WO2014054005A2 - PREPARACIÓN NANOSOMAL DEL COMPLEJO FORMADO POR QUERCETINA (U OTRO FLAVONOL, FLAVONA O UN DERIVADO DE LOS MISMOS) Y LA 2-HYDROXIPROPIL- β-CICLODEXTRINA PARA USO INTRAVENOSO EN PATOLOGÍA CEREBRAL - Google Patents

PREPARACIÓN NANOSOMAL DEL COMPLEJO FORMADO POR QUERCETINA (U OTRO FLAVONOL, FLAVONA O UN DERIVADO DE LOS MISMOS) Y LA 2-HYDROXIPROPIL- β-CICLODEXTRINA PARA USO INTRAVENOSO EN PATOLOGÍA CEREBRAL Download PDF

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Definitions

  • the invention consists in the preparation of nanosomes of lecithin cholesterol, without propylene glycol, of the complex formed by quercetin (or another flavonol or flavone or a derivative thereof) and 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin, by a process that allows its use Intravenous safe and effective in the treatment of brain pathology of the adult and the newborn child.
  • the preparation is safe, stabilizing altered hemodynamic parameters in severe neonatal hypoxia in newborn pigs and is effective in protecting brain function in experimental Parkinson's disease models and in newborn pigs undergoing hypoxia.
  • Cerebrovascular Attack implies focal or massive neuronal death in the brain, constituting one of the main causes of death or disability in Brazil and the world. Since around 8% generate death and the incidence is around 90/100 000, these pathologies represent a great impact on the community due to their high morbidity, the high cost they generate and the impact on the quality of life that provoke [1, 2].
  • hypoxic-ischemic brain damage develops leading to chronic neurological disorders and death, with an incidence of 0.5 to 1 per 1000 live births in developed countries [8]. This situation worsens in developing countries given that there are more pregnancies without adequate control and a greater number of non-institutionalized deliveries.
  • the brain damage can be moderated with a 6% risk of death, and up to 30% of survivors have disabling sequelae. When this damage is severe, mortality rises to 60% and the total survivors persist with sequelae [9].
  • the search for antioxidants is one of the most researched therapeutic approaches for brain damage of hypoxic-ischemic origin.
  • the strategies are related to the synthesis of new compounds or the search and characterization of natural compounds with antioxidant potential.
  • flavonoids such as Quercetlna.
  • Quercetin is a flavonoid widely distributed in nature where it is found in fruits and vegetables and is a potent antioxidant. [16].
  • Quercetlna undergoes an important hepatic metabolization (glucuronization, methylation, etc.) due to which the circulating levels of the free flavonoid are very low.
  • the lipophilic nature of Quercetin hinders its dissolution in water-soluble media for access to the brain, the need for a transporter that protects the molecule from metabolization and facilitates brain access appears as a key requirement to study in vivo The therapeutic effect observed in neurons in culture.
  • Quercetin is not detected in the brain due to low bioavailability.
  • the inventors In order to provide Quercetin with a vehicle that facilitates access to the brain, the inventors first formulated liposomes containing only a mixture of lecithin with Quercetin. Brain protection was then demonstrated experimentally in a model of ischemia in rats, when liposomes were injected intraperitoneally (22).
  • Liposomes have been widely used in the pharmaceutical industry in various clinical applications to transport and deliver a wide range of active ingredients [50, 51].
  • the quercetin preparation must be administered immediately, intravenously.
  • Figure 1 Electrocardiogram recording, oxygen saturation, systemic blood pressure and pulmonary arterial pressure. The latter increases after administration of Uposomas.
  • the formulation of the transporter was modified first with the addition of cholesterol that improved solubility, decreasing the quercetin crystals that could be observed in the phase contrast microscope as seen in the photomicrographs A and B of Figure 2, where the crystals present in A, disappear in B.
  • HPBCD 2 hydroxypropyl ⁇ -cyclodextrin
  • the present innovation differs from these in that in addition to obtaining the quercetin / HPBCD complex, it encapsulates it in a lecithin / cholesterol nanosome.
  • the novelty for the purposes of brain protection is that the complex with HPBCD, achieves a double synergistic neuroprotective action, an aspect demonstrated by us in the protection model in Experimental Parkinson, and not mentioned in the Chinese patent documents indicated above.
  • the present innovation differs from the state of the art in its field, in that it does not use polyethylene glycol (PEG) in its formulation. Quercetin and PEG liposomes have been studied in mice with solid tumors [28,29] and in anxiety in adult rats [1] given orally.
  • PEG polyethylene glycol
  • Figure 3 Measurement of particle size and stability of liposomes with and without PEG by Zeta Sizer describing the zeta potential of the liposomes, their size (bars) and dispersion (polydispersity index: linear curve).
