CN102010454B

CN102010454B - 一种胞磷胆碱钠化合物及其新方法

Info

Publication number: CN102010454B
Application number: CN2010105781201A
Authority: CN
Inventors: 胡建荣
Original assignee: Individual
Current assignee: Hainan Meida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2010-12-02
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2030-12-02
Also published as: CN102010454A

Abstract

本发明提供了一种胞磷胆碱钠化合物及其新方法，通过活性炭吸附、酸化反应和制备色谱柱分离纯化达到纯化的目的，最终得到高纯度的胞磷胆碱钠化合物，弥补了目前生产的原料纯度低的缺陷，同时提高了制剂产品质量，减少了毒副作用。而且与现有技术相比，本方法工艺简便易行，成本低，收率高，产品纯度高，适合于工业化生产，本发明精制方法制备的胞磷胆碱钠适合在制备神经激活剂药物中的应用。

Description

一种胞磷胆碱钠化合物及其新方法

技术领域

本发明涉及一种胞磷胆碱钠化合物及其新方法，属于医学技术领域。

背景技术

胞磷胆碱钠为胞嘧啶核苷二磷酸胆碱的简称，是磷脂类磷脂酰胆碱的前体物质，为卵磷脂合成的必要辅酶，其分子式为C₁₄H₂₅N₄NaO₁₁P₂，结构式为：

胞磷胆碱钠是内源性合成磷脂酰胆碱的中间体，是构建生物膜的重要成分。中枢神经损伤后，胞磷胆碱钠参与修复和再生，起神经保护作用；在神经介质的转移和生物电的传导中也起重要作用。胞磷胆碱钠在临床上主要用于头部外伤及脑术后伴有意识障碍、脑梗塞急性意识障碍、促进脑卒中偏瘫患者上肢功能恢复及急性胰腺炎等病症，对急性中风、外科手术后引起的神经损伤、意识障碍，对帕金森综合症、痴呆症、青光眼等有明显的临床治疗效果。胞磷胆碱钠为目前临床用量最大的神经激活剂，具有以下特点：(1)降低脑血管阻力，增加脑血流，促进脑物质代谢，改善脑循环；(2)增强脑干网状结构的机能，增强锥体系统机能，改善运动麻痹，促进卵磷脂合成，改善脑代谢，可与脑多肽合用，对改善脑功能有协同作用；(3)主要适应症为急性颅脑外科及脑手术后意识障碍；(4)临床上还用于其它中枢神经系统急性损伤引起的功能和意识障碍、震颤麻痹、耳鸣和神经性耳聋、安眠药中毒等；(5)近年临床上广泛用于缺血性脑中风、脑动脉硬化、多梗塞性痴呆、老年痴呆症、小儿病毒性脑炎等。

1956年Geiger在动物试验中发现胞磷胆碱钠能使脑损伤恢复：1957年Kennedy的研究证实其在脑磷脂质的合成中至关重要，1961年日本武田制药公司开发生产出胞磷胆碱钠，并于1988年在我国注册。胞磷胆碱钠原料药已被中国药典2005版二部收载，目前国内已有多家药厂生产上市，并有3家进口：日本协和、武田、意大利Pro.Bio.Sint公司。目前，临床上使用以胞磷胆碱钠注射剂为主，口服制剂有胞磷胆碱钠口服液和胞磷胆碱钠胶囊。

目前制备胞磷胆碱钠的方法有：(1)化学合成，利用CMP(5’-胞苷酸)和磷酸胆碱作为反应物，对-甲苯磺酰氯作为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺存在下进行缩合制备，用717(Cl^-)型阴离子交换柱和711(Cl^-)型浓缩柱分离液酒精沉淀制备胞磷胆碱钠，其缺点是难与缩合剂分离，产品不适合药用；(2)酶促合成，抽提细胞液用胞苷三磷酸(CTP)和磷酸胆碱生物合成胞磷胆碱钠，酶和细胞抽提液合成需要底物CTP，合成价格高；(3)游离细胞和酵母无细胞抽提液合成胞磷胆碱钠，游离酵母合成需要大量酵母，且只能一次性使用。

专利CN1944661公布了一种胞磷胆碱钠的制备方法是以5’-胞苷酸和磷酸胆碱作为反应物、以酵母作为生物催化剂生物合成胞磷胆碱钠，反应流程为：

本合成反应工艺操作较简单，但得到的胞磷胆碱钠的纯度不高，对临床用药有一定的影响，需作进一步的纯化。

中国药典2005年版规定，胞磷胆碱钠含量不得少于98.0％，有关物质照高效液相色谱法，色谱图中对应当于5′-胞苷酸的峰面积不得大于对照品溶液的主峰面积(0.3％)，其他单个杂质的峰面积不得大于对照溶液(2)的主峰面积(0.2％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液(1)的主峰面积。

在存放不当或存放时间过长时，导致药物活性成分含量降低，色泽加强，有关物质含量升高。还有，在某些情况下，由于生产工艺控制不当，导致药物纯度不符合要求。有必要进一步进行纯化，得到高品质的、纯度高的胞磷胆碱钠。

因此本发明的目的在于提供一种高纯度的胞磷胆碱钠及其精制方法以满足需要。

发明内容

针对这些不纯的产品，现有技术没有公开纯化胞磷胆碱钠化合物的方法，实际上，本领域具有一般经验的技术人员清楚地知道在获得高纯度化合物方面面临的种种困难，所有这些绝非现有一般分离纯化的理论就可以预期解决的，需要克服许多难题。

申请人在大量现有文献的基础上，通过大量筛选的实验，发现上述文献以及一般的纯化分离方法例如结晶等方法难于获得高纯度高产率的化合物，而各种分离纯化方法以及多种条件参数又存在多种多样组合的可能性和不可预测性。本发明人经过长期认真的研究，令人惊奇地发现，经过组合应用特定的方法并优化参数后可以提供高纯度高产率的胞磷胆碱钠化合物，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供一种胞磷胆碱钠化合物的精制方法，通过活性炭吸附、酸化反应和制备色谱柱分离纯化达到精制纯化的目的，最终得到高纯度的胞磷胆碱钠化合物，弥补了目前生产的原料纯度低的缺陷。

在本发明的一个方面，优选地，上述方法中所述的活性炭吸附纯化包括加热搅拌的步骤，其中加热优选的温度为30～90℃，更优选的温度为40～80℃，特别优选的温度为60～70℃。

在本发明的一个方面，药物的分离和纯化方法包括吸附方法，如使用活性炭。不幸的是，除了去除颜色和其它不需要的物质外，活性炭还不可逆地吸附所感兴趣的药物，这导致产率明显降低。本发明证实活性炭有利于胞磷胆碱钠的纯化，其中活性炭的使用量为溶液总体积的0.05-4％(g/ml)，优选为0.1-1％(g/ml)，特别优选为0.2-0.5％(g/ml)(g/ml)。

在本发明的一个方面，在本发明的方法中得到的所需纯度在某种程度上依赖于杂质的量和色谱柱的操作环境。在流动相中有机溶剂的选择和用量必须是可控的，使得不会过早地把杂质洗脱出来。一般而言，本发明所用色谱柱的直径为约0.1至约200cm，优选为至少5cm。此方法中色谱柱的长度范围优选为约10厘米至约100厘米，更优选长度范围为约20厘米至约30厘米，最优选的长度为25厘米。

一般而言，分离纯化过程中，色谱柱填料可以为硅胶、氧化铝或大孔树脂等，所用硅胶的粒径可为45-250μm、孔径为

的细孔硅胶；所用氧化铝可为中性氧化铝，所用中性氧化铝可以为100～200目或200～300目；所用的大孔树脂型号可以为AB-8、D101、HPD400、HPD100、D1300，本发明人发现硅胶柱或氧化铝对本品纯化有着独到分离的效果，而且成本相对较低，而大孔树脂对产品的纯度并没有明显改善。

本发明人在上述基础上进行大量的优化实验，筛选得到了适宜的流动相，因此在本发明的一个方面，优选地，上述精制方法中所述的色谱柱纯化条件为：应用固定相填料选自硅胶或氧化铝制备的色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为8-10的碱溶液的混合溶液为流动相。

在本发明的一个方面，作为优选，每次纯化药物的质量与色谱柱填料的质量之比为1∶10-200，优选质量比为1∶15-100。流动相(洗脱剂)的用量只要满足将药物基本上完全洗脱即可，洗脱后的流分分段收集，不同段的流分中药物的含量不同，为了获得高纯度的药物(纯度大于99.5％)，需将药物含量大于85％的流分合并，优选将药物含量大于90％的流分合并。优选地，含量大于90％的流分基本上连续流出。

在本发明的一个实施方案，本发明提供的胞磷胆碱钠化合物的精制方法，包括如下步骤：

(1)将胞磷胆碱钠粗品溶于水中，加热10-30min，加入溶液总体积0.2-0.5％(g/ml)的活性炭，保温60℃搅拌10-30min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入酸，搅拌反应至溶液的pH为1.5-3.0，冷藏静置过夜，产生胞磷胆碱沉淀，抽滤得到胞磷胆碱；

(3)将得到的胞磷胆碱上柱，应用固定相填料选自硅胶或氧化铝制备的色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为8-10的碱溶液的混合溶液为流动相进行洗脱，其中所述的碱选自氢氧化钠、碳酸氢钠和碳酸钠中的一种，并且优选氢氧化钠；流速为3.0-5.0ml/min，柱温30-35℃；分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入有机溶剂，室温充分搅拌2-4h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用有机溶剂洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠。

在本发明的一个方面，优选地，上述步骤(2)中所述的酸选自盐酸、磷酸、草酸、乙酸中的一种，优选为盐酸，更优选为1mol/L的盐酸溶液。

在本发明的一个方面，优选地，上述步骤(2)中搅拌反应至溶液的pH值为1.8-2.5，更优选为pH值为2.2。

在本发明的一个方面，优选地，上述步骤(3)中碱溶液的pH为8.5-9.5，更优选为pH值为9.0。

在本发明的一个方面，优选地，上述步骤(4)中所述有机溶剂选自四氢呋喃、乙腈、丙酮、环己烷、正丁烷、异丙醇、三氯甲烷和二氯甲烷中的一种，优选为四氢呋喃。

在本发明的一个方面，提供了本发明精制方法制备的胞磷胆碱钠在制备神经激活剂药物中的应用。

本发明提供的胞磷胆碱钠化合物的精制方法，通过活性炭吸附、酸化反应和制备色谱分离纯化，大大提高了胞磷胆碱钠的纯度和含量，优化了制剂的产品质量，减少了毒副作用，保障了临床用药的安全，而且与现有技术相比，本方法工艺简便易行，成本低，收率高，产品纯度高，适合于工业化生产。上述不合格的或从市面上回收来的胞磷胆碱(钠)，均可以采用本发明的方法，进行精制。

有文献报道了一些大孔树脂为填充剂的层析柱或离子树脂交换柱的纯化方法，大孔树脂刚性不强、易破碎以及致孔剂等合成原料或溶剂去除不净而残留，易流入药液造成二次污染，对其预处理、再生纯化工艺缺乏规范性指标，使用离子树脂交换柱则是成本太高，还需要柱子的再生活化，较为复杂，而且会引入大量的钠离子，纯度并没有明显改善。本发明人发现本发明的硅胶或氧化铝柱方法显著优于这些纯化方法。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步解释或说明本发明内容，但实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1 胞磷胆碱钠的精制

(1)将100g纯度为96.8％的胞磷胆碱钠粗品溶于120ml水中，加热10min，加入0.24g的活性炭，保温60℃搅拌10min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入1mol/L的盐酸，搅拌反应至溶液的pH为2.2，冷藏静置过夜，产生胞磷胆碱沉淀，抽滤得到胞磷胆碱89.5g；

(3)将上步得到的89.5g胞磷胆碱上柱，应用固定相填料选自硅胶的制备色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为9.0的氢氧化钠溶液的混合溶液为流动相进行洗脱；流速为3.8ml/min，柱温35℃；分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入四氢呋喃1000ml，室温充分搅拌3h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用四氢呋喃100ml洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠91.8g，纯度为99.9％，收率为94.7％。

实施例2 胞磷胆碱钠的精制

(1)将100g纯度为96.8％的胞磷胆碱钠粗品溶于120ml水中，加热30min，加入0.6g的活性炭，保温60℃搅拌20min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入1.5mol/L的磷酸，搅拌反应至溶液的pH为1.5，冷藏静置过夜，产生胞磷胆碱沉淀，抽滤得到胞磷胆碱89.8g；

(3)将上步得到的89.8g胞磷胆碱上柱，应用固定相填料选自氧化铝的制备色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为8.0的碳酸氢钠溶液的混合溶液为流动相进行洗脱；流速为3.0ml/min，柱温30℃；分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入三氯甲烷1000ml，室温充分搅拌2h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用三氯甲烷100ml洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠92.3g，纯度为99.8％，收率为95.2％。

实施例3 胞磷胆碱钠的精制

(1)将100g纯度为96.8％的胞磷胆碱钠粗品溶于120ml水中，加热20min，加入0.48g的活性炭，保温60℃搅拌30min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入2.0mol/L的草酸，搅拌反应至溶液的pH为3.0，产生胞磷胆碱沉淀，抽滤得到胞磷胆碱89.2g；

(3)将上步得到的89.2g胞磷胆碱上柱，应用固定相填料选自氧化铝的制备色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为10.0的氢氧化钠溶液的混合溶液为流动相进行洗脱；流速为5.0ml/min，柱温35℃；分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入异丙醇1000ml，室温充分搅拌4h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用异丙醇100ml洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠92.3g，纯度为99.8％，收率为95.2％。

下面列举现有技术类似方法或本发明筛选过程的部分对比实施例，以说明本发明的技术效果。

对比例1胞磷胆碱钠的精制(不用色谱柱)

(2)将上步得到的89.5g胞磷胆碱和pH为9.0的氢氧化钠溶液的混合溶液充分反应，得澄清溶液；

(3)向溶液中加入四氢呋喃1000ml，室温充分搅拌3h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用四氢呋喃100ml洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠90.6g，纯度为97.3％，收率为91.1％。

对比例2 胞磷胆碱钠的精制(使用HPD400的层析柱)

(3)将上步得到的89.8g胞磷胆碱上柱，应用HPD400为填料的制备色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为8.0的碳酸氢钠溶液的混合溶液为流动相进行洗脱；流速为3.0ml/min，柱温30℃；分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入三氯甲烷1000ml，室温充分搅拌2h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用三氯甲烷100ml洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠90.1g，纯度为97.5％，收率为90.8％。

对比例3 胞磷胆碱钠的精制(pH值范围的不同)

(2)向所得滤液中缓慢加入2.0mol/L的草酸，搅拌反应至溶液的pH为3.5，产生胞磷胆碱沉淀，抽滤得到胞磷胆碱87.5g；

(3)将上步得到的86.5g胞磷胆碱上柱，应用固定相填料选自氧化铝的制备色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为10.2的氢氧化钠溶液的混合溶液为流动相进行洗脱；流速为5.0ml/min，柱温35℃；分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入异丙醇1000ml，室温充分搅拌4h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用异丙醇100ml洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠91.7g，纯度为97.8％，收率为92.6％。

对比例4 胞磷胆碱钠的精制(pH值范围的不同)

(2)向所得滤液中缓慢加入2.0mol/L的草酸，搅拌反应至溶液的pH为1.0，产生胞磷胆碱沉淀，抽滤得到胞磷胆碱87.4g；

(3)将上步得到的87.4g胞磷胆碱上柱，应用固定相填料选自氧化铝的制备色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为10.0的氢氧化钠溶液的混合溶液为流动相进行洗脱；流速为5.0ml/min，柱温35℃；分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入异丙醇1000ml，室温充分搅拌4h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用异丙醇100ml洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠89.7g，纯度为97.6％，收率为90.4％。

上述实施例和对比例从不同方面充分说明了本发明特定组合方法的优越性，尤其是包括硅胶和氧化铝柱的色谱条件和优化后的参数，带来了意想不到的效果，是理论上无法合理预期的。不受理论限制，可能是各种纯化方法对药物中不同杂质的除去效果不同，本发明提供的精制方法具有实质的特点和显著的进步，取得的意想不到的技术效果，获得了高产率高纯度的产品。

已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。本申请所引用的各个参考文献，在此全文引入作为参考。

Claims

1.一种胞磷胆碱钠化合物的制法，包括如下步骤：

(1)将胞磷胆碱钠粗品溶于水中，加热10-30min，加入溶液总体积0.2-0.5％g/ml的活性炭，保温60℃搅拌10-30min，过滤脱碳，收集滤液；

(2)向所得滤液中缓慢加入酸，搅拌反应至溶液的pH为1.5-3.0，冷藏静置过夜，产生胞磷胆碱沉淀，抽滤得到胞磷胆碱，其中所述的酸选自盐酸、磷酸、草酸中的一种；

(3)将得到的胞磷胆碱上柱，应用固定相填料选自硅胶或氧化铝制备的色谱柱进行分离纯化，以体积比为1∶3的三氯甲烷和pH为8-10的碱溶液的混合溶液为流动相进行洗脱，其中所述的碱选自氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种；流速为3.0-5.0ml/min，柱温30-35℃，分段收集流分，合并含量大于90％的洗脱液；

(4)向洗脱液中加入有机溶剂，室温充分搅拌2-4h，逐渐析出固体，于2-8℃放置8小时，过滤，用有机溶剂洗涤，50℃减压干燥，得到精制的胞磷胆碱钠，其中所述有机溶剂选自四氢呋喃、异丙醇和三氯甲烷中的一种。

2.根据权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制法，其特征在于步骤(2)中搅拌反应至溶液的pH值为1.8-2.5。

3.根据权利要求1所述的胞磷胆碱钠的制法，其特征在于步骤(3)中碱溶液的pH为8.5-9.5。