CN109718208B - 多糖修饰的纳米硒复合物在恶性腹水治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多糖修饰的纳米硒复合物在制备治疗恶性腹水(MA)药物中的应用。本发明中所述的纳米硒复合物可以显著降低恶性腹水小鼠的腹水量，有效改善小鼠机体的活动状态，延长模型小鼠生存期，对恶性腹水具有很好的治疗效果。本发明所得的多糖修饰的纳米硒复合物原料廉价易得，合成方法简便易操作，治疗效果显著，适合大规模扩大合成，直至商业化。

Description

多糖修饰的纳米硒复合物在恶性腹水治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体而言，涉及多糖纳米硒复合物在制备治疗恶性腹水药物中的应用。

背景技术

恶性腹水是由各种恶性肿瘤(卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌等)引起的，导致液体在腹腔内积聚，致使腹腔内液体异常增多的现象，临床表现为腹部增大，食欲不振、活动受限、腹部不适和呼吸窘迫等。当恶性腹水发生时，多出现食欲不振、恶心、呕吐、呼吸困难、明显腹胀、下肢浮肿等症状，更严重时将会出现腹部质地坚硬，凹凸不平，腹压明显增大，呼吸严重困难，丧失劳动力，生活质量明显下降，最后导致死亡。恶性腹水的特征是恶性肿瘤所致的腹腔壁层腹膜发生弥漫性病变，导致腹壁膜上毛细血管通透性增大，进一步使血管内各种蛋白、细胞、细胞因子外漏到腹腔，形成腹腔积液，引起腹部增大、不适等问题。

由肿瘤导致的恶性腹水是高发性疾病，由于恶性腹水是很多癌症的并发症，且发展速度极快，预后较差，因此一旦发生恶性腹水的症状，则难以治愈，极大的影响生活质量，会对人类健康造成的很大的危害。恶性腹水的治疗目前并没有特效药物。临床上主要采用利尿、腹腔穿刺及置管引流、腹腔内化疗、免疫疗法、热疗等措施进行治疗，常用的药物包括顺铂、卡铂、洛铂、阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、阿霉素等，都有一定的副作用且只能缓解腹水带来的不适，不能从根本上进行治疗。利尿剂对恶性腹水一般疗效差，文献报道的有效率仅约44％(49/112)，目前尚无可靠方法能预测哪些患者将从利尿疗法中获益。腹腔穿刺及置管引流用于治疗恶性腹水已有很多年的历史，对各项临床研究的结果汇总发现，腹腔穿刺引流虽然可迅速缓解患者腹胀、腹痛及呼吸困难等症状，但不久后腹水又会回升，达到之前的水平，需要再一次的穿刺引流，给患者带来极大的痛苦。恶性腹水疾病病程快、病死率高、临床治疗措施匮乏，因此在深入了解其发病机制的基础上开发新型的治疗恶性腹水的药物迫在眉睫。

炎症因子在恶性腹水发生过程中具有重要作用。腹腔内炎症严重时，腹腔内产液增多，吸收减少，进而形成炎性腹腔内积液。目前研究表明恶性腹水构成因素还与炎症因子密切相关，如白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素-α(IFN-α)等在恶性腹水的形成中起重要作用^[1]。IL-6可通过体液免疫、细胞免疫功能介导全身炎症反应，有研究显示^[2-3]癌性腹水患者中IL-6水平明显升高，且与腹腔化疗疗效有密切关系^[4]。单纯化疗药治疗虽可暂时控制腹水形成，停药后会反复发作，具有顽固、量大、反复出现的特点。以上研究也表明，单纯的杀灭肿瘤细胞并不能从根本上缓解恶性腹水。

长期以来，硒作为一种参与生命活动的重要营养元素被人们所重视，目前对硒的研究有很多，其具有多种药理活性：诱导氧化致凋亡、调节机体免疫功能、调控癌基因与抗癌基因的表达、阻断癌细胞分裂增殖的信息传递、通过氧化胁迫破坏癌细胞线粒体的功能、阻断癌细胞的能量供应、抑制肿瘤新生血管的生成等。与其他形式的硒相比，纳米硒颗粒具有更好的药理活性，且毒性较小。此外纳米硒颗粒可以利用多糖，蛋白质等进行多种功能化的修饰，增强其稳定性格并且提高其药理活性。到目前为止，多糖修饰的纳米硒复合物在恶性腹水中的应用尚无明确报道。

上述背景中涉及的参考文献：

[1].黄宁.炎症因子与肿瘤[J]中国民族民间医药，2010,19(9):87-89

[2].Reinartz S,Schumann T,Finkernagel F,et al.Mixed-polarizationphenotype of ascites-associated macrophages in human ovarian carcinoma:correlation of CD163expression,cytokine levels and early relapse.Int JCancer.2014；134(1):32-42

