CN102134585A

CN102134585A - 血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用

Info

Publication number: CN102134585A
Application number: CN2010101012807A
Authority: CN
Inventors: 荆清; 秦永文; 王国坤; 朱嘉琦
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2011-07-27

Abstract

本发明公开了血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的新用途，miRNA本身仅有18～25个核苷酸，其成熟体稳定存在于细胞浆中，因此在急性心梗后miRNA早于结构蛋白类物质(如肌钙蛋白troponin)释放进入循环血中，可在心梗早期被检测到水平的升高，作为急性心梗诊断的早期标志物。对于心梗早期(胸痛3h内)病人的诊断，目前尚无良好的特异标志物可用，因此寻找能用于早期诊断急性心梗的标志物具有广阔的市场前景。

Description

血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用

【技术领域】

本发明涉及医学分子生物学技术领域，更具体地讲，涉及血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的新用途。

【背景技术】

MicroRNA(miRNA)是一类仅有18～25个核苷酸的内源性非编码小RNAs，广泛存在于各种生物体内。miRNA通过与靶基因mRNA 3’非翻译区(3’-UTR)结合，降解或抑制mRNA翻译，调控靶基因的表达，参与调控多种生物学功能。1993年，Ambros首先在线虫中发现了一段非编码的单链小分子RNA-lin4，具有调节线虫发育时相的作用。随后近20年的科学研究，在人体中已发现了721条miRNA(Sanger miRbase 14.0)，这些miRNA在人体的许多生命活动中起着重要的调节作用。

真核生物的miRNA具有高度的序列保守性，表达时序性和组织细胞特异性等特点。近年来的研究表明心肌特异性表达的miRNA在心肌细胞分化，心脏发育和功能维持中扮演着重要角色。2007年，zhao等通过选择性敲除miR-1基因，发现miR-1能通过调控转录因子Hand2的表达影响心脏的发育过程。同年，miR-1，miR-133a，miR-208等心脏中重要的miRNA调控心肌肥厚病理进程也陆续被发现。这些科学发现说明miRNA表达水平的变化与组织器官的发育以及其正常生理活动密切相关。

近两年来，科学发现miRNA不仅在细胞内调节机体生理病理进程，而且还存在于体液中，如血浆，脑脊液等。2008年，Mitchell等首先发现许多miRNA稳定存在于血浆中，其中miR-141的水平可作为前列腺癌诊断的标志物。随后疾病诊断标志物的探索内容中增加了miRNA的研究，并且一些miRNA也陆续被研究发现可作为肿瘤，组织损伤等疾病的诊断标志物，如miR-92a可作为结肠癌的诊断标志物，miR-122可作为药物肝损伤的监控标志物。

心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，在我国居民的死亡谱中，心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手。急性心肌梗死是由于持续而严重的心肌缺血而引起的部分心肌急性缺血性坏死，是心血管疾病中的一种非常严重的疾病类型，死亡率较高，据统计，约有1/3～1/2的患者在送至医院之前死亡。因此，心梗的早期诊断对于疾病的治疗具有重要作用。

目前用于诊断急性心肌梗塞的标志物主要有肌钙蛋白troponin，肌酸激酶CK，肌红蛋白Mb等，其中肌钙蛋白troponin在急性心梗后(3～6h)血中浓度很快升高，被认为是目前最好的诊断标志物，已成为急性心梗的诊断“金标准”。但对于心梗早期(胸痛3h内)病人的诊断，目前尚无良好的特异标志物可用，因此寻找能用于早期诊断急性心梗的标志物具有广阔的市场前景。

【发明内容】

本发明的目的是提供血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的新用途。

本发明的研究基础：

1.人心脏中特异性表达的miRNA筛选与鉴定

用经典的trizol法(美国MRC公司，cat.no.TR118)分别提取大鼠和人各组织的总RNA，通过miRNA文库、miRNA基因芯片、Northern Blot、real-timePCR等技术，筛选并鉴定了心肌特异表达的miRNA(miR-208a、miR-499、miR-1、miR-133a)。图1为miR-208a、miR-499、miR-1、miR-133a在大鼠各组织中的Northern Blot结果，miR-208a和miR-499仅在大鼠心肌中表达，miR-1和miR-133a仅在大鼠心肌和骨骼肌中有表达。图2为miR-208a、miR-499、miR-1、miR-133a在大鼠(A)和人(B)各组织中的real-time PCR结果，miR-208a在大鼠和人的心肌中表达；miR-499除了在心肌表达外，在骨骼肌中也有微小的表达；miR-1和miR-133a在大鼠和人的心肌与骨骼肌组织中表达，且在骨骼肌的表达量比在心肌中更高。这4个miRNAs在其他组织均无表达。

