CN102046658B - 白介素-4受体α(IL-4Rα)-173的结合成员 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白介素-4受体α(IL-4R)的结合成员，特别是抗体分子，及其在例如治疗或预防IL-4R、IL-4和/或IL-13有关病症，例如哮喘和COPD中的治疗应用。

Description

白介素-4受体α(IL-4Rα)-173的结合成员
本发明涉及白介素-4受体α(IL-4Rα，亦称CD124)的结合成员，特别是抗体分子，及其在例如治疗或预防IL-4Rα、IL-4和/或IL-13有关病症，例如哮喘和COPD——中的治疗应用。
人IL-4Rα亚单位(Swiss Prot登录号P24394)是一个以高亲和力结合人IL-4的140kDa I型膜蛋白质(Andrews等，J.Biol.Chem(2002)277：46073-46078)。IL-4/IL-4Rα复合体可以经由IL-4上的结构域与共同γ链(γc，CD132)或IL-13Rα1(IL-13Rα1)亚单位发生二聚作用，形成两个不同的信号转导复合物，通常分别称作I型和II型受体。或者，IL-13可以结合IL-13Rα1形成IL-13/IL-13Rα1复合物，这种复合物募集IL-4Rα亚单位形成II型受体复合物。因而，IL-4Rα介导IL-4和IL-13的生物活性(有关综述见Gessner等，Immunobiology，201：285，2000)。体外研究表明，IL-4和IL-13激活众多细胞类型中的效应功能，例如T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、气道平滑肌细胞、呼吸道上皮细胞、肺成纤维细胞和内皮细胞(有关综述参见Steinke等，Resp Res，2：66，2001，和Willis-Karp，Immunol Rev，202：175，2004)。
IL-4Rα在许多种细胞类型上的表达数量不高(100-5000分子/细胞)(Lowenthal等，J Immunol，140：456，1988)，例如外周血T细胞、单核细胞、气道上皮细胞、B细胞和肺成纤维细胞。造血细胞中I型受体占优势，而II型受体在造血细胞和非造血细胞上都有表达。
IL-4Rα在人群中的多态性已有人做过描述(有关综述参见Gessner等，Immunobiology，201：285，2000)，据报道，在部分人群中与IgE水平或临床特应性有关。例如，V75R576 IL-4Rα与变应性哮喘以及IL-4Rα功能增强有关(Risma等，J.Immunol.169(3)：1604-1610，2002)。
许多证据表明，IL-4/IL-13途径在哮喘病理学(有关综述参见Chatila，Trends in Molecular Med，10：493，2004)以及大量罗列于本文它处的其它病症中起着重要作用。据信，IL-4和IL-13分泌的增加引发并维持这种疾病过程。IL-13被认为是触发气道高反应性(AHR)、粘液分泌过多以及气道重塑的支配性配偶体(partner)，而IL-4提示是Th2极化和IgE产生的主要诱发因素(Wynn，AnnuRev Immunol，21：425，2003)。
疾病动物模型的证据进一步支持IL-4Rα在哮喘中的作用。在用卵清蛋白(OVA，一种模型变应原)进行变应原刺激的过程中给予功能性鼠IL-4R拮抗剂(IL-4突变体；C118缺失)抑制了原先用OVA敏化的小鼠中过敏性气道嗜曙红细胞增多以及AHR的发生(Tomkinson等，J.Immunol.166(9)：5792-5800，2001)。此外，多项体内研究证实了在哮喘动物模型中阻断IL-13或IL-14的正面作用。例如，在OVA-诱导持续性气道炎症的慢性模型中，治疗性给予抗-IL-13单克隆抗体抑制了AHR、中止了上皮下纤维化和炎症的进展、并将粘液分泌过多恢复到了基础水平(Yang等，J.Pharmacol.Exp.Ther.313(1)：8-15，2005)。在小鼠OVA模型中，但在免疫期间给予时，用抗-IL-4抗体抑制-IL-4显示出使嗜酸性粒细胞浸润的显著降低(Coyle等，Am J Resp Cell Mol Biol，13：54，1995)。在类似模型中，OVA刺激后，IL-4-缺陷型小鼠在支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞明显较少，支气管周围炎症少得多(Brusselle等，Clin Exp Allergy，24：73，1994)。
