CN102093236B

CN102093236B - 一种门冬氨酸鸟氨酸化合物及其制法

Info

Publication number: CN102093236B
Application number: CN 201010578106
Authority: CN
Inventors: 杨明贵
Original assignee: HAINAN MEILAN SHIKE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HAINAN MEILAN SHIKE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2010-12-02
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2030-12-02
Also published as: CN102093236A

Abstract

本发明提供了一种高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物，其通过先将门冬氨酸鸟氨酸溶于水中，用活性炭吸附纯化，然后用有机溶剂沉淀，再用色谱柱分离纯化，最后用有机溶剂析晶，得到高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物，而且与现有技术相比，本方法工艺简便易行，成本低，收率高，产品纯度高，提高了制剂产品质量，减少了毒副作用，适合于工业化生产。

Description

一种门冬氨酸鸟氨酸化合物及其制法

技术领域

本发明涉及一种门冬氨酸鸟氨酸化合物及其新制法，属于医学技术领域。

背景技术

门冬氨酸鸟氨酸最先与20世纪70年代在德国用于临床，1991年收载德国药典，并被美国FDA批准用于治疗肝性脑病。随着临床应用经验的积累，逐步发现了门冬氨酸鸟氨酸在肝病相关治疗中更广泛的应用。门冬氨酸鸟氨酸有两种剂型，即门冬氨酸鸟氨酸颗粒剂(Ornithine Aspartate Granules)和门冬氨酸鸟氨酸注射剂(Ornithine Aspartate for Injection)。门冬氨酸鸟氨酸的商品名有瑞甘、雅博司。

门冬氨酸鸟氨酸的化学名称为：(s)-2，5-二氨基戊酸(s)-2-氨基丁二酸盐，分子式为：C₉H₁₉N₃O₆，结构式为：

门冬氨酸鸟氨酸在体内可提供尿素和谷氨酰胺合成的底物，谷氨酰胺是氨的解毒产物，同时也是氨的储存及运输形式，在生理和病理条件下，尿素的合成及谷氨酰胺的合成会受到鸟氨酸、门冬氨酸和其他二羧基化合物的影响。鸟氨酸几乎涉及尿素循环的活化和氨的解毒的全过程。在此过程中形成精氨酸，继而分离出尿素形成鸟氨酸。门冬氨酸参与肝细胞内核酸的合成，以利于修复被损伤的肝细胞。此外，由于门冬氨酸对肝细胞内三羧酸循环代谢过程的间接促进作用，促进了肝细胞内的能量合成，利于损伤肝细胞的修复，加快肝细胞的恢复。因此，临床上适用于急、慢性肝病以及高血氨症，特别是因肝脏疾病所引起的中枢神经系统症状的改善及肝性脑病的救治。

L-鸟氨酸-L-天门冬氨酸盐的化学合成文献报道有以下几种方法：

1.德国专利DE4020980公开了应用精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸，再与L-天门冬氨酸反应而得。由于精氨酸酶价格昂贵，工业化供应困难，该工艺成本极高，尚不具有工业化价值。

2.英国专利GB965637公开了将L-鸟氨酸盐酸盐溶解于水，通过“Amberlite”IR-120阳离子交换树脂(铵盐型)吸附洗脱，再用氨水解离，蒸馏除去氨，得到游离鸟氨酸，与L-天门冬氨酸在水溶液中，通过加入甲醇析晶；方法二是梯度结晶法，采用消旋的游离DL-鸟氨酸与L-天门冬氨酸先在水中溶解，加入甲醇析出D-鸟氨酸-L-天门冬氨酸盐。过滤后的母液继续加入甲醇，则析出了L-鸟氨酸-L-天门冬氨酸盐。方法一采用了离子交换树脂，操作复杂；方法二梯度结晶法不容易控制，得到的产品品质较差，且成盐拆分收率低。

3.英国专利GB1067742公开了采用强酸性(H-型)离子交换树脂来使L-鸟氨酸盐酸盐游离，再与L-天门冬氨酸成盐，经过结晶处理，最后得到收率52％的L-鸟氨酸-L-天门冬氨酸盐一水合物。该工艺同样采用树脂柱脱盐，且收率较低，三废产生量较大。

4.1992年，日本KYOWA公司申请了欧洲专利EP477991，也是先将L-鸟氨酸盐酸盐水溶液通过Diaion SKIB树脂吸附，氨水解吸附，脱氨后与L-天门冬氨酸成盐，加入甲醇回流处理，结晶而得。该法仍然具有三废产生量大、需要过树脂柱、成本偏高等缺点。

