CN102143750B - 用作蛋白激酶抑制剂的大环嘧啶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够抑制蛋白激酶的大环衍生化合物、含有这些化合物的药学组合物以及合成这些化合物的方法。这些化合物可用于治疗由不受调节和/或紊乱的激酶活性引起的增殖性疾病，例如癌症、牛皮癣、病毒性和细菌性感染、炎症性疾病和自身免疫疾病。

Description

用作蛋白激酶抑制剂的大环嘧啶
技术领域
本发明涉及大环嘧啶化合物及其作为药学活性药物的用途，这些化合物抑制蛋白激酶尤其是Aurora激酶，藉此抑制异常细胞增殖和生长。
发明背景
蛋白激酶代表一个大的蛋白质家族，在调节广泛的各种细胞过程起着中枢作用，维持对细胞功能的控制。这些激酶包括Akt、Axl、Aurora A、AuroraB、Aurora C、dyrk2、epha2、fgfr3、flt-3、vegfr3、igf1r、IKK2、JNK3、Vegfr2、MEK1、MET、P70s6K、Plk1、RSK1、Src、TrkA、Zap70、cKit、bRaf、EGFR、Jak2、PI3K、NPM-Alk、c-Abl、BTK、FAK、PDGFR、TAK1、LimK、Flt3、Flt1、PDK1和Erk。对这些激酶的抑制已经成为一个重要的治疗标靶工具。
许多疾病都与由蛋白激酶介导的事件触发异常细胞反应相关。这些疾病包括癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、神经退化性疾病、过敏症和哮喘、阿尔茨海默病以及荷尔蒙相关性疾病。因此，医学化学领域已经进行了大量的研究，尝试寻找可以作为有效治疗药物的蛋白激酶抑制剂。
本发明的化合物是新颖的和高效的选择性Aurora激酶(A、B和C)以及激酶TrkA、TrkB、Flt3(D835Y)(h)、Ret(h)、IRAK4(h)、FAK(h)、KDR9H0、PYK(2)(h)和Tie2(K849w)的ATP-竞争性抑制剂。保守的丝氨酸/苏氨酸激酶的Aurora家族在细胞分裂过程中发挥实质作用。这三个哺乳动物的旁系同源物在序列方面十分相似，但它们的定位、功能、底物和调节配偶体相差很大。
Aurora A在有丝分裂过程中主要与纺锤极相关，需要中心体分离和成熟(Sausville EA.Nat.Med.，(2004)10：234-235)。Aurora A也能促进卵母细胞成熟、极体挤出、纺锤定位以及在分裂中期I脱离而在减数分裂过程中发挥作用。Aurora B是一种染色体过客蛋白质，在有丝分裂中发挥多种功能。AuroraB要求组蛋白H3磷酸化以及正常染色体定向、缩合和紧密。最近也发现，它对染色体双取向、动粒-微管相互作用以及纺锤组装关卡是必需的。Aurora B对于完成细胞分裂也是必不可少的。对Aurora C激酶的认识更少，只知道它似乎在减数分裂的细胞中优先表达。Aurora激酶似乎提供了额外的调节，对于有丝分裂事件的舞蹈术(choreography)是必要的。
Aurora激酶在某些癌症包括大肠癌、乳癌、卵巢癌和其他实体瘤癌症中过度表达。编码Aurora A和B激酶的基因倾向在某些癌症中扩增，而编码AuroraC激酶的基因位于染色体区，经历重排和缺失。Aurora A与各种各样的恶性疾病相关联，包括原发性大肠癌、结肠直肠癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫颈癌、成神经细胞瘤和其他实体瘤癌症(Warner等人(2003)MolecularCancer Therapeutics 2：589-95)。因为Aurora A和B激酶在人癌症中往往增多或者过度表达，使得它们成为有吸引力的治疗性干预标靶(Mountzios等人，Cancer Treatment Reviews(2008)34：175-82；Gautschi等人，Clin.Cancer Res.(2008)，14(6)：1639-48；Mortlock等人，Current Topics in Medicinal Chemistry(2005)，5：807-21)。
TrkA(原肌球蛋白相关激酶A)、TrkB和TrkC都是对神经细胞生长和分化非常重要的蛋白激酶亚族的成员。TrkA是对神经生长因子(NGF)具有高亲和力的受体激酶，因此在神经细胞分化和存活中起着关键作用。一般认为，它对癌症、智力迟钝和痛觉缺失十分重要。TrkB由脑源性神经营养因子(BDNF)激活，同样在癌症和涉及神经细胞存活的疾病中具有重要作用。
Flt3是一种受体酪氨酸激酶，在造血祖细胞、B细胞前体细胞和巨噬细胞前体细胞中表达。因此，Flt3在造血祖细胞增殖和存活、巨噬细胞细胞分化、以及树突细胞分化中具有重要作用。它在急性骨髓性白血病(AML)中过度表达，已经发现它在其他造血性疾病中发生突变。
Ret(h)是一种受体酪氨酸激酶，用于胞外信号传导分子的神经胶质细胞系衍生的神经营养因子。丧失与该族激酶相关的功能突变会发展为先天性巨结肠症，而Ret(h)的过度表达与癌症有关，包括甲状腺髓质癌、副甲状腺肿瘤、内分泌腺瘤II型和III型、以及嗜铬细胞瘤。
IRAK4(h)(白细胞介素-1受体相关激酶-4)是需要激活白细胞介素-1(IL-1)通道的IRAK家族中一个成员。Qin等人已经表明，IRAK和IRAK4的激酶活性对IL-1介导信号传导是多余的，但IRAK4对于IRAK被有效地募集到IL-1受体复合物是必需的(Qin等人，J.Biol.Chem.，279(25)：26748-53(June18，2004)。IL-1通道发生机能失常可导致产生非机能性淋巴细胞、风湿性关节炎、退化性骨病和阿尔茨海默氏病，伴随发烧、发炎、免疫系统缺陷和感染等问题。
粘着斑激酶(FAK)在细胞粘着、迁移和存活具有一定作用。它是一种非受体酪氨酸激酶，最初被鉴定为致癌基因蛋白酪氨酸激酶v-src的底物，但现在被认为在锚定细胞骨架中也发挥作用，因为它与癌症也有一定关系。PYK-2也是FAK家族成员，被定为一种富含脯氨酸的酪氨酸激酶。PYK-2也被称为“相关性粘着斑酪氨酸激酶”、“细胞粘着激酶”和“钙依赖性酪氨酸激酶”，已经发现它所存在的细胞种类少于FAK，但它在神经细胞、上皮细胞和造血细胞、自然杀伤细胞、B和T淋巴细胞以及巨核细胞中的表达很高。因此，它在免疫和发炎反应以及在通过淋巴细胞的细胞骨架重组而进行的细胞极化中都有重要作用(15Aug.08)。
KDR(激酶插入区域受体)是III型受体酪氨酸激酶，普遍存在于整个身体中。因此，它的过度表达与各类癌症、风湿性关节炎、骨和精神病有关。
Tie-2与它的家族成员Tie-1一样，都是一种在发展血管内皮细胞中表达的受体蛋白激酶。Tie-2对于发展内皮细胞之间血管网络的血管生成尤为重要，而Tie-1在建立血管结构完整性方面更为重要，失去Tie-1会导致出血和水肿(Sato等人，Nature，1995，376(6535)：70-74)。
已经有报导，少数大环化合物可作为蛋白激酶抑制剂。例如，Schering AG教导了大环苯胺基嘧啶化合物，它们具有取代的磺基肟基并能选择地抑制2型细胞激酶如Aurora激酶，但同时也可用作1型细胞激酶如细胞周期蛋白依赖型激酶的选择性抑制剂(WO 2007/079982)。Eisai Co.，Ltd.要求保护具有任选地取代的苯甲酰基的大环化合物，它们可用于治疗恶性瘤、血管生成、炎性疾病和自身免疫疾病(WO 03/076424)。IRM LLC教导大环吡啶基-嘧啶胺衍生物能抑制细胞周期蛋白依赖型激酶例如CDK2和CKD5(WO 04/078682)。AbbottLaboratories教导一些治疗癌症的蛋白激酶抑制剂，它们是苯并二氧杂三氮杂环十七碳烯腈衍生物(US 2005/0215556；WO 05/047294)。Bayer Schering PharmaAG描述了作为Aurora激酶选择性抑制剂的嘧啶苯环萘基砜(酰)亚胺衍生物(EP1 803 723)。Janssen Pharmaceutica N.V.教导了用于治疗癌症、糖尿病、炎性疾病和关节炎的2，4(4，6)嘧啶大环化合物(WO 06/061415)。
因此，本发明的目的是鉴定作为蛋白激酶尤其是Aurora激酶抑制剂的另外的和更有效的大环化合物。本发明另一个目的是提供有效地抑制紊乱的(disturbed)、不受控制的或不受调节(unregulated)的Aurora激酶活性。
这些化合物和含有这些化合物的药物组合物可以单独地存在或以试剂盒形式存在。本发明还包括使用这些化合物和药物组合物来治疗由不受调节和不受控的细胞增殖所引起的增殖性疾病例如癌症、牛皮癣、病毒性或细菌性感染、血管再狭窄、炎症性疾病和自身免疫疾病。
本发明也包括制备这些大环衍生化合物的方法，这些化合物能够有效地抑制不受调节的Aurora激酶的活性。
结合以下部分的描述和权利要求书，本领域技术人员将更明白本发明的其他目的、特征和优点。
发明内容
本发明涉及一些化合物，它们抑制、调节和/或调整Aurora激酶的信号传导。本发明还涉及包括这些化合物的组合物，以及使用这些化合物治疗与Aurora激酶相关的疾病和不适的方法。本发明第一方面提供具有通式I所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物、互变异构体、对映体或外消旋混合物：
Figure BPA00001329749000051
其中：
X是H；卤素，较佳地氟；CF3；CN，NO2，N(RR’)；C(O)N(RR’)；C(O)OR；C(O)H；S(O)2；S(OH)；S(O)；或S(O)NRR’；
Figure BPA00001329749000052
各自独立地是芳基，饱和或不饱和杂环，或者饱和或不饱和桥联或非桥联单环、双环或三环碳环，它们中任一是任选地可取代的；
--------表示有或无双键；
L1，L2，L2’，L2”，L2″′，和L3，各自独立地是CH2，CH，CH(OH)，C(＝O)，O，S，S(O)，S(OH)，S(O)2，NR2或NH；
R和R’各自独立地是H，C1-C6烷基；C1-C6杂烷基；芳基；杂芳基；杂环；(CH2)2OH；(CH2)2-O-(CH2)2；
R2是芳基，杂芳基或烷基；(CH2)2-NH2；(CH2)2-NRx或(CH2)2-Ry，其中Rx和Ry各自独立地是CH3或C2H5；
n，p和q，各自独立地是0或1；
r是0，1，2，3，或4。
在一较佳实施例中，通式I所示的化合物与一或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂、载体等一起配制成药物制剂。本领域技术人员都应该认识到各种术语“稀释剂”、“赋形剂”和“载体”之间的重叠关系。
在本发明一优选方面，
Figure BPA00001329749000061
是取代或未取代的苯基。苯基也可以与碳环、杂环或芳基连接，形成双环结构。特别优选地，
Figure BPA00001329749000062
是未取代的或者被CN，OH，F或4-甲基-哌嗪取代的苯基。
在本发明另一优选方面，是任选地取代的降莰烷基，降冰片烯基，环丙基，环丁基，环戊基，或环己基。特别优选地，
Figure BPA00001329749000064
是双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。
在本发明又一优选方面，X是H+，CN，NO2，OH，ORx，ORy，CF3，N(RR’)；C(O)N(RR’)；C(O)OR；C(O)H；S(O)2；S(OH)；S(O)；S(O)NRR’，或者卤素特别是F，其中R和R’各自独立地是H，而Rx和Ry如以上所定义。
在本发明又一优选方面，L1和L3各自独立地是CH2，O，S(O)，SO2，NH或S；L2是CH2；以及n，p和q全部都是0。
在本发明再一优选方面，L1和L3各自独立地是CH2，O，NH或S；L2是CH2，CH(OH)，S(O)，SO2或C(＝O)；L2’，L2”，和L2”’各自独立地是CH2或CH；以及n，p和q全部都是1。
本发明还包括治疗需要抑制激酶蛋白的受试者的方法，所述方法包括把有效量的通式I所示的激酶抑制剂给予该受试者。
在一优选实施例中，将通式I所示的化合物与一或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂、载体等一起配制成药物制剂，该药物制剂任选地可包装成试剂盒。
本发明再一方面提供一种治疗或预防如下疾病或适应症的方法：癌症、肿瘤形成、血管生成、动脉硬化、眼病、炎症性疾病、关节炎和再狭窄等等。所述方法包括把治疗有效量的通式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、前药、对映体、互变异构体、水合物、溶剂化物、或外消旋混合物给予有需要的受试者。
本发明的范围还包括制备性化合物I-XX、最终化合物1-39及其药学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物、互变异构体、对映体、或外消旋混合物。
本发明的其他实施例包括：通式I所示的化合物用作药物；通式I所示的化合物在制备用于治疗需要抑制激酶蛋白的受试者的药物中的用途；以及通式I所示的化合物在制备用于抑制或减少单位点或转移癌症的细胞增殖的药物中的用途。
本发明还包括通式I所示的化合物或其药学上可接受的衍生物、溶剂化物、盐、互变体和立体异构体，包括这些化合物以所有比例形成的混合物，用于治疗例如需要抑制激酶蛋白的受试者，其中该受试者患有增殖性或炎症性疾病。
本发明的范围也包括一种合成本发明的化合物的方法。
本发明也涉及通式I所示的化合物与其他药学活性成分联合使用来治疗需要治疗激酶相关性功能失常的受试者，特别是如下疾病的受试者：哺乳动物的血管生成；癌症；肿瘤形成、生长和扩散；动脉硬化；眼病，例如老年黄斑病变、脉络膜新生血管以及糖尿病视纲膜病变；炎症性疾病；关节炎；血栓形成；纤维化；肾小球性肾炎；神经退化性疾病；牛皮癣；血管再狭窄；伤口愈合；移植排斥；代谢性疾病；自身免疫疾病；肝硬化；糖尿病、血管疾病和免疫疾病。
本发明的化合物特别适合用作Aurora激酶的抑制剂，用于治疗以Aurora激酶过强表达或过度表达为特点的实体瘤。这些实体瘤包括单核细胞白血病、脑瘤、乳腺瘤、胰腺瘤、卵巢瘤、泌尿生殖器瘤、淋巴系统瘤、胃腺瘤、喉部瘤、以及肺部瘤包括肺腺癌和小细胞肺腺癌。
此外，本发明提供调节和/或抑制不受调节或紊乱的Aurora激酶活性的药物组合物和方法，用于治疗或治愈包括各种癌症在内的增殖性疾病，所述方法包括把有效量的通式I所示的激酶抑制剂给予有需要的受试者。具体地，通式I所示的化合物可用来治疗某些形式的癌症。通式I所示的化合物还可以在某些已有的癌症化疗中提供额外的或协同的作用，和/或可用来恢复某些已有的癌症化疗和放射性治疗的功效。
本发明的化合物对细胞分裂具有抑制作用，因而在异种移植肿瘤模型中具有体内抗增殖作用。所以，当将这些化合物给予患有过度增殖性疾病的病人时，所述化合物能够抑制肿瘤生长，减少与淋巴增殖性疾病相关的炎症，抑制移植排斥，抑制由于组织修复而引起的神经损伤等等。本发明的化合物适用于治疗性或预防性目的。预防增殖可通过在明显的疾病发展之前给予本发明的化合物来实现，例如预防肿瘤生长、预防转移发生、减少与心血管手术相关的再狭窄等等。或者，本发明的化合物可通过稳定或改善病人的症状来治疗持续的疾病。
具体实施方式
本发明涉及抑制、调节和/或调整蛋白激酶尤其Aurora，TrkA，TrkB，Flt3(D835Y)(h)，Ret(h)，IRAK4(h)，FAK(h)，KDR9H0，PYK(2)(h)和Tie2(K849w)的信号传导的化合物。本发明还涉及包括这些化合物的组合物，以及使用这些化合物治疗与激酶相关的疾病和不适的方法。本发明第一方面提供具有通式I所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物、互变异构体、对映体或外消旋混合物：
Figure BPA00001329749000081
其中：
X是H；卤素，较佳为F；OH；ORx；ORy；CF3；CN，NO2，N(RR’)；C(O)N(RR’)；C(O)OR；C(O)H；S(O)2；S(OH)；S(O)；或S(O)NRR’；
Rx和Ry各自独立地是CH3或C2H5；
Figure BPA00001329749000091
各自独立地是芳基，饱和或不饱和杂环，或者饱和或不饱和桥联或非桥联单环、双环或三环碳环，它们中任一是任选地可取代的；；
--------表示有或无双键；
L1，L2，L2’，L2”，L2″′和L3各自独立地是CH2，CH，CH(OH)，C(＝O)，O，S，S(O)，S(OH)，S(O)2，或NH；
R和R’各自独立地是H；C1-C6烷基；C1-C6杂烷基；芳基；杂芳基；杂环；(CH2)2OH；(CH2)2-O-(CH-2)2；(CH2)2-NH2；(CH2)2-NRx或(CH2)2-Ry；
n，p和q各自独立地是0或1；
r是0，1，2，3或4。
在一较佳实施例中，通式I所示的化合物与一或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂、载体等一起配制成药物制剂。本领域技术人员都应该认识到各种术语“稀释剂”、“赋形剂”和“载体”之间的重叠关系。
在本发明一优选方面，
Figure BPA00001329749000092
是取代或未取代的苯基。在取代的情况下，较佳的取代基是CN，CH3-C(＝O)-NH-，或者是任选地取代的饱和或不饱和杂环。苯基也可以与碳环、杂环或芳基连接，形成双环或三环结构。
在本发明另一优选方面，
Figure BPA00001329749000093
是任选地取代的降莰烷基，降冰片烯基，环丙基，环丁基，环戊基，或环己基。任选的取代基包括羧酸，羧酸酰胺，乙烷，乙烯和(2-羟基)-乙氧基。
在本发明第一实施例中，
Figure BPA00001329749000094
是苯基；
Figure BPA00001329749000095
是被羧酸酰胺取代的降莰烷；X是F；L1是O；L2是CH2；L3是S；n是1；p和q都是0。
在第一实施例的第一子实施例中，L1是NH；L2是C(＝O)；L2’是CH2；L3是S；n是1；p和q是0。
在第一实施例的第二子实施例中，L1是CH2；L2是CH2；L3是S；n，p和q是0。
在第一实施例的第三子实施例中，L1是CH(OH)；L2是CH2；L3是S；n，p和q都是0。
在第一实施例的第四子实施例中，L1是CH2；L2是S；L3是S；n，p和q都是0。
在第一实施例的第五子实施例中，L1是CH2；L2是CH2；L3是S(O)；n，p和q都是0。
在第一实施例的第六子实施例中，L1是CH2；L2是CH2；L3是S(＝O)(＝O)；n，p和q都是0。
在第一实施例的第七子实施例中，
Figure BPA00001329749000101
是苯基；
Figure BPA00001329749000102
是被羧酸取代的降莰烷；X是F；L1是O；L2是CH2；L2’是CH2；L3是S；n是1；p和q都是0。
在第一实施例的第八子实施例中，L1和L2都是CH；L3是S；以及n，p和q都是0。
在本发明第二实施例中，
Figure BPA00001329749000103
是被CN取代的苯基；
Figure BPA00001329749000104
是被羧酸酰胺取代的降莰烷；X是F；L1是NH；L2是C(＝O)；L2’是CH2；L3是S；n是1；p和q都是0。
在本发明第三实施例中，
Figure BPA00001329749000105
是被甲基-哌嗪取代的苯基；
Figure BPA00001329749000106
是被羧酸酰胺取代的降莰烷；X是F；L1是NH；L2是C(＝O)；L2’是CH2；L3是S；n是1；p和q都是0。
在第三实施例的第一子实施例中，L1是O，L2是CH2；L2’是CH2；L3是S；n是1；p和q都是0。
在本发明第四实施例中，
Figure BPA00001329749000107
是喹啉；
Figure BPA00001329749000108
是被羧酸酰胺取代的降莰烷；X是F；L1是C(＝O)；L2是CH2；L3是S；n，p和q都是0。在第四实施例的第一子实施例中，
Figure BPA00001329749000109
是异吲哚。
在本发明第五实施例中，
Figure BPA000013297490001010
是苯基；
Figure BPA000013297490001011
是被羧酸酰胺和乙烷、乙烯或(2-羟基)乙氧基二取代的环戊烷；X是F；L1是O；L2是CH2；L2’是CH2L3是CH2；n是1；p和q都是0。
在第五实施例的第一子实施例中，L1是O；L2是CH2；L2’是CH；L3是CH；环戊烷被羧酸酰胺和乙烷基邻位二取代；n是1；p和q都是0。
在第五实施例的第二子实施例中，L1是O；L2是CH2；L2’和L3都是CH(OH)；环戊烷被羧酸酰胺和乙烯基邻位二取代；n是1；p和q都是0。
在第五实施例的第三子实施例中，L1是O；L2是CH2；L2’和L3都是CH(OH)；环戊烷被羧酸酰胺和(2-羟基)乙氧基邻位二取代；n是1；p和q都是0。
在本发明第六实施例中，
Figure BPA00001329749000111
是苯基；
Figure BPA00001329749000112
是环己烷；X是F；L1和L3都是O；L2和L2’都是CH；L2”是CH2；n和p是1；q是0。
在本发明第六实施例的第一子实施例中，L2和L2”’都是CH2；L2’和L2”都是CH(OH)；L1和L3都是O。
在本发明第六实施例的第二子实施例中，L1和L3都是O；L2和L2”’都是CH2；L2’和L2”都是CH。
在本发明第六实施例的第三子实施例中，L1和L3都是O；L2，L2’，L2”和L2”’都是CH2。
在本发明第七实施例中，
Figure BPA00001329749000113
是被甲基羧酸酰胺取代的苯基；
Figure BPA00001329749000114
是被羧酸酰胺取代的降莰烷；X是F；L1是CH(OH)；L2是CH2；L3是S；n，p和q都是0。
在本发明第七实施例的第一子实施例中，
Figure BPA00001329749000115
是苯基，
Figure BPA00001329749000116
是被6-氨基-1-苯基乙烯基-羧酸酰胺取代的降莰烷；X是F；L1是C(＝O)；L2是CH2；L3是S；n，p和q都是0。
在本发明第八实施例中，
Figure BPA00001329749000117
是苯基；
Figure BPA00001329749000118
是被氨基取代的降莰烷；X是F；L1是CH(OH)；L2是CH2；L3是S；n，p和q都是0。
本发明还包括治疗需要抑制激酶蛋白的受试者的方法，该方法包括把有效量的通式I所示的激酶抑制剂给予该受试者。
在一优选实施例中，将通式I所示的化合物与与一或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂、载体等一起配制成药物制剂，该药物制剂任选地可包装成试剂盒。本发明还包括通式I所示的化合物或其药学上可接受的衍生物、溶剂化物、盐、互变体和立体异构体，包括这些化合物以所有比例形成的混合物，用于治疗例如需要抑制激酶蛋白的受试者，其中该受试者患有增殖性或炎症性疾病。
本发明也包括治疗或预防如下疾病的方法：癌症、肿瘤形成、血管生成、动脉硬化、眼病、炎症性疾病、关节炎、水肿和再狭窄等等。所述方法包括把治疗有效量的通式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物、互变异构体、对映体、或外消旋混合物给予有需要的受试者。
本发明的其他实施例包括：通式I所示的化合物用作药物；通式I所示的化合物在制备用于治疗需要抑制激酶蛋白的受试者的药物中的用途；通式I所示的化合物在制备用于抑制或减少单位点或转移癌症的细胞增殖的药物中的用途。
本发明的范围还包括制备性化合物1-21、最终化合物1-33及其药学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物、互变异构体、对映体、或外消旋混合物。
本发明也包括一种合成本发明的化合物的方法。