2.血浆总RNA的提取方法

血浆中的RNA存在于一种相对特殊的环境，血浆中蛋白质，糖类等物质含量较多，因此血浆的预处理和RNA的提取都不同于常规的方法。本发明对血浆采用两步离心的方法，去除了血液中的血细胞以及细胞碎片，并采用美国MRC公司的产品TRI Reagent BD(一种专门抽提血浆或血清中RNA的试剂)，按照其操作规程，并经过一定的优化，用来提取血浆中的RNA，可用来作定量检测。由于血浆中RNA检测目前并无合适的参照可用，本方法在RNA提取过程中添加了外源性的参照cel-miR-39和cel-miR-238(线虫中表达的miRNA，在人体内无该序列)，并在检测目标miRNA的同时，也对血浆中表达最高的miRNA(miR-451和miR-16)进行了检测，以便于保证real-time PCR检测的准确性。

血浆样本预处理方法：抽取不同个体的血液，收集于EDTA抗凝管中，先经4℃，820g离心10分钟，去除血细胞，上清再经4℃，16000g离心，去除细胞碎片，最后取上层血浆于1.5ml RNase/DNase-free的离心管中，在此，-80℃冻存备用。

RNA抽提的具体步骤如下：

1.每例个体取200μl血浆，加入750μl TRI Reagent BD(cat.no.TB126)和20μl醋酸(5mol/L)，混匀后，剧烈振荡30秒，室温静置5分钟。

2.加入200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5分钟，4℃，12000g离心15分钟。

3.抽取等体积上清液，加入等量的外源性参照物cel-miR-39和cel-miR-238，混匀后加入核酸共沉剂，再混匀后加入异丙醇，-20℃静置30分钟，4℃，12000g离心15分钟。

4.弃上清，加入75％乙醇(DEPC处理水配制)清洗沉淀，4℃，7500g离心5分钟。

5.弃上清，于室温晾干后加入DNase/RNase-free的水充分溶解，用分光光度计测定所得RNA的浓度。

3.血浆miRNA的real-time PCR检测

使用美国应用生物公司的miRNA检测试剂盒(包括反转录试剂盒，特异性miRNA引物及探针，荧光定量检测试剂盒等)检测miR-208a和其他参照miRNA的相对水平。具体过程如下：

1.反转录反应：使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(P/N：4366596)和目标miRNA特异性反转录引物进行反转录反应，具体操作如下：

1)配制反应体系：2μl提取的血浆总RNA，0.15μl的dNTPs(各0.25mmol/L)，1μl的反转录酶(3.33U/μl)，0.19μl的RNase抑制剂(0.25U/μl)，1.5μl反转录缓冲液(10×)，3μl特异性的miRNA反转录引物(P/N：4427975)，7.16μl水(DNase/RNase-free)。2)反转录反应：在Bio-rad公司的PCR仪(S1000 thermal cycler)上进行反转录反应，反应参数为：16℃，30分钟；42℃，30分钟；85℃，5分钟。

2.real-time PCR反应：使用TaqMan Universal PCR MasterMix(P/N：4324018)和目标miRNA特异性探针和引物进行荧光实时定量PCR反应。具体操作如下：

1)配制反应体系：5μl反转录产物(适当比例稀释)，1μl特异性的miRNA反应引物和TaqMan探针(P/N：4427975)，10μl TaqMan Universal PCR MasterMix，4μl水(DNase/RNase-free)。2)Real-time PCR反应：在Qiagen公司的实时定量荧光PCR仪(RG-3000A)上进行real-time PCR反应：95℃预变性10分钟，循环参数为95℃，15秒；60℃，1分钟，循环次数为40。所有反应重复三次，每次取固定的荧光阈值，取得的平均值即为该样品中目标miRNA的Ct值。

3.real-time PCR结果的分析：用上述方法可测得的样品血浆中目标miRNA和参照miRNA(如miR-16，miR-451，cel-miR-39等)的Ct值。以cel-miR-39为参照，求得其它miRNA在血浆中的相对含量，以PCR检测中经典的2^-ΔCt的方式表示血浆中miR-208a的水平(ΔCt为目标miRNA与参照cel-miR-39的Ct值之差)。

4.血浆中miRNA的表达分布

作为一个良好的疾病诊断标志物，首要的前提是在健康人群血浆中检测不到或者相对稳定存在。因此本发明首先通过miRNA芯片的方法检测了4位健康人血浆中miRNA的表达水平，结果如图3。大约有170多种miRNA在健康人血浆中可被miRNA芯片检测到，miR-451和miR-16在健康人血浆含量最高，且相对稳定。miR-133a也能被检测，但表达较低，而miR-1，miR-499和miR-208a都不能被检测到。

同时，本发明通过更为精确的方法(real-time PCR)重点检测了miR-208a、miR-499、miR-1、miR-133a、miR-16和miR-451在血浆中的水平，结果如表1。Real-time PCR是一种较基因芯片更为精确的检测方法，miRNA芯片检测到高水平的miR-451和miR-16在real-time PCR中也出现了较小的Ct值(水平较高)；并且对于miRNA检测不到信号的miR-1和miR-499，real-time PCR也检测到了微弱的稳定信号；而miR-208a在两种检测方法中都不能被检测到，说明miR-208a在健康人血浆中的水平极低。

表1.miRNA芯片和real-time PCR检测信号的比较。

5.大鼠心梗模型血浆中miRNA的变化

对于miRNA是否可成为心肌梗塞诊断新的标志物，本发明首先在心梗的动物模型中做了验证。本发明通过冠状动脉结扎的方法建立大鼠心肌梗塞模型，这是一种经典的大鼠心梗模型的建立方法，在此不作详细描述。

首先本发明对冠状动脉结扎后不同时间的血浆进行了收集并检测miR-208a、miR-499、miR-1和miR-133a在血浆中的水平变化，同时也检测了miR-16和miR-122(仅在肝脏中表达的miRNA)在血浆中的变化，结果如图4A。miR-208a、miR-499、miR-1、miR-133a和miR-16在结扎后1-3小时，血浆水平都明显升高了，在3-12小时呈现最高值，12小时后开始降低。最明显是miR-208a，在结扎前不能被检测到，结扎3小时后到达最高值，在6-12小时开始下降，24小时后降至检测不到的水平。但是miR-122在结扎前后并无显著的变化。

因为心梗模型的建立过程中也涉及到了骨骼肌的创伤，这些创伤可能造成血浆中目标miRNA(尤其是miR-1、miR-133a和miR-499)的水平上升，因此本发明又分别在手术组(麻醉开胸结扎)、假手术组(麻醉开胸后不结扎)和非手术组(麻醉)的大鼠血浆中检测了这些miRNA的水平，结果如图4B。miR-1、miR-133a、miR-499、miR-16的水平在假手术组和手术组大鼠血浆中均出现了显著的升高，mi R-208a在非手术组和假手术组大鼠血浆中都不能被检测到，而在手术组大鼠血浆中明显升高。miR-122在三组大鼠血浆中都无明显的变化。

6.心梗病人血浆中miRNA的变化

本发明收集了33例心肌梗塞患者、16例冠心病患者(非心梗)、17例其他心血管疾病患者和30例健康人，患者的临床情况如表2，患者之间年龄和性别并无显著性差异。通过血浆RNA的抽提，real-time PCR的方法对血浆中目标miRNA分别作了检测，结果如图5A。miR-1、miR-133a和miR-499在心梗患者血浆中的水平明显高于非心梗患者和健康人群(P＜0.01)，而非心梗患者(冠心病和其它心血管疾病患者)与健康人群之间并无显著差异。变化最为明显的是miR-208a，在非心梗患者(冠心病和其它心血管疾病患者)与健康人群血浆中用real-time PCR均检测不到，在90.0％(30/33)的心梗患者血浆中能明显检测到表达。miR-16和miR-451的水平在心梗患者，非心梗患者(冠心病和其它心血管疾病患者)与健康人群血浆中都没有显著的变化。

表2.心梗与非心梗患者的一般资料

P₁：心梗与非心梗患者之间的比较。P₂：心梗，冠心病，非冠心病患者三者之间的比较。

本发明同时对5名心梗患者进行了2个月的随访研究，结果如图5B。miR-1、miR-133a和miR-499的水平在治疗2个月后的患者血浆中明显降低(P＜0.01)。而miR-208a的变化最为明显，在入院时，5位病人的miR-208a都能在血浆中检测到，而治疗后患者血浆中则检测不到。

7.miRNA作为心梗诊断的ROC评价

根据所得数据进行ROC分析，miR-208a，miR-499，miR-1和miR-133a都能较好的区分心梗与非心梗，AUC下面积分别为0.965，0.822，0.847和0.867，诊断准确度较高。在诊断心肌梗塞特异性100％的条件下，miR-208a，miR-499，miR-1和miR-133a的诊断敏感性分别为90.9％，36.4％，33.3％和15.2％，见图6。miR-208a表现出了最高的诊断敏感性。

8.血浆中miR-208a作为心梗早期的诊断标志物

根据心梗患者的胸痛时间，分析了33例已诊断为心梗的患者血浆中miR-208a，结果如表3。

由表中数据可知，在所有的心梗病人，90.9％患者血浆中miR-208a的水平高于诊断临界值(2^-ΔCt＞0.015)，而在胸痛早期(3小时以内)的心梗病人血浆中，100％的心梗患者血浆中miR-208a的水平高于诊断临界值，如今被广泛使用的肌钙蛋白troponin也不能在胸痛早期完全被检测到，初步说明miR-208a可作为心梗诊断的早期标志物。

表3.miR-208a在不同胸痛时间的心梗患者中的水平

9.miR-208a在其他类型疾病(非心血管疾病)患者血浆中的水平

miR-208a在胸痛症状的心血管疾病患者中能准确地诊断出心肌梗塞，未验证其作为标志物的假阳性，本发明在其他类型疾病(非心血管疾病)患者的血浆中检测了miR-208a的水平。

选取了8名急性肾损伤患者(AKI)，11名慢性肾衰患者(CRF)，11名脑中风患者(stroke)以及9名外科创伤患者(trauma)。经血浆收集，RNA抽提，定量检测血浆miRNA水平，结果如图7。miR-208a在这几种疾病患者的血浆中均未被检测到。

10.miR-208a水平诊断心肌梗塞的范围

根据测得的数据，在所有的心梗病人，血浆中miR-208a的诊断临界值为2^-ΔCt＞0.015。患者血浆中miR-208a高于该水平的则诊断为心梗；低于该水平的则诊断为非心梗。

本发明的积极效果：

基于目前血浆中miRNA可作为其它疾病(如肿瘤等)的诊断标志物，而且miR-208a在心肌细胞中特异表达的性质，我们推测，miR-208a可在心梗后进入循环血中，检测其水平可作为心梗的诊断标志物。更重要的是miRNA本身仅有18～25个核苷酸，其成熟体稳定存在于细胞浆中，因此在急性心梗后miRNA可能早于结构蛋白类物质(如肌钙蛋白troponin)释放进入循环血中，可在心梗早期被检测到水平的升高，作为急性心梗诊断的早期标志物。

【附图说明】

图1为miRNA在大鼠各组织中的Northern Blot检测；

图2为miRNA在大鼠(A)和人(B)各组织中的real-time PCR检测；

图3为miRNA在健康人血浆中的表达分布；

图4为miRNA在大鼠心梗模型中血浆中的水平；

图5为miRNA在心梗及非心梗患者(A)以及随访的心梗患者(B)血浆中的水平；

图6为miRNA作为心梗诊断标志物的ROC评价，其中心肌梗塞患者血浆中miRNA水平为一组，非心梗患者血浆中miRNA水平为一组；

图7为miRNA在其他类型疾病患者血浆中的水平。

【具体实施方式】

以下结合附图对本发明的技术方案做详细说明。

血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用的实施方法：

(1)血浆采集：

抽取患者1ml血液，分别在4℃进行两步离心，最后取上层血浆于RNase/DNase-free的离心管中。

(2)血浆总RNA抽提：

取200μl血浆，经优化的血浆RNA抽提方法提取血浆中的总RNA，提取过程中加入cel-miR-39作为系统的内参。

(3)Real-time PCR反应：

使用美国应用生物公司的miRNA检测试剂盒(包括反转录试剂盒，特异性miRNA引物及探针，荧光定量检测试剂盒等)检测血浆中miR-208a和cel-miR-39以及其它参照miRNA(如miR-16等)的水平，以三次结果(Ct值)的平均值作为该miRNA的Ct值。

(4)数据的标准化处理：

根据测得的样品血浆中miR-208a和参照miRNA(如miR-16，cel-miR-39等)的Ct值。以cel-miR-39为参照，求得miR-208a在血浆中的相对含量，以PCR检测中经典的2^-ΔCt的方式表示血浆中miR-208a的水平(ΔCt为目标miRNA与参照cel-miR-39的Ct值之差)。

(5)血浆中miR-208a水平诊断心梗

结合其它诊断参数，根据测得的血浆中miR-208a的水平，与诊断临界值比较，大于临界值则诊断为心肌梗塞，小于临界值则为非心梗。

Claims

1.血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用。

2.一种急性心梗诊断早期标志物，其特征在于，所述标志物为血浆miR-208a。