一种丙氨酰谷氨酰胺化合物及其新方法
技术领域
本发明涉及一种丙氨酰谷氨酰胺化合物及其新方法,属于医学技术领域。
背景技术
丙氨酰谷氨酰胺又名N-(2)-L-丙氨酰-L-谷酰胺,英文名L-alanyl-L-glutamine,化学名称为N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,分子式C8H15N3O4,分子量217.22,结构式为:
为白色或类白色结晶性粉末,无臭;有引湿性,在水中易溶,在甲醇中几乎不溶,在冰醋酸中略溶。
丙氨酰谷氨酰胺作为肠外营养药物,可用于提高患者细胞免疫功能,有效降低危重患者的感染风险,尤其对严重感染、恶性肿瘤等重伤病人的治疗和恢复有重要作用,可缩短患者总住院时间。临床研究表明,使用Gln对严重代谢疾病(如烧伤/外伤/大手术、急慢性感染、骨髓移植和多器官功能障碍综合症)、肠道功能不全(如肠炎短肠综合症和放化疗所致粘膜损害)、免疫缺乏综合症(如艾滋病、危重病或骨髓移植后伴发的免疫功能低下)等疾病具有良好的治疗效果。丙氨酰谷氨酰胺的使用能较好地维持血循环中淋巴细胞总数,缓解手术及化疗导致的免疫抑制,这可能与Ala-Gln提供给淋巴细胞充足的呼吸燃料有关。丙氨酰谷氨酰胺作为肠外营养的使用是十分有效的,能减轻胃肠癌手术化疗患者机体的蛋白分解,有效地改善氮平衡,维持血循环中淋巴细胞的数目,从而改善患者营养状况,增强机体对手术及化疗的耐受性。
丙氨酰谷氨酰胺的作用机制为:L-谷氨酰胺(L-Glutamine,Gln)是一种体内必需的氨基酸,也是人体内含量最多的氨基酸,在蛋白质、核酸合成中具有重要作用。Gln在血浆中的含量高达0.8-0.9毫摩尔/升,约占游离氨基酸总量的20%。Gln是肠粘膜上皮细胞、肾小管上皮细胞和免疫活性细胞等代谢活跃细胞的能量来源,被认为是机体的氮源运载工具,在体内各组织间转运氮源,发挥清除氨等有毒物质等重要功能。N-(2)-L-丙氨酰-L-谷酰胺为营养物质,体内降解出L-谷氨酰胺,供给机体物质合成或能量消耗使用。
丙氨酰谷氨酰胺首先由德国森尤斯(Fresenius,AG)研制,1999年进口到中国,2004年我国厦门大学的赵玉芬教授等科研人员采用全新的工艺路线,合成出丙氨酰谷氨酰胺,这种原创性的合成方法具有工艺稳定、原料易得、副反应成分低、产品安全性好等优点,但得到的丙氨酰谷氨酰胺的纯度还有待进一步的提高从而增强药物临床使用的安全性。
中国发明专利CN1392156公开了一种丙氨酰谷氨酰胺合成方法,N端保护的氨基酸与三苯基磷、六氯乙烷在有机溶剂中反应形成活泼酯;活泼酯与谷氨酰胺在有机溶剂和无机碱水溶液的混合溶液中进行,用无机酸酸化,然后脱去N端保护基团。其原料极为便宜,合成工艺简单,中间产物不需要分离和提纯处理,产物容易分离提纯;反应结束生成住主产物丙-谷二肽和副产物三苯基氧磷。
CN1786019A公开了一种丙氨酰谷氨酰胺的制造方法,包括将酯化的L-乳酸在催化剂存在的条件下,与氯化亚砜反应,得2-氯丙酸酯;在2-氯丙酸酯中加碱液进行水解,得2-氯丙酸;将2-氯丙酸与氯化剂反应,得2-氯丙酰氯;将2-氯丙酰氯与L-谷氨酰胺反应,得N-(2-氯)-丙酰基-谷氨酰胺;将N-(2-氯)-丙酰基-谷氨酰胺与氨水进行反应,得丙-谷二肽产品等步骤。但在采用该合成方法的工业化生产工艺中,由于得到的反应液中含有氯化铵等杂质,需要进行结晶除盐。目前关于丙氨酰谷氨酰胺生产工艺中除盐的常规方法为采取醇(如甲醇、乙醇、异丙醇等)加水的方式进行结晶除盐。
CN1164611C、CN1302008C、CN1315868C、CN1680428A、CN10162938B也公开了丙氨酰谷氨酰胺合成方法。但是用以上合成方法制备的丙氨酰-L-谷氨酰胺相关杂质较多且单一杂质大于0.5%,很难直接用于药品注射液的配制。相关杂质主要有:丙氨酸,谷氨酰胺,焦谷氨酸,丙氨酰-L-环谷氨酰胺,和三苯基氧磷等。依然需要一种简单易行的精制甘氨酰-L-谷氨酰胺的方法以提供高纯度的丙氨酰谷氨酰胺化合物以解决上述问题。本精制方法操作简单,环境污染小,成本低,满足了药物临床安全性对丙氨酰谷氨酰胺化合物高纯度的要求。
针对这些不纯的产品,现有技术没有公开纯化丙氨酰谷氨酰胺化合物的方法,实际上,本领域具有一般经验的技术人员清楚地知道在获得高纯度化合物方面面临的种种困难,所有这些绝非现有一般分离纯化的理论就可以预期解决的,需要克服许多难题。
发明内容
申请人在大量现有文献的基础上,通过大量筛选的实验,发现上述文献以及一般的纯化分离方法例如结晶等方法难于获得高纯度高产率的化合物,而各种分离纯化方法以及多种条件参数又存在多种多样组合的可能性和不可预测性。本发明人经过长期认真的研究,令人惊奇地发现,经过组合应用特定的方法并优化参数后可以提供高纯度高产率的丙氨酰谷氨酰胺化合物,从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种丙氨酰谷氨酰胺化合物的精制方法,其通过活性炭吸附、有机溶剂沉淀、色谱柱吸附分离纯化和有机溶剂析晶达到精制纯化的目的,最终产物纯度较现有产品有很大的提高,优化了制剂产品质量,减少了毒副作用,保证了临床用药的安全。