本发明也涉及通式I所示的化合物与其他药学活性成分联合使用来治疗需要治疗激酶相关性功能失常的受试者，特别是如下疾病的受试者：哺乳动物的血管生成；癌症；肿瘤形成、生长和扩散；动脉硬化；眼病，例如老年黄斑病变、脉络膜新生血管以及糖尿病视纲膜病变；炎症性和血液疾病；关节炎；血栓形成；纤维化；肾小球性肾炎；神经退化性疾病；牛皮癣；血管再狭窄；伤口愈合；移植排斥；代谢性疾病；自身免疫疾病；肝硬化；糖尿病、血管疾病和免疫疾病。
本发明的化合物特别适合用作如下激酶的ATP-抑制剂：Aurora，TrkA，TrkB，Flt3(D835Y)(h)，Ret(h)，IRAK4(h)，FAK(h)，KDR9H0，PYK(2)(h)和Tie2(K849w)，用于治疗以激酶过强表达或过度表达为特点的实体瘤。这些实体瘤包括单核细胞和急性骨髓性白血病、脑瘤、乳腺瘤、胰腺瘤、卵巢瘤、泌尿生殖器瘤、淋巴系统瘤、胃腺瘤、喉部瘤、以及肺部瘤包括肺腺癌和小细胞肺腺癌。
此外，本发明提供调节和/或抑制不受调节(unregulated)或紊乱的Aurora，TrkA，TrkB，Flt3(D835Y)(h)，Ret(h)，IRAK4(h)，FAK(h)，KDR9H0，PYK(2)(h)和Tie2(K849w)激酶活性的药物组合物和方法，用于治疗或治愈包括各种癌症在内的增殖性疾病，所述方法包括把有效量的通式I所示的激酶抑制剂给予有需要的受试者。具体地，通式I所示的化合物可用来治疗某些形式的癌症。通式I所示的化合物还可以在某些已有的癌症化疗中提供额外的或协同的作用，和/或可用来恢复某些已有的癌症化疗和放射性治疗的功效。
本发明的化合物特别适合用作激酶抑制剂，用于治疗以激酶过强表达或过度表达为特点的实体瘤。这些实体瘤包括单核细胞或急性骨髓性白血病、脑瘤、乳腺瘤、胰腺瘤、卵巢瘤、泌尿生殖器瘤、淋巴系统瘤、胃腺瘤、喉部瘤、以及肺部瘤包括肺腺癌和小细胞肺腺癌。
本发明的化合物对细胞分裂具有抑制作用，因而在异种移植肿瘤模型中具有体内抗增殖作用。所以，当将这些化合物给予患有过度增殖性疾病的病人时，所述化合物能够抑制肿瘤生长，减少与淋巴增殖性疾病相关的炎症，抑制移植排斥，抑制由于组织修复而引起的神经损伤等等。本发明的化合物适用于治疗性或预防性目的。预防增殖可通过在明显的疾病发展之前给予本发明的化合物来实现，例如预防肿瘤生长、预防转移发生、减少与心血管手术相关的再狭窄等等。或者，本发明的化合物可通过稳定或改善病人的症状来治疗持续的疾病。
II.定义
本文每次关于本发明的化合物的描述都包括药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药、互变异构体、对映体、立体异构体、类似物或衍生物，包括以任何比例混合的混合物。
如果取代基以它们的常规化学通式从左到右的方式来书写，也包括从右到左书写结构的取代基，例如-CH2O-任选地也包括-OCH2-。
术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，除非另外特别指出，指的是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链、或者环状烃基或其组合。该术语优选为甲基、乙基、丙基、异-丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、戊基、或己基；也包括环烷基和二环烷基例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、降莰烷等等。烷基链中1至7个氢原子可以由F、Cl和/或Br取代，和/或1或2个CH2基团可以由O、S、SO、SO2和/或CH＝CH基团取代。
术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，指的是任选地取代的、直链或支链且由烷烃衍生出来的二价基团，例如，-CH2CH2CH2-。“亚烷基”优选为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基或亚叔丁基、亚戊基、1-、2-或3-甲基亚丁基、1，1-、1，2-或2，2-二甲基亚丙基、1-乙基亚丙基、亚己基、1-、2-、3-或4-甲基亚戊基、1，1-、1，2-、1，3-、2，2-、2，3-或3，3-二甲基亚丁基、1-或2-乙基亚丁基、1-乙基-1-甲基亚丙基、1-乙基-2-甲基亚丙基、1，1，2-或1，2，2-三甲基亚丙基、或二氟亚甲基。特别优选的是具有1、2、3、4、5或6个碳原子的亚烷基，较佳为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚叔丁基、亚戊基、亚己基、二氟亚甲基、四氟亚乙基或1，1-二氟亚乙基。
“环亚烷基”(“环亚烷基”)优选为环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基或环亚庚基。
术语“芳基”除非另有指明，指的是多元不饱和芳香族单环或多环，较佳地具有1至3个环，其中多元环以共价稠合或相连在一起。术语“芳基”例如是苯基，邻-、间-或对-甲苯基，邻-、间-或对-乙基苯基，邻-、间-或对-丙基-苯基，邻-、间-或对-异丙基苯基，邻-、间-或对-叔丁基-苯基，邻-、间-或对-羟基苯基，邻-、间-或对-硝基-苯基，邻-、间-或对-氨基-苯基，邻-、间-或对-(N-甲基氨基)苯基，邻-、间-或对-(N-甲基-氨基-羰基)-苯基，邻-、间-或对-乙酰氨基-苯基，邻-、间-或对-甲氧基---苯基，邻-、间-或对-乙氧基-苯基，邻-、间-或对-乙氧基-羰基-苯基，邻-、间-或对-(N，N-二-甲基-氨基)-苯基，邻-、间-或对-(N，N-二-甲基-氨基羰基)-苯基，邻-、间-或对-(N-乙基-氨基)-苯基，邻-、间-或对-(N，N-二乙基氨基)-苯基，邻-、间-或对-氟苯基包括二氟苯基，邻-、间-或对-溴苯基包括二溴苯基，邻-、间-或对-氯苯基包括二氯苯基，邻-、间-或对-(甲基磺酰氨基)-苯基，邻-、间-或对-(甲基-磺酰基)-苯基，邻-、间-或对-甲基硫烷基苯基，邻-、间-或对-氰基-苯基，邻-、间-或对-羧基-苯基，邻-、间-或对-甲氧基羰基-苯基，邻-、间-或对-甲酰基苯基，邻-、间-或对-乙酰基苯基，邻-、间-或对-氨基--磺酰基苯基，邻-、间-或对-(吗啉-4-基羰基)-苯基，邻-、间-或对-(吗啉-4-基羰基)-苯基，邻-、间-或对-(3-氧吗啉-4-基)-苯基，邻-、间-或对-(哌啶基羰基)-苯基，邻-、间-或对-[2-(吗啉-4-基)乙氧基]-苯基，邻-、间-或对-[3-(N，N-二乙基氨基)丙氧基]-苯基，邻-、间-或对-[3-(3-二乙基-氨基-丙基)-脲基]-苯基，邻-、间-或对-(3-二乙基氨基-丙氧基羰基-氨基)-苯基，更优选为2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二-氟苯基，2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二氯苯基，2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二-溴苯基，2，4-或2，5-二硝基-苯基，2，5-或3，4-二甲氧基-苯基，3-硝基-4-氯-苯基，3-氨基-4-氯-，2-氨基-3-氯-，2-氨基-4-氯-，2-氨基-5-氯-或2-氨基-6-氯苯基，2-硝基-4-N，N-二甲基-氨基-或3-硝基-4-N，N-二甲基-氨基-苯基，2，3-二氨基-苯基，2，3，4-、2，3，5-、2，3，6-、2，4，6-或3，4，5-三-氯苯基，2，4，6-三甲氧基苯基，2-羟基-3，5-二氯-苯基，p-碘-苯基，3，6-二-氯-4-氨基-苯基，4-氟-3-氯苯基，2-氟-4-溴苯基，2，5-二氟-4-溴-苯基，3-溴-6-甲氧基-苯基，3-氯-6-甲氧基-苯基，3-氯-4-乙酰氨基-苯基，3-氟-4-甲氧基苯基，3-氨基-6-甲基-苯基，3-氯-4-乙酰氨基苯基或2，5-二甲基-4-氯苯基。
在一较佳实施例中，“芳基”优选是未取代的或者由一或多个卤素、OR、CN或CONH2单取代、双取代或三取代的苯基，其中R是H，含有一或多个杂原子的烷基或烷基链；或者取代基与它们所连接的苯基上的碳原子一起形成第二个环，从而提供双环结构。
术语“杂芳基”指的是含有1至4个选自N、O、S、Si、P和B杂原子的芳基环，其中氮和硫原子任选地是氧化的，氮原子任选地是季铵化。杂芳基可以与分子的其余部分通过碳原子或杂原子连接在一起。非限制地，芳基和杂芳基的例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、7-氮杂吲哚、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基、1-哌啶基、3-苯并呋喃基，以及4-苯并二氧杂环己烯基。每个上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自以下描述的可接受的取代基。
为简单起见，术语“芳基”当与其他术语联合使用时，例如芳氧基、芳基硫氧基或芳基烷基，任选地包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”任选地包括芳基与烷基结合的基团(例如，苄基，苯乙基，吡啶基甲基等等)，其中包括这样的烷基：碳原子(例如亚甲基)已经由例如氧原子取代(例如，苯氧基甲基，2-吡啶基氧基甲基，3-(1-萘氧基)丙基等等)。术语“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”每个均任选地包括上述基团的未取代的、单取代、二取代或三取代形式。
术语″烷氧基″、″烷基氨基″和″硫烷基″(或硫代烷氧基)具有本领域的常规意义，指的是分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的那些烷基。
烷基和杂烷基的取代基包括通常那些基团，如链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、链炔基、环烷基、杂环烷基、环链烯基和杂环链烯基，它们总的被称为“烷基取代基”，可以但不限于是一或多个选自以下组内的基团：取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基，以及-R1，其中R1是-OH、O-烷基、-CN、-卤素、-C(O)OH、-C(O)O(烷基)、-C(O)NH2、-C(O)NH(烷基)、-C(O)N(烷基)2、-CH2OH、-CH2O(烷基)、-CH2NH2、-CH2NH(烷基)、-CH2N(烷基)2、-SO2OH、-SO2O(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)、以及-SO2N(烷基)2。基于上述关于取代基的讨论，本领域技术人员应该理解，术语“烷基”包括这样的基团，所述基团包括与氢以外的其他基团连接的碳原子，例如卤代烷基(如-CF3和-CH2CF3)以及酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
与有关烷基的取代基相似，芳基和杂芳基的取代基总的也称为“芳基取代基”。这些取代基选自例如：取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、-OH、-O-烷基、-CN、-卤素、-C(O)OH、-C(O)O(烷基)、-C(O)NH2、-C(O)NH(烷基)、-C(O)N(烷基)2、-CH2OH、-CH2O(烷基)、-CH2NH2、-CH2NH(烷基)、-CH2N(烷基)2、-SO2OH、-SO2O(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)和-SO2N(烷基)2。
本文使用的术语″酰基″指的是含有羰基残基的取代基，C(O)R。R的例子包括H、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基以及取代或未取代的杂环烷基。
本文使用的术语″稠合环系统”指的是至少2个环，其中每个环与另一个环有至少2个共同原子。稠合环系统可以包括芳香族或非芳香族环。“稠合环系统”的例子是萘、吲哚、喹啉、色烯、降莰烷等等。
本文使用的术语“治疗”指的是预防具体疾病或治疗已存在的适应症。
本文使用的术语″治疗有效量″指的是本发明的化合物、材料或含有本发明化合物的组合物的用量能同时阻断或抑制哺乳动物的激酶受体而有效地产生某些所希望的治疗效果，从而阻止待治疗细胞中该途径的生物后果，其效益/风险的比率对于任何医学治疗都是合理的。典型的治疗有效量的范围在0.1至1000mg范围内，较佳地在0.1至500mg范围内。
术语“药学上可接受的盐”包括根据此处描述的化合物的具体取代基，由相对无毒性酸或碱制备得到的活性化合物。当本发明的化合物包含相对酸性官能度，将这些化合物的中性形式与足够量的所希望的碱(不论是纯的形式或在合适的惰性溶剂中)反应可以得到碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐、或镁盐，或者类似的盐。当本发明的化合物包含相对碱性官能度，将这些化合物的中性形式与足够量的所希望的酸(不论是纯的形式或在合适的惰性溶剂中)反应可以得到酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的例子包括无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸等)形成的盐，以及由相对无毒性的有机酸(例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、杏仁酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、邻甲苯基磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲烷磺酸等等形成的盐。也包括由氨基酸如精氨酸和有机酸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等等形成的盐(参见Berge等的J.Pharm.Sci.，66，1(1977)。本发明一些具体化合物同时包含碱性和酸性官能度，使得这些化合物可以转化为碱或酸加成盐。
化合物的中性形式较佳地通过将盐与碱或酸接触然后以常规方式分离母体化合物而产生。化合物的母体形式在某些物理性质例如在极性溶剂中的溶解度与各种盐形式不同，但除此之外盐与化合物的母体形式针对本发明的目的是等同的。
除了盐形式之外，本发明也提供前药形式的化合物。此处描述的化合物前药指在生理条件下容易发生化学变化而生成本发明化合物的那些化合物。例如，本发明羧酸类似物的前药包括各类酯。作为示例，本发明的药物组合物包括羧酸酯。作为另一个示例，前药适合于治疗/预防要求药物分子穿过血脑屏障的那些疾病和适应症。在一优选实施例中，前药进入脑部，在脑部它转化为药物分子的活性形式。另外，前药在体内环境通过化学或生物化学方法能够转化为本发明的化合物。例如，当前药与合适的酶或化学试剂一起放在透皮贴片贮存器内，它可以缓慢地转化为本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以不溶解形式和可溶解形式包括水合形式存在。一般地，可溶解形式与不溶解形式是等同的，都包含在本发明的范围之内。本发明的某些化合物可以多晶型或无定形的形式存在。一般地，所有物理形式都可用在本发明考虑的方法中，也包含在本发明的范围之内。“化合物或者化合物的药学上可接受的盐、水合物、多形态或溶剂合物”用于包含“或者”的意思，因为符合多于上述一个标准的物质都包括在内，例如既是盐又是溶剂化物的物质也包括在本发明之内。
本文所用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)、硼(B)和磷(P)。
术语“杂烷基”本身或与另一个术语一起使用，除非另外特别指出，指的是稳定的直链或支链，或者环烃基，或其组合，由指定数目的碳原子和至少一个杂原子组成，其中杂原子选自O、N、Si和S，并且氮原子和硫原子可任选地是氧化的，氮原子可以任选地是季铵化的。杂原子O、N、S和Si可以设置在杂烷基的任何内部位置上或者在烷基与分子其余部分连接的位置上。例子包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多2个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，除非另外特别指出，指的是由杂烷基衍生出来的二价基团，例如但不限于：-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据链的任一末端或两个末端(例如，亚烷氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的化学式的书写方向不代表该连接基团的方向。例如通式-CO2R’-包括-C(O)OR’和-OC(O)R’。
术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语一起使用，除非另外特别指出，分别指的是环状“烷基”和“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置上。“环烷基”或“杂环烷基”取代基可以直接或通过连接基团与分子的其余部分连接，其中连接基团优选是烷基。环烷基的例子包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、降莰烷基、降冰片烯基等等。杂环烷基的例子包括但不限于：1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。
术语“卤素”本身或作为另一个取代基的一部分，除非另外特别指出，指的是氟、氯、溴或碘原子。另外，“卤代烷基”等术语包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”包括但不限于：三氟甲基，二氟甲基，氟甲基，2，2，2-三氟乙基，4-氯丁基，3-溴丙基等等。
本文使用的术语“TEA”、“DMF”、“LDA”、“DCM”和“TFA”用作合成本发明化合物的试剂，分别指的是“四乙胺“、“N，N-二甲基甲酰胺”、“二异丙基氨基锂”、“二氯甲烷”和“三氟乙酸”。
本发明某些化合物具有不对称的碳原子(光学中心)或双键；本发明的范围还包括外消旋体、对映异构体、几何异构体和各个异构体。采用手性合成子或手性试剂或者采用常规技术解析可以制备光学活性的(R)-和(S)-异构体。当此处描述的化合物包含烯烃双键或其他几何不对称中心时，除非特别指出，意味着这些化合物包括E和Z几何异构体。同样，本发明包括全部互变形式。
本文使用的术语“宿主”或“有需要的病人”可以是任何哺乳动物种类，例如灵长类动物特别是人、啮齿类、兔、马、手、绵羊、狗、猫等等。动物模型在家畜医治和实验研究是令人感兴趣的，为治疗人的疾病提供了模型。
通过体外试验来确定用本发明的化合物治疗具体细胞的易受性。通常，把细胞培养基与不同浓度的本发明的化合物混合一段时间，足够让活性试剂诱导细胞死亡或抑制细胞迁移，培养时间一般是1小时至一星期。体外试验使用的培养细胞来自切片样本。然后计算治疗后仍然存活的细胞数。
药物剂量取决于所使用的具体化合物、具体疾病、病人的情况等等。治疗剂量一般足够减轻目标组织中不希望的细胞数，但能够维持病人的存活。治疗一般会持续至细胞数目减少，例如细胞负荷至少减少约50％，也可以持续至在身体基本上检测不到不希望的细胞。
II.药物组合物
虽然本发明的化合物可以原始化合物的形式给药，但最好将它们制成药物组合物。本发明另一方面提供一种药物组合物，该药物组合物包含通式I或Ia所示的化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，以及一或多种药学载体，任选地一或多种其他治疗成分。载体是″可接受的″，意思是与制剂的其他成分是兼容的，对接受者是无害的。术语“药学上可接受的载体”包括媒介、稀释剂、赋形剂及其他适合掺入药物制剂的成分。
化合物或组合物的制剂包括任何适合肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内、腹膜和关节内)，直肠、离子电渗疗、鼻、吸入以及口服(包括皮肤、口腔、舌下和眼内)给药途径的制剂。最适合的途径取决于接受者的情况和疾病。制剂可以方便地制成单位剂量形式，可通过药物领域内所公知的任何方法制备。所有方法都包括将化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物(″活性成分″)与构成一或多种助剂的载体掺合在一起的步骤。一般地，制剂是这样配制的；将活性成分与液体载体或磨细的固体载体或二者均匀地和紧密地结合在一起，若需要的话，再将产物加工成所希望的制剂。口服制剂已为本领域技术人员所知，制备口服制剂的一般方法已在很多标准药物参考书中有记载，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy.，A.R.Gennaro，ed.(1995)，其全部内容纳入作为参考。
含有通式I或Ia所示化合物的药物组合物可以方便地配制成单位剂量形式，可通过药物领域上任一公知的方法制备。优选的单位剂量制剂含有有效剂量或适当比例的活性成分或药学上可接受的盐。预防剂量或治疗剂量的多少一般与待治疗的疾病性质和严重性以及给药途径有关。剂量和可能还有剂量频率随着各个病人的年龄、体重和应答而变化。通常，总的日剂量是大约每日0.1mg至大约每日7000mg的范围，较佳地大约每日1mg至大约每日100mg的范围，更佳是大约每日25mg至大约每日50mg的范围，可以是单剂也可以分多剂给予。在某些实施例中，总的日剂量可以是大约每日50mg至大约每日500mg的范围，较佳地，大约每日100mg至大约每日500mg的范围。一般建议，小孩、65岁以上病人以及肾和肝功能受损的病人开始时接受较低剂量，再根据各人的应答和/或血压水平来滴定该剂量。某些情况可能需要使用在上述剂量范围之外的剂量，这对本领域技术人员是显而易见的。此外，要注意临床医生或治疗医师会结合各个病人的应答知道如何和什么时候中断、调节或终止治疗。
本发明的口服制剂可以配制成离散单位，例如胶囊、扁囊或片剂，每剂含有预定量的活性成分；也可以配制成粉剂或粒剂；溶液或悬液，使用水性液体或非水性液体；或者油包水液体乳液或水包油液体乳液。活性成分还可以配制成大丸剂、干药糖剂或糊剂。
将通式I所示化合物压制或模压可以制成片剂，任选地使用一或多种附加成分。在适当机器上将活性成分压成自由流动的形式如粉剂或粒剂，任选地掺合粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂，就可以制成压制片。在适当机器上将粉状化合物用惰性液体稀释剂弄湿进行模压，就可以制成模制片。片剂可以任选地包衣或制成刻痕片，使在片剂里面的活性成分持续、延迟或受控地释放出来。口服或肠胃外持续释放药剂系统已为本领域技术人员所公知，实现持续释放口服或肠胃外药物的一般方法记载在例如Remington，THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，21ST Ed.，(1995)Pages 1660-75。应该明白，除了上述特别提到的成分之外，本发明的制剂还可以包括本领域关于配制药物所知的其他成分，例如口服制剂可以包括香味剂。
肠胃外制剂包括水性或非水性无菌注射溶液，这些无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使制剂与预定接受者的血液等压的溶质。肠胃外制剂还包括水性或非水性无菌悬液，这些无菌悬液可以包括助悬剂和增稠剂，而口服制剂还可以包括香味剂。各种制剂可以配制成含有多剂单位剂量的容器例如密封安瓿和小瓶；也可以储存在冻干条件下，仅需要在使用之前才加入无菌液体载体例如生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)等等。以上文提到的各种无菌粉剂、粒剂和片剂可以即时制备注射溶液和悬液。通过直肠给予的制剂可以配制成栓剂，含有常规载体如可可油或聚乙二醇。口腔内局部给予的制剂例如含服或舌下制剂，包括活性成分与调味剂如蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶结合的锭剂(lozenge)；以及活性成分与明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶结合的锭片(pastille)。