对于人，IIa期研究显示，IL-4Rα拮抗剂(所谓IL-4突变蛋白)降低变应原诱导的延迟哮喘反应并减弱哮喘患者肺的静息期炎症状态(Wenzel等，Lancet，370：1422，2007)。这些人数据进一步强化了IL-4Rα拮抗剂在哮喘方面具有临床实用性的主张。
除了其在哮喘中的作用，IL-4Rα与许多其它病理学情形有关，例如：
慢性阻塞性肺疾患(COPD)包括患各种程度的慢性支气管炎、小气道疾病和肺气肿的患者群，以对目前哮喘的疗法反应差的渐进性不可逆转肺功能减退为特征。对COPD的根本原因仍知之不详。一种“荷兰假说”认为，对COPD和哮喘存在着共同的易感性，因此，类似的机理可造成这两种病症发病(Sluiter等，Eur Respir J，4(4)：p.479-89，1991)。Zheng等人(J Clin Invest，106(9)：1081-93，2000)证实，IL-13在小鼠肺中的过度表达引起肺气肿、提高粘膜产量及炎症，反映了人COPD的诸多方面。此外，作为过敏性炎症的小鼠模型中的IL-13依赖性应答，AHR显示可预测吸烟者的肺功能减退(Tashkin等，Am J Respir CritCare Med，153(6Pt 1)：1802-11，1996)。另外还确立了IL-13启动子多态性与产生COPD易感性之间的关联(Van Der Pouw Kraan等人，Genes Immun，3(7)：436-9，2002)。因此，征兆是IL-4/IL-13途径，尤其是IL-13，在COPD的发病机理中起着重要作用。
IL-13在炎性肠病的发病机理可能有作用。Heller等人(Heller等，Immunity，17(5)：629-38，2002)报道，给予可溶性IL-13Rα2中和IL-13改善了人溃疡性结肠炎的鼠模型中的结肠炎症。相应地，与对照相比，溃疡性结肠炎患者的直肠活检试样中IL-13的表达较高(Inoue等，Am J Gastroenterol，94(9)：2441-6，1999)。
除哮喘外，IL-4/IL-13途径还与其它纤维化病症相关，像全身性硬皮病(Hasegawa等，J Rheumatol，24(2)：328-32，1997)、肺纤维化(Hancock等，Am JRespir Cell Mol Biol，18(1)：60-5，1998)、寄生虫诱导的肝纤维化(Fallon等，JImmunol，164(5)：2585-91，2000；Chiaramonte等，J Clin Invest，104(6)：777-85，1999；Chiaramonte，Hepatology 34(2)：273-82，2001)、以及膀胱纤维化(Hauber等，J.Cyst Fibr，2：189，2003)。
IL-4，在一定程度上还有IL-13，对于B细胞介导的活性是决定性的，比如B细胞增生、免疫球蛋白分泌、以及FcεR的表达。IL-4Rα抑制剂的临床应用包括例如在变态反应治疗中用于遏制IgE合成(例如包括特应性皮炎和食物变态反应)、在移植治疗中用于预防移植排异、以及遏制延迟型过敏性或接触过敏性反应。
IL-4R拮抗剂还可用作变态反应免疫疗法的佐剂以及用作疫苗佐剂。
针对IL-4Rα的抗体已有描述。两个例子是中和性鼠抗-IL-4Rα单克隆抗体MAB230(克隆25463)和I6146(克隆25463.11)，分别由明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems)和密苏里州圣路易斯的西格马公司提供。这些抗体属于IgG2a亚型，是从纯化重组人IL-4Rα(杆状病毒源)免疫的小鼠产生的小鼠杂交瘤开发出的。另外两个中和性鼠抗-IL-4Rα抗体M57和X2/45-12分别由新泽西州富兰克林湖市BD生物科学公司(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)和加利福尼亚州圣迭哥市电子生物科学公司(eBioscience，San Diego，CA)提供。这些是IgG1抗体，也是由用重组可溶性IL-4Rα免疫的小鼠的小鼠杂交瘤产生的。
全人抗体似乎比鼠或嵌合抗体有更好的临床实用性。这是因为，经常生产的是针对鼠免疫球蛋白的FC部分的人抗鼠抗体(HAMA)，导致迅速的清除以及可能的过敏反应(Brochier等，Int.J.Immunopharm.，17：41-48，1995)。虽然嵌合抗体(鼠可变区及人恒定区)比鼠单克隆抗体的免疫原性差，但已经报道了人抗嵌合抗体(HACA)反应(Bell和Kamm，Aliment.Pharmacol.Ther.，14：501-514，2000)。
WO 01/92340(Immunex)描述针对IL-4受体的人单克隆抗体，是通过涉及用可溶性IL-4R肽对转基因小鼠进行免疫以及形成分泌IL-4R的抗体的杂交瘤细胞系的步骤生成的，公开的主要抗体12B5是一种IgG1抗体，而且是完全人抗体。
