CN104630339B - 用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用 - Google Patents

用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104630339B
CN104630339B CN201410557018.1A CN201410557018A CN104630339B CN 104630339 B CN104630339 B CN 104630339B CN 201410557018 A CN201410557018 A CN 201410557018A CN 104630339 B CN104630339 B CN 104630339B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
expression
reagent
mirnas
coronary syndrome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410557018.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104630339A (zh
Inventor
顾东风
李向东
王来元
杨跃进
黄建凤
李宏帆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Original Assignee
Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuwai Hospital of CAMS and PUMC filed Critical Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority to CN201410557018.1A priority Critical patent/CN104630339B/zh
Publication of CN104630339A publication Critical patent/CN104630339A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104630339B publication Critical patent/CN104630339B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs(即microRNAs)及其应用。所述循环miRNAs包括miR‑3149和/或miR‑122，进一步包括miR‑2861，更进一步包括miR‑140‑3p和/或miR‑720，这些循环miRNAs可作为标志物用于急性冠脉综合征的早期诊断。

Description

用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及相关应用。
背景技术
急性冠脉综合征(ACS)包括急性心肌梗死(AMI)和不稳定性心绞痛(UA)，是最凶险的心血管疾病，也是导致世界范围内心血管病死亡率和发病率的主要原因。近年，我国急性冠脉综合征(ACS)发病率呈快速升高趋势。中国多省市队列研究(CMCS)显示，与上世纪90年代初北京地区心血管病人群监测(MONICA)研究相比，我国ACS发病率升高近1倍，达114例/10万·人年。全国每年死于心血管病的患者有350万，因急性冠脉综合征(ACS)死亡的人数为70万，是我国每年车祸死亡总人数的7倍。在美国每年有近200万的患者发作急性冠脉综合征(ACS)，其中有80万为AMI，在AMI中有近213,000的患者死亡，近1/2的患者在症状出现后1小时以内、赶至医院前死亡。指南推荐，在ACS发生后最好在3h内进行血运重建，以挽救缺血心肌，预防心脏衰竭，最终降低死亡率(Hamm CW,Bassand JP,Agewall S,et al.Escguidelines for the management of acute coronary syndromes in patientspresenting without persistent st-segment elevation:The task force for themanagement of acute coronary syndromes(acs)in patients presenting withoutpersistent st-segment elevation of the european society of cardiology(esc).Eur Heart J.2011；32:2999-3054)。因此，ACS患者的早期准确诊断，是及时进行缺血心肌再灌注治疗的保证，对改善患者预后有重要意义。
目前对急性冠脉综合征的诊断，是基于典型症状、心电图和心肌钙蛋白(cTnI和cTnT)做出的，但这些诊断标准都各有其局限和不足。急性冠脉综合征的典型症状包括长时间胸痛、呼吸急促和恶心，但是在老年患者、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)患者及糖尿病患者中，症状常不典型或缺乏症状。另外，左束支传导阻滞、心脏起搏器、慢性缺血型心肌病或陈旧性心梗都可能造成急性冠脉综合征心电图的不典型改变。特别是，被认为急性冠脉综合征诊断金标准的生物学标志物心肌钙蛋白cTnI，并不能区别不稳定性心绞痛和稳定性心绞痛患者，而且由于心肌钙蛋白在肺栓塞和肾衰等多种疾病状态下也会发生改变，使其诊断价值大打折扣；并且心肌钙蛋白水平升高，仅能提示心肌损伤，而不能说明损伤机制；心肌钙蛋白要在冠状动脉阻塞6-12小时后才能检测出，即便是高敏肌钙蛋白也要在心肌梗死发生3小时后才能检测出。因此，寻找新的、敏感、特异生物标志物，对ACS的早期诊断，具有重大意义。