[3].Pourgholami MH,Ataie-Kachoie P,Badar S,Morris DL.Minocyclineinhibits malignant ascites of ovarian cancer through targeting multiplesignaling pathways.GynecolOncol.2013；129(1):113-9

[4].金涌，朱金水，陈玮，等.消化道恶性肿瘤伴癌性腹水患者腹腔化疗前后血清及腹水IL-6和sIL-6R水平变化的意义[J]放射免疫学杂志，2006,19(2):90-91

发明内容

本发明的目的在于提供多糖修饰的纳米硒复合物在制备治疗恶性腹水的药物中的应用。

多糖修饰的纳米硒复合物由纳米硒和药学上允许的功能化多糖组成；所述功能化多糖包括但不限于葡聚糖、壳聚糖、真菌多糖(香菇多糖、香菇菌多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、枸杞多糖、银耳多糖、木耳多糖)、植物多糖(枸杞多糖、银杏多糖、茶多糖、魔芋多糖)等天然或合成多糖的一种或多种。多糖修饰可以增强纳米硒的稳定性和活性，通过物理吸附作用使得纳米硒颗粒得以良好分散，增强纳米硒在降低炎症因子表达方面的功效。

所述恶性腹水包括但不限于肝硬化、肝癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等所引起的腹水。所述治疗恶性腹水的药物包括多糖修饰的纳米硒复合物及其药学上可接受的辅料。所述治疗恶性腹水的药物在给药治疗中，多糖修饰的纳米硒复合物的有效给药量为每天(9±4)mg/kg。

所述的多糖修饰的纳米硒通过以下方法制得：

1>将样品多糖溶解在去离子水中，加热以破坏分子内和分子间氢键，获得单链多糖；

2>在25℃下将制备的单链多糖水溶液与亚硒酸钠混合，并搅拌均匀。向混合物中滴加抗坏血酸水溶液和丁二酸酐，室温下搅拌24小时。

3>用超纯水透析2天即可得到产物。

本发明提供的治疗恶性腹水药物的优势在于：多糖修饰的纳米硒复合物可降低恶性腹水的腹水量、改善机体状态，延长生存期，对恶性腹水具有很好的治疗效果。

附图说明

图1是多糖修饰的纳米硒复合物的粒度表征图。

图2是多糖修饰的纳米硒复合物的EDX元素分析图。

图3是多糖修饰的纳米硒复合物的TEM图及单个粒子的高分辨率透射电镜(HRTEM)图。

图4是多糖修饰的纳米硒复合物的FT-IR图。

图5是正常小鼠腹部和建模第六天小鼠腹部图。

图6是各组小鼠解剖之前腹部图。

图7和图8分别是小鼠的腹水体积颜色对比图。

图9-11是不同多糖修饰纳米硒颗粒对小鼠腹水中炎症因子表达影响的情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1多糖修饰的纳米硒复合物的制备及表征：

本实施例中使用氧化还原法来合成多糖修饰的纳米硒复合物，先用维生素C的还原性还原H₂SeO₃溶液或Na₂SeO₃溶液，再用葡聚糖、香菇多糖、壳聚糖进行修饰，即得。葡聚糖由上海国药试剂集团提供，批号：20170321；壳聚糖由上海国药试剂集团提供，批号：20160525；香菇多糖由北京索莱宝生物科技有限公司提供，批号：20150813。

本发明制备的具有抗恶性腹水活性的葡聚糖、香菇多糖、壳聚糖功能化纳米硒复合物是通过以下方法制备的(以葡聚糖为例)：

首先，向葡聚糖(50-150mg)中加入去离子水中，140℃加热，得到单链的多糖。

常温下，在单链的多糖溶液(2mg/ml)中滴加二氧化硒溶液或亚硒酸钠(0.1M)溶液，变加边搅拌，再加入维生素C溶液(0.2M)，继续搅拌。

搅拌均匀后，在上述得到的溶液中滴加丁二酸酐，边滴加边混匀，将混合物反应24小时。

最后，将上述得到的混合物用去离子水进行透析2天，即可得到葡聚糖修饰的纳米硒复合物。

对获得的多糖修饰纳米硒复合物进行表征，图1显示产物平均粒径在53.8nm，EDX元素分析(图2)表明产物中含硒量64.3％，形貌显示(图3)纳米硒分散性好，产物为球形纳米硒，FT-IR(图4)显示修饰多糖与纳米硒之间通过物理吸附相互作用，达到修饰效果。

实施例2小鼠恶性腹水模型的建立和多糖修饰的纳米硒复合物药效学检测实验方法及步骤：

1.本发明使用动物为昆明小鼠(雌性)：由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心和北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

