠呈镇静状态，使得它们趋于入眠。
这些结果显示，干燥的常叶萱草叶的安全性高，因为即使在长期摄食的情况下，也不会出现类似的药物样抵抗性和蓄积能力。
实施例4.常叶萱草热水提取物的抗抑郁样作用
进行了通过应用水迷宫学习任务测定抗抑郁样作用(效果)的实验。将五十(50)只未经过实验的雄性C57BL/6N小鼠饲养在具有恒定温度和湿度的动物室内，室内设置为12-12小时明暗周期。使小鼠充分适应饲养环境，然后用作受试动物。在实验开始时，小鼠为10-14周龄，平均体重为23.7g(SD＝3.21)。将受试动物分成4组，每组由12或13只小鼠组成，使得各组几乎为相同的平均体重和平均周龄。这些组分别称为OS-Akino组、OS-SSRI组、OS-溶媒组和无OS-溶媒组。实验装置为涂成白色的圆形水池，直径110cm，高40cm。水池装水至22cm深。加入二氧化钛使水混浊。水温保持在24℃±1℃。
实验由两个阶段组成。在第1阶段中，对OS条件下的3组受试小鼠进行开放空间游泳处置(OS，open space swimming treatment)连续5天。准确地讲，一天一次将受试小鼠从池壁放入水池中，然后使之游泳5分钟。在第2阶段，在水池里的水表面下5mm处提供直径为11.5cm的圆盘型逃避台，然后进行水迷宫学习训练。准确地讲，一天5次将小鼠放入水池中，然后测定小鼠到达逃避台的时间(逃跑潜伏期)。如果小鼠在60秒钟内无法到达逃避台，则收回小鼠，将逃跑潜伏期确定为60秒钟。连续10天进行这种水迷宫学习训练。在第2阶段，每天在开始水迷宫学习训练前30分钟，给予各成分(见各组名称的后半部分)，也就是说，Akino(从常叶萱草中提取的水溶性成分)、SSRI(马来酸氟伏沙明，25mg/kg)或对照溶媒(蒸馏水)。使用胃管经口给予Akino和蒸馏水，SSRI经腹腔注射。剂量总是为10ml溶液/kg小鼠体重。
参照以下文献进行该实施例：Sun，M.K.和Alkon，D.L.(2003)，Open Space Swimming Test To Index Antidepressant Activity(指示抗抑郁药活性的开放空间游泳试验)，Journal of Neuroscience Methods，126，35-40。
图5表示第2阶段的结果。图5的每个值代表了每组每个训练日的平均逃跑潜伏期(±标准误差)。在无OS-溶媒组，逃跑潜伏期快速缩短(用表示训练(日)的函数表示)，这就表明已获得适应性逃避行为。另一方面，在OS-溶媒组中，逃跑潜伏期几乎从未缩短，清楚观察到水迷宫学习障碍。这个结果表明，通过第1阶段中的开放空间游泳处置，在受试小鼠中引起抑郁状态，这可解释为动机降低的一种状态。这种解释也得到了OS-SSRI组获得的良好学习结果的支持。观察到OS-Akino组的逃跑潜伏期与OS-溶媒组在第2阶段头半期的几乎相同的程度。然而，OS-Akino组的逃跑潜伏期显示在第2阶段的中期和后半期有逐渐变得越来越短的趋势。在第2阶段的最后一天，OS-Akino组的逃跑潜伏期达到相当于无OS-溶媒组或OS-SSRI组的水平。准确地讲，这就证实了从常叶萱草中提取的水溶性成分具有类似于SSRI的抗抑郁样作用(效果)。
实施例5.常叶萱草热水提取物的睡眠改善作用(效果)
将肌电位电极预先插入成熟雄性C57BL/6N小鼠的颈部肌肉内。将脑电波电极连接在每只小鼠的大脑皮层表面。把小鼠放入具有恒定温度和湿度(25℃和55％)的隔音实验室或箱中，内设12-12小时明暗周期(在8:00开灯，在20:00关灯)。将不会限制小鼠行动的电线与两种类型的电极的每一种连接，接着是几天的适应。应用专用睡眠分析软件，实时自动记录小鼠的脑电图和肌肉活动记录。
上午8:00开始自动记录(第一天，基础睡眠-觉醒量的日变化)。次日10:00，通过灭菌探头口服给予未麻醉的小鼠无菌水一次(第2天，对照实验)。剂量为10mL/kg小鼠体重。例如，如果小鼠体重为30g，则单剂量为0.3mL溶剂。给药后把小鼠放回它们原来的笼子中，然后记录脑电波的动作信号和肌电位。次日10:00，按与上述剂量相同的量口服给予常叶萱草弱酸性热水提取物(图中表示为θ)，记录脑电波的动作信号和肌电位(第三天，样本实验)。48小时后停止记录(第4天，恢复实验)。