  • liposomal quercetin preparations have already been used for neuronal recovery
  • the present preparation differs from the previous state of the art in the size ( ⁇ 200nm) of the lipid particles, in that it does not include PEG in its formulation , in that the active molecule for the purposes of the objective to be achieved (neuroprotection) is not only quercetin, but the quercetin / HPBCD complex and in which the resulting preparation has adequate hemodynamic tolerance for intravenous administration.
  • the present invention also relates to a method of preparing an injectable formulation for intravenous administration comprising lecithin / cholesterol nanosomes of the complex formed by quercetin or another flavonol or flavone or its alkylated and / or sulforated derivatives with 2-hydroxypropyl- -cyclodextrin, prepared according to the following stages:
  • stage II - Inclusion of the complex obtained in stage I in a lecithin / cholesterol nanosome in a proportion of 5 to 10 respectively, with sonication for a period of 5 min to 2 hours.
  • step II The preparation obtained in step II is mixed with the complex obtained in step I in a flavonoid / cholesterol ratio of 0.5 to 2 times.
  • cholesterol is used in addition to lecithin.
  • Quercetin / HPBCD for the incorporation of Quercetin / HPBCD in the bilayer of phosphatidylcholine and cholesterol, they are mixed in 0.5 to 5ml of 30-95% ethanol solution Quercetin and ⁇ - ⁇ -CD (1-20 to 50 times ratio).
  • This solution is kept in a laminar flow chamber under magnetic stirring for more than 48 hours for the formation of complexes between the components. Subsequently, phosphatidylcholine and cholesterol are added to this mixture and physiological serum is injected at a pH between 6.2 and 7.8. The injection is made between 40 and 80 ° C in a reactor, under magnetic stirring and at a variable flow.
  • Figure 4 photograph taken with an increase of 72000X by electron microscopy.
  • the preparation obtained according to the formulation described previously was evaluated in its hemodynamic tolerance in rats and in newborn pigs.
  • the latter were anesthetized, with electrocardiographic monitoring, and monitoring of systemic blood pressure (SBP), pulmonary arterial pressure (PAP), heart rate (HR), central temperature (CT), and oxygen saturation (Sat0 2 ).
  • SBP systemic blood pressure
  • PAP pulmonary arterial pressure
  • HR heart rate
  • CT central temperature
  • oxygen saturation Sat0 2
  • Nanosomal quercetin / HPBCD preparations were injected into the animal intravenously at Quercetin concentrations of 10mg / kg.
  • hypoxia was caused by decreasing oxygen inspired by 8% endotracheal tube. During hypoxia, the saturation of 02 decreases to levels below 20%.
  • the inspired oxygen fraction (Fi02) is taken at 1 for 30 min, to begin resuscitation and after that time it is maintained for 8 h at appropriate levels (above 90%) by applying an increase in inspired fraction of 0 2 that you are receiving if it falls below the minimum required.
  • Figure 6 Record of systemic blood pressure throughout the hypoxia experiment in a newborn pig, as an example of the variability caused by hypoxia and the stability provided by the nanosomes.
  • Figure 6 shows the monitoring of PAS. It stands out as the PAS remains stable after the injury in the animal that received the preparation, while in the hypoxic the instability subsequent to resuscitation is observed with repeated episodes of hypotension, which were only reversed with the addition of adrenaline.
  • toxin 6- is injected hydroxidepamine (6-OHDA) in Substance Nigra (SN) of male adult rats and an injury similar to that seen in patients with Parkinson's disease occurs.
  • the neurotransmitter dopamine descends in the SN and in the striatum (ES), which is the area of the terminals of the neurons of the SN.
  • Figure 8 Dopamine levels in the striatum of injured rats in the substance nigra with the 6-OHDA toxin in an experimental Parkinson's disease model. The significant decrease is observed after the lesion (white bar) and the statistically significant recovery after intravenous administration of the nanosomal preparation 1 h and 24 h after 6-OHDA (HPBCD). Injected 1 h after the injury, the nanosomes, without quercetin, also manage to recover dopamine, but not at 24 hours. (HPBCD).