本发明解决的技术方案如下:
一种如下所示结构的丙氨酰谷氨酰胺化合物的精制方法,
先将丙氨酰谷氨酰胺用活性炭吸附纯化,然后用有机溶剂沉淀,再用色谱柱分离纯化,最后用有机溶剂析晶,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺化合物。
在本发明的一个方面,优选地,上述方法中所述的活性炭吸附纯化包括加热搅拌的步骤,其中加热优选的温度为30~90℃,更优选的温度为40~80℃,特别优选的温度为60~70℃。
在本发明的一个方面,药物的分离和纯化方法包括吸附方法,如使用活性炭。不幸的是,除了去除颜色和其它不需要的物质外,活性炭还不可逆地吸附所感兴趣的药物,这导致产率明显降低。本发明证实活性炭可用于丙氨酰谷氨酰胺的纯化,其中活性炭的使用量为溶液总体积的0.05-4%(g/ml),优选为0.1-1%(g/ml),特别优选为0.2-0.4%(g/ml)。
在本发明的一个方面,色谱柱的直径为约0.1至约200cm,优选为至少5cm。此方法中色谱柱长度范围优选为约10厘米至约100厘米,更优选长度范围为约20厘米至约30厘米,最优选的长度为25厘米。
一般而言,分离纯化过程中,色谱柱填料可以为硅胶、氧化铝或大孔树脂等,所用硅胶的粒径可为100~200目或200~300目;所用氧化铝可为中性氧化铝;所用的大孔树脂型号可以为AB-8、D101、DA-201、HPD400、HPD100、D1300,本发明人发现硅胶柱对本品纯化有着独到分离的效果,而且成本相对较低,而氧化铝和大孔树脂柱对产品的纯度并没有明显改善。
本发明人在上述基础上进行大量的优化实验,筛选得到了适宜的流动相,因此在本发明的一个方面,优选地,上述精制方法中所述的色谱柱纯化条件为:以体积比为3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为硅胶,流速为2.5-5.0ml/min,柱温30-40℃。
在本发明的一个方面,作为优选,每次纯化药物的质量与色谱柱填料的质量之比为1∶10-200,优选质量比为1∶15-100。流动相(洗脱剂)的用量只要满足将药物基本上完全洗脱即可,洗脱后的流分分段收集,不同段的流分中药物的含量不同,为了获得高纯度的药物(纯度大于99.5%),需将药物含量大于85%的流分合并,优选将药物含量大于90%的流分合并。优选地,含量大于90%的流分基本上连续流出。
作为本发明一优选实施方案,本发明丙氨酰谷氨酰胺化合物的制备步骤包括:
(1)将丙氨酰谷氨酰胺粗品溶于纯化水中,加入溶液总体积0.2-0.4%(g/ml)的活性炭,60-70℃搅拌20-30min,趁热过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢滴加入有机溶剂,搅拌,产生沉淀,过滤得到丙氨酰谷氨酰胺固体;
(3)将丙氨酰谷氨酰胺固体上柱,通过色谱柱分离纯化,以体积比为3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为硅胶,流速为2.5-5.0ml/min,柱温30-40℃,分段收集流分,合并含量大于90%的洗脱液;
(4)将洗脱液减压浓缩至约1/2的体积,加入有机溶剂,搅拌,逐渐析出固体,冷藏过夜,过滤,滤饼用有机溶剂洗涤,60℃减压干燥12±2小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺。
在本发明的一个方面,优选地,上述精制方法中所述的有机溶剂选自三氯甲烷、二氯甲烷、乙腈、甲醇、异丙醇、环己烷、乙酸乙酯、异丙醚、石油醚、乙醚中的一种或多种,优选体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂。优选地,所述有机溶剂与滤液的体积比为1∶1~10∶1,优选地为3∶1~7∶1。
在本发明的一个方面,提供了本发明精制方法的丙氨酰谷氨酰胺化合物在制备肠外营养药物中的应用。
本发明提供的丙氨酰谷氨酰胺化合物的精制方法,通过活性炭吸附、有机溶剂沉淀、色谱柱吸附分离纯化和有机溶剂析晶,大大提高了丙氨酰谷氨酰胺的纯度和含量,优化了制剂的产品质量,减少了毒副作用,保证了临床用药的安全,而且与现有技术相比,本方法工艺简便易行,反应条件温和,成本低,收率高,纯度高,适合于规模化连续大生产。上述不合格的或从市面上回收来的丙氨酰谷氨酰胺化合物,均可以采用本发明的方法,进行精制。