2.小鼠恶性腹水模型的建立及给药治疗

2.1小鼠恶性腹水模型的建立将50只小鼠随机分为5组，正常组、对照组(恶性腹水模型组)、多糖修饰的纳米硒复合物组(多糖修饰的纳米硒复合物组包括以下三组：葡聚糖修饰的纳米硒复合物组、壳聚糖修饰的纳米硒复合物组、香菇多糖修饰的纳米硒复合物组，建模后分别给药葡聚糖修饰的纳米硒复合物、壳聚糖修饰的纳米硒复合物、香菇多糖修饰的纳米硒复合物)，每组10只。正常组每只一次性腹腔注射0.1mL的0.9％生理盐水；对照组以及多糖修饰的纳米硒复合物组每只一次性腹腔注射0.1mL的EAC细胞(细胞数量为1×10⁶个)。六天后比较对照组和正常组，判断建模效果。

2.2恶性腹水小鼠的给药治疗

在建模后第四天，给予小鼠药物治疗(9mg/kg)，正常组以及对照组每次每只腹腔注射0.1mL的0.9％的生理盐水，多糖修饰的纳米硒复合物组每次每只腹腔注射多糖修饰的纳米硒复合物(浓度为1mg/mL),给药剂9mg/kg。每天一次。

3.实验结果及评价：

1)模型建立结果

如附图5所示，图5是正常小鼠腹部和恶性腹水建模第六天小鼠腹部图片。从图5中可以看出，建模六天后小鼠腹部比正常组大且毛发蓬松，杂乱，没有光泽；精神萎靡，运动减少，身体蜷缩。这些特征表明已建模成功。

2)多糖修饰的纳米硒复合物药效学检测

给药后第14天后对小鼠进行解剖，检测多糖纳米硒对恶性腹水的药效。此时模型组小鼠腹部明显比正常组有较大隆起，毛发完全杂乱，没有光泽，精神极度萎靡，活动受限；给药多糖修饰的纳米硒复合物组小鼠几乎和正常小鼠相当，腹部几乎没有隆起，精神状态良好。如图6所示，图6是各组小鼠给药第14天解剖之前腹部图片。对照组小鼠腹部明显比正常组和给药组小鼠大，而给药组小鼠腹部几乎和正常组相当，说明多糖修饰的纳米硒复合物能很大程度上抑制腹水产生。图7-8为小鼠腹水体积与颜色对比图，由图可以看出，与对照组相比，给药组腹水很少，平均为1.5mL；对照组腹水体积较多，平均22.5mL/只，腹水颜色较给药组深，呈现血红色，说明对照毛细血管通透性比给药组大，血液渗出到腹腔。在解剖时先将小鼠颈椎脱臼处死，之后再用注射器从腹部抽取腹水放到50mL离心管中，测量体积。图9-11为小鼠腹水中炎症因子检测结果，从结果中可以看出，给药后腹水中炎症因子明显比对照组低，说明药物可以显著降低炎症因子的表达。以上实验结果表明多糖修饰的纳米硒复合物药后小鼠腹水得到了明显的缓解，且毛细血管通透性增大现象有明显改善。通过观察实验过程中小鼠的状态，发现对照组小鼠毛发杂乱、没有光泽、精神萎靡、运动减少、身体蜷缩，给药组的小鼠活动状态较好，以上症状得到了明显的改善。此外，对照组小鼠平均存活时间为22天，给药组小鼠存活时间基本同正常组相当，可长时间存活，能明显延长小鼠的生存期。

以上实施例表明：多糖修饰的纳米硒复合物可以降低恶性腹水的腹水量、改善机体状态，延长生存期，对恶性腹水具有很好的治疗效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.多糖修饰的纳米硒复合物在制备恶性腹水治疗药物中的应用；

所述的多糖修饰的纳米硒通过以下方法制得：

1>将样品多糖溶解在去离子水中，加热以破坏分子内和分子间氢键，获得单链多糖；

2>在25℃下将制备的单链多糖水溶液与亚硒酸钠混合，并搅拌均匀；向混合物中滴加抗坏血酸水溶液和丁二酸酐，室温下搅拌24小时；

3>用超纯水透析2天即可得到产物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述多糖修饰的纳米硒复合物中，多糖为药学上允许的功能化多糖，包括葡聚糖、壳聚糖、真菌多糖、植物多糖中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于: 所述真菌多糖包括香菇多糖、香菇菌多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、银耳多糖、木耳多糖，所述植物多糖包括枸杞多糖、银杏多糖、茶多糖、魔芋多糖。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多糖修饰的纳米硒复合物中多糖与纳米硒通过物理吸附相互作用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多糖修饰的纳米硒复合物通过降低炎症因子的表达发挥作用，所述炎症因子包括IFN gamma、VEGFA、IL-1a、IL-1b、IL-6、MCP-1、MCP-2、TNF-α。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多糖修饰的纳米硒复合物在降低恶性腹水的腹水量、改善机体状态、延长生存期方面显示应用效果。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述恶性腹水包括肝硬化、肝癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌所引起的腹水。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述恶性腹水治疗药物包括多糖修饰的纳米硒复合物及其药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述恶性腹水治疗药物的给药量为，以多糖修饰的纳米硒复合物计，每天（9±4）mg/kg。

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