Abstract

La invención consiste en la preparación de nanósomas de lecitina colesterol, sin propilenglicol, del complejo formado por quercetina (u otro flavonol o flavona o un derivado de los mismos) y la 2-hydroxipropil-β-ciclodextrina, por un proceso que permite su utilización intravenosa segura y eficaz en el tratamiento de la patología cerebral del adulto y el niño recién nacido. La preparación es segura, estabilizando los parámetros hemodinámicos alterados en la hipoxia severa neonatal en cerdos recién nacidos y es eficaz en proteger la función cerebral en modelos de Enfermedad de Parkinson experimental y en cerdos recién nacidos sometidos a hipoxia.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA de la Solicitud de Patente de Invención para un invento titulado: PREPARACIÓN NANOSOMAL DEL COMPLEJO FORMADO POR QUERCETINA (U OTRO FLAVONOL. FLAVONA O UN DERIVADO DE LOS MISMOS) Y LA 2-HYDROXIPROPIL-B- CICLODEXTRINA PARA USO INTRAVENOSO EN PATOLOGÍA CEREBRAL
RESUMEN
La invención consiste en la preparación de nanósomas de lecitina colesterol, sin propilenglicol, del complejo formado por quercetina (u otro flavonol o flavona o un derivado de los mismos) y la 2-hydroxipropil-3-ciclodextrina, por un proceso que permite su utilización intravenosa segura y eficaz en el tratamiento de la patología cerebral del adulto y el niño recién nacido.
La preparación es segura, estabilizando los parámetros hemodinámicos alterados en la hipoxia severa neonatal en cerdos recién nacidos y es eficaz en proteger la función cerebral en modelos de Enfermedad de Parkinson experimental y en cerdos recién nacidos sometidos a hipoxia.
MEMORIA DESCRIPTIVA
A. ANTECEDENTES QUE JUSTIFICAN LA NECESIDAD DE LA INVENCION a) Importancia de las enfermedades neurológicas en el adulto.
El Ataque Cerebrovascular (ACV) implica muerte neuronal focal o masiva en el cerebro, constituyendo una de las principales causas de muerte o incapacidad en Uruguay y el mundo. Siendo que alrededor del 8% generan muerte y la incidencia está en el entorno de 90/100 000, estas patologías representan un gran impacto en la comunidad por su alta morbilidad, por el alto costo que generan y por la afectación en la calidad de vida que provocan [1 ,2].
Por otro lado, entre el 20 y el 70 % de quienes sobreviven a un ACV persisten con secuelas causantes de diversos grados de discapacidad.
Tomando las cifras de EEUU, cada año hay casi un millón de nuevos ACV, con una alta incidencia de mortalidad (1 cada 17 muertes, 12%), siendo la tercera causa de muerte, sólo detrás de las enfermedades cardiovasculares y el cáncer [2].
Pese a esta situación, se carece de terapias específicas, siendo los activadores del plasminógeno la única alternativa terapéutica aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) de EEUU. b) Importancia y severidad de las enfermedades neurológicas en el recién nacido.
La asfixia del recién nacido es una problemática de gran magnitud, la Organización Mundial de la Salud encontró que el 28% de las muertes neonatales en el mundo son a causa de asfixia y trauma, de un total de cerca de 5 millones de muertes neonatales. En el período 2000-2003, 20% de las muertes neonatales en la Región de las Américas (excluyendo a Canadá y a Estados Unidos) sucedieron por asfixia durante el parto. Ello hace un estimado de 33.000 muertes neonatales por asfixia anualmente en los países de América Latina.
Como consecuencia de la asfixia se desarrolla daño hipóxico-isquémico cerebral que conduce a trastornos neurológicos crónicos y muerte, con una incidencia de 0,5 a 1 por 1000 nacidos vivos en países desarrollados [8]. Esta situación empeora en países en vías de desarrollo dado que hay mayor cantidad de embarazos sin control adecuado y mayor número de partos no institucionalizados. El daño encefálico puede ser moderado con un riesgo de muerte de 6%, y hasta 30% de los sobrevivientes tienen secuelas incapacitantes. Cuando este daño es severo, la mortalidad se eleva hasta 60% y el total de los sobrevivientes persisten con secuelas [9]. c) Ausencia de recursos terapéuticos para la patología cerebral aguda
Las consecuencias devastadoras de la hipoxia-isquemia cerebral adulta y perinatal. parecen hasta el momento actual inevitables debido a la ineficacia de las opciones terapéuticas disponibles.
Se han ensayado diversos tratamientos con potencial neuroprotector. Entre ellos, y dado que la secuencia de eventos tóxicos desencadenados por la isquemia implica la producción de radicales libres y especies reactivas del oxígeno, han sido ensayados sustancias con capacidad antioxidante [13, 14]. La evidencia no justifica hasta el momento la recomendación del uso rutinario de ninguno de estos agentes y la hipotermia es la única medida terapéutica disponible por el momento para la asfixia perinatal.