5.中国专利CN101100435A公开了将L-鸟氨酸硫酸盐溶于蒸馏水中，加入L-天门冬氨酸，加热溶解后，用氢氧化钡中和硫酸，过滤；再用D403树脂鳌合残余的钡离子；过滤除去鳌合树脂，溶液减压浓缩，活性炭脱色，加入无水乙醇在搅拌、加热、回流状态下结晶。该方法用到了剧毒的钡离子，且仍需要树脂柱来去除重金属离子。因此该操作工艺复杂，工业化生产难度较大。

6.中国专利CN101798275A公开了一种L-鸟氨酸-L-天门冬氨酸盐的制备方法，特点是以L-鸟氨酸醋酸盐为原料，将其与L-天门冬氨酸在水中反应。具体地，该方法包括将L-鸟氨酸醋酸盐溶于水后，加入L-天门冬氨酸，然后用氨调节pH值至6～9，加入活性炭脱色过滤，滤液中加入适量的乙醇或甲醇，搅拌结晶，过滤、干燥得成品。

目前国内外报道的门冬氨酸鸟氨酸原料药的合成工艺的研究路线均较复杂，收率低，而且得到的最终产物纯度很低，对药物的临床效果有很大的影响。尤其是在门冬氨酸鸟氨酸存放不当或存放时间过长时，导致药物活性成分含量降低，色泽加强，有关物质含量升高。另外在某些情况下，由于生产工艺控制不当，导致药物纯度不符合要求。非常有必要对不合格的产品进一步进行纯化，以提供高品质高纯度的门冬氨酸鸟氨酸。因此市场上特别需要一种高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物以及精制方法。

针对这些不纯的产品，现有技术没有公开纯化门冬氨酸鸟氨酸化合物的方法，实际上，本领域具有一般经验的技术人员清楚地知道在获得高纯度化合物方面面临的种种困难，所有这些绝非现有一般分离纯化的理论就可以预期解决的，需要克服许多难题。

发明内容

申请人在大量现有文献的基础上，通过大量筛选的实验，发现上述文献以及一般的纯化分离方法例如结晶等方法难于获得高纯度高产率的化合物，而各种分离纯化方法以及多种条件参数又存在多种多样组合的可能性和不可预测性。本发明人经过长期认真的研究，令人惊奇地发现，经过组合应用特定的方法并优化参数后可以提供高纯度高产率的门冬氨酸鸟氨酸化合物，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供一种门冬氨酸鸟氨酸化合物及其精制方法，其通过活性炭吸附，有机溶剂沉淀和色谱柱吸附分离纯化达到精制纯化的目的，最终产物纯度较现有产品有很大的提高，优化了制剂产品质量，减少了毒副作用，保证了临床用药的安全。

本发明解决的技术方案如下：

一种如下所示结构的门冬氨酸鸟氨酸化合物的精制方法，

先将门冬氨酸鸟氨酸溶于水中，用活性炭吸附纯化，然后用有机溶剂沉淀，再用色谱柱分离纯化，最后用有机溶剂析晶，得到高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物。

在本发明的一个方面，优选地，上述方法中所述的活性炭吸附纯化包括加热搅拌的步骤，其中加热优选的温度为30～90℃，更优选的温度为40～80℃，特别优选的温度为60～70℃。

在本发明的一个方面，药物的分离和纯化方法包括吸附方法，如使用活性炭。不幸的是，除了去除颜色和其它不需要的物质外，活性炭还不可逆地吸附所感兴趣的药物，这导致产率明显降低。在本发明的一个方面，本发明证实活性炭可有利于门冬氨酸鸟氨酸的纯化，其中活性炭的使用量为溶液总体积的0.02-5％(g/ml)，优选为0.05-1％(g/ml)，特别优选为0.1-0.3％(g/ml)。

在本发明的一个方面，在本发明的方法中得到的所需纯度在某种程度上依赖于杂质的量和色谱柱的操作环境。在流动相中有机溶剂的选择和用量必须是可控的，使得不会过早地把杂质洗脱出来。一般而言，本发明所用色谱柱的色谱柱包括直径为约0.1至约200cm，优选为至少5cm。色谱柱长度范围优选为约10厘米至约100厘米，更优选长度范围为约20厘米至约30厘米，最优选的长度为25厘米。

一般地，分离纯化过程中，色谱柱填料可以为硅胶、氧化铝或大孔树脂，所用硅胶的粒径为45-250μm、孔径为

的细孔硅胶；优选为粒径 75-150μm、孔径为

的细孔硅胶；所用氧化铝最优选为中性氧化铝，所用中性氧化铝可以为100～200目或200～300目；所用的大孔树脂型号可以为AB-8、D101、HPD400、HPD100、D1300。在本发明的一个方面，本发明人发现中性氧化铝不仅可以充分吸附上柱物中的成分杂质及其它色素，还对本品纯化有着独到的效果，而且成本相对较低，操作较硅胶柱层析简易。在本发明优选的方面，所用氧化铝为中性氧化铝，所用中性氧化铝可以为100～200目或200～300目。