microRNA(简称miRNA)参与动脉粥样硬化发展、斑块破裂、血小板活化和凝集、以及冠状动脉闭塞后心肌细胞死亡过程。很多miRNAs的表达具有组织特异性，并可进入包括血浆和尿液在内的体液中，有望成为急性冠脉综合征的潜在生物学标志物。近期研究表明，有些miRNAs，如miR-1、miR-133a、miR-208、miR-208a、miR-208b、miR-499和miR-499-5p，在急性心肌梗死时选择性和/或高表达，被认为是心肌损伤的生物学标志物。然而，这些miRNAs中，最早的也要在急性心肌梗死症状出现后4小时才能检出，使得这些miRNAs难以作为急性冠脉综合征的早期诊断生物学标志物。
发明内容
本发明的主要目的在于寻找能够用于急性冠脉综合征早期诊断的敏感、特异性生物学标志物，并提供其相关应用。
本案发明人通过一系列的研究证明，miR-122、miR-3149特别是二者组合可用于急性冠脉综合征的早期诊断。在此基础上，还可以进一步结合miR-140-3p、miR-720和/或miR-2861。研究表明，急性冠脉综合征患者的循环miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149比非急性冠脉综合征患者显著上调，ROC曲线下面积AUC分别是0.838、0.818、0.865、0.852和0.670，特别是同时用miR-122、miR-2861和miR-3149诊断急性冠脉综合征时，AUC甚至可达0.925。猪急性心肌梗死模型动物实验表明，冠状动脉结扎后180-240分钟，血浆miR-122水平上调，30-240分钟后，循环的miR-3149表达也上调，而血浆cTnI水平在急性心肌梗死发生240分钟时与假手术组间仍无表达差异。
据此，一方面，本发明提供了循环miRNAs作为急性冠脉综合征的早期诊断的标志物的应用，其中，所述循环miRNAs包括miR-3149和/或miR-122。
根据本发明的具体实施方案，本发明的可作为急性冠脉综合征的早期诊断的标志物中，所述循环miRNAs还包括miR-2861。
更进一步的，本发明的可作为急性冠脉综合征的早期诊断的标志物中，所述循环miRNAs还包括miR-140-3p和/或miR-720。
另一方面，本发明还提供了检测循环miRNAs的表达水平的试剂在制备用于急性冠脉综合征的早期诊断的组合物中的应用，其中，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂包括检测miR-3149和/或miR-122的表达水平的试剂。
根据本发明的具体实施方案，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂还包括检测miR-2861的表达水平的试剂。
更进一步的，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
可以应用所属领域中任何可行的方法检测所述miRNAs的表达水平。例如，可采用以下任意一种方法检测所述miRNAs的表达水平：Nothern blot方法：即首先通过电泳将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后与特定miRNA补配对的探针杂交来检测目的miRNA。具体步骤为：首先提取总RNA，然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小被分离，再将胶上的RNA分子被转移到膜上并以烘烤或者紫外交联的方法加以固定，应用生物素、放射性同位素标记的探针与膜上的RNA、杂交，经信号显示后表明待测miRNA表达。实时荧光定量PCR(实时定量RT-PCR或qPCR)以及qPCR Array(即将检测不同基因表达的反应体系排列于同一反应板上进行同时检测)：即将RNA逆转录成cDNA后，再应用实时荧光定量PCR方法(qPCR)对miRNAs表达进行检测的方法。具体步骤为：提取总RNA后，应用茎环法或末端加尾法等方法逆转录成cDNA，再通过qPCR(如Taqman探针法、SybrGreen染料法等)进行实时荧光定量PCR。应用比较Ct法，计算miRNAs与内参基因的相对表达量。miRNA芯片技术：分离纯化的miRNAs经过逆转录及第二链cDNA合成(有些需要预扩增)进行标记后，与芯片上的miRNA探针杂交，通过对信号的采集及数据分析，确定miRNA表达谱及表达量的方法。高通量测序法：提取总RNA后，从中分离纯化小RNA，然后连接5’和3’接头，合成第一链及第二链cDNA，PCR扩增测序文库，应用二代测序技术(如罗氏454、illumina Solexa或Life Tech.SOLid平台)，进行高通量测序。结果经数据分析，并与miRBase、rRNA、tRNA、RefSeq等数据库比对，对已知miRNAs进行注释，并测序得到的序列与该物种全基因组序列进行比对分析通过数学模型(如折叠模型)预测新的miRNAs。