对由此记录的脑电波的动作信号和肌电位进行数据处理，然后以4秒钟的间隔确定小鼠的睡眠期。根据脑电波频率(Hz)、振幅和肌电位的肌肉紧张度的组合，将睡眠期分为4期：深层非REM睡眠(δ波带0.75Hz-4.0Hz)、浅层非REM睡眠(σ波带11Hz-14Hz)、REM睡眠(θ波带6Hz-9Hz)和觉醒(15Hz-25Hz)。计算对应于脑电波信号的频率(在2小时内观察到的次数)的每期的累计值，然后把该值作图，绘出线图。
与给予溶剂的小鼠组(n＝5)相比，在休息时间段(8:00-20:00)内给予小鼠(n＝5)常叶萱草弱酸性热水提取物增加非REM睡眠到较高水平，并使这种水平保持约3小时。因此，常叶萱草弱酸性热水提取物使非REM睡眠的量和REM睡眠的量这二者增加了约5小时(图6)。此外，在给药后，常叶萱草弱酸性热水提取物保持非REM睡眠的深度达6-9小时(图7)。
即使当在活动时间段(20:00-8:00)内给予小鼠提取物，也未观察到这种增加现象。
接下来，为了研究常叶萱草弱酸性热水提取物的外周效果，在上午10:00时，在休息时间段开始后2小时口服给予常叶萱草弱酸性热水提取物(箭头)。每小时使用专用传感器，测量小鼠直肠温度。小鼠深层体温和直肠温度之间的差异表示与对照相比的温度差异(X±SE，n＝13；图8)。因此，当给予常叶萱草弱酸性热水提取物时，四肢外周血管扩张，并在给药后30分钟变成浅红色，还观察到深层体温降低。在给药后1小时，温度达到最低温度峰值，然后逐渐回到原来的基础温度。
根据上述结果，认为常叶萱草弱酸性热水提取物具有通过与给药后外周血管舒张作用有关的体温下降而加快入睡的作用，在此之后保持在中枢的非REM睡眠或REM睡眠的量的增加。
实施例6.常叶萱草热水提取物的疲劳恢复作用
利用小鼠强制游泳试验和测定自发性活动量的系统，进行了确定疲劳改善作用(效果)的实验。将六十八(68)只未经过实验的雄性C57BL/6N小鼠饲养在具有恒定温度和湿度的动物室内，室内设置为12-12小时明暗周期。使小鼠充分适应饲养环境，然后用作受试动物。在实验开始时，小鼠为10-12周龄，平均体重为22.8g(SD＝1.28)。把受试动物分成7组，使得各组就平均体重和平均周龄而言几乎相同。这些组称为FS-Akino组(n＝11)、FS-溶媒组(n＝10)、无FS-溶媒组(n＝9)、FS-Dia组(n＝9)、FS-Caf组(n＝9)、FS-Imi组(n＝11)和FS-SSRI组(n＝9)。
将圆柱形水箱(底部表面直径18cm，高29cm)装入24±1℃的水至15cm深，放入能够实现隔音和遮光的实验室内。在暗期开始前7小时，使在FS条件下的受试小鼠在水箱中进行30分钟强制游泳处置。准确地讲，迫使受试小鼠在它们不能逃离的条件下游泳。把对照无FS-Cnt组的受试小鼠留在同一类型的空水箱中30分钟。
强制游泳处置30分钟后，将Akino(从常叶萱草中提取的水溶性成分)、地西泮(Dia，2.5mg/kg)、咖啡因(Caf，15mg/kg)、丙米嗪(Imi，30mg/kg)、SSRI(马来酸氟伏沙明，25mg/kg)或溶媒(蒸馏水)这些对应于各组名称后半部分的成分分别给予各受试小鼠。Akino和蒸馏水使用胃管经口服给予，地西泮、咖啡因、丙米嗪和SSRI经腹腔注射。剂量总是为10ml溶液/kg小鼠体重。
给予这些药物后，把受试小鼠放入丙烯酸笼(20cm长×30cm宽×12cm高)内。连续测定自发性活动量(在给药后6小时的暗期)12小时。本文使用的饲养笼事先已经灭菌。本文使用的所有地板垫、饲料、供水瓶等都是新准备的。采用测定实验动物运动量的系统(Muromachi Kikai Co.，Ltd.)，使用Super Mex传感器和专用软件(CompACT AMS ver.3)，测定了自发性活动量。