药学上可接受的载体有很多种形式，取决于所希望的给药途径，例如口服或肠胃外给药(包括静脉给药)。制备口服剂量形式的组合物时，可选用任一常用药物介质，例如对于口服液制剂(如混悬液、酏剂和溶剂)，可采用水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、色料等等。对于口服固体制剂(如粉剂、胶囊、片剂)，可选用淀粉、糖类、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等载体，固体口服制剂比液体制剂好。片剂和胶囊由于容易给药，所以是最适宜的口服固体剂量单位形式。有需要的话，可以用标准水性或非水性技术给片剂包衣。也可以使用口服或肠胃外缓释剂量形式。
示例性制剂已为本领域技术人员所公知，它们的一般制备方法在任何标准药物教科书中有记载，例如Remington，THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，21st Ed.，(1995)Lippincott。
本发明一方面考虑采用以试剂盒形式出售的有药学活性的药剂治疗疾病/适应症。该试剂盒包括装在注射器、盒、袋等等的本发明化合物。通常，试剂盒包括服用化合物的指示。当出售不同剂量浓度和/或形式(如口服和肠胃外)，或者处方医生希望滴定组合中各个成分时，试剂盒形式特别有利。
这种试剂盒的一个例子是所谓吸塑包装(blister pack)。吸塑包装在包装工业是众所周知的，已经被广泛地使用在药物单位剂量形式(片剂、胶囊等等)的包装上。它们通常由在一片相对硬的物料上覆盖透明的薄片(较佳是透明塑料薄片)组成。在包装过程中，塑料薄片上形成多个凹穴。凹穴的大小和形状与要包装的片剂或胶囊相同。将片剂或胶囊放在凹穴内，将相对硬的物料片相对于塑料薄片密封，薄片的密封面与形成凹穴的方向相反。具体的剂量说明往往印在每个吸塑包装上。
在本发明另一具体实施例中，提供了设计成按预定使用数量一次分配每日剂量的分配器。
III.治疗或预防方法
本发明另一方面提供一种治疗或预防疾病或适应症的方法，所述疾病或适应症是与激酶相关的功能失常，特别是如下疾病：哺乳动物的血管生成；癌症；肿瘤形成、生长和扩散；动脉硬化；眼病，例如老年黄斑病变、脉络膜新生血管以及糖尿病视纲膜病变；炎症性疾病；关节炎；血栓形成；纤维化；肾小球性肾炎；神经退化性疾病；牛皮癣；血管再狭窄；伤口愈合；移植排斥；代谢性疾病；自身免疫疾病；血液疾病；肝硬化；糖尿病；血管疾病和免疫疾病。所述方法包括将治疗有效量的通式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、前药、互变异构体、对映体、或外消旋混合物给予有需要的受试者。
根据本发明治疗的受试者包括需要治疗上述病症的人(病人)和其他哺乳动物。
本发明的化合物具有独特的抑制细胞分裂和影响细胞内Aurora激酶活性的药学特性。因此，这些化合物对由Aurora激酶活性调节的疾病和适应症，特别是癌症相关的肿瘤和适应症是有效的。在一实施例中，本发明的化合物与现时其他治疗标准相比副作用较少。
本发明的化合物通常比已知的抗癌药物有更高的选择性，显示抑制Aurora激酶活性的选择性更高。这些化合物也具有较优越的活性性质，包括良好的生物利用率。因此，它们比现有许多已知的方法治疗与不受调节或紊乱的Aurora激酶活性相关性疾病更有利。
IV.一般合成步骤
本发明的化合物通常由本领域技术人员已知的合成类似化合物的方法来制备。这在以下流程和制备性实施例中示出。大部分起始材料向供应商购买，例如Aldrich Chemicals Co.或Sigma Chemical Company。不是通过商业途径获得的化合物可以由本领域技术人员所知的方法制备，可参考以下文献给出的方法：“Organic Reactions，”Volumes 1-40，John Wiley & Sons(1991)；“Rodd’s  Chemistry of Carbon Compounds，”Volumes 1-5 and Suppl.，Elservier SciencePublishers(1989)；“Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis，”Volume1-15，John Wiley & Sons(1991)；以及“Advanced Organic Chemistry，”JerryMarch，John Wiley & Sons，4th Ed.(1992)；Lücking等人，ChemMedChem2007，2，63-77；以及Nicolaou.等人，Agew.Chem.Int.Ed.2005，44，4490-4527。本发明的全部大环化合物都是通过本发明人提出的方法合成的。
流程1
Figure BPA00001329749000241
流程2
Figure BPA00001329749000242
流程3
Figure BPA00001329749000251
流程4a
Figure BPA00001329749000261
流程4b
Figure BPA00001329749000262
流程5a
Figure BPA00001329749000271
流程5b
Figure BPA00001329749000272
流程5c
Figure BPA00001329749000273
流程5d
流程5e
Figure BPA00001329749000282
流程6
Figure BPA00001329749000291
流程7
流程8
Figure BPA00001329749000311
程序A：通过铟催化作用将硝基还原为苯胺
将硝基芳基化合物溶解在以4∶1混合的乙醇/水溶液(10mL)中。向该溶液加入氯化铵和铟(O)金属颗粒。反应容器加热至回流。一般地，反应在2至3小时内完成。反应完成后，过滤反应混合物以除去不溶物质，然后浓缩。将粗混合物留起结晶，无需进一步纯化。
程序B：通过H-Cube氢化反应系统将硝基还原为苯胺
将硝基芳基化合物溶解在约20mL甲醇中，然后以1mL/min速率通过45℃使用5％ Pt/C筒体的H-Cube氢化反应系统。将粗苯胺浓缩并结晶，无需进一步纯化。
程序C：通过HATU进行酰胺化
向圆底烧瓶加入胺(1eq)、羧酸(1.5eq)和N-[(1H-1，2，3-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸酯(HATU，1.5eq)。将该干混合物溶解在二甲基甲酰胺(3.00ml)中，加入N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(3eq)。反应混合物室温搅拌过夜，搅拌15小时。反应混合物用约50mL乙酸乙酯稀释并用2∶1盐水∶水的溶液萃取来纯化所希望的产物。再萃取水溶液一次，合并有机层。合并的有机萃取液经硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产物经快速色谱法(洗脱梯度为己烷/乙酸乙酯/甲醇)进一步纯化，得到所希望的产物。
程序D：通过4-硝基苯基氯甲酸酯形成脲或氨基甲酸酯
在干净和干燥的配有搅拌棒的小瓶中将乙醇/胺#1(2eq)溶解在甲苯(3.00ml)中。在该混合物中加入N，N-二乙基乙胺(2eq)，然后用注射器加入4-硝基苯基氯甲酸酯(2eq)。反应混合物室温搅拌。30分钟后，向反应溶液加入在1mL二甲基甲酰胺中的胺#2(1eq)溶液。反应混合物室温搅拌2小时。再将反应混合物浓缩，经制备性RP-HPLC纯化，得到所希望的产物。
分析性LC/MS
使用以下两种方法进行分析性LC/MS：
方法A：
使用Discovery
Figure BPA00001329749000331
C18，5μm，3x 30mm柱，流速为400μL/min，5μL的进样环路，流动相(A)：含0.1％甲酸的甲醇，流动相(B)：含0.1％甲酸的水；停留时间以分钟表示。具体做法：(I)流过带ESI+modus中UV/Vis二极管阵列探测器G1315B(Agilent)和Finnigan LCQ Duo MS探测器的四元泵G1311A(Agilent)，在254和280nm处进行UV-探测，采用梯度为15-95％的流动相(B)，3.2分钟线性梯度；(II)保持95％的(B)1.4分钟；(III)流动相(B)从95％降到15％，0.1分钟线性梯度；(IV)保持15％的(B)2.3分钟。
方法B：
使用Waters Symmetry
Figure BPA00001329749000332
C18，3.5μm，4.6x 75mm柱，流速为1mL/min，10μL进样环路，流动相(A)：含0.05％TFA的水，流动相(B)：含有0.05％TFA的ACN；停留时间以分钟表示。具体做法：(I)流过带ESI+modus中UV/Vis二极管阵列探测器G1315B(Agilent)和Agilent G1956B(SL)MS探测器的二元泵G1312A(Agilent)，在254和280nm处进行UV-探测，采用梯度为20-85％的流动相(B)，10分钟线性梯度；(II)保持85％的(B)1分钟；(III)流动相(B)从85％降到20％，0.2分钟线性梯度；(IV)保持20％的(B)3.8分钟。
制备性HPLC
使用Waters Atlantis TM dC18 OBD TM 10μM(30X 250mm)柱或WatersSunfire TM Prep C18 OBD TM 10μM(30X 250mm)柱进行制备性HPLC。这些柱使用时的流速为60mL/min，Waters Prep LC 4000系统配置进样环路(10mL)和ISCO UA-6 UV/Vis检测器。流动相来自两个溶剂储存器：(A)水，(B)HPLC-梯度乙腈。典型的制备性运行使用线性梯度(例如，在60分钟内0-60％溶剂B)。
以下实施例只举例说明本发明的选定实施例，对本发明的范围没有限制作用。
制备性实施例
建筑模块的合成
实施例I
3-{[1-(4-甲氧基-苯基)-亚甲-(E)-基]-氨基}-环己醇
在室温和强烈搅拌条件下，向3-氨基环己醇(0.9g，7.81mmol)在氢氧化钠水溶液(1mL，1M)中的溶液加入4-甲氧基苯甲醛(1.12g，8.20mmol)。反应混合物搅拌30分钟。真空过滤收集固体，用水洗涤，然后干燥，得到粗产物3-{[1-(4-甲氧基-苯基)-亚甲-(E)-基]-氨基}-环己醇，无需进一步操件可直接使用。
实施例II
(3-烯丙氧基-环己基)-[1-(4-甲氧基-苯基)-亚甲(E)-基]-胺
Figure BPA00001329749000342
室温下搅拌3-{[1-(4-甲氧基-苯基)-亚甲-(E)-基]-氨基}-环己醇(200mg，0.86)、烯丙基溴(149μL，1.71mmol)和60％氢化钠在矿物油中的分散液(60％，69mg，1.71mmol)在DMF(4mL)中的悬液。24小时后，用甲醇淬灭反应，用乙酸乙酯稀释，并用水和盐水洗涤。有机层用固体硫酸镁干燥。浓缩，得到(3-烯丙氧基-环己基)-[1-(4-甲氧基-苯基)-亚甲-(E)-基]-胺，无需进一步操件可直接使用。
实施例III
3-烯丙氧基-环己基胺
将(3-烯丙氧基-环己基)-[1-(4-甲氧基-苯基)-亚甲-(E)-基]-胺(100mg，0.37mmol)在丙酮(2mL)中的溶液加热至回流。加入盐酸水溶液(0.25mL，1M)，加热至回流并保持多30分钟。反应混合物分隔为盐酸水溶液(1M)和乙酸乙酯。水相用浓氢氧化钠水溶液处理直至呈碱性，再用乙酸乙酯萃取。有机相减压浓缩，得到3-烯丙氧基-环己基胺。
实施例IV
(3-烯丙氧基-环己基)-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-胺
在70℃下，将3-烯丙氧基-环己基胺(200mg，1.29mmol)、碳酸氢钠(216mg，2.58mmol)和2，4-二氯-5-氟嘧啶(237mg，1.42mmol)l)在乙醇∶水(1∶1，4mL)中的混合物搅拌40小时。反应混合物冷却，加入小量iPOH。结晶析出产物，过滤，得到粗产物。粗产物用快速硅胶柱纯化，得到260mg产物。
实施例V
N * 4 * -(3-烯丙氧基-环己基)-N * 2 * -(3-烯丙氧基-苯基)-5-氟-嘧啶-2，4-二胺
Figure BPA00001329749000352
加压容器装有(3-烯丙氧基-环己基)-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-胺(130mg，0.45mmol)、3-(烯丙氧基)苯胺(102mg，0.68mmol)和TFA(84μL，1.14mmol)在异丙醇(2mL)中的溶液，密封该容器，加热至100℃，保持过夜。反应混合物冷却，经快速硅胶色谱法纯化，得到N*4*-(3-烯丙氧基-环己基)-N*2*-(3-烯丙氧基-苯基)-5-氟-嘧啶-2，4-二胺(79mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.71min；m/z 399.2(M+1)]。
实施例VI
4-(4-甲氧基亚苄基氨基)环己醇
在室温和强烈搅拌条件下，向4-氨基环己醇(1g，8.68mmol)在氢氧化钠水溶液(1mL，1M)中的溶液加入4-甲氧基苯甲醛(1.24g，9.12mmol)。反应混合物搅拌30分钟。真空过滤收集固体，用水洗涤，干燥，得到4-(4-甲氧基亚苄基氨基)环己醇(1.80g)，无需进一步操作可直接使用。
实施例VII
(4-(烯丙氧基)-N-(4-甲氧基亚苄基)环己胺
室温下搅拌4-(4-甲氧基亚苄基氨基)环己醇(1g，4.29mmol)、烯丙基溴(1.87mL，21.4mmol)和60％氢化钠在矿物油中的分散液(857mg，21.4mmol)在DMF(20mL)中的悬液。3天后，用甲醇淬灭反应，用乙酸乙酯稀释，并用水和盐水洗涤。有机层用固体硫酸镁干燥。浓缩，得到(4-(烯丙氧基)-N-(4-甲氧基亚苄基)环己胺，无需进一步操件可直接使用。
实施例VIII
4-(烯丙氧基)环己胺
Figure BPA00001329749000371
将4-(烯丙氧基)-N-(4-甲氧基亚苄基)环己胺(1.20g，4.39mmol)在丙酮(20mL)中的溶液加热至回流。加入盐酸水溶液(2.5mL，1M)，加热至回流并保持多30分钟。反应混合物分隔为盐酸水溶液(1M)和乙酸乙酯。水相用浓氢氧化钠水溶液处理直至呈碱性，再用乙酸乙酯萃取。有机相减压浓缩，得到4-(烯丙氧基)环己胺(630mg)。
实施例IX
N-(4-(烯丙氧基)环己基)-2-氯-5-氟嘧啶-4-胺
Figure BPA00001329749000372
在70℃下，将4-(烯丙氧基)环己胺(500mg，2.58mmol)、碳酸氢钠(433mg，5.15mmol)和2，4-二氯-5-氟嘧啶(473mg，2.83mmol)在DMF(13mL)中的混合物搅拌40小时。反应混合物冷却，加入小量iPOH。结晶析出产物，过滤。
实施例X
N 4 -(4-(烯丙氧基)环己基)-N 2 -(3-(烯丙氧基)苯基)-5-氟嘧啶-2，4-二胺
Figure BPA00001329749000373
加压容器装有N-(4-(烯丙氧基)环己基)-2-氯-5-氟嘧啶-4-胺(300mg，1.05mmol)、3-(烯丙氧基)苯胺(235mg，1.57mmol)和TFA(194μL，2.62mmol)在异丙醇(5mL)中的溶液，密封该容器，加热至100℃，保持过夜。反应混合物冷却，经快速硅胶色谱法纯化，得到N4-(4-(烯丙氧基)环己基)-N2-(3-(烯丙氧基)苯基)-5-氟嘧啶-2，4-二胺(褐色固体，180mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.84min；m/z 399.4(M+1)]。
实施例XI
(1S，2S，3R，4R)-3-(2-(3-(烯丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1] 庚-5-烯-2-甲酰胺
加压容器配置了搅拌棒，装有(1S，2S，3R，4R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(500mg，1.77mmol)、3-(乙烯基氧基)苯胺(290mg，1.95mmol)、三氟乙酸(327μL，4.42mmol)和异丙醇(9mL)，密封该容器，加热至100℃，保持过夜。真空过滤收集固体，得到(1S，2S，3R，4R)-3-(2-(3-(烯丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(灰色固体，0.50g)。LC/MS[方法A，停留时间：4.49min；m/z 396.1(M+1)]。
实施例XII
S-(1S，2R，4S，5S，6S)-5-氨基甲酰基-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚 烷-2-基硫代乙酸酯
Figure BPA00001329749000382
在氮气气氛下，将(1S，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(10g，35.37mmol)、硫代乙酸(2.77mL，38.9mmol)和偶氮二异丁腈(581mg，3.54mmol)在甲苯(180mL)中的混合物加热至回流，保持过夜。反应混合物减压浓缩，残留物经快速硅胶色谱法(洗脱液为己烷/乙酸乙酯)纯化，分离出两个产物。获得2.5g S-{(1S，2R，4S，5S，6S)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}硫代乙酸酯。LC/MS[方法B，停留时间：5.31min；m/z 359.0(M+1)]。
实施例XIII
S-(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[2-(3-硝基苯基)-2-氧乙 基]硫代}二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000391
上述色谱法也获得3.9g S-(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[2-(3-硝基苯基)-2-氧乙基]硫代}二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。LC/MS[方法B，停留时间：5.15min；m/z 359.0(M+1)]。
实施例XIV
硫代乙酸S-{3-[4-((1S，2S，3S，4S，6R)-6-乙酰基硫烷基-3-氨基甲酰基-二环 [2.2.1]庚-2-基氨基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-苄基}酯
Figure BPA00001329749000392
向硫代乙酸S-(3-硝基-苄基)酯(1g，4.7mmol)在乙醇(10mL)中的溶液加入Pd/C(10％，催化量)。混合物在氢气气氛下(30Psi)搅拌，过夜。混合物过滤，浓缩，得到粗硫代乙酸S-(3-氨基-苄基)酯。
按照实施例11描述的方法，以该粗硫代乙酸S-(3-氨基-苄基)酯来合成硫代乙酸S-{3-[4-((1S，2S，3S，4S，6R)-6-乙酰基硫烷基-3-氨基甲酰基-二环[2.2.1]庚-2-基氨基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-苄基}酯。
实施例XV
(1S，2S，3S，4S，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(2-(3-硝基苯基)-2-氧乙基硫 代)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000401
向S-{(1S，2R，4S，5S，6S)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}硫代乙酸酯(300mg，0.84mmol)在无水甲醇(5mL)中的悬液加入甲醇钠溶液(0.3mL，约30％，溶解在甲醇中)，得到的混合物室温搅拌30分钟。反应混合物用2-溴-3’-硝基苯乙酮(306mg，1.25mmol)处理，室温搅拌过夜。反应混合物用甲醇稀释，加入强酸阳离子交换树脂(氢形式)中和，过滤，减压浓缩。得到的残留物经快速硅胶色谱法纯化，得到(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[2-(3-硝基苯基)-2-氧乙基]硫化}二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(230mg)。
LC/MS[方法A，停留时间：5.69min；m/z 480.0(M+1)]。
实施例XVII
Figure BPA00001329749000402
按照以下实施例25描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：4.99min；m/z 521.1(M+1)]。
实施例XVIII
(1S，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-氰基二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
室温和氮气气氛下，装在配有搅拌棒的圆底烧瓶中将催化剂钴络合物(43.00mg；0.07mmol.)(按照J.Am.Chem.Soc.2006，128，11693-11712描述的方法制备)溶解在乙醇(2ml)中。2分钟后，在搅拌条件下向红色溶液加入(1S，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(2.00g；7.07mmol)，再加入4-甲基苯磺酰氰(41mg；8.49mmol)。然后，滴加入苯基硅烷(0.87ml；7.07mmol；1.00eq.)。得到的红色均匀混合物室温搅拌45分钟。
反应混合物浓缩，分散在硅胶上，再上载至硅胶柱进行快速色谱法，梯度为在己烷中的0-80％乙酸乙酯，得到所希望的产物(490mg，得率为22％)。LC/MS[方法B，停留时间：4.1min；m/z 310.0(M+1)]。
实施例XIX
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷- 2-甲酰胺
在0℃和搅拌条件下，向(1S，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-氰基二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(0.98g；3.16mmol)在四氢呋喃(15ml)中的溶液加入9-硼双环[3.3.1]壬烷-9-氢化锂(15.82ml；1.00M，溶解在THF 15.82mmol中)。10分钟后，将反应烧瓶升温至室温，再加热至66℃保持1小时。缓慢地加入甲醇淬灭反应。混合物真空浓缩至大约10mL，加入硅胶粉末(60目)，混合物干燥，过夜。将粉末在干燥条件下加载至硅胶柱进行快速色谱法，梯度为加入了1％三乙胺的1∶1氯仿∶甲醇，得到所希望的产物(0.297mg，得率为30.1％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.59min；m/z 314.3(M+1)]。
实施例XX