从而，本发明的检测循环miRNAs(miR-3149、miR-122、miR-2861、miR-140-3p和/或miR-720)的表达水平的试剂可以包括：采用Nothern blot方法检测循环miRNAs的表达水平的试剂，采用qPCR或qPCR Array技术检测循环miRNAs的表达水平的试剂，采用miRNA芯片技术检测循环miRNAs的表达水平的试剂，或者采用高通量测序法检测循环miRNAs的表达水平的试剂。
另一方面，本发明还提供了一种用于急性冠脉综合征的早期诊断的组合物，该组合物包括检测miR-3149和/或miR-122的表达水平的试剂，进一步优选还包括检测miR-2861的表达水平的试剂，更进一步优选还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
另一方面，本发明还提供了一种用于急性冠脉综合征的早期诊断的试剂盒，该试剂盒包括检测miR-3149和/或miR-122的表达水平的试剂，进一步优选还包括检测miR-2861的表达水平的试剂，更进一步优选还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
根据本发明，当临床症状和心电图改变不典型患者血浆循环miRNAs：miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861、miR-3149的水平显著升高时，应高度怀疑急性冠脉综合征并采取进一步诊疗措施。特别是当miR-122、miR-2861和miR-3149同时升高和/或miR-122、miR-3149同时升高时，对于ACS症状临床不典型患者的鉴别诊断意义更大(ROC曲线下面积AUC分别为0.925和0.843)。本发明的实施例4中，ACS患者较non-ACS患者miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149变化的倍数分别为20.7、14.7、49.4、27.6和12.5倍。
从而，在本发明的技术方案中，当临床症状和心电图改变不典型的待测个体样品中血浆循环miRNAs的表达水平相较于非急性冠脉综合征患者(non-ACS)显著升高时，则可评估个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。例如，当待测个体样品中miR-122的水平升高时，当待测个体样品中miR-140-3p的水平升高时，当待测个体样品中miR-720的水平升高时，当待测个体样品中miR-2861的水平升高时，和/或当待测个体样品中miR-3149的水平升高时，则可评估个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。特别是，当miR-122和miR-3149的水平同时升高，更优选是当miR-122、miR-2861和miR-3149的水平同时升高，则个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。
本发明的标志物具有高敏感度和特异性，对于急性冠脉综合征的早期诊断具有重要意义。
附图说明
图1A-1至图1G-2：应用qRT-PCR检测各miRNA在非冠心病、稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛和急性心肌梗死四组患者血浆样本中的表达分析结果。图中缩写：CHD＝冠心病、SA＝稳定性心绞痛、UA＝不稳定性心绞痛、AMI＝急性心肌梗死。
图2A-1至图2E-2：应用qRT-PCR检测另一人群样本中miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149的表达分析结果。图中缩写：CHD＝冠心病、SA＝稳定性心绞痛、UA＝不稳定性心绞痛、AMI＝急性心肌梗死。
图3A-1至图3F：训练数据集中急性冠脉综合征和非急性冠脉综合征患者血浆miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149表达差异分析结果。
图4A至图4G：猪急性心肌梗死模型中循环miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149表达差异分析结果。缩写：AMI-NVF＝急性心肌梗死无室颤、AMI-VF＝急性心肌梗死合并室颤，ISCH＝缺血，Sham＝假手术。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照所属领域的常规操作、或按照制造厂商所建议的操作条件进行。
各实施例中研究受试者入选标准：
本发明研究收入了2012年2月到8月间到中国医学科学院阜外心血管病医院心内科就诊的具有胸闷、胸痛症状的患者，共包括115例急性心肌梗死患者和456例非急性心肌梗死患者。急性心肌梗死患者[包括ST段抬高心肌梗死(STEMI)和非T段抬高心肌梗死(NSTEM)]，临床诊断标准为：急性缺血性胸痛、心电图(ECG)改变，生化标记物(cTnI>0.1ng/ml)和冠状动脉造影结果(2011，欧洲心脏病学会)(Hamm CW,Bassand JP,Agewall S,etal.Esc guidelines for the management of acute coronary syndromes in patientspresenting without persistent st-segment elevation:The task force for themanagement of acute coronary syndromes(acs)in patients presenting withoutpersistent st-segment elevation of the european society of cardiology(esc).Eur Heart J.2011；32:2999-3054)。