图9表示测定自发性活动量的结果。图9左半边表示在暗期的头半期(20-02点钟)各组每小时的平均自发性活动量(±标准误差)。图9的右半边表示在暗期的后半期(02-08点钟)的每小时平均自发性活动量(±标准误差)。暗期是期间小鼠处于活动的时间段。已知自发性活动量在暗期的头半期特别高。从FS-溶媒组和无FS-溶媒之间的比较清楚可见，自发性活动被强制游泳处置显著抑制。同样在FS-Caf组、FS-Imi组和FS-SSRI组中，自发性活动量等于FS-溶媒组的自发性活动量，并且比无FS-溶媒组的显著较低。另一方面，在头半个时间段和后半个时间段两者中，FS-Dia组的自发性活动量比FS-溶媒组的显著较高。FS-Dia组的自发性活动量的水平接近无FS-溶媒组的水平。地西泮用作安眠药片，并且已知在强制游泳处置后诱导睡眠，使得水平降低的自发性活动得到恢复。由强制游泳处置诱发的自发性活动的降低，可以通过睡眠来改善。因此，这被认为是疲劳指标。
FS-Akino组的自发性活动量比FS-溶媒组的高，与FS-Dia组的情况一样，并且观察到与无FS-溶媒组相同的水平。因此，可以得出结论，从常叶萱草中提取的水溶性成分可介导睡眠改善作用，并具有具有缓解疲劳的效果。
实施例7.常叶萱草热水提取物对人的睡眠改善作用(效果)
通过双盲比较研究(双盲交叉试验)，研究了从干燥的常叶萱草叶(Hemerocallis fulva L.var.sempervirens M.Hotta)得到的提取物对健康成人的夜间睡眠、次日身体状况和日间困倦的作用。
材料与方法
受试者选自35名申请了由Somnoquest Co.，Ltd.计划的“睡眠改善补充剂监测试验”的申请者，所述受试者不包括由于某些疾病(例如睡眠障碍)已获得门诊治疗的申请者和日常服用某些药物或补充剂的申请者。同样，也不对未回答下文所描述的多个问题选项的申请者(占所有问题选项12％以上为“未回答”)进行分析。最后，待分析的受试者数为25(10名男性受试者和15名女性受试者)，平均年龄42.4岁(范围：22-68)。受试者的平均睡眠时间为6.0小时(自陈过去1个月)。
评价对象
通过实施例1中描述的方法，使用从干燥的常叶萱草叶中提取的热水提取物制作胶状物，然后用作补充剂用于评价(下文中称为胶状物提取物)。由PP制造的小型半透明部件(ポ一シヨンportion)装满了胶状物提取物，然后用透明的EP/DL/NY膜密封。胶状物的重量约为17g，并含有2g从干燥的常叶萱草叶中提取的热水提取物。为了比较和对比，还制作了未加入任何热水提取物的安慰剂胶状物，然后将上述同一类型的一份装入胶状物，然后密封。加入两种类型的胶状物中的合成香料是相同的，但是胶状物提取物富含果糖玉米糖浆，安慰剂胶状物用红糖调整味道。就颜色和味道而言，难以分辨两者之间的差异。
实验技术
将3个(3)胶状物提取物和3个安慰剂胶状物样品以及进行实验的说明书(为受试者注明“睡眠改善补充剂监测试验”)并随附一份问卷邮寄往每位受试者各自的家中。受试者受邀在任意一天服用并评价胶状物样品。
本实施例采用受试者内设计方法(within-subjects design method)进行。准确地讲，邀请所有受试者体验胶状物提取物和安慰剂胶状物两者，然后对各种胶状物样品的评价结果进行了比较。对于一半左右的受试者，胶状物提取物被标记为“补充剂A”，安慰剂胶状物被标记为“补充剂B”。对于其余的受试者，胶状物提取物和安慰剂胶状物以相反方式标记(补充剂B为补充剂A，反之亦然)。指导所有受试者以2天以上的间隔服用并评价补充剂A，然后以2天以上的间隔服用补充剂B。使体验两种类型的胶状物的顺序在受试者中均衡。受试者被告知两种类型的胶状物是开发的两种用于睡眠改善目的的补充剂。对于服用和评价胶状物样品的2种情况，都采用相同的规程。不论胶状物类型如何，都要求每位受试者：按规定在计划就寝前约2小时服用3个胶状物样品；次日，起床后30分钟回答“上午问卷”；然后在夜间就寝前1小时回答“夜晚问卷”。还要求受试者在回答问题后立即把全部问卷表装入信封，将表格保存在其中，不再添加或改变他们的回答。
问卷项目和问卷