De la carencia de terapias efectivas para el daño cerebral surge la actual y grave necesidad de caracterizar compuestos con posibilidades de ofrecer protección al tejido cerebral en situaciones de daño hipóxico-isquémico agudo o afecciones neurodegenerativas. d) Búsqueda de nuevos recursos terapéuticos
La búsqueda de antioxidantes es una de las aproximaciones terapéuticas que más se investigan para el daño cerebral de origen hipóxico-isquémico. Las estrategias están relacionadas con la síntesis de nuevos compuestos o la búsqueda y caracterización de compuestos naturales con potencial antioxidante. Entre estos se encuentran flavonoides como Quercetlna.
La Quercetina es un flavonoide ampliamente distribuido en la naturaleza donde se le encuentra en frutas y vegetales y es un potente antioxidante. [16].
Numerosas evidencias en neuronas en cultivo han mostrado la acción protectora de Quercetina frente a diversas agresiones oxidativas [17,18]. Las evidencias in vivo son menos numerosas y se han observado mayoritariamente en experimentos con administración oral, en forma crónica, por más de 7 días (17). Los casos de acción beneficiosa por administración aguda, lo han sido en trauma o isquemia cerebral transitoria y por administración intraperitoneal. Similar número de estudios han mostrado resultados negativos, sobre todo en modelos de Enfermedad de Parklnson experimental [17]. Estos resultados contradictorios se atribuyen a que la quercetina no atraviesa la barrera hematoencefálica y las situaciones experimentales positivas implicaron la ruptura de esta barrera permitiendo el pasaje cerebral. Además, las vías utilizadas experi mentalmente (oral e intraperitoneal) no son adecuadas para situaciones agudas de patología cerebral.
Por otro lado, la Quercetlna sufre una Importante metabolización hepática (glucuronización, metilación, etc.) debido a lo cual los niveles circulantes del flavonoide libre son muy bajos. Si a esto se le agrega que la naturaleza lipofílica de la Quercetina dificulta su disolución en medios hidrosolubles para su acceso al cerebro, la necesidad de un transportador que proteja a la molécula de la metabolización y facilite el acceso cerebral aparece como una exigencia clave para estudiar in vivo el efecto terapéutico observado en neuronas en cultivo.
B. DESCRIPCION DE LA INVENCION a) Antecedentes inmediatos
El conjunto de resultados obtenidos por el grupo innovador en estudios experimentales in vitro confirma el papel antioxidante y neuroprotector de la Quercetina. [20-23].
Sin embargo, en preparaciones acuosas la Quercetina no es detectada en el cerebro debido a una baja biodisponibilidad.
A los efectos de proporcionar a la Quercetina un vehículo que facilitara su acceso al cerebro, los inventores formularon en primera instancia liposomas conteniendo solamente una mezcla de lecitina con Quercetina. Se demostró luego, experimentalmente, la protección cerebral en un modelo de isquemia en ratas, cuando los liposomas eran inyectados por vía intraperitoneal (22).
Los liposomas han sido ampliamente usados en la industria farmacéutica en diversas aplicaciones clínicas para transportar y entregar una amplia gama de principios activos [50, 51].
Debe tenerse en cuenta, que, para su utilización en patologías como el ACV o la asfixia del recién nacido, el preparado de quercetina debe ser administrado en forma inmediata, por la vía intravenosa.
En las investigaciones realizadas por los inventores se pudo demostrar que la preparación de liposomas de lecitina y quercetina que había resultado beneficiosa administrada por vía intraperitoneal en ratas (27), producía efectos adversos importantes cuando se administraba por vía intravenosa en cerdos. Esto se evidencia cuando se analiza el efecto sobre la presión arterial pulmonar en la Figura 1 , donde se observa un aumento durante la administración intravenosa de un preparado de liposomas con quercetina en un cerdo recién nacido en condiciones básales (flecha)
Figure imgf000006_0001
Figura 1: Registro de electrocardiograma, saturación de oxigeno, presión arterial sistémica y presión arterial pulmonar. Esta última aumenta luego de administración de Uposomas.
Ya que no existen formulaciones nanosomales para uso intravenoso se modificó la formulación del transportador en primer lugar con el agregado de colesterol que mejoró la solubilidad, disminuyendo los cristales de quercetina que se podían observar en el microscopio de contraste de fase como se ve en las microfotografías A y B de la Figura 2, donde los cristales presentes en A, desaparecen en B.
Figure imgf000006_0002
b) Ventajas de la invención respecto al estado del arte
Para mejorar la biodisponibilidad se agregó 2 hidroxipropil^-ciclodextrina (HPBCD) al nanósoma. En nuestro caso se utiliza la HPBCD ya que posee mejor solubilidad y no es tóxica en varios modelos animales y en humanos, incluso en niños [32]. Se ha descrito que HPBCD forma complejos con Quercetina lo que resulta en una encapsulación molecular, que incluso se ha postulado para uso cerebral en los documentos de patentes de China CN101301477A y CN101301477B.
La presente innovación se diferencia de éstas en que además de obtener el complejo quercetina/HPBCD, lo encapsula en un nanósoma de lecitina/colesterol. La novedad a los efectos de la protección cerebral, radica en que el complejo con HPBCD, logra una doble acción neuroprotectora sinérgica, aspecto demostrado por nosotros en el modelo de protección en Parkinson Experimental, y no mencionada en los documentos de patentes chinas antes indicados.
La presente innovación se diferencia del estado del arte en su campo, en que no utiliza polientilenglicol (PEG) en su formulación. Liposomas de Quercetina y PEG se han estudiado en ratones con tumores sólidos [28,29] y en ansiedad en ratas adultas [1 ] dados por vía oral.
En la solicitud de patente CN102058536A de Mayo de 2011 se ha utilizado la combinación de fosfolípidos/colesterol con ciclodextrinas (CDs) y PEG con el objeto de obtener una mayor estabilidad y solubilidad de liposomas.
Estudios realizados por los inventores, incluyendo el PEG en los preparados nanosomales demostró una menor estabilidad de los nanósomas en cuanto al tamaño, evaluado mediante el seguimiento de preparados con o sin PEG, determinando el tamaño de partículas y el índice de polidispersidad hasta dos meses luego de su preparación (Figura 3).
Por otro lado se ha demostrado que la utilización en general de gllcoles en la solubilización de medicamentos se asocia a efectos adversos como flebitis, dolor y hemolisis. Particularmente en la edad pediátrica y neonatal (por debajo de los 4 años) y en pacientes con alteraciones de la enzima alcohol deshldrogenasa o con baja filtración glomerular o embarazo o enfermedad hepática, éstos están propensos a la acumulación de los glicoles y por lo tanto en mayor riesgo de toxicidad. En la etapa neonatal, directamente, no existen evaluaciones del riesgo y no es recomendado su uso, por ejemplo por ESNEE (European Study for Neonatal Excipients Exposure). Esto llevó a que no se incluyera el uso de PEG en la formulación que se propone en esta patente, lo que hace una diferencia marcada con las preparaciones nanosomales disponibles y que marca una diferencia en cuanto a la obviedad. CON PEG
Figure imgf000008_0001
(í as)
Figura 3: Medida del tamaño de partícula y estabilidad de liposomas con y sin PEG mediante Zeta Sizer que describe el potencial zeta de los liposomas, su tamaño (barras) y dispersión (índice de polidispersidad: curva lineal).
De estos antecedentes puede concluirse que aunque preparaciones liposomales de quercetina ya han sido utilizadas para la recuperación neuronal, la presente preparación se diferencia del anterior estado del arte en el tamaño (<200nm) de las partículas lipídicas, en que no incluye PEG en su formulación, en que la molécula activa a los efectos del objetivo a alcanzar (neuroprotección) no es sólo quercetina, sino el complejo quercetina/HPBCD y en que la preparación resultante presenta adecuada tolerancia hemodinámica ante su administración intravenosa.
Aunque pueda parecer obvia la inclusión de HPBCD en un liposoma, a partir de los datos disponibles, debe tenerse en cuenta que los inventores obtuvieron evidencias experimentales que la HPBCD es necesaria para la seguridad de la aplicación intravenosa del preparado (figura 4, abajo). La presente invención se refiere también a un método de preparación de una formulación inyectable para administración por vía intravenosa que comprende nanósomas de lecitina/colesterol del complejo formado por quercetina u otro flavonol o flavona o sus derivados alquilados y/o sulforados con 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, preparada según las siguientes etapas:
I - Obtención del complejo mezclando 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina y quercetina u otro flavonol o flavona en una proporción de quercetina u otro flavonol o flavona a 2-hidroxipropil- β-ciclodextrina de 1 :20 a 1 :50 veces, por un período de tiempo de 12 a 90 horas, en un medio conteniendo etanol, con agitación continua en condiciones estériles.
II.- Inclusión del complejo obtenido en la etapa I en un nanósoma de lecitina/colesterol en una proporción de 5 a 10 respectivamente, con sonicación durante un período de 5 min a 2 horas.
III - La preparación obtenida en el paso II se mezcla con el complejo obtenido en el paso I en una relación de flavonoide/colesterol de 0.5 a 2 veces.
IV.- La formulación obtenida en III se inyecta en una solución fisiológica a una temperatura de entre 60 y 100 grados celsius con una velocidad de 5 a 30 ml/h para que resulte en la formación de nanósomas. c. Ejemplo de realización de la invención
Para la preparación de la cubierta lipídica de los nanósomas se utiliza colesterol además de lecitina.
Para la incorporación de Quercetina/HPBCD en la bicapa de fosfatidilcolina y colesterol se mezclan en 0,5 a 5ml de solución de etanol al 30-95 % Quercetina y ΗΡ-β-CD (relación 1 -20 a 50 veces).
Esta solución se mantiene en cámara de flujo laminar bajo agitación magnética durante más de 48 h para la formación de complejos entre los componentes. Posteriormente se agrega a esta mezcla fosfatidilcolina y colesterol y se inyecta suero fisiológico, a pH entre 6,2 y 7,8. La inyección se realiza entre 40 y 80°C en un reactor, bajo agitación magnética y a un flujo variable.
Durante todo el procedimiento se garantiza el trabajo bajo condiciones de técnica aséptica lo cual permite contar con un preparado que puede ser utilizado en forma intravenosa.
En la siguiente fotografía se observa una imagen de microscopía electrónica de los nanósomas
Figure imgf000010_0001
Figura 4: fotografía tomada con un aumento de 72000X por microscopía electrónica.
C. ENSAYOS
Para evaluar la seguridad y efectividad de la preparación nanosomal se realizaron los siguientes ensayos.
a.- Seguridad: Tolerancia y seguridad hemodinámica en ratas y cerdos recién nacidos
La preparación obtenida de acuerdo a la formulación descrita previamente fue evaluada en su tolerancia hemodinámica en ratas y en cerdos recién nacidos. Estos últimos estaban anestesiados, con monitorización electrocardiográfica, y monitorización de presión arterial sistémica (PAS), presión arterial pulmonar (PAP), frecuencia cardíaca (FC), temperatura central (TC), y saturación de oxígeno (Sat02). Se evaluó también el estado acido-base, ionograma, hemoglobina, hematocrito, pH y gases en sangre.
Las preparaciones nanosomales de quercetina/HPBCD se inyectaron al animal en forma Intravenosa a concentraciones de Quercetina de 10mg/kg.
Como se muestra en la figura 5, no fueron observados cambios en FC, Sat02, PAS y PAP luego de la administración de los nanósomas, lo cual demuestra su seguridad hemodinámica como base para la administración del preparado por vía sistémica.
Figure imgf000011_0001
Figura 5: Registros fisiológicos antes y después de la administración de los nanósomas
Administrada en ratas en forma intravenosa, por la vena femoral, en flujo continuo de 30 minutos en la misma concentración de Quercetina de 10 mg/kg, la preparación nanosomal de Quercetina/HPBCD no mostró alteraciones clínicas. b.- Efectividad neuroprotectora I: Estabilización de parámetros hemodinámicos alterados por la hipoxia severa en cerdos recién nacidos
Saturación de 02 y fracción inspirada de oxígeno
En cerdos recién nacidos, anestesiados y monitorizados como se describe en el parágrafo anterior, se provocó una hipoxia disminuyendo el oxigeno inspirado por sonda endotraqueal al 8%. Durante la hipoxia, la saturación de 02 disminuye hasta niveles por debajo de 20%.
Luego de terminada la hipoxia la fracción inspirada de oxígeno (Fi02) se lleva a 1 durante 30 min, para comenzar la reanimación y luego de ese tiempo se mantiene por 8 h en niveles adecuados (por encima de 90%) aplicando un aumento en la fracción inspirada de 02 que está recibiendo si desciende por debajo de lo mínimo requerido.
Para llegar a saturaciones de oxígeno adecuadas los animales que habían sido sometidos a hipoxia, requirieron más oxígeno (FI02 0,34±0,25), mientras que los que recibieron la preparación nanosomal e hipoxia requirieron una FI02 de 0,22 ±0,04 significativamente menor tal como se demuestra en la Tabla 1 , que muestra un análisis de Chi cuadrado de la proporción de animales que requirieron sólo aire y de aquellos que necesitaron oxígeno.
Figure imgf000012_0001
Tabla 1: Distribución de la proporción de animales que requirieron aire u oxigeno para mantener una saturación >90%. *= p>0.05 (Chi cuadrado/Fischer).
Esto indica un menor requerimiento de oxigeno en el grupo de animales tratados con la preparación nanosomal para mantener un intercambio adecuado y poder entregar a los diferentes órganos el aporte de oxígeno apropiado. En particular este hecho indica un mejor estado fisiológico, con una protección de la lesión pulmonar que induce el evento hipóxico y la posterior re oxigenación.
