CN102108417A

CN102108417A - 4种侵染番茄的双生病毒的rflp检测方法

Info

Publication number: CN102108417A
Application number: CN2009102006209A
Authority: CN
Inventors: 张辉; 朱为民; 邰翔; 朱龙英; 万延慧; 杨少军; 余力
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2011-06-29

Abstract

本发明提供了一种同时检测四种侵染番茄的双生病毒的RFLP方法，包括如下步骤：(1)将包括可扩增四种双生病毒全长基因组的引物(SH2F/R、Y10F/R、PaF/R、ZJ16F/R)的PCR体系进行PCR反应，获得PCR产物：(2)将酶切体系在37℃保温1.5h，获得酶切产物；(3)将酶切产物进行检测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照，分析结果。本发明RFLP检测双生病毒技术有以下优点：1、可以利用PCR区分4种在我国非常流行的侵染番茄的双生病毒，解决了通常需要利用测序才能检测这几个病毒的问题。降低了费用，节约了时间；2、该方法还可以对这4种双生病毒复合侵染的现象进行检测。

Description

4种侵染番茄的双生病毒的RFLP检测方法

技术领域

本发明涉及区分4种侵染番茄的双生病毒的RFLP检测方法。

背景技术

近几年，双生病毒对我国番茄的危害十分严重，双生病毒种类很多，目前在我国番茄上流行的双生病毒种类有番茄黄化曲叶病毒(TomatoYellow Leaf Curl Virus，TYLCV)、中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl China Virus，TYLCCNV)、中国番木瓜曲叶病毒(Papaya Leaf CurlChina Virus，PaLCuCNV)、台湾番茄曲叶病毒(Tomato Leaf Curl TaiwanVirus，TYLCTWV)等。病毒的检测是进行病害监测、流行学研究以及防治研究的重要内容。双生病毒在番茄上产生的症状非常类似，从而使得通过症状来进行不同双生病毒种类的鉴定非常困难。目前对双生病毒种的鉴定主要通过利用双生病毒DNA序列的保守序列设计简并引物进行扩增，然后进行序列测定，最后通过序列的比对来进行种类的鉴定。这使得鉴定工作费时费力而且很难鉴定复合侵染的现象。

本发明的目的在于建立一种仅通过常规PCR及酶切反应便可将我国发生面积较广的4种双生病毒鉴定区分的方法，旨在节省鉴定时间、降低实验成本，为鉴定工作提供方便。

本发明的方法，包括如下步骤：

(1)将PCR体系按照如下的程序进行PCR反应：

94℃变性2分钟，然后94℃变性45秒、52℃退火45秒、72℃延伸2分30秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟，获得PCR产物，4℃保存；

所说的PCR体系为水溶液，组分和含量为：

模板DNA 20ng/L

混合引物 0.2umol/L

10×buffer 2ul/L

Mg²⁺ 3.5mmol/L

dNTPs 250umol/L

SspI酶 0.2uL/L

所说的模板DNA指的是番茄DNA，制备方法如下：

1、取番茄嫩叶放入研钵中，加入液氮，研磨成粉末状，取40mg装入2mL的圆头离心管中。

2、加入700ul CTAB提取液，剧烈摇晃，使CTAB提取液与样品充分混合均匀。

(100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，3％CTAB，2％PVP，2％β-巯基乙醇)

3、65℃水浴1h。

4、置于4℃冰箱或室温冷却至15℃以下。

5、加入700μl 24∶1氯仿/异戊醇，上下缓慢颠倒混匀，抽提15min至溶液呈乳浊状，保证样品和氯仿充分混合。

6、12000rpm离心10min。

7、取上清液于1.5ml离心管中，加入等体积的预冷-20℃的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀。

8、-20℃冰箱静置3h以上。

9、12000rpm离心10min，弃上清液。用70％乙醇洗涤沉淀2次。

10、吹干DNA，让乙醇挥发干净。

11、加200uL TE 65℃水浴溶解DNA。

(TE：10mmol/L Tris-Hcl和1mmol/LEDTA，PH＝8)

所说的混合引物是由以下几种引物混合起来的引物混合物：

TYLCV引物序列：

SH2F：5’-gggatccacttctaaatgaa-3’

SH2R：5’-tggatcccacatattgcaag-3’

TYLCCNV引物序列：

Y10F：5’-gggatcctctgctcaacgag-3’

Y10R：5’-aggatcccacatgcttaacg-3’