(1)为了研究受试者的睡眠状况，采用了匹兹堡睡眠质量指数(日语版)(Yuriko Doi，Masumi Minowa，Makoto Uchiyama，Kyoko Okawa(1998)，匹兹堡睡眠质量指数(问卷)出品，日语版，Psychotherapeutics，13(6)，761-763)。要求受试者在试食胶状物样品两种之一前回答该问卷。
(2)上午问卷
要求受试者回答有关服用胶状物样品当晚的睡眠时间、睡眠质量、起床时的心境和/或情绪及睡眠状况。至于睡眠时间，要求各受试者在问卷表预制订的栏目中记入睡眠时间至分钟。至于睡眠质量，要求各受试者使用VAS(直观类比量表(Visual Analog Scale))回答。准确地讲，假定画在表格上的100-mm线段的左端代表睡眠“非常好”，假定该线段的右端代表睡眠“非常差”。要求各受试者通过在线段的任一点上切分，来表示他或她自己对头一晚睡眠质量的主观评价。在回收问卷表后，测量从线段左端到切分处的长度至毫米作为分值。至于心境和情绪的测量，使用日语版的POMS(心境量表(Profile of Mood States))(McNaire，D.M.，Lorr，M.和Droppleman，L.F.，1992 Profile of Mood States，San Diego：Educational and industrial testing service.；Kazuhito Yokoyama和Shunichi Araki(1997)，日语版，POMS Guidellines，KANEKOSHOBO)，8项用于V(活力)尺度，7项用于F(疲劳)尺度。要求各受试者作从“非常适合”(4分)到“不适合”(0分)的5分评价(或者要求回答每一项。同样，至于睡眠状况，要求各受试者作从“非常适合”(4分)到“不适合”(0分)的5分评价。准确地讲，要求各受试者回答询问受试者的睡眠质量或睡眠状况的10个项目，包括“可以立即入睡(上床后无法立即入睡)”和“起床时感觉愉快”。
(3)夜晚问卷
要求各受试者使用VAS就服用胶状物样品后接着睡觉之后一天的身体状况回答问卷。假定画在表上的100-mm线段的左端代表“非常好”，假定该线段右端代表“非常差”。要求各受试者按照用于睡眠质量的相同方式表达他或她自己对身体状况的主观评价并打分。同样，至于日间困倦，列举了8种情况，包括“在阅读书籍、杂志、漫画、文件等的时候”和“在午饭后小憩的时候”。要求各受试者作从“从未睡着(或许)”(0分)、“未睡着但想睡(或许)”(1分)、“打瞌睡(或许)”(2分)或“熟睡(或许)”(3分)的4分评价。准确地讲，要求各受试者回答他们是否在各种情况下实际上感到睡意，或者，如果允许他们感到瞌睡时，他们是否会感到瞌睡。
结果
本实施例中的受试者在这样的条件下招募，也就是使得候选人应具有表明睡眠问题或睡眠障碍的主观的轻微症状，例如“入睡有困难”、“夜晚中途或凌晨觉醒”或“睡不熟和次日仍觉疲倦”，或者候选人应对睡眠改善补充剂感兴趣。在进行本实验时，要求受试者遵守有关限制吸烟、服用安眠药片和饮酒、进食及喝含有咖啡因的饮料的规定。
睡眠时间、睡眠质量和次日身体状况
表1、图10和图11表示通过VAS测定的各种条件类型的睡眠时间、POMS分值及睡眠质量和身体状况的分值。本文中还显示了过去一个月内每天的平均睡眠时间(使用匹兹堡睡眠质量指数(问卷)的回答而获得)供参考。在服用安慰剂胶状物的条件下平均睡眠时间为5.6小时(标准差＝1.75)的同时，在服用胶状物提取物的条件下的平均睡眠时间长达6.7小时(标准差＝1.49)。当进行相应的t检验时，在各种条件之间观察到显著性差异(t(24)＝2.73，p＜.05)。同样，通过相似检验，对在服用胶状物提取物的条件下睡眠时间之间的差异与过去一个月内的平均睡眠时间进行了比较，证实了有显著性差异(t(24)＝2.23，p＜.05)。另一方面，在服用安慰剂胶状物的条件下睡眠时间和过去一个月内的平均睡眠时间之间未观察到统计上有显著性差异(t(24)＝1.16，n.s.)。因此，睡眠时间通过摄取由常叶萱草得到的热水提取物而延长。