根据冠状动脉造影结果，将有胸闷、胸痛症状的非急性心肌梗死患者分为：冠心病368例和非冠心病88例。386例冠心病患者根据其胸痛典型性分为：稳定性心绞痛(SA)81例，不稳定性心绞痛(USA)287例。其中稳定性心绞痛(SA)的定义为：仅有与体力活动相关的缺血症状，无心电图动态改变，且cTnI<0.03ng/ml。不稳定性心绞痛定义为：无或较少体力活动相关的缺血症状频繁发作，心电图动态改变有或无，且cTnI<0.03ng/mL。根据携带冠心病危险因素(老年、肥胖、吸烟、过量饮酒、运动少、高血脂、高血压、糖尿病和家族史)的数量，将88例非冠心病病人又分为16例健康个体(危险因素数量n<＝2)，和72例为高危组(危险因素数量n>3)。排除具有自身免疫病、急性或慢性感染、严重的肝、肾功能障碍、以及其它恶性肿瘤病史的患者。对ACS病人和非ACS病人的检测数据，进行受试者操作特性(ROC)曲线分析，研究miRNA是否可作为ACS的潜在诊断标志物。
研究方案经中国医学科学院阜外心血管病医院伦理委员会通过，病患入选前均书面签署知情同意书。
各实施例中所用实验方法：
血浆收集和储存
用EDTA抗凝管在心脏导管室收集5ml病人外周血样本，用于检测miRNAs表达水平。血样采集后4℃保存，并在2小时内1500g离心15分钟，分离血浆和细胞层。血浆转移到一个新的无RNA酶和DNA酶Eppendorf管中，4℃下2500g离心10分钟，去除细胞碎片。上清血浆转移到新的无RNA酶和DNA酶Eppendorf管中，-80℃冻存。剔除发生溶血的样本。
RNA制备
采用厂家推荐的方案用TRIzol LS Reagent(Invitrogen，USA)，从500μL血浆中提取血浆总RNA。用20μL无RNA酶水溶解纯化的总RNA，用NanoDrop2000(NanoDrop Products，Wilmington，Del.，USA)进行RNA定量。
miRNA芯片和验证
应用人miRNA表达谱芯片(Agilent miRNAs microarray Version 16.0)检测血浆miRNA表达谱。该芯片基于Sanger miRBase，release 16.0设计，包含1205条人源miRNAs和142条病毒来源miRNAs。每张芯片包含8个相同的微阵列，按照Agilent miRNA microarraysystem操作指南，以100ng Cy3-标记的RNA进行杂交。芯片用Agilent Microarray扫描仪(Cat#G2565BA，Agilent technologies，Santa Clara，CA，USA)扫描，Extraction software10.7软件(Agilent technologies，Santa Clara，CA，USA)提取数据。原始数据应用GeneSpring软件11.0(Agilent technologies，Santa Clara，CA，USA)，分位数算法进行归一化。CY3单色杂交获得的原始信号，经稳定表达的內源对照miR-1228矫正后，以2为底进行对数转换。同一样本在同一微阵列中重复点的内变异系数在15％以上，或阳性信号低于5％，结果就认为是不可靠的，排除后进一步分析。如果某一miRNA在任一组(急性心肌梗死、健康对照、高危或稳定性心绞痛组)中超过50％的血浆样本中能阳性检出，则认为这个miRNA是能够检出的。
实时定量RT-PCR
应用miRNA茎环法实时定量RT-PCR技术检测特定miRNA表达(ABI PRISM7900system，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。使用Fast Start Universal ProbeMaster Mix(Roche，Germany)逆转录。TaqMan探针法qRT-PCR检测miR-122、miR-140-3p、miR-144、miR-720、miR-1225-3p和miR-1228表达，Assay ID分别为：002245、002234、197375、002895、002766和002919(Applied Biosystems)。应用SYBR Green qRT-PCR方法，Fast SYBR Green Select Master Mix(Applied Biosystems，USA)检测miR-2861和miR-3149表达水平，引物委托南京骥桀生物工程有限公司(Nanjing BioSteedBioTechnologies Co.，Ltd)合成。引物序列如下：
miR-2861：
反转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCC
CAC-3’；(SEQ ID No.1)
正向引物：5’-ACACTCCAGCTGGGGGGGCCTGGCGGT-3’；(SEQ ID No.2)
反向引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’(SEQ ID No.3)。
miR-3149：
反转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATACA
CAC-3’；(SEQ ID No.4)
正向引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTTTGTATGGATATGTGT-3’(SEQ ID No.5)；
反向引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’(SEQ ID No.6)。
应用cDNA synthesis kit(Roche，Germany)，以20ng总RNA逆转录成cDNA，反应条件为16℃30分钟、42℃30分钟、85℃5分钟灭活逆转录酶。qRT-PCR分析采用20μL反应体系，三次重复实验矫正实验变异。qRT-PCR反应程序为50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒，60℃60秒，45个循环。比较Ct法计算miRNA相对表达量。Ct值>45的结果按照45计算。按照拷贝数＝2(-Ct)将Ct值转化成拷贝数，并以miR-1228矫正。qRT-PCR获得数据经对数转换，统计分析时应用散点图排除离群值。血浆心肌钙蛋白I(cTnI)检测
血浆cTnI浓度按产品手册(Abnova，Taiwan，China)应用ELISA方法检测。
动物实验方案
36只雄性巴马小型猪(10月龄体重25到35kg)经高胆固醇饮食(3％胆固醇、15％猪油、6.0％花生油、5％白糖、0.5％胆汁酸盐和0.025μg/kg体重/天尼古丁)饲喂20周，不限制体力活动。然后，将猪随机分为两组：(1)急性心肌梗死组(AMI，n＝30)：实验动物结扎冠状动脉左前降支(LAD)4小时；该组进一步分为急性心肌梗死后无室颤组(AMI-NVF)和急性心肌梗死合并室颤组(AMI-VF)；(2)假手术组(n＝6)：冠状动脉左前降支仅以缝合线环绕，并不结扎。所有动物行肌肉注射700mg盐酸氯胺酮和30mg安定麻醉，并每小时2mg/kg体重持续静脉滴注维持麻醉。每只动物都用呼吸机(SV900；Siemens-Elema，Solna，Sweden)辅助呼吸。用直肠式温度计监控体温，并用热垫保持动物体温在37-38℃。如果心室颤动持续超过10秒钟，采用2焦耳体内除颤。手术前及缺血30、60、90、120、180和240分钟时采集血样用以检测miRNA。
所有实验动物均按照《实验动物护理和使用指南》(美国国家卫生研究所出版)受到人道主义关怀。动物实验方案经由中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物管理委员会批准。
统计分析
应用单因素方差One way ANOVA分析和Fisher精确检验，比较不同组患者基线特征。miRNA芯片数据分析时，用Mann-Whitney非配对检验进行健康组和急性心肌梗死组、高危组和急性心肌梗死组、以及稳定性心绞痛和急性心肌梗死组这三对两两比较。分析qRT-PCR数据时，使用比较Ct法计算miRNA相对表达。miRNA表达值以平均数±标准误表示。应用单因素方差分析进行三组间参数比较，应用Bonferroni进行检验后两两比较。两组间采用独立样本t检验。应用双侧检验，P<0.05为统计显著性标准。建立受试者工作特征曲线(ROC)以区别急性冠脉综合征患者和胸痛患者。使用SPSS 20.0进行统计分析。
实施例1、miRNA芯片分析验证本发明的标志物在健康组和高危人组间的表达差异
本实施例中，收集急性冠脉综合征病例及健康对照共32人，分为健康组、高危组、不稳定性心绞痛组和急性心肌梗死组(每组8例)，各组间临床特征无显著差异(见表1)。
表1.miRNA芯片分析各组样本临床特征
应用miRNA芯片对上述健康组、高危组、稳定性心绞痛组和急性心肌梗死组(每组8例)中的miR-3149、miR-122、miR-2861、miR-140-3p、miR-720以及应用miRNA芯片(AgilentmiRNAs microarray Version 16.0)筛选出的miR-144、miR-1225-3p的表达水平进行定量检测。
定量结果显示：与健康组、高危组和稳定性心绞痛组相比，急性心肌梗死组循环的miR-122、miR-140-3p、miR-144、miR-720、miR-1225-3p、miR-2861和miR-3149表达水平显著上升(2倍以上，P值均<0.05，以黑体字表示)。由于在健康组和高危人组间无miRNA表达差异，在此后各实施例中，将这两组合并为非冠心病组(见表2)。
表2.急性心肌梗死组(AMI)与健康组(Health)、高危组(Highrisk)和稳定性心绞痛组(SA)相比miRNA相对表达量的miRNA芯片结果
实施例2、第一阶段qRT-PCR分析验证本发明的标志物在急性冠脉综合征和非急性冠脉综合征个体中的表达差异
在2012年2、3月间采集的111例患者血浆样本，其中非冠心病21例，稳定性心绞痛30例，不稳定性心绞痛30例和急性心肌梗死30例，各组临床特征无显著差异(见表3)。
表3.第一阶段qRT-PCR分析验证7个miRNAs的各组样本临床特征
应用qRT-PCR检测血浆中miR-3149、miR-122、miR-2861、miR-140-3p、miR-720、miR-144、miR-1225-3p表达量。