PaLCuCNV引物序列：

PaF：5’-gggatcctttactgaacgag-3’

PaR：5’-aggatcccacatgtttggcg-3’

TYLCTWV引物序列：

ZJ16F：5’-gggatccacttttaaatgat-3’

ZJ16R：5’-tggatcccacattttaccga-3’

10×buffer为一种PCR反应缓冲液，为10～50mmol/LTris-Hcl(PH8.3～8.8)，可采用上海生工公司的产品；

Mg²⁺来源于氯化镁的化合物；

dNTPs为一种PCR反应必须物，其化学名称为三磷酸脱氧核苷酸，可采用上海生工公司的产品；

SspI酶可采用上海生工公司的产品；

(2)酶切产物的制备：

将酶切体系在37℃保温1.5h，获得及酶切产物；

所说的酶切体系为水溶液，组分和含量为：

酶切体系为：

PCR产物0.35uL/L，

SspI酶0.05uL/L，

Buffer0.1uL/L，

(3)配置2.5％的琼脂糖凝胶，加入1μL EB(0.5μg/ml)倒入胶槽中，插入梳子，待胶凝固后检测。分别取10uL PCR产物和10uL酶切产物进行检测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照；

所说的EB的化学名称为溴化乙锭，可采用市售产品，如上海生工公司的产品，染色方法，为现有技术，如Williamson，V.M.文献报道的方法；

Bio-RAD凝胶成像系统为一种通用的系统，可采用Bio-RAD公司的产品；

(4)结果分析：TYLCV单独侵染的番茄植株可产生66bp、162bp、2561bp的片段，附图可显示2500bp左右的一条带。TYLCCNV单独侵染的番茄植株可产生119bp、141bp、401bp、532bp、1552bp的片段，附图可显示1500bp左右一条带及500bp左右的两条带。PaLCuCNV单独侵染的番茄植株可产生145bp、1054bp、1558bp的片段，附图可显示1500bp和1000bp左右各一条带。TYLCTWV单独侵染的番茄植株可产生146、2602bp的片段，附图可显示2600bp左右的一条带。TYLCV与TYLCCNV复合侵染的番茄可产生66bp、119bp、141bp、162bp、401bp、532bp、1552bp、2561bp的片段，附图可显示2500bp、1500bp左右各一条带及500bp左右处的两条带。TYLCV与PaLCuCNV复合侵染的番茄可产生66bp、145bp、162bp、1054bp、1558bp、2561bp的片段，附图可显示2500bp、1500bp、1000bp左右各一条带。TYLCV与TYLCTWV复合侵染的番茄可产生66bp、146、162bp、2561bp、2602bp的片段，附图可显示2600bp左右的一条粗亮带。TYLCCNV与PaLCuCNV复合侵染的番茄可产生119bp、141bp、145bp、401bp、532bp、1054bp、1552bp、1558bp的片段，附图可显示1500bp左右的一条带，1000bp左右的一条带及500bp左右的两条带。TYLCCNV与TYLCTWV复合侵染的番茄可产生119bp、141bp、146、401bp、532bp、1552bp、2602bp的片段，附图可显示2600bp、1500bp左右的各一条带及500bp左右的两条带。PaLCuCNV与TYLCTWV复合侵染的番茄可产生145bp、146、1054bp、1558bp、2602bp的片段，附图可显示2600bp、1500bp、1000bp左右各一条带。通过以上带型的不同可以区分除了TYLCV和ToLCuTWV外的大部分双生病毒类型，而TYLCV和ToLCuTWV之间可以通过延长电泳时间将2560bp左右的条带和2600bp左右的条带分离开进行鉴定。此外，这两个病毒可以通过症状很容易区分开来，TYLCV可产生明显的黄化症状，而ToLCuTWV不产生黄化症状，此外还可以通过。

本鉴定技术有以下优点：1、可以通过PCR方法区分这4种侵染番茄的双生病毒，节省了时间，降低了实验费用。2、可鉴定这四种双生病毒间的复合侵染。

具体实施方式

利用四种双生病毒的侵染性克隆单独接种或两两混合接种4片真叶大小的番茄苗(品种为‘2300’)，接种后20天，取番茄的嫩叶，采用Williamson，V.M文献公开的方法，分别提取DNA，为模板DNA。

番茄2300为上海农科院园艺所番茄组选育的高代自交系，为双生病毒的感病品种。