同时，关于睡眠质量(t＜1)和身体状况(t(24)＝1.26，n.s.)的分值，在服用胶状物提取物的条件下得到的值略高于在安慰剂条件下的值，但是未检测到显著性差异。同样，在POMS试验中未观察到V尺度(t(24)＝1.17，n.s.)的差异。然而，F尺度(分值)(t(24)＝1.77，p＜.1)在不同条件之间趋于显示出显著性差异，因此在服用热水提取物后通过睡眠减轻起床时的疲倦。
Figure BPA00001309897200251
睡眠状况及起床时的心境和情绪
各种条件类型的受试者对10项有关睡眠状况及起床时的心境和情绪的回答(要求各名受试者回答“上午问卷”)概括于表2中。对于各条件之间的所有项目都进行了相应的t检验。但全部项目都未发现有显著性差异。
Figure BPA00001309897200271
次日的日间困倦
各种条件类型的受试者对8项有关日间困倦的回答(要求受试者回答“夜晚问卷”)概括于表3、图12A和12B。在8种情况当中，在两种情况下，“当身处公共场合的时候”(t(24)＝2.28，p＜.05)和“在午饭后小憩的时候”(t(24)＝2.79，p＜.05)，在服用胶状物提取物的条件下得到的值显著低于在安慰剂条件下的值，这就表明了次日的日间困倦在摄取热水提取物后通过睡眠得到减轻。
实施例8.常叶萱草叶的热水提取物对脑电波的作用
受试人(受试者1：49岁女性，受试者2：44岁男性)受邀服用胶状物样品，该样品含有通过实施例7中描述的方法从干燥的常叶萱草叶中提取的热水提取物。随后，在睡眠期间测量脑电波，以研究在睡眠期随时间的变化。
对于对照试验，要求受试者服用装有密封在其中的安慰剂胶状物(未补充热水提取物)的相同类型的部件，然后测量脑电波。
图13表示受试者1的结果。图13A表示当受试者1服用不合提取物的胶状物样品(安慰剂)时测量的脑电波。图13B表示当受试者1服用含有提取物的胶状物样品时测量的脑电波。测量脑电波的结果见图13，其揭示了：(i)就寝后极深层睡眠(NREM-S4)数增加1小时；和(ii)在整个睡眠时间内，δ波(表示深层睡眠的脑电波信号的频率)的频率(出现)增加。这就表明服用提取物导致在开始睡眠时的深层睡眠增加，睡眠期间深层睡眠的频率增加。
图14表示受试者2的结果。图14A表示当受试者2服用不含提取物的胶状物样品(安慰剂)时测量的脑电波。图14B表示当受试者2服用含有提取物的胶状物样品时测量的脑电波。测定脑电波的结果见图14，其揭示了：(i)就寝后极深层睡眠(NREM-S4)数增加1小时，且其持续时间也延长；和(ii)清晨4-5点的警觉状态(觉醒)因服用提取物而明显消失。这就表明摄取提取物在开始睡眠时增加深层睡眠，并且进一步减少夜晚中途的觉醒。
实施例9.常叶萱草的热水提取物与其它物质之间的抗抑郁样作用和对深层体温变化的作用的比较
1.抗抑郁样作用
采用用于实施例4中测定抗抑郁样作用的实验装置(强制游泳装置)。将未经过实验的雄性C57BL/6N小鼠和雄性ddY小鼠饲养在具有恒定温度和湿度的动物室内，室内设置为12-12小时明暗周期。使小鼠充分适应饲养环境，然后用作受试者动物。
在第一天，进行了强制游泳处置15分钟。在处置后30分钟，给予从干燥的常叶萱草叶中提取的热水提取物和其它物质。随后，在第二天，进行了强制游泳处置5分钟。此时，在处置前30分钟，给予从干燥的常叶萱草叶中提取的热水提取物或其它物质。
在第一天和第2天，采用Super Mex传感器(Muromachi Kikai Co.，Ltd.)测量了5分钟内的不动反应的时间。
实验方法见图15。
用于本实验的物质如下。
(a)θ-高(常叶萱草叶的热水提取物)
(b)θ-低(常叶萱草叶的热水提取物)
(c)FX-高(常叶萱草花的热水提取物)
(d)FX-低(常叶萱草花的热水提取物)
(e)SJW(金丝桃(贯叶连翘(Hypericum perforatum)))
(f)Valleri(缬草)
图16表示给予上述试验物质(a)、(b)、(c)和(d)的结果。结果分别显示了在每种情况下的不动反应。
如图16所示，当使用常叶萱草叶的热水提取物时，不动反应时间的延长受抑制，当使用常叶萱草花的热水提取物，不动反应的时间延长。结果表明，常叶萱草叶的热水提取物的抗抑郁样作用优于常叶萱草花的热水提取物。