有文献报道了一些大孔树脂为填充剂的层析柱或离子树脂交换柱的纯化方法,大孔树脂刚性不强、易破碎以及致孔剂等合成原料或溶剂去除不净而残留,易流入药液造成二次污染,对其预处理、再生纯化工艺缺乏规范性指标,使用离子树脂交换柱则是成本太高,还需要柱子的再生活化,较为复杂,而且会引入大量的钠离子,纯度并没有明显改善。本发明人发现本发明的硅胶柱方法显著优于这些纯化方法。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步解释或说明本发明内容,但实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1 丙氨酰谷氨酰胺的精制
(1)将100g纯度为97.4%的丙氨酰谷氨酰胺粗品溶于800ml纯化水中,加入1.6g的活性炭,60℃搅拌20min,过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢滴加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂2400ml,搅拌,产生沉淀,过滤得到丙氨酰谷氨酰胺固体;
(3)将丙氨酰谷氨酰胺固体上柱,通过色谱柱分离纯化,以体积比3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为硅胶,流速为2.5ml/min,柱温30℃,分段收集流分,合并含量大于90%的洗脱液;
(4)将洗脱液减压浓缩至约1/2的体积,加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂800ml,60℃搅拌1h,逐渐析出固体,冷藏过夜,过滤,用体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂100ml洗涤,60℃减压干燥12小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺93.6g,纯度为99.9%,收率为96.0%。
实施例2 丙氨酰谷氨酰胺的精制
(1)将100g纯度为97.4%的丙氨酰谷氨酰胺粗品1000ml纯化水中,加入4g的活性炭,70℃搅拌30min,过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂7000ml,搅拌,产生沉淀,过滤得到丙氨酰谷氨酰胺固体;
(3)将丙氨酰谷氨酰胺固体上柱,通过色谱柱分离纯化,以体积比3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为硅胶,流速为5.0ml/min,柱温40℃,分段收集流分,合并含量大于90%的洗脱液;
(4)将洗脱液减压浓缩至约1/2的体积,加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂800ml,60℃搅拌2h,逐渐析出固体,冷藏过夜,过滤,用体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂100ml洗涤,60℃减压干燥10小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺92.7g,纯度为99.8%,收率为95.0%。
实施例3丙氨酰谷氨酰胺的精制
(1)将100g纯度为97.4%的丙氨酰谷氨酰胺粗品溶于1000ml纯化水中,加入3g的活性炭,65℃搅拌20min,过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂5000ml,搅拌,产生沉淀,过滤得到丙氨酰谷氨酰胺固体;
(3)将丙氨酰谷氨酰胺固体上柱,通过色谱柱分离纯化,以体积比为3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为硅胶,流速为4.0ml/min,柱温35℃,分段收集流分,合并含量大于90%的洗脱液;
(4)将洗脱液减压浓缩至约1/2的体积,加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂800ml,60℃搅拌2h,逐渐析出固体,冷藏过夜,过滤,用体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂100ml洗涤,60℃减压干燥12小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺91.0g,纯度为99.9%,收率为93.3%。
实施例4 丙氨酰谷氨酰胺的精制
(1)将100g纯度为97.4%的丙氨酰谷氨酰胺粗品溶于1000ml纯化水中,加入4g的活性炭,60℃搅拌30min,过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂4000ml,搅拌,产生沉淀,过滤得到丙氨酰谷氨酰胺固体;