本发明人在上述基础上进行大量的优化实验，筛选得到了适宜的流动相，因此在本发明的一个方面，优选地，上述方法中所述的色谱柱分离纯化条件为以体积比1∶2的乙腈和水混合溶剂为流动相，固定相填料为氧化铝，流速为2.5-4.8ml/min，柱温25-40℃。

在本发明的一个方面，作为优选，每次纯化药物的质量与色谱柱填料的质量之比为1∶10-200，优选质量比为1∶15-100。流动相(洗脱剂)的用量只要满足将药物基本上完全洗脱即可，洗脱后的流分分段收集，不同段的流分中药物的含量不同，为了获得高纯度的药物(纯度大于99.5％)，需将药物含量大于85％的流分合并，优选将药物含量大于90％的流分合并。优选地，含量大于90％的流分基本上连续流出。

作为本发明一优选实施方案，本发明门冬氨酸鸟氨酸化合物的精制步骤包括：

(1)将门冬氨酸鸟氨酸化合物粗品溶于纯化水中，优选加入溶液总体积0.1-0.3％(g/ml)的活性炭，60-70℃搅拌20-30min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入有机溶剂，搅拌反应，产生沉淀，过滤得到门冬氨酸鸟氨酸固体；

(3)将门冬氨酸鸟氨酸固体上柱，通过色谱柱分离纯化，以体积比1∶2的乙腈和水混合溶剂为流动相，固定相填料为氧化铝，流速为2.5-4.8ml/min，柱温25-40℃，分段收集流分，合并含量大于等于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入有机溶剂，室温充分搅拌2-4h，逐渐析出固体，于2-8 ℃静置过夜，过滤，用有机溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物。

在本发明的一个方面，优选地，上述方法中所述的有机溶剂选自甲醇、乙腈、三氯甲烷、异丙醚、环己烷、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙醇中的一种或多种，优选为体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂。优选地，所述有机溶剂与滤液的体积比为1∶1～15∶1，优选地为3∶1～8∶1。

在本发明的一个方面，涉及本发明精制方法制备的门冬氨酸鸟氨酸在制备肝病相关治疗的药物中的应用。

本发明提供的门冬氨酸鸟氨酸的精制方法，通过活性炭吸附、有机溶剂沉淀和色谱柱吸附分离纯化，和现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：大大提高了门冬氨酸鸟氨酸的纯度和含量，优化了制剂的产品质量，减少了毒副作用，保证了临床用药的安全性，而且与现有技术相比，本方法工艺简便易行，成本低，收率高，产品纯度高，适合于工业化生产。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步解释或说明本发明内容，但实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1 门冬氨酸鸟氨酸的精制

(1)将100g纯度为96.5％的门冬氨酸鸟氨酸化合物粗品溶于1000ml的纯化水中，加入溶液1g的活性炭，60℃搅拌20min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入3000ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂，搅拌产生沉淀，过滤得门冬氨酸鸟氨酸固体；

(3)将所得门冬氨酸鸟氨酸固体上柱，通过色谱柱分离纯化，以体积比为1∶2的乙腈和水混合溶剂流动相，固定相填料为氧化铝，流速为2.5ml/min，柱温25℃，分段收集流分，合并含量大于等于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂800ml，室温充分搅拌2h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用120ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物88.6g，纯度为99.8％，总收率为91.6％。

实施例2 门冬氨酸鸟氨酸的精制

(1)将100g纯度为96.5％的门冬氨酸鸟氨酸化合物粗品溶于1000ml的纯化水中，加入溶液3g的活性炭，70℃搅拌30min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入8000ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂，搅拌产生沉淀，过滤得门冬氨酸鸟氨酸固体；

(3)将所得门冬氨酸鸟氨酸固体上柱，通过色谱柱分离纯化，以体积比1∶2的乙腈和水混合溶剂为流动相，固定相填料为氧化铝，流速为4.8ml/min，柱温40℃，分段收集流分，合并含量大于等于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂1400ml，室温充分搅拌3h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用120ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物87.9g，纯度为99.8％，总收率为90.9％。

实施例3 门冬氨酸鸟氨酸的精制

(1)将100g纯度为96.5％的门冬氨酸鸟氨酸化合物粗品溶于1000ml的纯化水中，加入溶液2g的活性炭，65℃搅拌25min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入5000ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂，搅拌产生沉淀，过滤得到门冬氨酸鸟氨酸固体；