图17表示给予上述试验物质(a)、(e)和(f)的结果。结果分别显示了在每种情况下的不动反应。
如图17所示，常叶萱草叶的提取物发挥等同于金丝桃的提取物的抗抑郁样作用。另一方面，缬草不发挥抗抑郁样作用。
2.对深层体温的作用
图18表示使用常叶萱草叶的热水提取物和其它试验物质的深层体温的测量结果。给予常叶萱草叶的热水提取物(θ)的小鼠中四肢的皮肤毛细血管扩张立即得到证实，直肠温度(深层体温)也降低。具有与所述提取物相同浓度的其它试验物质(Gly：甘氨酸，GABA：γ-氨基丁酸和茶氨酸)也降低深层体温，但下降速率低于由常叶萱草叶的热水提取物引起的下降速率。
结果表明，常叶萱草叶的热水提取物在本文所测试的物质中具有促进睡眠的最大效果。
图19表示常叶萱草热水提取物和其它睡眠改善·抗焦虑·抗抑郁相关物质的特征。其它睡眠改善·抗焦虑·抗抑郁相关物质的特征参见日本国立健康营养研究所(National Institute of Health and Nutrition)的保健食品原料数据库。
工业实用性
如实施方案中所述，已经证实萱草属植物的热水提取物发挥抗抑郁样作用和通过提高睡眠质量的疲劳恢复作用。迄今为止都未曾发现使用热水从萱草属植物(特别是其叶中)提取的提取物具有抗抑郁样作用和基于睡眠改善的疲劳恢复作用。本发明首次显示了萱草属植物的热水提取物的抗抑郁样作用和基于睡眠改善的疲劳恢复作用。
本发明的萱草属植物的热水提取物可作为具有抗抑郁样作用和基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，用于食品饮料领域或医学领域。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用其整体结合到本文中。

Claims (12)

1.一种具有抗抑郁样作用的组合物，其含有萱草属(Hemerocallis)植物的热水提取物作为活性成分。
2.权利要求1的具有抗抑郁样作用的组合物，其中所述萱草属植物是常叶萱草(Hemerocallis fulva var.sempervirens)。
3.权利要求1或2的具有抗抑郁样作用的组合物，其中所述热水提取物是萱草属植物叶的热水提取物。
4.权利要求1-3中任一项的具有抗抑郁样作用的组合物，其是食品或饮料。
5.权利要求4的具有抗抑郁样作用的组合物，所述组合物标注有其预期用途，以使其用于缓解抑郁症状。
6.一种具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其含有萱草属植物的热水提取物作为活性成分。
7.权利要求6的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其中萱草属植物是常叶萱草。
8.权利要求6或7的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其中所述热水提取物是萱草属植物叶的热水提取物。
9.权利要求6-8中任一项的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，其是食品或饮料。
10.权利要求9的具有基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物，所述组合物标注有其预期用途，以使其用于减轻疲劳。
11.一种用于从萱草属植物制备具有抗抑郁样作用和基于睡眠改善的疲劳恢复作用的组合物的方法，所述方法包括
将经干燥的萱草属植物用60℃-100℃的水加热30-90分钟，将由此得到的提取物过滤，然后将滤液浓缩至每克经干燥的萱草属植物为0.5ml-2ml。
12.权利要求11的方法，所述方法还包括将1-3体积的水溶性有机溶剂加入1体积的经过滤的提取物中，使得有机溶剂的浓度范围为55％-90％，将生成物过滤，然后将滤液浓缩至每克经干燥的萱草属植物为0.5ml-2ml。
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