结果显示：急性心梗组中miR-122和miR-720显著高于非冠心病组，分别为非冠心病组的17.8和6.6倍(P值均<0.05，图1A-1、图1A-2、图1D-1、图1D-2)。急性冠脉综合征ACS组(UA+AMI)miR-122、miR-140-3p、miR-144、miR-720、miR-2861、和miR-3149表达水平高于非急性冠脉综合征组(non-CHD+SA)，(P值均<0.05，图1A-1、图1A-2、图1B-1、图1B-2、图1C-1、图1C-2、图1D-1、图1D-2、图1F-1、图1F-2、图1G-1、图1G-2)。此外，miR-144的检出率较低(仅为64.0％)，miR-1225-3p表达在急性冠脉综合征和非急性冠脉综合征患者中无显著差(图1E-1、图1E-2)。
实施例3、第二阶段qRT-PCR分析验证本发明的标志物在急性冠脉综合征和非急性冠脉综合征个体中的表达差异
进一步在2012年4-8月间收集428例患者血浆样本(非冠心病51例、稳定性心绞痛43例、不稳定性心绞痛257例和急性心肌梗死77例)，各组临床特征无显著差异(见表4)。
表4.第二阶段验证本发明miRNAs的各组样本临床特征
应用qRT-PCR检测上述各血浆样本中miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149的表达。
结果表明，miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149在急性冠脉综合征组(ACS，UA+AMI)中的表达水平显著高于非急性冠脉综合征组(non-ACS，non-CHD+SA)(P值均<0.001)(图2A-1、图2A-2、图2B-1、图2B-2、图2C-1、图2C-2、图2D-1、图2D-2、图2E-1、图2E-2)。特别是，急性心肌梗死组miR-2861和miR-3149表达显著高于非冠心病组和稳定性心绞痛组(P值均<0.05)(图2D-1、图2D-2、图2E-1、图2E-2)。
实施例4、在训练数据集中分析急性冠脉综合征和非急性冠脉综合征组中miRNAs表达差异
合并实施例2、实施例3全部539例受试者实验数据(急性冠脉综合征394例，非急性冠脉综合征145例)，构建训练数据集，分析用本发明的5个miRNAs诊断急性冠脉综合征的受试者工作特征曲线(ROC)，计算曲线下面积(AUC)，评估其检验效能。
结果参见图3A-1至图3F以及表5，与非急性冠脉综合征组(non-ACS，non-CHD+SA)相比，急性冠脉综合征组(ACS，UA+AMI)中miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149表达分别上升20.7、14.7、49.3、27.6和12.5倍(P值均<0.001)(图3A-1、图3A-2、图3B-1、图3B-2、图3C-1、图3C-2、图3D-1、图3D-2、图3E-1、图3E-2)。用ROC曲线分析这5种循环miRNAs对ACS的诊断效能，结果参见图3F及表5。
表5.由394例急性冠脉综合征和145例非急性冠脉综合征患者构成的训练数据集中，miRNAs在急性冠脉综合征和非急性冠脉综合征组的表达差异和诊断效能
从本实施例的结果可以看出，急性冠脉综合征患者的循环miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861和miR-3149比非急性冠脉综合征患者显著上调，ROC曲线下面积AUC分别是0.838、0.818、0.865、0.852和0.670(表5)，这些标志物单独或组合应用于诊断急性冠脉综合征具有实际意义，特别是同时用miR-122、miR-2861和miR-3149联合诊断急性冠脉综合征时，AUC甚至可达0.925。
实施例5、急性心肌梗死小型猪血浆miRNAs水平检测
应用36只巴马小型猪，随机分为急性心肌梗死组和假手术组，结扎冠状动脉左前降支构建急性心肌梗死模型。根据冠脉结扎后是否出现室颤，将急性心肌梗死组又进一步分为急性心肌梗死合并室颤(AMI-VF)和急性心肌梗死无室颤组(AMI-NVF)，术前及缺血后30、60、90、120、180和240分钟时采集血样，检测其中miR-122、miR-140-3p、miR-720、miR-2861、miR-3149及血浆cTnI的表达变化。
埃文斯蓝染色(Evens Blue Staining)和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)染色(TTC Staining)确认急性心肌梗死建模成功(图4A)。
结果表明，与假手术组相比，冠状动脉结扎180和240分钟后，血浆miR-122表达水平迅速升高(P＝0.002)，并且急性心肌梗死合并室颤组(AMI-VF)中表达也显著高于急性心肌梗死无室颤组(AMI-NVF)(P<0.001)(图4B)。此外，与假手术组相比，心肌缺血30-240分钟，血浆miRNA-3149水平急剧增高(P值均<0.05)，并且冠状动脉结扎后120和180分，急性心肌梗死合并室颤组(AMI-VF)高于急性心肌梗死无室颤组(AMI-NVF)(P值均<0.001)(图4F)。但与假手术组相比，冠状动脉结扎后240分钟内，血浆miR-140-3p、miR-720、miR-2861及cTnI表达水平未检出显著变化(P值均>0.05)(图4C、图4D、图4E和图4G)。
上述结果表明，miR-122与miR-3149，特别是miR-3149可用于急性冠脉综合征的早期诊断。

Claims (8)