(3)将所得门冬氨酸鸟氨酸固体上柱，通过色谱柱分离纯化，以体积比1∶2的乙腈和水混合溶剂为流动相，固定相填料为氧化铝，流速为3.6ml/min，柱温30℃，分段收集流分，合并含量大于等于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂1000ml，室温充分搅拌4h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用100ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物89.1g，纯度为99.9％，总收率为92.2％。

实施例4 门冬氨酸鸟氨酸的精制

(1)将100g纯度为96.5％的门冬氨酸鸟氨酸化合物粗品溶于1000ml的纯化水中，加入溶液1.8g的活性炭，60℃搅拌30min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂4000ml，搅拌产生沉淀，过滤得到门冬氨酸鸟氨酸固体；

(3)将所得门冬氨酸鸟氨酸固体上柱，通过色谱柱分离纯化，以体积比为1∶2的乙腈和水混合溶剂流动相，固定相填料为氧化铝，流速为4.5ml/min，柱温30℃，分段收集流分，合并含量大于等于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂1000ml，室温充分搅拌3h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用100ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物88.3g，纯度为99.8％，总收率为91.3％。

下面列举现有技术类似方法或本发明筛选过程的部分对比实施例，以说明本发明的技术效果。

对比例1 门冬氨酸鸟氨酸的精制(不用色谱柱)

(2)向滤液中加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂800ml，室温充分搅拌2h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用120ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物82.7g，纯度为97.3％，总收率为83.3％。

对比例2 门冬氨酸鸟氨酸的精制(使用硅胶层析柱)

(3)将所得门冬氨酸鸟氨酸固体上柱，通过色谱柱分离纯化，以体积比1∶2的乙腈和水混合溶剂为流动相，固定相填料为硅胶，流速为4.8ml/min，柱温40℃，分段收集流分，合并含量大于等于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂1400ml，室温充分搅拌3h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用120ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物85.4g，纯度为97.8％，总收率为86.6％。

对比例3 门冬氨酸鸟氨酸的精制(使用HPD400柱)

(3)将所得门冬氨酸鸟氨酸固体上柱，通过色谱柱分离纯化，以体积比1∶2的乙腈和水混合溶剂为流动相，固定相填料为HPD400，流速为3.6ml/min，柱温30℃，分段收集流分，合并含量大于等于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂1000ml，室温充分搅拌4h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用100ml体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物82.2g，纯度为98.0％，总收率为83.5％。

有文献报道的一些纯化方法中采用了使用离子树脂交换柱，由于离子树脂交换柱成本太高，还需要柱子的再生活化，且对其预处理、再生纯化工艺缺乏规范性指标，而且会引入大量的钠离子，纯度并没有明显改善。大孔树脂刚性不强、易破碎以及致孔剂等合成原料或溶剂去除不净而残留，易流入药液造成二次污染，而使用普通的硅胶为填充剂的层析柱，得到的产物纯度较低，并没有很大的提高；说明这些层析柱都不适宜用于高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物的进一步纯化。

上述实施例和对比例从不同方面充分说明了本发明特定组合方法的优越性，尤其是包括氧化铝柱的色谱条件以及优化后的参数，带来了意想不到的效果，是理论上无法合理预期的。不受理论限制，可能是各种纯化方法对药物中不同杂质的除去效果不同，本发明提供的精制方法具有实质的特点和显著的进步，取得的意想不到的技术效果，获得了高产率高纯度的产品。

已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。本申请所引用的各个参考文献，在此全文引入作为参考。

Claims

1.一种如下所示结构的门冬氨酸鸟氨酸化合物的精制方法，

其特征在于先将门冬氨酸鸟氨酸溶于水中，用活性炭吸附纯化，然后用有机溶剂沉淀，再用色谱柱分离纯化，最后用有机溶剂析晶，得到高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物；其中所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、三氯甲烷、异丙醚、环己烷、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙醇中的一种或多种，所述色谱柱分离纯化的条件为以体积比1∶2的乙腈和水混合溶剂为流动相，固定相填料为氧化铝，流速为2.5-4.8ml/min，柱温25-40℃。

2.根据权利要求1所述门冬氨酸鸟氨酸的精制方法，其特征在于制备步骤包括：

(1)将门冬氨酸鸟氨酸化合物粗品溶于纯化水中，加入溶液总体积0.1-0.3％g/ml的活性炭，60-70℃搅拌20-30min，过滤脱炭，收集滤液；

(4)向洗脱液中加入有机溶剂，室温充分搅拌2-4h，逐渐析出固体，于2-8℃静置过夜，过滤，用有机溶剂洗涤，50℃减压干燥，即得高纯度的门冬氨酸鸟氨酸化合物。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为体积比为2∶1的丙酮和乙腈的混合溶剂。