(3)将丙氨酰谷氨酰胺固体上柱,通过色谱柱分离纯化,以体积比为3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为硅胶,流速为2.8ml/min,柱温40℃,分段收集流分,合并含量大于90%的洗脱液;
(4)将洗脱液减压浓缩至约1/2的体积,加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂800ml,60℃搅拌2h,逐渐析出固体,冷藏过夜,过滤,用体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂100ml洗涤,60℃减压干燥12小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺91.5g,纯度为99.9%,收率为93.8%。下面列举现有技术类似方法或本发明筛选过程的部分对比实施例,以说明本发明的技术效果。
对比例1 丙氨酰谷氨酰胺的精制(不用色谱柱)
(1)将100g纯度为97.4%的丙氨酰谷氨酰胺粗品溶于800ml纯化水中,加入1.6g的活性炭,60℃搅拌20min,过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢滴加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂2400ml,搅拌,产生沉淀,冷藏过夜,过滤,用体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂100ml洗涤,60℃减压干燥12小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺91.8g,纯度为97.9%,收率为92.3%。
对比例2 丙氨酰谷氨酰胺的精制(使用DA-201层析柱)
(1)将100g纯度为97.4%的丙氨酰谷氨酰胺粗品1000ml纯化水中,加入4g的活性炭,70℃搅拌30min,过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂7000ml,搅拌,产生沉淀,过滤得到丙氨酰谷氨酰胺固体;
(3)将丙氨酰谷氨酰胺固体上柱,通过色谱柱分离纯化,以体积比3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为DA-201,流速为5.0ml/min,柱温40℃,分段收集流分,合并含量大于90%的洗脱液;
(3)将洗脱液减压浓缩至约1/2的体积,加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂800ml,60℃搅拌2h,逐渐析出固体,冷藏过夜,过滤,用体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂100ml洗涤,60℃减压干燥10小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺90.1g,纯度为98.2%,收率为90.8%。
对比例3 丙氨酰谷氨酰胺的精制(使用氧化铝交换柱)
(1)将100g纯度为97.4%的丙氨酰谷氨酰胺粗品溶于1000ml纯化水中,加入3g的活性炭,65℃搅拌20min,过滤脱碳,收集滤液;
(2)向所得滤液中缓慢加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂5000ml,搅拌,产生沉淀,过滤得到丙氨酰谷氨酰胺固体;
(3)将丙氨酰谷氨酰胺固体上柱,通过色谱柱分离纯化,以体积比为3∶1的水和乙腈的混合溶剂为流动相,固定相填料为氧化铝,流速为4.0ml/min,柱温35℃,分段收集流分,合并含量大于90%的洗脱液;
(4)将洗脱液减压浓缩至约1/2的体积,加入体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂800ml,60℃搅拌2h,逐渐析出固体,冷藏过夜,过滤,用体积比为1∶3的三氯甲烷和乙腈的混合溶剂100ml洗涤,60℃减压干燥12小时,得到高纯度的丙氨酰谷氨酰胺90.1g,纯度为98.0%,收率为90.7%。
上述实施例和对比例从不同方面充分说明了本发明特定组合方法的优越性,尤其是包括硅胶柱的色谱条件以及优化后的参数,带来了意想不到的效果,是理论上无法合理预期的。不受理论限制,可能是各种纯化方法对药物中不同杂质的除去效果不同,本发明提供的精制方法具有实质的特点和显著的进步,取得的意想不到的技术效果,获得了高产率高纯度的产品。
应该理解,虽然本发明结合实例进行了详细的说明,但上述说明旨在举例说明,而不以任何方式限制其发明内容。对本领域技术人来说,基于本文的说明可以最大程度地利用本发明,并可在没有脱离本发明的权利要求范围或精神内进行多种修改或修饰。本申请所引用的各个参考文献,在此全文引入作为参考。