1.检测循环miRNAs的表达水平的试剂在制备用于急性冠脉综合征的早期诊断的组合物中的应用，其中，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂包括检测miR-3149、miR-122和miR-2861的表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，检测循环miRNAs的表达水平的试剂包括：采用Nothern blot方法检测循环miRNAs的表达水平的试剂，采用qPCR或qPCR Array技术检测循环miRNAs的表达水平的试剂，采用miRNA芯片技术检测循环miRNAs的表达水平的试剂，或者采用高通量测序法检测循环miRNAs的表达水平的试剂。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其中，当临床症状和心电图改变不典型的待测个体样品中miR-122、miR-2861和miR-3149的水平同时升高，则个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。
5.一种用于急性冠脉综合征的早期诊断的组合物，该组合物包括检测miR-3149和miR-122的表达水平的试剂，还包括检测miR-2861的表达水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，该组合物还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
7.一种用于急性冠脉综合征的早期诊断的试剂盒，该试剂盒包括检测miR-3149和miR-122的表达水平的试剂，还包括检测miR-2861的表达水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，该试剂盒还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
CN201410557018.1A 2014-10-20 2014-10-20 用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用 Active CN104630339B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410557018.1A CN104630339B (zh) 2014-10-20 2014-10-20 用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410557018.1A CN104630339B (zh) 2014-10-20 2014-10-20 用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104630339A CN104630339A (zh) 2015-05-20
CN104630339B true CN104630339B (zh) 2017-03-08

Family

ID=53209583

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410557018.1A Active CN104630339B (zh) 2014-10-20 2014-10-20 用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104630339B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283901A (zh) * 2019-07-25 2019-09-27 青岛大学 用于冠心病诊断的miRNA探针组合物、引物组合物和冠心病诊断试剂盒
CN115433776B (zh) * 2022-09-30 2023-12-22 中国医学科学院阜外医院 Ccn3在调控血管平滑肌细胞钙化中的应用
CN117385024B (zh) * 2023-11-29 2024-04-19 梅州市人民医院(梅州市医学科学院) 一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747072B (zh) * 2012-06-07 2014-04-16 中国医学科学院阜外心血管病医院 与冠心病易感性显著关联的易感区域chr5p15的单核苷酸多态性位点及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104630339A (zh) 2015-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
McManus et al. Plasma microRNAs are associated with atrial fibrillation and change after catheter ablation (the miRhythm study)
Johnson et al. Prevalence and clinical correlates of QT prolongation in patients with hypertrophic cardiomyopathy
Kubo et al. Lifelong left ventricular remodeling of hypertrophic cardiomyopathy caused by a founder frameshift deletion mutation in the cardiac myosin-binding protein C gene among Japanese