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(3-硝基苯基)乙酰氨基) 甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000421
向3-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酸(0.16ml；0.70mmol)在DCM(5ml)中的溶液加入1-氯-N，N，2-三甲基丙-1-烯-1-胺(592.81mg；0.59mmol)。混合物在室温搅拌1小时。反应混合物真空浓缩，得到粗酸氯化物。它可以直接用在下一步骤中，无需进行进一步纯化。
向(1R，2S，3R，4R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(50.00mg；0.16mmol)在DCM(2ml)中的溶液加入三乙胺(0.03ml；0.19mmol)，再加入粗(3-硝基苯基)乙酰氯(0.70ml；0.25M；0.18mmol)。反应在室温搅拌16小时。反应混合物浓缩，经快速色谱法(使用在己烷中的0-100％乙酸乙酯，然后50％甲醇-乙酸乙酯)纯化，得到18.75mg(24.7％)纯产物。LC/MS[方法B，停留时间：5.2min；m/z 477.3(M+1)]。
大环化合物的合成
实施例1
(16Z)-4-氟-14，19-二氧杂-2，6，8，26-四氮杂四环[18.2.2.1～3，7～.1～9，13～]二十六 烷-3(26)，4，6，9(25)，10，12，16-庚烯
Figure BPA00001329749000422
向N4-(4-(烯丙氧基)环己基)-N2-(3-(烯丙氧基)苯基)-5-氟嘧啶-2，4-二胺(100mg，0.25mmol)在无水二氯甲烷中的溶液加入第二代Grubbs催化剂(32mg，0.04mmol)在无水二氯甲烷中的溶液。反应混合物(总体积为125mL)加热至回流，保持3天，再用第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(23.6mg，0.0376mmol)处理。反应混合物再加热至回流，保持4天。将反应混合物过滤，浓缩。得到的残留物经制备性反相HPLC处理，分离出两个主要产物，洗脱较快的化合物是(16Z)-4-氟-14，19-二氧杂-2，6，8，26-四氮杂四环[18.2.2.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷-3(26)，4，6，9(25)，10，12，16-庚烯(白色固体，2.5mg)。LC/MS[方法B，停留时间：3.06min；m/z 371.2(M+1)]。
实施例2
(16E)-4-氟-14，19-二氧杂-2，6，8，26-四氮杂四环[18.2.2.1～3，7～.1～9，13～]二十六 烷-3(26)，4，6，9(25)，10，12，16-庚烯
Figure BPA00001329749000431
由上述实施例1描述的方法制备。经制备性反相HPLC分离出两个主要产物，洗脱较慢的化合物为(16E)-4-氟-14，19-二氧杂-2，6，8，26-四氮杂四环[18.2.2.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷-3(26)，4，6，9(25)，10，12，16-庚烯(白色，3mg)。LC/MS[方法B，停留时间：3.59min；m/z 371.2(M+1)]。
实施例3
(15E，16aR，18S，19S，19aR)-3-氟-18-乙烯基-14，16a，17，18，19，19a-六氢-1H，7H- 6，2(次氮基(azeno))-8，12-(次甲基(metheno))环戊[n][1，7，9，13](氧杂三氮杂环十八烯 (oxatriazacyclooctadecine))-19-甲酰胺
边搅拌边向(1S，2S，3R，4R)-3-(2-(3-(烯丙氧基)苯基氨基)-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(100mg，0.25mmol)在无水二氯甲烷中的溶液加入第二代Grubbs催化剂(32.2mg，0.04mmol)在无水二氯甲烷中的溶液。反应混合物(总体积为13mL)加热至回流，在氮气存在下回流3小时，然后冷却，减压浓缩。将得到的残留物进行制备性反相(C-18)HPLC，分离出两个主要产物，洗脱较快的化合物是(15E，16aR，18S，19S，19aR)-3-氟-18-乙烯基-14，16a，17，18，19，19a-六氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺(白色固体，15mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.04min；m/z 396.2(M+1)]。
实施例4
(15Z，16aR，18S，19S，19aR)-3-氟-18-乙烯基-14，16a，17，18，19，19a-六氢-1H，7H- 6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺
由上述实施例3描述的方法制备。经制备性反相HPLC分离出两个化合物，其中洗脱较慢的化合物为(15Z，16aR，18S，19S，19aR)-3-氟-18-乙烯基-14，16a，17，18，19，19a-六氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺，为灰色固体(1.5mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.19min m/z 396.2(M+1)]。
实施例5
(16aS，18R，19S，19aR)-18-乙基-3-氟-14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2- (次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺
Figure BPA00001329749000451
将实施例3和4的产物化合物的混合物(10mg)溶解在甲醇(5mL)中，然后在装上催化剂10％ Pd/C筒体的H-Cube连续流动加氢反应器中进行加氢反应。反应混合物减压浓缩。将得到的残留物进行制备性反相(C-18)HPLC，分离出两个主要产物，洗脱较快的化合物是(16aS，18R，19S，19aR)-18-乙基-3-氟-14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺(白色固体，1mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.54min；m/z 400.3(M+1)]。
实施例6
(15Z，16aR，18R，19S，19aR)-18-乙基-3-氟-14，16a，17，18，19，19a-六氢-1H，7H-6，2- (次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺
Figure BPA00001329749000452
由上述实施例5描述的方法制备。经制备性反相HPLC分离出两个化合物，其中洗脱较慢的化合物为(15Z，16aR，18R，19S，19aR)-18-乙基-3-氟-14，16a，17，18，19，19a-六氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺，为白色固体(1.7mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.63min；m/z 398.3(M+1)]。
实施例7
(15R，16R，16aS，18R，19S，19aR)-18-(1，2-二羟基乙基)-3-氟-15，16-二羟基- 14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13] 氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺
Figure BPA00001329749000461
室温下，向实施例3的终产物化合物(10mg，0.03mmol，1eq.)和4-甲基吗啉-N-氧化物(8.9mg，0.08mmol)在丙酮/水(4∶1，1mL)中的悬液加入四氧化锇(0.19mg，0.007mmol)。反应混合物室温搅拌2小时，减压浓缩。将得到的残留物用饱和亚硫酸钠水溶液(1mL)处理，并进行制备性HPLC，分离出产物混合物。洗脱较快的化合物是(15R，16R，16aS，18R，19S，19aR)-18-(1，2-二羟基乙基)-3-氟-15，16-二羟基-14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺(白色固体，1mg)。没有测定羟基的立体化学。LC/MS[方法B，停留时间：1.01min；m/z 464.5(M+1)]。
实施例8
(15S，16S，16aS，18R，19S，19aR)-18-(1，2-二羟基乙基)-3-氟-15，16-di羟基- 14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13] 氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺
Figure BPA00001329749000462
按照制备上述实施例7的终产物化合物的方法制备。经过制备性HPLC，分离出洗脱较慢的化合物为(15S，16S，16aS，18R，19S，19aR)-18-(1，2-二羟基乙基)-3-氟-15，16-di羟基-14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺(乳白色固体，1mg)。没有测定羟基的立体化学。LC/MS[方法B，停留时间：1.20min；m/z 464.5(M+1)]。
实施例9
(15RS，16SR，16aS，18R，19S，19aR)-18-乙基-3-氟-15，16-二羟基- 14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13] 氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺
Figure BPA00001329749000471
室温下边搅拌边向实施例6(5mg，0.01mmol)和4-甲基吗啉-N-氧化物(4.42mg，0.04mmol)在丙酮/水(4∶1，0.5mL)中的悬液加入四氧化锇(0.10mg，0.0003mmol)。反应混合物室温搅拌过夜，加入饱和亚硫酸钠水溶液(1mL)淬灭反应，过滤，浓缩。将得到的残留物进行制备性反相HPLC，得到(15RS，16SR，16aS，18R，19S，19aR)-18-乙基-3-氟-15，16-二羟基-14，15，16，16a，17，18，19，19a-八氢-1H，7H-6，2-(次氮基)-8，12-(次甲基)环戊[n][1，7，9，13]氧杂三氮杂环十八烯-19-甲酰胺(乳白色固体，1mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.16min；m/z432.2(M+1)]。
实施例10
Figure BPA00001329749000472
向硫代乙酸S-{3-[4-((1S，2S，3S，4S，6R)-6-乙酰基硫烷基-3-氨基甲酰基-二环[2.2.1]庚-2-基氨基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-苄基}酯(30mg，0.06mmol)在甲醇(300mL)中的溶液加入甲醇钠/甲醇(30％，0.1mL)。混合物室温搅拌过夜，搅拌时溶液敞开，与大气接触(不加盖子)。混合物浓缩，经快速色谱法纯化，得到终产物(24mg)。LC/MS[方法A，停留时间：5.01min；m/z 418.1(M+1)]。
实施例11
Figure BPA00001329749000481
加压容器装有制备性实施例XV(50mg，0.10mmol)在乙醇(1.2mL)中的溶液，向该溶液加入氯化铵(55.7mg，1.04mmol)、水(0.6mL)和铟(49.1mg，0.43mmol)。密封该容器，加热至100℃，保持1小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释，用Alltech相分离柱分离两相。有机相减压浓缩，得到粗(1S，2S，3S，4S，5R)-5-(2-(3-氨基苯基)-2-氧乙基硫代)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺，无需进一步操作可直接使用。
在一个三颈烧瓶中将TFA(10.3μL，0.14mmol)和无水乙腈(20mL)加热至回流。通过滴液漏斗在1小时内向TFA溶液滴加入粗(1S，2S，3S，4S，5R)-5-(2-(3-氨基苯基)-2-氧乙基硫代)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(25mg，0.06mmol)在乙腈/异丙醇(1∶1，10mL)中的溶液。反应混合物再加热至回流，过夜。反应混合物冷却，减压浓度，得到的残留物经快速硅胶色谱法纯化，得到终产物化合物(11mg)。LC/MS[方法A，停留时间：3.94min；m/z414.2(M+1)]。
实施例12
Figure BPA00001329749000482
将上述实施例11的终产物化合物(60mg，0.15mmol)与硼氢化钠(22mg，0.58mmol)在THF/乙醇(1∶1，2mL)中的混合物室温搅拌4小时。反应混合物经制备性HPLC处理，得到产物(白色固体，3mg)。LC/MS[方法A，停留时间：3.54min；m/z 416.2(M+1)]。
实施例13
Figure BPA00001329749000491
向上述实施例12的终产物化合物(50mg，0.12mmol)在DMSO(0.5mL)中的溶液加入NaH(60％，26mg，0.66mmol)。混合物室温和氮气存在下搅拌30分钟。向该混合物加入4-(3-氯丙基)吗啉氢氯化物(48mg，0.24mmol)。让反应在室温进行，过夜。加入甲醇淬灭混合物，并用乙酸中和。然后进行制备性HPLC，得到纯加合物(7mg)。LC/MS[方法B，停留时间：2.50min；m/z 543.7(M+1)]。
实施例14
Figure BPA00001329749000492
按照上述实施例13描述的方法制备标题化合物，但该反应的反应时间是3小时。LC/MS[方法A，停留时间：3.97min；m/z 460.3(M+1)]。
实施例15
Figure BPA00001329749000493
0℃下，向上述实施例11的终产物化合物(80mg，0.19mmol)在pyr-DCM(1∶1，2mL)中的溶液滴加入TfCl(82μL，0.77mmol)。将混合物加热至室温，搅拌过夜。混合物浓缩，并用乙酸中和。然后进行C-18制备性HPLC，得到纯加合物(1mg)。LC/MS[方法B，停留时间：1.24min；m/z 398.1(M+1)]。
实施例16
Figure BPA00001329749000501
0℃下，将上述实施例11的终产物化合物(400mg，0.97mmol)悬于THF(5mL)中。在氮气气氛下边搅拌边向混合物滴加入液体LiAlH4(1M，溶于THF中，3.87mL)。将混合物加热至室温。5小时之时，加入甲醇淬灭反应。取大约20％(体积)混合物用乙酸中和，然后进行C-18制备性HPLC，得到纯加合物(40mg)。LC/MS[方法A，停留时间：0.32min；m/z402.3(M+1)]。
实施例17
Figure BPA00001329749000502
向上述实施例16(30mg，0.07mmol)和丙烯酸(7mg，0.1mmol)在DMF(1mL)中的溶液加入N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N′-乙基碳二亚胺氢氯化物(18.6mg，0.1mmol)、1H-1，2，3-苯并三唑-1-醇(13mg，0.1mmol)和三乙胺(28μL，0.17mmol)。反应混合物室温搅拌过夜。将混合物进行C-18制备性HPLC，得到纯加合物(3mg)。LC/MS[方法A，停留时间：3.71min；m/z 456.4(M+1)]。
实施例18
Figure BPA00001329749000511
将2-(3-硝基苯基)乙醇(1g，6.0mmol)和甲苯磺酰氯(1.37g，7.2mmol)在吡啶-DCM(1∶1，10mL)中室温搅拌过夜。混合物用DCM稀释，用10％HCl、饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。有机层浓缩，干燥，得到粗2-(3-硝基苯基)乙基4-甲基苯磺酸酯。它无需进一步纯化可直接用在下一步骤中。
向S-{(1S，2R，4S，5S，6S)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}硫代乙酸酯(300mg，0.84mmol)在无水甲醇(5mL)中的悬液加入甲醇钠溶液(0.3mL，约30％，溶于甲醇中)，得到的混合物室温搅拌30分钟。反应混合物用粗2-(3-硝基苯基)乙基4-甲基苯磺酸酯(537mg，1.7mmol)处理，室温搅拌过夜。反应混合物用甲醇稀释，加入强酸阳离子交换树脂(氢形式)中和，过滤，减至浓缩。得到的残留物经快速硅胶色谱法纯化，得到(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[2-(3-硝基苯基)乙基]硫代}二环[2.2.1]庚烷(245mg)。
向(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[2-(3-硝基苯基)乙基]硫代}二环[2.2.1]庚烷(243mg，0.5mmol)在乙醇(7mL)中的悬液加入NH4Cl(268mg，5.0mmol)和水(3.5mL)。混合物加热至100℃直至完成(1小时)。混合物过滤，浓缩，干燥。得到的粗产物(1S，2S，3S，4S，5R)-5-{[2-(3-氨基苯基)乙基]硫代}-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺可直接用在下一步骤中，无需进一步纯化。
将TFA(29μL)和100mL干ACN加入到500mL圆底烧瓶中。加热回流。在3小时内用注射泵滴加入(1S，2S，3S，4S，5R)-5-{[2-(3-氨基苯基)乙基]硫代-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.00mg；0.16mmol.)在1/1ACN/iPrOH(15mL)中的溶液。混合物回流，过夜。冷却，浓缩。将到的残留物进行反相制备性HPLC，得到实施例18的纯化合物(10mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.58min；m/z 400.1(M+1)]。
实施例19
Figure BPA00001329749000521
在氮气存在下，向上述实施例18的终产物化合物(50mg，0.12mmol)在DCM中的溶液加入MCPBA(70％，37mg，0.14mmol)。混合物室温搅拌4小时。用饱和NaHSO3溶液淬灭反应，混合物浓缩。得到的残留物进行反相制备性HPLC，得到所希望的加合物(3mg)。LC/MS[方法A，停留时间：3.28min；m/z 432.1(M+1)]。
实施例20
Figure BPA00001329749000522
在氮气存在下，向N-(3-羟基苯基)乙酰胺(1g，6.6mmol)在DMF(10mL)中的溶液加入NaH(60％，0.24g，9.9mol)。30分钟后，向混合物加入固体乙烷-1，2-二基双(4-甲基苯磺酸酯)(7.4g，19.9mmol)。反应过夜。混合物用乙酸乙酯(5mL)稀释，倒入150mL水。真空过滤，干燥，得到粗产物2-[3-(乙酰基氨基)苯氧基]乙基4-甲基苯磺酸酯。该加合物无需进一步操作，可直接用在下一步骤中。
按照合成上述实施例18的终产物化合物的方法制备(1S，2S，3S，4S，5R)-5-({2- [3-(乙酰基氨基)苯氧基]乙基}硫代)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚 烷-2-甲酰胺。将TFA(22μL)和50mL干ACN加入到100mL圆底烧瓶中。加热回流。在3小时内用注射泵滴加入((1S，2S，3S，4S，5R)-5-({2-[3-(乙酰基氨基)苯氧基]乙基}硫代)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(50mg；0.10mmol.)在1/1 ACN/iPrOH(10mL)中的溶液。混合物回流，过夜。向回流混合物加入HCl(4M，在二噁烷中，1mL)，搅拌过夜。混合物冷却，浓缩。将到的残留物进行反相制备性HPLC，得到实施例20的纯化合物(9mg)和实施例21的纯化合物(10mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.56min；m/z 416.1(M+1)]。
实施例21
Figure BPA00001329749000531
该化合物的制备参见上述实施例20。LC/MS[方法A，停留时间：4.87min；m/z 417.1(M+1)]。
实施例22
Figure BPA00001329749000532
按照上述实施例20的合成方法制备(1S，2S，3S，4S，5R)-5-({2-[5-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯氧基]乙基}硫代)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。
大环化步骤与合成上述实施例20的终产物化合物相类似，得到该新化合物(6mg)。LC/MS[方法A，停留时间：3.50min；m/z 514.3(M+1)]。
实施例23
(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-[(2-{[2-(4-甲基哌嗪-1-基)- 5-硝基苯基]氨基}-2-氧乙基)硫代]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000541
将溴乙酰溴(80.87μl；0.93mmol.)溶解在于DCM(2mL)中，冷却至0℃。向反应混合物加入三乙胺(141.58μl；1.02mmol.)，然后加入2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯胺(200.00mg；0.85mmol.)(溶解在2mL DMF中)。混合物在0℃搅拌1小时，加热至室温共保持2小时。混合物浓缩，干燥，得到粗2-溴-N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基]乙酰胺。该加合物无需进一步纯化，直接用在下一步骤中。
按照上述实施例18描述的方法制备标题化合物。LC/MS[方法A，停留时间：3.55min；m/z 593.1(M+1)]。
实施例24
Figure BPA00001329749000542
按照上述实施例18描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.60min；m/z 527.2(M+1)]。
实施例25
Figure BPA00001329749000551
按照上述实施例25描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：4.60min；m/z 519.9(M+1)]。
实施例26
Figure BPA00001329749000552
按照上述实施例25描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：4.07min；m/z 454.2(M+1)]。
实施例27
Figure BPA00001329749000553
按照上述实施例25描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：3.65min；m/z 429.1(M+1)]。
实施例28
Figure BPA00001329749000561
按照上述实施例25描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法B，停留时间：3.71min；m/z 469.4(M+1)]。
实施例29
Figure BPA00001329749000562
按照上述实施例25描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：3.82min；m/z 455.2(M+1)]。
实施例30
Figure BPA00001329749000563
采用J.Am.Chem.Soc.2006，128，11693-11712描述的方法制备1-{(2R，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}肼-1，2-二羧酸二叔丁酯和它的异构体1-{(2S，5R，6S)-6-(氨基羰基)-5-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}肼-1，2-二羧酸二叔丁酯的混合物。具体地说，在室温和氮气存在下将Mn(dpm)3(6.05mg；0.01mmol)溶解在iPrOH(2.50ml)中。将深褐色溶液置于冰浴中冷冻至0℃。一次性地向该冷冻溶液加入(2S，3R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(141.35mg；0.50mmol)、(E)-二氮烯-1，2-二羧酸二叔丁酯(172.70mg；0.75mmol)和苯基硅烷(0.06ml；0.50mmol)。得到的悬液在0℃搅拌30分钟，然后加热至室温。反应进行5小时。用水(1mL)淬灭反应。加入盐水(5mL)，反应混合物用乙酸乙酯萃取(3x～10mL)。合并有机层，硫酸镁干燥，过滤有机层，浓缩，得到浅橙色残留物。该残留物经正相色谱法提纯，得到所希望的产物(97mg)和它的区域异构体(160mg)。
将1-{(2S，5R，6S)-6-(氨基羰基)-5-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}肼-1，2-二羧酸二叔丁酯(113.00mg；0.22mmol)和(3-氨基苯基)乙酸(33.17mg；0.22mmol)在干iPrOH(2.00ml)中的混合物装在配有搅拌棒的微波管中。密封该容器，通过注射器加入三氟乙酸(0.04ml；0.55mmol；2.50eq.)。混合物室温搅拌5小时。
加入多一等摩尔TFA，反应回流过夜。混合物浓缩，经过反相制备性HPLC处理，得到所希望的大环加合物(4mg)。LC/MS[方法A，停留时间：0.37min；m/z 412.2(M+1)]。
实施例31
边搅拌边向(1R，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({[(3-硝基苯基)乙酰基]氨基}甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(18.75mg；0.04mmol)在乙醇(10mL)中的溶液加入氯化铵(21.03mg；0.39mmol)、铟金属(18.51mg；0.16mmol)和水(5mL)。混合物加热至回流，保持4小时，然后将温度降至70℃，保持12小时。该反应冷却至室温，通过吸水柱过滤，最后浓缩，得到粗(1R，2S，3R，4R)-5-((2-(3-氨基苯基)乙酰氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。
闭环步骤与合成上述实施例25的终产物化合物相类似，得到该所希望的大环化合物(1mg，7％)。LC/MS[方法B，停留时间：1.6min；m/z 411.3(M+1)]。
实施例32
Figure BPA00001329749000581
按照上述实施例22描述的方法制备该终产物化合物。LC/MS[方法A，停留时间：3.6min；m/z 390.2(M+1)]。
实施例33
(16Z)-6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六 烷-1(24)，3(26)，4，6，16，20，22-庚烯
Figure BPA00001329749000582
向N*4*-(3-烯丙氧基-环己基)-N*2*-(3-烯丙氧基-苯基)-5-氟-嘧啶-2，4-二胺(70mg，0.18mmol)在无水二氯甲烷中的溶液加入第二代Grubbs催化剂(22mg，0.03mmol)在无水二氯甲烷(90mL)中的溶液。反应加热至回流，过夜。反应混合物过滤，浓缩。得到的残留物经制备性反相HPLC分离出两个主要产物，其中洗脱较慢的化合物是(16Z)-6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷-1(24)，3(26)，4，6，16，20，22-庚烯(白色固体，1mg)。LC/MS[方法B，停留时间：5.15min；m/z 371.4(M+1)]。
实施例34
6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷- 1(24)，3(26)，4，6，16，20，22-庚烯
Figure BPA00001329749000591
由上述实施例33描述的方法制备。经制备性反相HPLC分离出两个主要产物，洗脱较快的化合物为6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷-1(24)，3(26)，4，6，16，20，22-庚烯(白色固体，1mg)。LC/MS[方法B，停留时间：4.70min；m/z 371.4(M+1)]。
实施例35
6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷- 1(24)，3(26)，4，6，20，22-己烯
Figure BPA00001329749000592
向6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷-1(24)，3(26)，4，6，20，22-己烯(10mg，0.03mmol)在乙醇(2mL)中的溶液加入Pd/C(5mg)。混合物室温和氢气(1atm)存在下搅拌。1小时后，混合物过滤，经制备性反相HPLC处理，得到所希望的产物(1mg)。LC/MS[方法A，停留时间：4.31min；m/z 373.3(M+1)]。
实施例36
(16R，17S)-6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二 十六烷-1(24)，3(26)，4，6，20，22-己烯-16，17-二醇
Figure BPA00001329749000601
向(16R，17S)-6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷-1(24)，3(26)，4，6，20，22-己烯-16，17-二醇(15mg，0.04mol)和4-甲基吗啉-N-氧化物(14mg，0.12mmol)在丙酮/水(4∶1，1mL)中的悬液加入加入四氧化锇(0.31mg，1.2mmol)。反应混合物搅拌2小时，过滤，经制备性HPLC分离出两个加合物(本实施例化合物和以下实施例37的化合物)。没有测定羟基的立体化学。它们暂时按照流程图那样分配。LC/MS[方法A，停留时间：3.33min；m/z 405.3(M+1)]。
实施例37
6-氟-14，19-二氧杂-2，4，8，26-四氮杂四环[18.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷- 1(24)，3(26)，4，6，16，20，22-庚烯
Figure BPA00001329749000602
按照上述实施例36描述的方法合该化合物。没有测定羟基的立体化学。它们暂时按照流程图那样分配。LC/MS[方法A，停留时间：3.83min；m/z 405.3(M+1)]。
实施例38
(16Z)-4-氟-14，19-二氧杂-2，6，8，26-四氮杂四环[18.2.2.1～3，7～.1～9，13～]二十六 烷-3(26)，4，6，9(25)，10，12，16-庚烯
Figure BPA00001329749000611
向制备性实施例11获得的N4-(4-(烯丙氧基)环己基)-N2-(3-(烯丙氧基)苯基)-5-氟嘧啶-2，4-二胺(100mg，0.25mmol)在无水二氯甲烷中的溶液加入第二代Grubbs催化剂(32mg，0.04mmol)在无水二氯甲烷中的溶液。反应混合物(总体积125mL)加热至回流，保持3小时。再用第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(23.6mg，0.0376mmol)处理。反应混合物然后加热至回流，保持4小时。反应混合物过滤，浓缩。得到的残留物经制备性反相HPLC分离出两个主要产物，其中洗脱较快的化合物是(16Z)-4-氟-14，19-二氧杂-2，6，8，26-四氮杂四环[18.2.2.1～3，7～.1～9，13～]二十六烷-3(26)，4，6，9(25)，10，12，16-庚烯(白色固体，2.5mg)。LC/MS[方法B，停留时间：3.06min；m/z 371.2(M+1)]。
其他大环化合物和合成中间体
实施例39
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-((2-(3-氨基苯基)乙酰氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000612
硝基还原步骤参照程序A进行，以(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({2-[(3-硝基-苯基)氨基]-2-氧乙基}硫代)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(18.75mg；0.04mmol)得到所希望的苯胺(15mg，85％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.8min；m/z 447.0(M+1)]。
3-(((1R，4R，5S，6R)-5-氨基甲酰基-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基-氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-基)甲基氨基甲酰基)苯基氨基甲酸叔丁酯5
Figure BPA00001329749000621
在配置了搅拌棒的闪烁管中将3-[(叔丁氧基-羰基)氨基]苯甲酸(0.16ml；0.70mmol)溶解在DCM(5.00ml)中。在室温下边搅拌混合物边滴加入1-氯-N，N，2-三甲基丙-1-烯-1-胺(592.81mg；0.59mmol)。90分钟后，反应混合物浓缩，再溶解在干DCM中，一边搅拌一边置于冰浴中冷却。向该溶液加入N，N-二甲基吡啶-4-胺(0.04ml；0.36mmol)和(1R，2S，3R，4R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(93.00mg；0.30mmol)，反应搅拌10小时。反应混合物浓缩，经快速色谱法提纯，得到纯化合物5(182mg，72％)。LC/MS[方法B，停留时间：6.0min m/z 534.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000622
实施例39
然后，按照实施例24描述的方法，在一个反应器内进行叔丁氧基羰基脱保护和闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R)-5-[({[(3-氨基苯基)氨基]羰基}氨基)甲基]-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(158.60mg；0.30mmol)和额外等量的三氟乙酸得到所希望的实施例39的大环化合物(2.1mg，1.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.8min；m/z 397.25(M+1)]。
实施例40
(1R，2S，3R，4R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((3-硝基苄基氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺6
Figure BPA00001329749000631
将(155.6mg；0.5mmol)、1-(溴甲基)-3-硝基苯(101.8mg；0.47mmol)、碳酸铯(193.9mg；0.60mmol)和二甲基甲酰胺(2.00ml)放在一个圆底烧瓶中。摇荡该烧瓶，以便溶解其内含物，然后在室温下搅拌直至完成。反应混合物浓缩，经快速色谱法(0-100％乙酸乙酯在己烷中)提纯，再用50％甲醇-乙酸乙酯洗刷，得到所希望的纯产物(106mg，47.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.8min；m/z 449.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000632
实施例40
然后，按照程序A描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[(3-硝基苄基)-氨基]甲基}二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(106.30mg；0.24mmol)得到所希望的苯胺，它可直接用在闭环步骤中。
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R)-5-[({[(3-氨基苯基)氨基]羰基}氨基)甲基]-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(158.60mg；0.30mmol)得到所希望的实施例40的大环化合物(6.3mg，7.6％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.61min；m/z 383.25(M+1)]。
实施例41
(1R，2S，3R，4R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((3-硝基苯乙基-氨基)-甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000641
在配置了搅拌棒的闪烁管中放入(1R，2S，3R，4R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(136.60mg；0.44mmol；1.00eq.)和2-(3-硝基苯基)乙基4-甲基苯磺酸酯(279.81mg；0.87mmol；2.00eq.)。混合物溶解在乙腈(5.00ml)中。边搅拌混合物边加入三乙胺(0.07ml；0.52mmol；1.20eq.)。反应混合物浓缩，经快速色谱法(0-100％乙酸乙酯在己烷中)提纯，再用50％甲醇-乙酸乙酯洗刷，得到所希望的产物(94.5mg，46.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：3.1min；m/z 463.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R)-5-((3-氨基苯乙基氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000642
按照程序A描述的方法进行硝基还原步骤，以(1S，2S，3S，4S，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({2-[(3-硝基-苯基)氨基]-2-氧乙基}硫代)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(94.50mg；0.20mmol)得到所希望的苯胺(62mg，70.2％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.62min；m/z 433.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000643
实施例41
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R)-5-[({[(3-氨基苯基)氨基]羰基}氨基)甲基]-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(24.20mg；0.05mmol)得到所希望的实施例41的大环化合物(14.9mg，18.5％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.59min；m/z 397.25(M+1)]。
实施例42
(1R，2S，3R，4R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((3-(3-硝基苯基)-脲基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
在配置了搅拌棒的闪烁管中将(1R，2S，3R，4R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(238.00mg；0.76mmol)溶解在二甲基甲酰胺(2.00ml)中，然后加入N，N-二乙基乙胺(0.32ml；2.28mmol)和1-异氰酸基-3-硝基苯(136.00mg；0.83mmol)。反应搅拌16小时。反应混合物浓缩，经快速色谱法(0-100％乙酸乙酯在己烷中)提纯，再用50％甲醇-乙酸乙酯洗刷，得到所希望的产物(143.6mg，39.6％)。LC/MS[方法B，停留时间：5.6min；m/z478.0(M+1)]。
Figure BPA00001329749000652
实施例42
按照程序A描述的方法进行硝基还原步骤，以((1R，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[(3-硝基苄基)-氨基]甲基}二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(106.30mg；0.24mmol)得到所希望的苯胺，它可直接用在闭环步骤中。
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R)-5-[({[(3-氨基苯基)氨基]羰基}氨基)甲基]-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(154.20mg；0.34mmol)得到所希望的实施例42的大环化合物(21.4mg，15.1％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.8min；m/z 412.25(M+1)]。
实施例43
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(4-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000661
按照程序C描述的方法进行酰胺化反应，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(66.60mg；0.17mmol)和2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲酸(90.19mg；0.34mmol)得到所希望的产物(72.4mg，72.7％)。LC/MS[方法B，停留时间：3.9min；m/z 467.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000662
实施例43
按照程序A描述的方法进行硝基还原和伴随的环化步骤，以(1R，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-6-({[(3-硝基苯基)氨基]羰基}氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.50mg；0.22mmol)得到所希望的实施例43的大环化合物(70.9mg，46.6％)。LC/MS[方法A，停留时间：0.44min；m/z 400.0(M+1)]。
实施例44
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)乙酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000671
按照程序C描述的方法进行酰胺化反应，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(63.70mg；0.17mmol)得到所希望的产物(79.4mg，62.6％)。LC/MS[方法B，停留时间：4.4min；m/z467.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000672
实施例44
将(1R，2S，3R，4R)-6-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(105.00mg；0.35mmol)和2-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(208.80mg；1.02mmol)在干iPrOH(2.00ml)中的混合物装在配有搅拌棒的微波管中。密封该容器，通过注射器加入三氟乙酸(0.04ml；0.55mmol)。混合物回流16小时。粗反应混合物经制备性HPLC(Waters.Sunfire柱，梯度：0-30％甲醇在三氟乙酸中的溶液(0.1％v/v))处理，得到实施例44的化合物(23mg，18％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.65min；m/z 402.25(M+1)]。
实施例45
(1R，2S，3R，4R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((3-硝基苯基-亚磺酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000681
在配置了搅拌棒的闪烁管中将(1R，2S，3R，4R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.00mg；0.32mmol)溶解在THF中。向该溶液加入三乙胺(0.06ml；0.41mmol)和3-硝基苯磺酰氯(91.82mg；0.41mmol)。密封该容器，室温搅拌。反应混合物经快速色谱法(0-100％乙酸乙酯在己烷中)提纯，再用50％甲醇-乙酸乙酯洗刷，得到所希望的产物(96.3mg，60.6％)。LC/MS[方法B，停留时间：4.3min；m/z 498.75(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R)-5-((3-氨基苯基亚磺酰氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000682
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({[(3-硝基苯基)-磺酰基]氨基}甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(93.00mg；0.19mmol)得到所希望的苯胺(87.4mg，85.1％)。LC/MS[方法B，停留时间：3.4min；m/z 469.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000683
实施例45
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R)-5-({[(3-氨基苯基)磺酰基]氨基}甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(93.00mg；0.20mmol)得到所希望的实施例45的大环化合物(7.3mg，8.5％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.62min；m/z 433.25(M+1)]。
实施例46
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(((3-硝基苯基)-甲基亚磺酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000691
在配置了搅拌棒的闪烁管中将(1R，2S，3R，4R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(98.20mg；0.32mmol)溶解在THF中。向该溶液加入三乙胺(0.06ml；0.41mmol)和3-硝基-α-甲苯磺酰氯(97.63mg；0.41mmol)。密封该容器，室温搅拌。反应混合物经快速色谱法(使用梯度为0-100％乙酸乙酯在己烷中)提纯，再用50％甲醇-乙酸乙酯洗刷，得到所希望的产物(58.3mg，35.7％)。LC/MS[方法B，停留时间：4.2min；m/z 513.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(((3-氨基苯基)甲基亚磺酰氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000692
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({[(3-硝基苄基)-磺酰基]氨基}甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(53.10mg；0.10mmol)得到所希望的苯胺(46.7mg，93.4％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.3min；m/z 483.25(M+1)]。
实施例46
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-({[(3-氨基苄基)磺酰基]氨基}甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(46.90mg；0.10mmol)得到所希望的实施例46的大环化合物(43.4mg，6.3％)。LC/MS[方法B，停留时间：1.7min；m/z 447.25(M+1)]。
实施例47
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(3-硝基苯基-氨基)-2-氧乙基氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
在配有搅拌棒的微波小瓶中将(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基-甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(66.90mg；0.21mmol)、2-氯-N-(3-硝基苯基)-乙酰胺(50.33mg；0.23mmol)、碳酸铯(0.04ml；0.53mmol)溶解在四氢呋喃(3.00mL)中。将该小瓶放在100℃的微波中保持16分钟。反应混合物经Waters Prep HPLC(梯度：0-30％甲醇在水中的溶液(0.1％v/v))处理30分钟，得到所希望的产物(73.2mg，69.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.4min；m/z492.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-((2-(3-氨基苯基氨基)-2-氧乙基氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(3-硝基苯基-氨基)-2-氧乙基氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(34.8mg，0.07mmol)得到所希望的苯胺。LC/MS[方法B，停留时间：0.63min；m/z 462.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000712
实施例47
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-((2-(3-氨基苯基氨基)-2-氧乙基氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(34.3mg，0.07mmol)得到所希望的实施例47的大环化合物(13.9mg，44％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.56min m/z 426.25(M+1)]。
实施例48
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((N-(3-硝基苄基)-乙酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
在配有搅拌棒的干净干燥圆底烧瓶中将(1R，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[(3-硝基苄基)-氨基]甲基}-二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(141.20mg；0.31mmol)溶解在THF(5.00ml)中。向该混合物加入N，N-二乙基乙胺(0.09ml；0.63mmol)，再加入乙酰氯(0.03ml；0.47mmol)，溶液在室温搅拌10分钟。浓缩的反应混合物经制备性反相HPLC(梯度：0-30％甲醇在0.1％三氟乙酸水溶液中)处理30分钟，得到所希望的产物(128.3mg，83％)。LC/MS[方法B，停留时间：3.8min；m/z 491.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R)-5-((N-(3-氨基苄基)乙酰氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000722
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((N-(3-硝基苄基)-乙酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(128.3mg，0.29mmol)得到所希望的苯胺。LC/MS[方法B，停留时间：2.3min；m/z 461.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000723
实施例48
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R)-5-((N-(3-氨基苄基)乙酰氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(128.3mg，0.28mmol)得到所希望的实施例48的大环化合物。LC/MS[方法B，停留时间：0.86min；m/z 425.25(M+1)]。
实施例49
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((甲基(3-硝基-苄基)氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
向(1R，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[(3-硝基苄基)氨基]甲基}二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(62.00mg；0.14mmol)在甲醇(10.00ml)中的溶液加入37％ AcC水溶液(15.42μl；0.21mmol)。反应在室温搅拌至经TLC测定亚胺生成全部完成。浓缩反应混合物以除去水，然后将残留物溶解在甲醇中，加入三乙酰氧基硼氢化钠(87.82mg；0.41mmol)并加入一滴乙酸。室温搅拌反应混合物15小时。浓缩的反应混合物直接用在硝基还原中。LC/MS[方法B，停留时间：2.1min；m/z 463.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(((3-氨基苄基)(甲基)氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000732
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-{[甲基(3-硝基苄基)氨基]甲基}二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(64.80mg；0.14mmol)得到所希望的苯胺(55mg，90.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.71min；m/z 433.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000741
实施例49
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(((3-氨基苄基)(甲基)氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(55mg，0.13mmol)得到所希望的实施例49的大环化合物(3mg，5.5％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.61min；m/z 397.25(M+1)]。
实施例50
(E)-2-(3，5-二叔丁基-2-甲氧基亚苄基氨基)-2，2-二苯基乙酸酯
Figure BPA00001329749000742
将氨基(联苯基)乙酸(1.07g；4.69mmol)、乙醇(50.00ml)和氢氧化钾(0.26g；4.69mmol)放在配有搅拌棒的100mL RBF中。悬液室温搅拌30分钟。向该反应烧瓶中加入3，5-二叔丁基-2-羟基苯甲醛(1.00g；4.27mmol)。反应在室温搅拌10小时，然后真空除去溶剂，高真空干燥8小时，得到吸湿的黄色固体(1.87g；90.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：3.2min)。
(1S，2S，3R，4S，5R)-5-叠氮基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺和(1R，2S，3R，4R，6S)-6-叠氮基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
在室温和氩气存在下，将氟硼酸钴(II)六水合物(10.22mg；0.03mmol)和{[(1E)-(3，5-二叔丁基-2-羟基苯基)亚甲基]氨基}(联苯基)乙酸钾(14.45mg；0.03mmol)溶解在乙醇(2.50ml)中，保持10分钟。向该溶液加入(2S，3R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(141.35mg；0.50mmol)，然后加入聚苯乙烯结合的4-甲基苯磺酰基叠氮化合物(500.00mg；0.75mmol；1.5mmol/g loading)和叔丁基氢过氧化物(0.03ml；5.50M；0.14mmol)。搅拌5分钟之后，滴加入六甲基二硅氧烷(0.16ml；0.75mmol)，该溶液在室温搅拌3天。加入去离子水(5mL)使反应淬灭，用硅石塞子过滤，用50mL乙酸乙酯稀释。有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗三次。水层用大约50mL乙酸乙酯回萃取。有机层合并，用盐水溶液洗涤，硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。得到的残留物溶解在3mL DMSO中，注入制备性HPLC柱，经反相柱分离(梯度：0％-100％ ACN在0.1％ TFA水溶液中)，得到(1S，2S，3R，4S，5R)-5-叠氮基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺，LC/MS[方法B，停留时间：2.7min；m/z 300.00(M+1)]；和(1R，2S，3R，4R，6S)-6-叠氮基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺，LC/MS[方法B，停留时间：3.8min；m/z300.00(M+1)]。
(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000751
向(1S，2S，3R，4S，5R)-5-叠氮基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(20.9g，63.7mmol)在THF(400mL)中的溶液加入PPh2(33.4g，127.3mmol)和水(46mL)，反应混合物室温搅拌2天。将混合物浓缩，再溶解在1NHCl(200mL)中，用乙酸乙酯(300mL X2)萃取。合并有机层，用1N HCl(150mL)回洗。合并的水层用乙酸乙酯(100mL)回萃取，用KOH碱化至pH 10。混合物连续地用乙酸乙酯(200mL X2)萃取，得到粗加合物。该粗加合物经硅胶色谱法提纯，得到所希望的加合物(8.9g，22％)。
(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(2-(2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)乙酰氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000761
按照程序C描述的方法进行酰胺化反应，以在二甲基甲酰胺(3.00ml)中的[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基]乙酸(160.25mg；0.57mmol)、邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸酯(163.62mg；0.43mmol)、(1R，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-三氟乙酸胺
Figure BPA00001329749000762
(118.70mg；0.29mmol)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.24ml；1.43mmol)得到所希望的产物(64.2mg，39.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：1.9min；m/z 561.25(M+1)]。
(1S，2S，3R，4R，5R)-5-(2-(5-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酰氨基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000763
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1S，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苯基]乙酰基}氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(64.20mg；0.11mmol)得到所希望的苯胺。LC/MS[方法B，停留时间：0.58min；m/z 531.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000771
实施例50
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1S，2S，3R，4R，5R)-5-({[5-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]乙酰基}-氨基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(59.20mg；0.11mmol)得到所希望的实施例50的大环化合物(2.9mg，5.3％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.74min；m/z 495.25(M+1)]。
实施例51
(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(2-(3-硝基苯基)-乙酰氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000772
按照程序C描述的方法进行酰胺化反应，以在二甲基甲酰胺(3.00ml)中的(3-硝基苯基)乙酸(80.21mg；0.44mmol)、邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸酯(126.27mg；0.33mmol)、(1R，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-二环[2.2.1]庚烷-2-三氟乙酸胺
Figure BPA00001329749000773
(91.60mg；0.22mmol)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.18ml；1.11mmol)得到所希望的产物(59mg，57.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：3.9min；m/z 463.25(M+1)]。
(1S，2S，3R，4R，5R)-5-(2-(3-氨基苯基)乙酰氨基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000781
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1S，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苯基]乙酰基}氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(64.20mg；0.11mmol)得到所希望的苯胺。LC/MS[方法B，停留时间：1.1min；m/z 433.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000782
实施例51
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1S，2S，3R，4R，5R)-5-{[(3-氨基苯基)乙酰基]氨基}-3-[(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(59.20mg；0.14mmol)得到所希望的实施例51的大环化合物(4.4mg，8.1％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.4min；m/z 397.25(M+1)]。
实施例52
(1R，2R，4S，5S，6R)-5-氨基甲酰基-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-基氨基甲酸3-硝基苄酯
按照程序D描述的方法进行氨基甲酸酯形成，以在1mL二甲基甲酰胺中的(3-硝基苯基)甲醇(0.06ml；0.48mmol)在甲苯(3.00ml)中的溶液、N，N-二乙基乙胺(0.13ml；0.97mmol)、4-硝基苯基氯甲酸酯(0.13ml；0.97mmol)和(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.00mg；0.33mmol)得到所希望的氨基甲酸酯(19.4mg，16.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：4.4min；m/z 479.25(M+1)]。
(1R，2R，4S，5S，6R)-5-氨基甲酰基-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-基氨基甲酸3-氨基苄酯
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以在甲醇(20.00ml)中的{(1R，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}氨基甲酸3-硝基苄酯(19.40mg；0.04mmol)得到所希望的苯胺(15.9mg，87.4％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.9min；m/z 449.25(M+1)]。
实施例52
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以{(1R，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}氨基甲酸3-氨基苄酯(22.90mg；0.05mmol)得到所希望的实施例52的大环化合物(1mg，3.3％)。LC/MS[方法B，停留时间：1.5min；m/z 413.25(M+1)]。
实施例53
(1R，2R，4S，5S，6R)-5-氨基甲酰基-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-基氨基甲酸2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苄酯
Figure BPA00001329749000801
按照程序D描述的方法进行氨基甲酸酯形成，以在1mL二甲基甲酰胺中的[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基]甲醇(167.67mg；0.67mmol)在甲苯(3.00ml)中的溶液、N，N-二乙基乙胺(0.09ml；0.67mmol)、4-硝基苯基氯甲酸酯(134.50mg；0.67mmol)和(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.00mg；0.33mmol)得到所希望的氨基甲酸酯(95.2mg，49.5％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.5min；m/z 577.25(M+1)]。
(1R，2R，4S，5S，6R)-5-氨基甲酰基-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-基氨基甲酸5-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苄酯
Figure BPA00001329749000802
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以在甲醇(20.00ml)中的{(1R，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}氨基甲酸2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苄酯(95.20mg；0.16mmol)得到所希望的苯胺(60.4mg，66.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.66min；m/z 547.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000811
实施例53
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以盐酸(0.60ml；4.00M；19.75mmol；4.0M在二噁烷中)和{(1R，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}氨基甲酸5-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苄酯(60.40mg；0.11mmol)得到所希望的实施例53的大环化合物(4.9mg，8.7％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.62min；m/z 511.25(M+1)]。
实施例54
(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(3-(3-硝基苄基)脲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000812
按照程序D描述的方法进行脲的形成，以在1mL二甲基甲酰胺中的(3-硝基苯基)甲烷氯化胺
Figure BPA00001329749000813
(45.59mg；0.24mmol)在THF(3.00ml)中的溶液、N，N-二乙基乙胺(0.07ml；0.48mmol)、4-硝基苯基氯甲酸酯(48.72mg；0.24mmol)和(1R，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-三氟乙酸胺
Figure BPA00001329749000821
(50.00mg；0.12mmol)得到所希望的脲(50.7mg，87.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：3.8min；m/z 478.25(M+1)]。
(1S，2S，3R，4R，5R)-5-(3-(3-氨基苄基)脲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000822
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以在甲醇(20.00ml)中的(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(3-(3-硝基苄基)脲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(50.70mg；0.11mmol)得到所希望的苯胺(32mg，67.3％)。LC/MS[方法B，停留时间：1.1min；m/z 448.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000823
实施例54
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1S，2S，3R，4R，5R)-5-({[(3-氨基苄基)氨基]羰基}氨基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(30.00mg；0.07mmol)得到所希望的实施例54的大环化合物(10.1mg，36.7％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.72min；m/z 412.25(M+1)]。
实施例55
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苄基氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000831
向(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(125.20mg；0.40mmol)在甲醇中的溶液加入2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲醛(246.63μl；0.40mmol)。反应在室温搅拌15小时。向该溶液加入三乙酰氧基硼氢化钠(253.71mg；1.20mmol)并加入一滴乙酸。室温搅拌反应混合物4小时。粗混合物经快速色谱法提纯，得到所希望的产物(115.4mg，52.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.62min；m/z 547.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-((5-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000832
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苄基]氨基}甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(45.00mg；0.08mmol)得到所希望的苯胺(42.5mg，39.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.57min；m/z 517.25(M+1)]。
实施例55
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-({[5-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基]氨基}-甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(59.20mg；0.11mmol)得到所希望的实施例55的大环化合物(13.7mg，24.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.56min；m/z 481.25(M+1)]。
实施例56
3-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯-1-磺酰氯
Figure BPA00001329749000842
在配有搅拌棒的干圆底烧瓶中将3-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯胺(0.50g；2.12mmol)一次性地加入到浓盐酸(0.71ml；23.28mmol)和冰乙酸(0.21ml；3.70mmol)的混合物中。将该圆底烧瓶放入干冰-乙醇浴中，待溶液的温度降至-10℃，滴加入10M亚硝酸钠水溶液(0.07ml；2.33mmol)，滴加的速度使得温度始终保持在-5℃以下。待亚硝酸钠溶液加完后，混合物搅拌45分钟。当重氮化完成后，通过在冰醋酸(2mL)中鼓泡二氧化硫气体(50.00ml；100.00V)来制备氧代硫烷氧化物在乙酸中的饱和溶液。然后向二氧化硫溶液加入氯化钴(I)(24.75mg；0.25mmol)，而继续在溶液中鼓泡二氧化硫。30分钟后，将含有搅拌状态的饱和二氧化硫溶液的烧瓶放在冰浴中，冷却至10℃，待重氮化完成后，在30分钟内分批加入反应混合物，冷冻，直至观察不到气体逸出。高真空条件下浓缩剩下的反应混合物，得到的残留物无需进一步纯化即可使用。
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苯基亚磺酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000851
在配置了搅拌棒的闪烁小瓶中将(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.00mg；0.32mmol)溶解在THF中。向该溶液加入三乙胺(0.06ml；0.41mmol)和3-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基-苯磺酰氯(132.49mg；0.41mmol)。密封该小瓶，室温搅拌15分钟。浓缩的反应混合物经制备性反相HPLC(梯度：0-30％甲醇在0.1％三氟乙酸水溶液中)处理30分钟，得到所希望的产物(119mg，62.6％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.3min；m/z 597.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-((3-氨基-5-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基亚磺酰氨基)-甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000852
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-[({[3-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基]磺酰基}氨基)甲基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(119.00mg；0.2mmol)得到所希望的苯胺。LC/MS[方法B，停留时间：1.1min；m/z 567.25(M+1)。
Figure BPA00001329749000861
实施例56
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-[({[3-氨基-5-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]磺酰基}-氨基)甲基]-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(99.00mg；0.17mmol)得到所希望的实施例56的大环化合物(6.3mg，6.8％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.65min；m/z 531.25(M+1)]。
实施例57
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苯胺基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000862
按照程序C描述的方法进行酰胺化反应，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(93.25mg；0.30mmol)和2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲酸(90.19mg；0.34mmol)得到所希望的产物(120.6mg，72％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.63min；m/z 561.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000871
实施例57
按照程序A描述的方法进行硝基还原和伴随的环化步骤，以(1R，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-6-({[(3-硝基苯基)氨基]羰基}氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.50mg；0.22mmol)得到所希望的实施例57的化合物(3mg，3.5％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.56min；m/z 495.25(M+1)]。
实施例58
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-(2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)乙酰氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000872
按照程序C描述的方法进行酰胺化反应，以[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基]乙酸(106.82mg；0.38mmol)和(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(60.00mg；0.19mmol)得到所希望的产物(96mg，87％)。LC/MS[方法B，停留时间：2.9min；m/z 575.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000881
实施例58
按照程序A描述的方法进行硝基还原和伴随的环化步骤，以(1R，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-6-({[(3-硝基苯基)氨基]羰基}氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.50mg；0.22mmol)得到所希望的实施例58的化合物(2.1mg，2.4％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.59min；m/z 509.25(M+1)]。
实施例59
(1R，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((2-羟基-2-(3-硝基苯基)乙基氨基)甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000882
在搅拌条件下，将碳酸氢铯(181.73mg；0.56mmol)加入至放在烧瓶中的2-(3-硝基苯基)环氧乙烷(40.53mg；0.25mmol)和(1R，2S，3R，4R，5R)-5-(氨基甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(70.00mg；0.22mmol)在二甲基甲酰胺(3.00ml)中的溶液中。反应在室温搅拌8天。反应混合物浓缩，经制备性反相HPLC提纯，得到所希望的产物(5.6mg，5.2％ yield)。LC/MS[方法B，停留时间：2.3min；m/z 479.25(M+1)]。
(1R，2S，3R，4R，5R)-5-((2-(3-氨基苯基)-2-羟基乙基氨基)甲基)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺
Figure BPA00001329749000891
按照程序B描述的方法进行硝基还原步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({[2-羟基-2-(3-硝基苯基)乙基]氨基}甲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(5.00mg；0.01mmol)得到所希望的苯胺。LC/MS[方法B，停留时间：0.57min；m/z 449.25(M+1)]。
Figure BPA00001329749000892
实施例59
按照实施例24描述的方法进行闭环步骤，以(1R，2S，3R，4R，5R)-5-({[2-(3-氨基苯基)-2-羟基乙基]氨基}甲基)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(4.6mg；0.02mmol；1.00eq.)得到所希望的实施例59的大环化合物(1.8mg，43.9％)。LC/MS[方法B，停留时间：0.6min；m/z 413.25(M+1)]。
实施例60
Figure BPA00001329749000893
实施例60
向S-{(1S，2R，4S，5S，6S)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基}硫代乙酸酯(200.00mg；0.56mmol；1.00eq.)在甲醇中的混合物加入0.15mL甲醇钠(30％，在甲醇中)。该混合物室温搅拌30分钟。向该混合物加入2-氯-N-(3-硝基苯基)-N-(2-噻吩基甲基)乙酰胺(173.21mg；0.56mmol；1.00eq.)，搅拌过夜。将该混合物与硅胶一起旋转蒸发。得到的残留物经硅胶柱(0％至100％己烷/乙酸乙酯，然后0％至50％甲醇/乙酸乙酯)处理，得到2-氯-N-(3-硝基-苯基)-N-噻吩-2-基甲基-乙酰胺。
按照实施例24描述的方法进行硝基还原和随后的闭环步骤，以2-氯-N-(3-硝基-苯基)-N-噻吩-2-基甲基-乙酰胺得到所希望的实施例60的大环化合物。LC/MS[方法A，停留时间：4.8min；m/z 525.1(M+1)]。
实施例61
Figure BPA00001329749000901
实施例61
参照实施例60描述的方法，以2-氯-1-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-硝基-苯基]-乙酮制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：1.7min；m/z 512.2(M+1)]。
实施例62和63
实施例62    实施例63
在氮气存在下，向实施例61(25mg，0.05mmol)的大环化合物在THF-乙醇(1∶1，2mL)中的溶液加入硼氢化钠(7.39mg；0.20mmol；4.00eq.)。混合物室温搅拌过夜。加入9mg NaBH4，混合物多搅拌4小时。用水淬灭混合物，得到的残留物经制备性HPLC纯化，得到实施例62的化合物(6mg)和实施例63的化合物(6mg)。没有测定羟基OH的立体化学。实施例62：LC/MS[方法A，停留时间：4.3min；m/z 514.1(M+1)]。实施例53：LC/MS[方法A，停留时间：3.2min m/z 514.1(M+1)]。
实施例64
Figure BPA00001329749000911
实施例64
在氮气存在下，向实施例61(20mg，0.04mmol)的化合物在干DCM(2mL)中的溶液加入MCPBA(11mg，70％，0.04mmol)。混合物室温搅拌4小时。用NaSO3水溶液淬灭反应。混合物浓缩，经制备性HPLC纯化，得到实施例64的化合物(5mg)。LC/MS[方法A，停留时间：0.33min；m/z 544.2(M+1)]。
实施例65
Figure BPA00001329749000912
实施例65
向实施例64(4mg，0.01mmol)的化合物在乙醇-THF(1∶1，1mL)中的溶液加入NaBH4(1.1mg，0.03mmol)。混合物室温搅拌20分钟。用水淬灭反应，并中和至pH 7。混合物经制备性HPLC纯化，得到实施例65的化合物(2mg)。LC/MS[方法A，停留时间：0.35min；m/z 546.5[M+1]。
实施例66
Figure BPA00001329749000921
实施例66
以2-(1-甲基-哌啶-4-基)-5-硝基苯酚为起始材料，按照实施例22描述的制备方法制备实施例66的化合物。LC/MS[方法B，停留时间：1.6min；m/z513.0(M+1)]。
实施例67
实施例67
按照合成实施例21化合物的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：4.6min；m/z 430.1(M+1)]。
实施例68
Figure BPA00001329749000931
实施例68
使Schlenk管中的[Rh(COD)Cl]2(175mg，0.35mmol)和(S，S)-DBPP(311mg，0.71mmol)中的氮气鼓泡/冲洗氮气。先后加入THF(58mL)和在2mL THF中的(1S，2S，3R，4R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺(5.00g；17.69mmol；1.00eq.)。混合物冷却至-78℃，搅拌10分钟，向溶液加入CatBH(1，3，2-苯二酚硼酸酯，3.77mL，35mmol)。混合物在-78℃搅拌30分钟，然后室温搅拌2天。混合物冷却至0℃，加入20mL乙醇，再加入20mL3M NaOH和20mL 30％ H2O2。混合物室温搅拌6小时。然后用170mL 1MNaOH溶液稀释。混合物用乙酸乙酸(3X)萃取，并用1M NaOH、水和盐水洗涤。浓缩有机层后，得到的残留物经快速柱处理，得到两个加合物(比例为3∶1)；(1S，2S，3R，4S，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-羟基二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(612mg，12％)和(1R，2S，3R，4R，6S)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-6-羟基二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(222mg，4％)。
向(1S，2S，3R，4S，5R)-3-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基氨基)-5-羟基-二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸酰胺(50mg，0.17mmol)和2-(2-氟-5-硝基苯基)乙酸(33mg，0.17mmol)在吡啶(1mL)中的溶液加入((1R，4S)-7，7-二甲基-2-氧二环[2.2.1]庚烷-1-基)甲磺酸(2.7mg，0.01mol)和N，N′-甲烷二亚基二环己胺(38mg，0.18mmol)。混合物室温搅拌3天。然后浓缩，得到的残留物经硅胶色谱法处理，得到(1S，2R，4S，5S，6R)-5-氨基甲酰基-6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-基2-(2-氟-5-硝基苯基)乙酸酯(12mg)。
硝基还原步骤在H-cube系统中进行，采用Pt筒体。流速是35℃时1mL/min。
大环化按照以下方式进行：将TFA和干CAN加入50mL圆底烧瓶中。在氮气存在下加热至回流。在1小时内通过注射器滴加入(1S，2R，4S，5S，6R)-5-(氨基羰基)-6-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚-2-基(5-氨基-2-氟苯基)乙酸酯(10.00mg；0.02mmol；1.00eq.)在ACN(2ml)中的溶液。混合物回流过夜。混合物浓缩，粗产物经制备性HPLC提纯，得到实施例68的化合物。LC/MS[方法B，停留时间：4.1min；m/z 416.3(M+1)]。
实施例69
Figure BPA00001329749000941
实施例69
按照实施例68描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法B，停留时间：3.6min；m/z 412.0(M+1)]。
实施例70
Figure BPA00001329749000942
实施例70
按照实施例58描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.3min；m/z 495.2(M+1)]。
实施例71
Figure BPA00001329749000951
实施例71
向2-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯氧基]乙基4-甲基苯磺酸酯(319.65mg；0.73mmol；1.10eq.)和(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(200.00mg；0.67mmol；1.00eq.)在DMF中的溶液加入碳酸氢铯(543.51mg；1.67mmol；2.50eq.)。混合物室温搅拌过夜。混合物浓缩，经硅胶色谱法提纯，得到(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯氧基)乙基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(110mg)。
按照实施例22描述的方法进行硝基还原和随后的大环化步骤，得到实施例71的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.37min；m/z 497.0(M+1)]。
实施例72
Figure BPA00001329749000952
实施例72
向(1S，2S，3R，4R，5R)-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]-5-({2-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯氧基]乙基}氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(100.00mg；0.18mmol；1.00eq.)在甲醇中的溶液加入37％甲醛(13.22μl；0.18mmol；1.00eq.)。混合物室温搅拌过夜。混合物与甲苯一起旋转蒸发4次，以除去水。将混合物重悬于甲醇中，加入三乙酰氧基硼氢化钠(151mg，4eq.)。混合物室温搅拌1小时，浓缩，经制备性HPLC提纯，得到(1S，2S，3R，4S，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(甲基(2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯氧基)乙基)氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(113mg)。
按照实施例22描述的方法进行硝基还原和随后的大环化步骤，得到实施例72的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.38min；m/z 511.0(M+1)]。
实施例73
Figure BPA00001329749000961
实施例73
按照实施例58描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.64min；m/z 415.4(M+1)]。
实施例74
Figure BPA00001329749000962
实施例74
向2-氯N-(3-硝基苯基)乙酰胺(43mg，0.20mmol)和(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(60mg；0.20mmol)在干乙腈中的溶液加入碳酸氢铯(163mg；0.50mmol)。混合物室温搅拌过夜。混合物浓缩，经硅胶色谱法提纯，得到(1S，2S，3R，4R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(2-(3-硝基苯基氨基)-2-氧乙基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。
按照实施例71描述的方法进行硝基还原和随后的大环化步骤，得到实施例74的化合物。LC/MS[方法B，停留时间：5.3min；m/z 412.2(M+1)]。
实施例75
Figure BPA00001329749000971
实施例75
将氯乙酰氯(218.81μl；2.75mmol)溶解在干DCM中，冷却至0℃。加入N，N-二乙基乙胺(442.44μl；3.17mmol；1.50eq.)，再加入2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯胺(500.00mg；2.12mmol；1.00eq.)。混合物在0℃搅拌1小时，加热至室温再搅拌1小时。溶液从澄清转浑浊黄色。LC/MS显示转化完成。混合物浓缩，干燥，得到粗2-氯-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)乙酰胺。该加合物无需进一步纯化可用在下一步骤中。
按照实施例74描述的方法进行随后的N-烷基化、硝基还原和大环化，得到实施例75的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.39min；m/z 510.4(M+1)]。
实施例76
实施例76
按照实施例58描述的方法制备该化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.77min；m/z 411.2(M+1)]。
实施例77
Figure BPA00001329749000981
实施例77
在密封试管中，边搅拌边向2-(3-硝基苯基)乙基4-甲基苯磺酸酯(235.87mg；0.73mmol；1.10eq.)和(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(200.00mg；0.67mmol；1.00eq.)在DMF中的溶液加入碳酸氢铯(543.51mg；1.67mmol；2.50eq.)。混合物室温搅拌一个周末。混合物浓缩，得到的残留物经硅胶色谱法提纯，得到纯加合物(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(3-硝基苯乙基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(50mg)。
按照实施例74描述的方法进行随后的硝基还原和大环化，得到实施例77的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.42min；m/z 308.0(M+1)]。
实施例78
Figure BPA00001329749000982
实施例78
在圆底烧瓶中，边搅拌边向2-(3-硝基苯基)环氧乙烷(121.22mg；0.73mmol；1.10eq.)和(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(200.00mg；0.67mmol；1.00eq.)在DMF中的溶液加入碳酸氢铯(543.51mg；1.67mmol；2.50eq.)。混合物室温搅拌过夜。混合物浓缩，得到的残留物经硅胶色谱法提纯，得到纯加合物(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(2-羟基-2-(3-硝基苯基)乙基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(50mg，16％)。
按照实施例74描述的方法进行随后的硝基还原和大环化，得到实施例78的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.40min；m/z 399.2(M+1)]。
实施例79
Figure BPA00001329749000991
实施例79
在配置了搅拌棒的闪烁小瓶中将(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-[(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)氨基]二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(200.00mg；0.67mmol；1.00eq.)溶解在THF(3.00ml)中。向该溶液加入三乙胺(212.74μl；1.53mmol；2.30eq.)和3-硝基-α-甲苯磺酰氯(188.68mg；0.80mmol；1.20eq.)。密封该小瓶，室温搅拌2小时。反应混合物浓缩，经硅胶色谱法提纯，得到(1S，2S，3R，4S，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-((3-硝基苯基)甲基亚磺酰氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。
按照实施例74描述的方法进行随后的硝基还原和大环化，得到实施例79的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：0.35min；m/z 433.6(M+1)]。
实施例80
Figure BPA00001329749000992
实施例80
在氮气存在下，向(3-硝基苯基)甲醇(384.91μl；3.27mmol；1.00eq.)在THF中的溶液加入氢化钠(261.18mg；6.53mmol；2.00eq.)。搅拌10分钟之后，向混合物加入3-溴丙-1-烯(727.36μl；6.53mmol；2.00eq.)。混合物室温搅拌过夜。混合物浓缩，得到的残留物经硅胶色谱法提纯，得到1-硝基-3-((丙-2-炔基氧基)甲基)苯(782mg，80％)。
向(1S，2S，3R，4S，5R)-5-叠氮基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(150mg，0.46mmol)和1-硝基-3-((丙-2-炔基氧基)甲基)苯(88mg，0.46mmol)在水-乙醇-叔丁醇(3∶2∶5，2mL)和乙酸乙酯(1mL)中的溶液加入CuSO4(0.5M，0.1mL)和铜粉(3mg)。混合物室温搅拌10天。混合物浓缩，得到的残留物经硅胶色谱法提纯，得到(1S，2S，3R，4S，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(4-((3-硝基苄基氧基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。
按照实施例74描述的方法进行随后的硝基还原和大环化，得到实施例80的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：4.2min；m/z 451.1(M+1)]。
实施例81
Figure BPA00001329749001001
实施例81
向(1S，2S，3R，4R，5R)-5-氨基-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(226mg，0.55mmol)的TFA盐和3-硝基苯基磺酰基氨基甲酸乙酯(164.8mg，0.60mmol)在二噁烷(2mL)中的溶液加入三乙胺(0.11mL，0.82mmol)。混合物回流5小时。混合物冷冻，浓缩。得到的残留物经硅胶色谱法提纯，得到(1S，2S，3R，4R，5R)-3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基氨基)-5-(3-(3-硝基苯基磺酰基)脲基)二环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(150mg，52％)。
按照实施例74描述的方法进行随后的硝基还原和大环化，得到实施例81的化合物。LC/MS[方法A，停留时间：3.1min；m/z 462.1(M+1)]。
实施例82
Figure BPA00001329749001011
实施例82
在-78℃和氮气存在下，向实施例18终产物化合物(50mg，0.12mmol)在DCM中的溶液加入MCPBA(70％，299mg，1.2mmol)。混合物在-78℃搅拌3小时。用饱和NaHSO3溶液淬灭反应，混合物浓缩。得到的残留物经反相制备性HPLC处理，得到所希望的加合物(3mg)。LC/MS[方法A，停留时间：3.33min；m/z 416.1(M+1)]。
Aurora活性的生物化学酶试验
已经有许多模型用于鉴定信号转导途径和检测不同信号转导途径之间的相互作用。例如，Khwaja等人的细胞培养基模型，EMBO，(1997)，16：2783-93，以及White等人的转基因动物模型，Oncogene，(2001)，20：7064-7072。要鉴定信号转导级联中某些级别，可使用相互作用的化合物来调解信号(例如参见Stephens等人，Biochemical J.，(2000)，351：95-105)。本发明的化合物也可用作测试动物和/或细胞培养基模型或者本文提到的临床疾病中激酶依赖型信号转导途径的试剂。
测量激酶活性的技术已为本领域技术人员所知。测定激酶活性的一般测试系统采用底物(例如组氨酸，见Alessi等人，FEBS Lett.(1996)，399(3)：333-338)或者碱性髓磷脂蛋白质，这些系统已记载于文献中(例如参见，Campos-González，R.and Glenney，Jr.，J.R.，J.Biol.Chem.(1992)，267：14535)。
已经有各种试验系统用于鉴定激酶抑制剂。亲近闪烁检测试验(SPA)(Sorg等人，J.of.Biomolecular Screening，(2002)，7：11-19)和特制平板试验(flashplate assay)都是测量作为底物带有ATP的蛋白质或肽的放射活性磷酸化。在抑制化合物存在下，检测到放射活性信号减弱或完全检测不到放射活性。均相时间分辨荧光共振能量传递(HTR-FRET)和荧光偏振(FP)技术也适合作为试验方法(Sills等人，J.of Biomolecular Screening，(2002)191-214)，使用caliper测试已为本领域技术人员所知。
其他非放射活性ELISA试验方法使用特异性磷-抗体(磷-AB)。磷-AB只与磷酸化底物结合。通过采用辣根过氧化物酶结合抗绵羊抗体的化学发光法可检测到这种结合(Ross等人，Biochem.J.(2002))。
此处描述的Aurora和其他激酶试验在两个Caliper Life Sciences系统中进行：LC3000系统和Desktop Profiler系统。它们通过测量酶反应结束时磷酸化或未磷酸化的荧光标记底物肽的相对量来提供酶活性的数据。肽的这些不同状态可通过在样本两端施加电势差进行分辨。产物具有带电磷酸盐基团(与底物相反)会导致两个肽之间的迁移性存在差别。底物肽和产物肽上荧光标记的激发可以清楚地看到这一点，在分析软件内以峰表示。
LC3000方法
例如，为了在Caliper Life Sciences LC3000系统中测量Aurora A抑制剂的抑制活性，采用TTP Mosquito液体处理仪器，在384孔板的每个孔内放置0.25μl在100％ DMSO中适当浓度的抑制剂(用于绘制剂量反应曲线)。向该反应加入各组分至终浓度为25μl：
0.067ng/μl GST-Aurora A(Carna Biosciences 05-101，N-末端GST融合全长Aurora A(1-403个氨基酸)，存取编号：NP_940835.1)，
15μM ATP(Fluka，02055)
1mM DTT(Sigma，D0632)
1mM MgCl2(Sigma，M1028)
1μM底物肽(序列FITC-LRRASLG-(CONH2)，由Tufts Peptide Synthesisservice合成
100mM HEPES pH 7.5(Calbiochem，391338)
0.015％ Brij-35(Sigma，B4184)。
反应在25℃培育90分钟，然后加入70μl终止缓冲液(100mM HEPES pH7.5，0.015％ Brij-35，10mM EDTA(Sigma，E7889))终止反应。
用Caliper LC 3000读取孔板，读取格式为芯片外迁移率试验格式(Off-Chipmobility shift assay format)，采用具有12个吸入针的芯片，参数如下：筛选压力-1.8psi，上游电压-2700，下游电压-1000。这些条件使得未磷酸化底物和磷酸化产物以不同峰分辨出来，因此可以直接测量底物转化为产物的百分比。将转化百分比与抑制剂浓度绘制成曲线，得到S形剂量应答曲线，基于该S形曲线可以用Microsoft Excel的XLFit计算IC50值。
Desktop Profiler方法
Desktop Profiler与LC 3000在计算底物转化产物的百分比都采用相同的原理。Caliper Life Sciences提供了其专有快速冷冻的含有选定激酶的预制384孔板。该384孔板的每一列都含有具体的选定激酶。第二板，即‘底物板’含有荧光标记的肽底物和ATP之混合物。以列的形式布置是便于底物板向酶板转移，可以向正确的酶提供正确浓度的底物/ATP。
化合物以单一浓度和所希望的格式被加入冷冻酶板中。从底物板转移底物/ATP混合物以启动反应。酶板在25℃培育90分钟。加入70μl终止缓冲液(100mM HEPES pH 7.5，0.015％ Brij-35，10mM EDTA(Sigma，E7889))终止反应。
板的读取方式与LC3000系统的板一样，底物峰和产物峰之比率表示该孔中酶的活性。这在板的热图谱(heat map)得到很好的表示，在热图谱中，每个孔用颜色标示相对于阳性和阴性对照(分别指没有抑制剂和没有ATP)的抑制百分比。
下表1列出了在上述两个系统中测试化合物的结果：
表1
某些大环化合物对Aurora A激酶和Aurora B激酶的抑制
Figure BPA00001329749001041
Figure BPA00001329749001051
Figure BPA00001329749001071
Figure BPA00001329749001081
Figure BPA00001329749001091
Figure BPA00001329749001101
Figure BPA00001329749001111
Figure BPA00001329749001121
Figure BPA00001329749001131
Figure BPA00001329749001141
Figure BPA00001329749001151
Figure BPA00001329749001171
Figure BPA00001329749001181
Figure BPA00001329749001191
Figure BPA00001329749001201
Figure BPA00001329749001211
Figure BPA00001329749001221
**IC50范围如下：+＝1-100nM
++＝101-1000nM
+++＝1001-6250nM
++++＝＞6250nM
表2
本发明具体化合物对其他激酶的抑制
  实施例18   实施例20   实施例27
  IC50(nM)   IC50(nM)   IC50(nM)
  Abl(T315I)(h)   +
  FAK(h)   ++   ++
  IRAK4(h)   +   ++   +
  Pyk2(h)   ++   ++
  Ret(h)   +++   ++   +
  Tie2(h)   +++   ++   ++
表3
本发明具体化合物浓度为1μM时对其他激酶的抑制(所示数字为抑制百分比)
Figure BPA00001329749001231
Figure BPA00001329749001241
Figure BPA00001329749001251
表3a
Figure BPA00001329749001261
表3b
Figure BPA00001329749001271
本说明书引用的所有出版物和专利申请都纳入作为参考。虽然结合本发明的具体实施例对本发明作了特别说明和描述，但本领域技术人员应当理解到，在不脱离所附权利要求书限定的本发明范围内，可以作出各种形式的变换和具体做法。

Claims (7)

1.如通式I所示的化合物：
Figure FDA0000448098330000011
其中：
X是F；
Figure FDA0000448098330000012
是苯基，所述苯基是未取代的或者被CN、OH、F或4-甲基-哌嗪取代；
Figure FDA0000448098330000013
是被甲酰胺和二羟基乙基可选性取代的环戊烷；
--------表示有或无双键；
L1是O；
L2是CH2；
L2’和L3各自独立地是CHOH；
n是1；
p和q各自独立地是0或1；
或其药学上可接受的盐、互变异构体、对映体或外消旋混合物。
2.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1所述的通式I化合物和生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
3.权利要求1所述的化合物用于制造治疗有需要的受试者如下疾病的药物的用途：增殖性疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染疾病。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述疾病是癌症。
5.如权利要求3或4所述的用途，其中所述受试者还同时、先后或交替进行接受至少一种其他活性药剂。
6.一种试剂盒，所述试剂盒包括单独的包装，第一包装具有治疗有效量的如权利要求2所述的药物组合物，第二包装具有治疗有效量的包含另一种药学活性成分的药物组合物。
7.如权利要求1所述的化合物，选自以下组内：
(16Z)-4-氟-14,19-二氧杂-2,6,8,26-四氮杂四环[18.2.2.1～3,7～.1～9,13～]二十六烷-3(26),4,6,9(25),10,12,16-庚烯；或
(16E)-4-氟-14,19-二氧杂-2,6,8,26-四氮杂四环[18.2.2.1～3,7～.1～9,13～]二十六烷-3(26),4,6,9(25),10,12,16-庚烯；
或其药学上可接受的盐、互变异构体、对映体或外消旋混合物。
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