Presión arterial sistémica
Se observa una caída progresiva de la presión arterial sistémica a lo largo del experimento, que muchas veces no logra mantener los niveles requeridos para la vida. Varios animales, luego de finalizada la hipoxia, mostraron una tendencia a la hipotensión, haciendo necesario el agregado de inotrópicos para mantener la estabilidad. En nuestro caso se utilizó adrenalina en infusión continua según el requerimiento de cada animal.
Esta respuesta hemodinámica. es más estable en los animales que recibieron el preparado en la dosis Quercetina de 1Qmg/kg. ya que mantuvieron la presión arterial sistémica más próxima a los controles y en niveles adecuados sin la necesidad del agregado de inotrópicos. Adrenalina No Adrenalina
Control 0 1 í ipoxw 0.38 0.62
Hipoxia + nniwsomai 0 1*
Tabla II: proporción de animales que requirieron de la adición de adrenalina para mantener estable la presión arterial sistémica ( * = p<0.05, Chi cuadrado/Fischer).
Figure imgf000013_0001
Figura 6: registro de presión arterial sistémica a lo largo del experimento de hipoxia en un cerdo recién nacido, como ejemplo de la variabilidad provocada por la hipoxia y la estabilidad proporcionada por los nanósomas.
En la figura 6 se observa la monitorización de PAS. Se destaca como la PAS se mantiene estable luego de la injuria en el animal que recibió el preparado, mientras que en el hipóxico se observa la inestabilidad subsecuente a la reanimación con reiterados episodios de hipotensión, que sólo fueron revertidos con el agregado de adrenalina.
Equilibrio ácido-base y metabolismo
Con respecto al equilibrio ácido-base, ionograma y metabolismo glucémico no se detectaron diferencias significativas entre el grupo hipoxia y el grupo que además recibió Quercetina en monodosis de 10mg/kg. c. Efectividad neuroprotectora II: mejoría del la actividad eléctrica cerebral por el tratamiento con nanosomes en cerdos recién nacidos sometidos a hipoxia.
En cerdos recién nacidos sometidos a una hipoxia severa por restricción de la fracción de oxígeno recibida, en el mismo modelo que el ejemplo previo, se registró la actividad eléctrica cerebral con un monitor de amplitud de frecuencia (CFM). Durante la situación experimental (hipoxia), se mantuvo la amplitud de actividad cerebral por debajo de un valor de 7μν por un tiempo mínimo de 17 min. Al transcurrir la hipoxia, la amplitud descendió notoriamente en todos los animales y se mantuvo descendida luego de la reanimación con 100% de oxígeno al momento del colapso periférico (descenso de marcadores hemodinámicos como presión arterial y frecuencia cardíaca). En los animales que recibieron el tratamiento con los nanósomas de quercetina/HPBCD con 10 mg/kg de quercetina se produjo una recuperación significativa de la actividad eléctrica cerebral que se mantuvo hasta 8 horas posteriores al fin de la hipoxia (Figura
Figure imgf000014_0001
Figura 7: Valores del límite superior de la amplitud de la actividad eléctrica en el electroencefalograma. Se muestran los valores básales, post reanimación y al final de 8 horas post hipoxia (* = p< 0.05 ) , d. Efectividad neuroprotectora III
En el modelo de hipoxia severa en cerdos recién nacidos ya mencionado en los parágrafos anteriores, luego del período experimental de 8 horas, los animales se mantuvieron en cuidados intensivos por 72 horas, asegurando su supervivencia. A las 72 horas persistía la mejoría electroencefalográfica observada al fin del experimento hipóxico en los animales tratados con los nanósomas de quercetina/HPCBD. Estos animales, además podían succionar el biberón y alimentarse (80%) mientras que sólo un 20% de los animales sometidos a hipoxia y sin tratamiento, podían hacerlo. Estos últimos requerían de una asistencia mayor en provisión de oxígeno e inotrópicos y no caminaban. Los animales tratados eran capaces de caminar, aunque con algunas dificultades. e. Efectividad neuroprotectora IV: Recuperación de los niveles de dopamina en el estriado de ratas en un modelo de Enfermedad de Parkinson experimental. modelo de Enfermedad de Parkinson experimental, se inyecta la toxina 6- hidroxidopamina (6-OHDA) en la Substancia Nigra (SN) de ratas adultas machos y se produce una lesión similar a la que se observa en pacientes con enfermedad de Parkinson. El neurotransmisor dopamina desciende en la SN y en el estriado (ES), que es la zona de las terminales de las neuronas de la SN. La administración de la preparación de nanósomas de quercetina/HPBCD en dosis de 10 mg de quercetina 1 hora y 24 horas después de la lesión por 6-OHDA , recupera significativamente los niveles de dopamina en el ES, un índice generalmente aceptado de recuperación neurológica funcional en el modelo (Figura 5).
Figure imgf000015_0001
Figura 8: Niveles de dopamina en el estriado de ratas lesionadas en la substancia nigra con la toxina 6- OHDA en un modelo de Enfermedad de Parkinson experimental. Se observa la disminución significativa luego de la lesión (barra blanca) y la recuperación estadísticamente significativa luego de administración Intravenosa de la preparación nanosomal 1h y 24 h luego de la 6-OHDA (HPBCD). Inyectados 1 h luego de la lesión, los nanósomas, sin quercetina, también logran recuperar la dopamina, no así a las 24 hs. (HPBCD).
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Claims

Reivindicaciones ] Una formulación inyectable para administración por vía intravenosa que comprende nanósomas de lecitina/colesterol conteniendo el complejo formado por flavonol o flavona y sus derivados alquilados y/o sulforados con 2-hidroxipropil-ciclodextnna, dispersos en - solución fisiológica, caracterizada porque la proporción de colesterol a lecitina es de 1 :5 a 1 :10; la proporción de flavonol o flavona y sus derivados alquilados y/o sulforados a 2- hidroxipropil-p-ciclodextrina es de 1 :20 a 1 :50; y la proporción del flavonol o flavona y sus derivados alquilados y/o sulforados a colesterol/lecitina es de 0.5:1 a 1 :10. ] Una formulación inyectable de acuerdo a la reivindicación 1 donde el flavonol o flavona y sus derivados alquilados y/o sulforados es quercetina, caracterizada porque la proporción de colesterol a lecitina es de 1 :5 a 1 :10; la proporción de quercetina a 2-hidroxipropil- - ciclodextrina es de 1 :20 a 1 :50; y la proporción de quercetina a colesterol/lecitina es de 0.5:1 a 1 :2, dispersos en solución fisiológica. ] Una formulación inyectable para administración por vía intravenosa que comprende nanósomas de lecitina/colesterol del complejo formado por quercetina u otro flavonol o flavona o sus derivados alquilados y/o sulforados con 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, caracterizada porque se prepara según las siguientes etapas:
I - Obtención del complejo mezclando 2-hidroxipropil-3-ciclodextrina y quercetina u otro flavonol o flavona en una proporción de quercetina u otro flavonol o flavona a 2-hidroxipropil- β-ciclodextrina de 1 :20 a 1 :50 veces por un período de tiempo de 12 a 90 horas, en un medio conteniendo etanol, con agitación continua en condiciones estériles.
II.- Inclusión del complejo obtenido en la etapa I en un nanósoma de lecitina/colesterol en una proporción de 5 a 10 respectivamente, con sonicación durante un período de 5 min a 2 horas.
III - La preparación obtenida en el paso II se mezcla con el complejo obtenido en el paso I en una relación de flavonoide/colesterol de 0.5 a 2 veces.
IV.- La formulación obtenida en III se inyecta en una solución fisiológica a una temperatura de entre 60 y 100 grados celsius con una velocidad de 5 a 30 ml/h para que resulte en la formación de nanósomas. ] Una formulación inyectable según la reivindicación 3 en la cual el flavonol utilizado en las etapas I a III es quercetina ] El uso de los nanósomas conteniendo el complejo formado por quercetina u otro flavonol o flavona y sus derivados alquilados y/o sulforados, con 2-hidroxipropil^-ciclodextrina, obtenidos a través de los diferentes pasos de la reivindicación 3, para preparar un medicamento que actúa como un agente neuroprotector para el tratamiento de los episodios agudos de ataque cerebrovascular en el adulto y los cuadros de asfixia perinatal en niños. ] El uso de los nanósomas conteniendo el complejo formado por quercetina u otro flavonol o flavona y sus derivados alquilados y/o sulforados con 2-hidroxipropil-ciclodextrina, obtenidos a través de los diferentes pasos de la reivindicación 3, para preparar un medicamento que actúa como un agente neuroprotector en los procesos neurodegenerativos cerebrales. ] El uso de los nanósomas conteniendo el complejo formado por quercetina u otro flavonol o flavona y sus derivados alquilados y/o sulforados con 2-hidroxipropil-ciclodextrina, obtenidos a través de los diferentes pasos de la reivindicación 3, para preparar un medicamento que actúa como un agente neuroprotector para la patología craneoencefálica traumática. ] Un procedimiento por el cual los nanósomas obtenidos a través de los diferentes pasos de la reivindicación 3 son utilizados en las reivindicaciones 5, 6 y 7, mediante administración por vía intravenosa.
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