Sherbuk et al. Biomarkers and mortality in severe Chagas cardiomyopathy
Goldraich et al. Transcoronary gradient of plasma microRNA 423-5p in heart failure: evidence of altered myocardial expression
CN104988216B (zh) 慢性心力衰竭相关的血清miRNA及其应用
Kitow et al. Mitochondrial long noncoding RNAs as blood based biomarkers for cardiac remodeling in patients with hypertrophic cardiomyopathy
Yoshida et al. Troponin elevation after radiofrequency catheter ablation of atrial fibrillation: relevance to AF substrate, procedural outcomes, and reverse structural remodeling
JP2011510650A5 (zh)
US11834719B2 (en) Genes and gene signatures for diagnosis and treatement of melanoma
CN104630339B (zh) 用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用
JP2019530878A5 (zh)
Vischer et al. Heart failure in patients with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy: Genetic characteristics
Hirota et al. A novel cardiac myosin-binding protein C S297X mutation in hypertrophic cardiomyopathy
JPWO2013179672A1 (ja) 子宮内膜症の判定方法
Balta et al. Broad electrocardiogram syndromes spectrum: from common emergencies to particular electrical heart disorders
Hitomi et al. A frameshift deletion mutation in the cardiac myosin-binding protein C gene associated with dilated phase of hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy
Guo et al. Mitochondrial DNA mutation m. 5512A> G in the acceptor-stem of mitochondrial tRNATrp causing maternally inherited essential hypertension
RU2587753C1 (ru) Способ прогнозирования риска развития инфекционного эндокардита
Yu et al. Cardiac abnormalities associated with pheochromocytoma and other adrenal tumors
Danzi et al. Effect of triiodothyronine on gene transcription during cardiopulmonary bypass in infants with ventricular septal defect
Lu et al. Effect of mitochondrial tRNALys mutation on the clinical and biochemical characteristics of Chinese essential hypertensive subjects
Sonsöz et al. Circulating levels of MicroRNAs in hypertrophic cardiomyopathy: the relationship with left ventricular hypertrophy, left atrial dilatation and ventricular depolarisation-repolarisation parameters
Rubin BMPR2 mutation and outcome in pulmonary arterial hypertension: clinical relevance to physicians and patients
CN117683849A (zh) 一种心力衰竭的生物标志物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant