CN102058536A - 槲皮素羟丙基β－环糊精包和物脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其制备方法和用途，属于药物制剂领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种能够提高槲皮素生物利用度的药物及该药物的制备方法。本发明能够提高槲皮素生物利用度的药物即为槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，其由下述重量配比的组分加上药学上可接受的溶剂制备而成：槲皮素1份，羟丙基β-环糊精1～100份，大豆磷脂5～50份，胆固醇1～10份，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺0.1～5份。
Description
技术领域
本发明涉及槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其制备方法和用途，属于药物制剂领域。
背景技术
肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种多种原因引起的以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，并最终导致肺间质纤维化及呼吸衰竭为特征的疾病。临床上由放射性和化疗药物引起的肺炎是常见的并发症，发生率为36％-60％。由多种原因包括细菌、粉尘、放射性物质以及化疗和放射性治疗等。其发病率约为5/10万。肺纤维化确诊后平均存活期约为2-4年，5年生存率约为50-70％，目前临床上还缺少特异性治疗方法。过去对肺纤维化的治疗仅限于非特异性抗炎、免疫抑制剂及糖皮质激素等，疗效及不理想。而随着我国工业化发展，环境污染加剧，各种原因导致的呼吸系统疾病的发病率提高，并多数转化为肺纤维化，从而对我国的国民经济和社会发展造成了极大影响。因而开发用于治疗肺纤维化的新药极其迫切和重要。
博来霉素(Bleomycin，BLM)是一类多肽类抗肿瘤药物，在临床使用中对多种类型肿瘤治疗效果较好，但绝大多数病人会产生剂量依赖性肺纤维化。在科研中单次将BLM在噬齿类动物气管内注射可建立与人肺间质性疾病相似的动物模型，因而广泛用于肺纤维化动物模型的建立。BLM导致的早期肺损伤无论在病理组织学上还是生理学上均与人类肺纤维化疾病相似。
槲皮素(Quercetin)是一种具有多种生理作用的天然黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜、水果和多种中草药中。多以苷的形式存在，其基本结构由连接羟基的三个环状分子构成，化学结构式如下：
槲皮素具有来源广泛、生物活性强及药理作用广泛的优点，其药理作用包括免疫增强功能、抗菌、抗病毒、镇痛、抑制血小板凝集、舒张血管、抗氧化活性、抗癌症、抗乙肝病毒、抗肝癌、抗肝肺纤维化等。因而槲皮素及其衍生物在医药、食品化妆品等领域倍受重视。但是，由于槲皮素不溶于水且难溶于其他多种药用溶剂，导致其生物利用度极低，进而限制了其在临床上的使用。因此，目前迫切需要寻找一种合适的方法改善槲皮素的水溶性提高其在体内的生物利用度，使其作为药物能够应用于临床并能够进行工业化大生产。
环糊精包和物脂质体是一种新型的给药系统，最早是由McCormack和Gregoriadis在1994年提出将环糊精应用于脂质体。该类新型脂质体与普通脂质体相比具有稳定性提高，药物泄漏率下降，载药量提高，提高药物疗效减少毒性及不良反应的优点。同时，该类新型脂质体还能够改变药物在体内的行为，具有缓释作用及靶向性。且β-环糊精由于生产工艺简单，成本较低，是目前工业上唯一能大量生产的环糊精类产品，但由于其C2、C3羟基之间形成分子内氢键，导致其在水中溶解度较低(1.85g/100Ml，20℃)，限制了β-环糊精的应用。羟丙基β-环糊精是β-环糊精2、3或6位羟基氢原子被羟丙基取代的一类无定形多组分衍生物，其水溶性比β-环糊精大大提高(＞500g/L，20℃)，并且具有溶血性低，安全性高的优点，因此可用作注射制剂添加物，且已通过美国食品药品监督管理局(FDA)审批，美国强生公司40％羟丙基β-环糊精增容的伊曲康唑口服液和静脉注射剂已经上市，因此羟丙基β-环糊精可以说是目前最有潜力的环糊精材料。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能够提高槲皮素生物利用度的药物。
本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体由下述重量配比的组分加上药学上可接受的溶剂制备而成：槲皮素1份，羟丙基β-环糊精1～100份，蛋黄磷脂或大豆磷脂5～50份，胆固醇1～10份，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺0.1～5份。
进一步的，为了使槲皮素生物利用度更高，本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体优选由下述重量配比的组分加上药学上可接受的溶剂制备而成：槲皮素1份，羟丙基β-环糊精10～60份，蛋黄磷脂或大豆磷脂6～20份，胆固醇2～6份，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺0.2～2份。
其中，上述的药学上可接受的溶剂的作用为：将羟丙基β-环糊精和槲皮素完全溶解，并达到将槲皮素包合进入羟丙基β-环糊精包合物的内腔的目的。所述溶剂可以是常用的溶解羟丙基β-环糊精和槲皮素的溶剂，如：无水乙醇、乙醚、正丁醇等溶剂中至少一种。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法，其包括如下步骤：
a、按重量配比将1～100份羟丙基β-环糊精加入药学上可接受的溶剂中，溶胀，制成质量体积比为0.01％-99％的羟丙基β-环糊精溶液，将1份槲皮素或其溶液加入羟丙基β-环糊精溶液中，混匀；其中，所述的药学上可接受的溶剂为无水乙醇、正丁醇、乙醚中至少一种；槲皮素与药学上可接受的溶剂的质量体积比为0.001％-20％；
b、将5～50份蛋黄磷脂或大豆磷脂，1～10份胆固醇，0.1～5份聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺或其溶液加入a步骤所得溶液中，混匀；其中，所述聚乙二醇的分子量为2000-8000；
c、b步骤所得溶液加热至30-80℃，搅拌并滴加质量体积比为0.5-50％的蔗糖水溶液，然后于30-80℃恒温搅拌5-60min；其中，上述蔗糖水溶液滴加前先预热至30-80℃；
d、c步骤所得溶液去除无水乙醇，即得槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体。
其中，上述a步骤中的溶胀时间优选为1min～24h。
其中，上述a步骤中可以采用常规方法使槲皮素混匀(即完全溶解)于溶剂中，如采用静置、加热、搅拌、超声或研磨等方法使槲皮素完全溶解于溶剂中。
其中，上述c步骤中加入蔗糖水溶液的目的是为了使脂质体内外水相等渗，c步骤中，蔗糖水溶液与a步骤中所述的药学上可接受的溶剂的体积比优选为1∶0.1-2。体积比过大则有机溶剂过少，脂溶性的槲皮素和脂质体膜材不能充分溶解；体积比过小则有机溶剂过多，导致后期除有机溶剂时间大大延长，且不利于脂质体的稳定
其中，上述c步骤的加热温度过高会导致磷脂氧化，温度过低则磷脂达不到相变温度不能形成脂质体。
其中，上述d步骤中可以采用常规方法去除无水乙醇，如采用减压旋转蒸发、减压分流、冷冻干燥或常压挥发等。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物中的用途。
其中，上述的肺纤维化疾病主要包括由化疗和放射性治疗中引起的肺纤维化疾病，还包括由其它原因引起的肺纤维化疾病。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂，其由上述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体加上药学上可接受的赋形剂制备而成。
其中，上述的赋形剂可以为药学上常用的赋形剂，如：山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘氨酸。
本发明所要解决的第五个技术问题是提供制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干 粉针剂的方法，其采用上述的制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法制备得到槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，然后加入赋形剂，冷冻、干燥，即得槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂；其中，赋形剂与槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的质量体积比为1％-50％∶1。其中，上述的赋形剂可以为药学上常用的赋形剂，如：山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘氨酸。
本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其粉针剂能充分溶解于可用于静脉滴注的溶液，如5％葡萄糖或生理盐水，提高了槲皮素的生物利用度，延长了其在体内的循环时间，进而扩大了其在临床上的使用范围，本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其粉针剂在低温4℃-8℃条件下可长期保存备用，具有良好的稳定性。本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其粉针剂为槲皮素的临床使用提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体对博来霉素引起的肺纤维化的治疗效果图；图中A和F为模型组；B和G为空脂质体加博来霉素租；C和H为槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体治疗组；D和I为单纯槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体组；E和J为生理盐水组；A-E为H&E染色，F-J为Masson染色(图中箭头指示表示模型组胶原广泛沉积，而经治疗后胶原沉积部分得到显著改善)。
图2为第三周的肺组织切片行天狼星红染色结果图(ns组)。
图3为第三周的肺组织切片行天狼星红染色结果图(治疗组)。
图4为第五周的肺组织切片行天狼星红染色结果图(ns组)。
图5为第五周的肺组织切片行天狼星红染色结果图(治疗组)。
具体实施方式
本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体由下述重量配比的组分加上药学上可接受的溶剂制备而成：槲皮素1份，羟丙基β-环糊精1～100份，蛋黄磷脂或大豆磷脂5～50份，胆固醇1～10份，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺0.1～5份。
进一步的，为了使槲皮素生物利用度更高，本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体优选由下述重量配比的组分加上药学上可接受的溶剂制备而成：槲皮素1份，羟丙基β-环糊精10～60份，蛋黄磷脂或大豆磷脂6～20份，胆固醇2～6份，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺0.2～2份。
其中，上述的药学上可接受的溶剂的作用为：将羟丙基β-环糊精和槲皮素完全溶解，并达到将槲皮素包合进入羟丙基β-环糊精包合物的内腔的目的。所述溶剂可以是常用的溶解羟丙基β-环糊精和槲皮素的溶剂，如：无水乙醇、乙醚、正丁醇等溶剂中至少一种。
本发明还提供乐制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法，其包括如下步骤：
a、按重量配比将1～100份羟丙基β-环糊精加入药学上可接受的溶剂中，溶胀，制成质量体积比为0.01％-99％的羟丙基β-环糊精溶液，将1份槲皮素或其溶液加入羟丙基β-环糊精溶液中，混匀；其中，所述的药学上可接受的溶剂为无水乙醇、正丁醇、乙醚中至少一种；槲皮素与药学上可接受的溶剂的质量体积比为0.001％-20％；
b、将5～50份蛋黄磷脂或大豆磷脂，1～10份胆固醇，0.1～5份聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺或其溶液加入a步骤所得溶液中，混匀；其中，所述聚乙二醇的分子量为2000-8000；
c、b步骤所得溶液加热至30-80℃，搅拌并滴加质量体积比为0.5-50％的蔗糖水溶液，然后于30-80℃恒温搅拌5-60min；其中，上述蔗糖水溶液滴加前先预热至30-80℃；
d、c步骤所得溶液去除无水乙醇，即得槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体。
其中，上述a步骤中的溶胀时间优选为1min～24h。
其中，上述a步骤中可以采用常规方法使槲皮素混匀(即完全溶解)于溶剂中，如采用静置、加热、搅拌、超声或研磨等方法使槲皮素完全溶解于溶剂中。
其中，上述c步骤中加入蔗糖水溶液的目的是为了使脂质体内外水相等渗，c步骤中，蔗糖水溶液与a步骤中所述的药学上可接受的溶剂的体积比优选为1∶0.1-2。体积比过大则有机溶剂过少，脂溶性的槲皮素和脂质体膜材不能充分溶解；体积比过小则有机溶剂过多，导致后期除有机溶剂时间大大延长，且不利于脂质体的稳定
其中，上述c步骤的加热温度过高会导致磷脂氧化，温度过低则磷脂达不到相变温度不能形成脂质体。
其中，上述d步骤中可以采用常规方法去除无水乙醇，如采用减压旋转蒸发、减压分流、冷冻干燥或常压挥发等。
本发明还提供了上述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物中的用途。
其中，上述的肺纤维化疾病主要包括由化疗和放射性治疗中引起的肺纤维化疾病，还包括由其它原因引起的肺纤维化疾病。
本发明还提供了一种槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂，其由上述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体加上药学上可接受的赋形剂制备而成。
其中，上述的赋形剂可以为药学上常用的赋形剂，如：山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘氨酸。
本发明还提供了制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂的方法，其采用上 述的制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法制备得到槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，然后加入赋形剂，冷冻、干燥，即得槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂；其中，赋形剂与槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的质量体积比为1％-50％∶1。其中，上述的赋形剂可以为药学上常用的赋形剂，如：山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘氨酸。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精0.5g在无水乙醇中溶胀1h，然后加入槲皮素10mg，25℃下搅拌0.5h使槲皮素完全溶解，得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂100mg，胆固醇20mg，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺6mg。其中，聚乙二醇的分子量为2000。制成混合溶液，再将上述混合溶液于60℃滴加入20ml质量体积比为2.5％的蔗糖溶液，无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶4，磁力搅拌10min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液总体积为10ml形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即得黄绿色絮状槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例2本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精5g在无水乙醇中溶胀2h，制成溶液，然后加入槲皮素0.2g，50℃下搅拌0.5h使槲皮素完全溶解，得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂1g，胆固醇0.2g，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺30mg其中聚乙二醇的分子量为2000，制成混合溶液，再将上述混合溶液于60℃下滴加入0.2L质量体积比为1.25％的蔗糖溶液。无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶4，磁力搅拌20min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液体积为0.1L形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，将0.25g蔗糖溶解在槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例3本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精0.5g在无水乙醇中溶胀1h，制成溶液，然后加入槲皮素20mg，25℃下超声5分钟使槲皮素完全溶解，得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂100mg，胆固醇20mg，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺2mg其中聚乙二醇的分子量为3000，制成混合溶液，再将上述混合溶液于65℃下滴加入20ml 2.5％的蔗糖溶液(质量体积 比)，无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶5，磁力搅拌10min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液体积为10ml形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例4本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精1g在无水乙醇中溶胀2h，制成溶液，然后加入槲皮素40mg，25℃下研磨10分钟使槲皮素完全溶解，得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂200mg，胆固醇50mg，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺5mg其中聚乙二醇的分子量为4000，制成混合溶液，再将上述混合溶液于65℃下滴加入20ml 2.5％的蔗糖溶液(质量体积比)，无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶5，磁力搅拌10min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液体积为10ml形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例5本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精0.4g在无水乙醇中溶胀20min，制成溶液，然后加入5mg/ml的槲皮素无水乙醇溶液0.4ml，25℃下静置1小时使槲皮素无水乙醇溶液与羟丙基β-环糊精溶液完全混合，得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂200mg，胆固醇50mg，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺12mg其中聚乙二醇的分子量为5000，制成混合溶液，再将上述混合溶液于55℃下滴加入20ml的5％蔗糖溶液(质量体积比)，无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶3，磁力搅拌10min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液体积为10ml形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例6本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精1g在无水乙醇中溶胀20min，制成溶液，然后加入5mg/ml的槲皮素无水乙醇溶液1ml，25℃下静置2小时使槲皮素无水乙醇溶液与羟丙基β-环糊精溶液完全混合，得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂500mg，胆固醇50mg，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺20mg其中聚乙二醇的分子量为6000，制成混合溶液，再将上述混合溶液于65℃下滴加入30ml 5％蔗糖溶液(质量体积比)，无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶3，磁力搅拌10min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液体积为20ml形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素羟丙基 β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例7本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精1g在无水乙醇中溶胀20min，制成溶液，然后加入槲皮素50mg，25℃下研磨30分钟使槲皮素完全溶解得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂600mg，胆固醇100mg，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺20mg其中聚乙二醇的分子量为7000，制成混合溶液，再将上述混合溶液于65℃下滴加入40ml 5％蔗糖溶液(质量体积比)，无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶5，磁力搅拌10min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液体积为20ml形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例8本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体及其冻干粉针剂的制备
将羟丙基β-环糊精1g在无水乙醇中溶胀30min，制成溶液，然后加入槲皮素50mg，55℃下搅拌30分钟使槲皮素完全溶解得到羟丙基β-环糊精槲皮素无水乙醇溶液后，加入大豆卵磷脂600mg，胆固醇100mg，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺15mg其中聚乙二醇的分子量为8000，制成混合溶液，再将上述混合溶液于65℃下滴加入40ml 5％蔗糖溶液(质量体积比)，无水乙醇与蔗糖溶液的体积比为1∶5，磁力搅拌10min后，旋转蒸发去除无水乙醇至溶液体积为20ml形成槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
试验例1本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂稳定性试验
实施例1～8所制备的本发明槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂于4℃-8℃保存0、1、6、12个月，观察其外观性状变化情况，并分别测定放置不同时间其含量、pH值、包封率、粒径(纳米)与分布均匀性(PDI)的变化，结果见表1所示。脂质体粒径和PDI如表1，)
表1本发明药物稳定性试验结果
试验例2本发明药物的毒理药理试验
1、本发明药物对小鼠的急性毒性试验
取SD大鼠20只，6-8周，雌雄各半，禁食12小时，正成饮水，采用尾静脉给药的方式，槲皮素的含量为5mg/ml，每只给药剂量为8ml。
按上述方法分别采用实施例1～8所制备的本发明药物进行试验，用药后大鼠均未出现明显的中毒症状及死亡情况，连续观察一周，动物全部存活，活动自如，毛发光滑，饮食正常，一周后解剖动物，肉眼及显微镜观察内脏器官，均未出现明显的药理学改变。
2、本发明药物的药代动力学实验
取BABL/c小鼠100只，6-8周，雌雄各半，随机分为对照组和实验组，每组50只。
对照组：槲皮素普通脂质体，其中槲皮素含量为5mg/ml，每只小鼠剂量0.2ml，尾静脉给药一次。于给药前取空白血，给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟眼球静脉取血，加入肝素抗凝后离心取血浆，同时将其主要内脏组织(心、肝、脾、肺、肾)分别取出，萃取后，HPLC测定血浆中槲皮素在不同时间点的浓度及其组织分布。
实验组(实验组采用的是实施例5制备的药物)：槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，其中槲皮素含量为5mg/ml，每只小鼠剂量0.2ml，尾静脉给药一次。于给药前取空白血，给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟、360分钟、480分钟、720分钟、1440分钟眼球取血，加入肝素抗凝后离心取血浆，同时将其主要内脏组织(心、肝、脾、肺、肾)分别取出，萃取后，HPLC测定血浆中槲皮素在不同时间点的浓度及其组织分布。其房室模型采用二室模型。
结果如表2所示，从血药浓度结果可以看出槲皮素普通脂质体组给药15分钟其血药浓度达到峰值。槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体组4小时其血药浓度达到峰值。因此可证明采用羟丙基β-环糊精包和物脂质体技术可明显延长药物在体内的循环时间。
表2 BABL/c小鼠体内血药浓度测定结果
3、本发明药物的药理学实验及结果
3.1槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体对博来霉素诱导的肺纤维化的治疗效果
3.1.1实验分组方法与模型建立
SD大鼠，6-8周龄、雌性，体重约200g，购自四川大学华西实验动物中心。先在动物房饲养，动物自由进饮食，黑夜白昼交替。动物适应环境后开始实验。随机分为5组，每组5只进行指标检测。其分组分别为1：博来霉素模型注射组；2：BBLM模型加空脂质体组；3：槲皮素脂质体治疗组(10mg/kg)；4：游离槲皮素治疗组(剂量4mg/kg)；5：生理盐水组。
以上各组(除生理盐水组)在建立模型后6小时进行给药，每天注射给药一次，共持续14天。在博莱霉素处理后第14天行支气管肺泡灌洗，通过检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎性细胞数和炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)水平，观察槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体对博来霉素所致肺急性炎症的影响；在博莱霉素处理后第28天处死大鼠，测定其肺组织羟脯氨酸含量，定量了解肺纤维化情况；制备肺组织石蜡切片，行HE以及Masson染色观察肺组织形态学改变
采用气道内滴入博莱霉素法，建立大鼠肺纤维化模型。每只大鼠均以10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射，麻醉生效后使大鼠取仰卧位固定于鼠板上，暴露其颈部，局部用碘伏消毒，于颈部正中位置做横向大切口，钝性分离皮下组织和颈部肌肉，暴露气管，然后抬高头部鼠板使大鼠呈头高足低位，大鼠身体长轴与地平面约成45度角，以环状软骨下方约3mm处为穿刺点，右手持连接7号针头的1ml玻璃注射器，使针头向前下方向与气管呈45度角，行直视下气管穿刺，有突破感后，回抽无阻力并见针管内不断有空气流入，表明已进入气管腔内。此时博莱霉素组向气管内注入浓度(博莱霉素5mg/kg溶于100ul生理盐水中)，生理盐水组则注入生理盐水100μl做对照，随后将大鼠直立，并左右轻轻晃动1～2分钟，尽可能使药液均匀分布于两肺。最后，消毒切口，间断缝合，每日消毒一次，五天后拆线。其余组注入等量无菌生理盐水。
3.2槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体对放疗引起的肺纤维化的治疗效果
3.2.1实验动物肿瘤模型的建立：模型采用6～8周龄、18g左右的雌性C57BL/6小鼠，麻醉固定后于直线加速器一次性照射14Gy建立放射性肺炎模型。
3.2.2槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体脂质体(4mg/kg)治疗放射性肺炎：放射性肺炎小鼠模型建立后，将小鼠随机分为4组，每组10只，开始治疗，具体为：
1)槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体：每只小鼠尾静脉注射200μl，于放射性肺炎模型建立后开始治疗，每天一次，共7次；
2)DM组(地塞米松组)：每只小鼠尾静脉注射地塞米松200μl(5mg)，于放射性肺炎模型建立后开始治疗，每天一次，共7次；
3)n.s组(生理盐水组)：每只小鼠尾静脉注射生理盐水200μl，于放射性肺炎模型建立后开始治疗，每天一次，共7次。
槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体肝纤维化的效应，肝脏切片进行天狼星红染色标记胶原蛋白生成，红染部位显示胶原蛋白。将第三周、第五周的肺组织切片行天狼星红染色(如图2、3、4、5所示；图2、4为ns组，图3、5为治疗组)，图中可见n.s组的小鼠肺组织内除了气管周围的胶原染色红色外，组织整体呈现红色，肺泡间隔亦有胶原形成，至第五周可见明显的胶原形成区域，而同时期内经过槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体治疗的小鼠肺组织切片内胶原染色则明显减少。组织学定量分析光绿染色区域提示对照组小鼠肺组织胶原蛋白生成为8.13％，槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体胶原蛋白为1.75％(与对照组相比，P＜0.001)。
Claims (11)
1.槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，其特征在于由下述重量配比的组分加上药学上可接受的溶剂制备而成：槲皮素1份，羟丙基β-环糊精1～100份，蛋黄磷脂或大豆磷脂5～50份，胆固醇1～10份，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺0.1～5份。
2.根据权利要求1所述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，其特征在于由下述重量配比的组分加上药学上可接受的溶剂制备而成：槲皮素1份，羟丙基β-环糊精10～60份，蛋黄磷脂或大豆磷脂6～20份，胆固醇2～6份，聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺0.2～2份。
3.根据权利要求1或2所述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，其特征在于：所述的药学上可接受的溶剂为无水乙醇、正丁醇、乙醚中至少一种。
4.制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法，其特征在于包括如下步骤：
a、按重量配比将1～100份羟丙基β-环糊精加入药学上可接受的溶剂中，溶胀，制成质量体积比为0.01％-99％的羟丙基β-环糊精溶液，将1份槲皮素或其溶液加入羟丙基β-环糊精溶液中，混匀；其中，所述的药学上可接受的溶剂为无水乙醇、正丁醇、乙醚中至少一种；槲皮素与药学上可接受的溶剂的质量体积比为0.001％-20％；
b、将5～50份蛋黄磷脂或大豆磷脂，1～10份胆固醇，0.1～5份聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺或其溶液加入a步骤所得溶液中，混匀；其中，所述聚乙二醇的分子量为2000-8000；
c、b步骤所得溶液加热至30-80℃，搅拌并滴加质量体积比为0.5-50％的蔗糖水溶液，然后于30-80℃恒温搅拌5-60min；其中，上述蔗糖水溶液滴加前先预热至30-80℃；
d、c步骤所得溶液去除无水乙醇，即得槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体。
5.根据权利要求4所述的制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法，其特征在于：a步骤中的溶胀时间为1min～24h。
6.根据权利要求4或5所述的制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法，其特征在于：c步骤中，蔗糖水溶液与a步骤中所述的药学上可接受的溶剂的体积比为1∶0.1-2。
7.权利要求1～3任一项所述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物中的用途。
8.槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂，其特征在于：由权利要求1～3任一项所述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体加上药学上可接受的赋形剂制备而成。
9.根据权利要求8所述的槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂，其特征在于：所述的赋形剂为山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘氨酸。
10.制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂的方法，其特征在于：采用权利要求4～6任一项所述的制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的方法制备得到槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体，然后加入赋形剂，冷冻、干燥，即得槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体粉针剂；其中，赋形剂与槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体的质量体积比为1％-50％∶1。
11.根据权利要求10所述的制备槲皮素羟丙基β-环糊精包和物脂质体冻干粉针剂的方法，其特征在于：所述的赋形剂为山梨醇、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘氨酸。
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