WO 05/047331(Immunex)进一步披露了通过VH结构域的寡核苷酸诱变而衍生自12B5(改名为H1L1)的抗体。每一个突变的VH链都与6个不同的VL链中的一个配对，产生一个小型抗体分子库。
WO 07/082068(Aerovance)披露了一种治疗哮喘的方法，包括给予具有R121D和Y124D取代的突变型人IL-4蛋白质。该专利说明书指导，药物组合物中给予的此类IL4突变蛋白能拮抗野生型huIL-4和野生型huIL-13结合受体。
WO 08/054606(Regeneron)披露了针对人IL-4R的特定抗体，其在能产生人抗体的转基因小鼠中产生。
发现并开发对另一物种例如短尾猴的直向同源蛋白也显示交叉反应性的人IL-4Rα抗体是有利和有益的。这样的抗体有助于表征此类抗体的药理学和体内安全性。效力或者对另一物种的亲和力，例如与人活性的差异小于10倍，是一种适当的评价。然而，人IL-4Rα蛋白与除猩猩之外的其它物种的直向同源IL-4Rα蛋白的相似性较低。因此，发现亲和力高、效力高、适合临床应用、对广泛认为适于临床开发的安全及毒理学评价的物种有交叉反应性的抗体是非常具有挑战性。
通过恰当设计的选择技术和试验，本发明人开发出了抑制人及短尾猴IL-4Rα生物活性的IL-4Rα结合成员。
如实施例所详述的，本发明人从初始的先导鉴定项目中选择了针对人IL-4Rα的单个抗体分子，这个抗体分子同时对短尾猴IL-4Rα具有一定的-尽管弱-结合能力和功能中和作用。遵循计划并设计的靶向及随机诱变，并进一步从这个亲代抗体分子选择突变体，开发出了大量性质极大改善的抗体分子。VH和VL区，包括亲代抗体(抗体1)、以及优化的抗体的互补决定区(CDR)，示于图1、2、3和4。这些抗体分子、VH、VL、CDR、以及包含一个或多个CDR的结合成员，构成本发明的诸方面。
除野生型IL-4Rα，发现本发明的结合成员还结合一种普通的人变体I75VIL-4Rα。
这里描述的结合成员高效中和IL-4Rα的生物学效应、高亲和力结合IL-4Rα并抑制IL-4和IL-13诱导的信号传导。需指出，结合成员抑制来自高亲和力复合物，例如IL-4:IL-4Rα:γc、IL-4:IL-4Rα:IL-13Rα1、IL-13:IL-13Rα1:IL-4Rα的信号传导。此类动作阻止IL-4和IL-13的信号传导。此外，数据显示，结合成员抑制IL-4Rα1型和2型复合物的相互作用及信号传导。下文进一步详述了结合成员的这些和其它特性与作用。
这些结合成员可用于治疗涉及IL-4Rα、IL-4或IL-13表达的病症，例如在本文它处提及的一种或多种IL-4Rα-、IL-4-或IL-13-有关病症，比如哮喘或COPD。
如本文它处所述，可采用表面等离振子共振，例如BIAcore测定结合成员与IL-Rα的结合。
可将表面等离振子共振数据拟合至1∶1朗格缪尔结合模型(同时ka kd)以及从速度常数之比kd1/ka1计算的亲和力常数Kd。本发明的结合成员结合人IL-4Rα的单价亲和力小于20nM。在其它实施方式中，结合人IL-4Rα的单价亲和力小于10nM，例如小于8、小于5nM。在其它实施方式中，结合成员还结合短尾猴IL-4Rα。在一个实施方式中，本发明的结合成员结合人IL-4Rα的单价亲和力在0.05至12nM的范围内。在一个实施方式中，本发明的结合成员结合人IL-4Rα的单价亲和力在0.1至5nM的范围内。在一个实施方式中，本发明的结合成员结合人IL-4Rα的单价亲和力在0.1至2nM的范围内。
在一个实施方式中，本发明的结合成员可以与人IL-4Rα发生免疫特异性结合，利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(如BIAcore试验，ELISA)(瑞典乌普萨拉的比亚科国际公司(Biacore International AB，Uppsala，Sweden))评估，其亲和力(KD)可能小于5000pM、小于4000pM、小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于11500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM。
在一个具体实施方式中，本发明的结合成员可与人IL-4Rα发生免疫特异性结合，利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(如BIAcore试验，ELISA)评估，其亲和力(KD)可以是25-5000pM、25-4000pM、25-3500pM、25-3000pM、25-2500pM、25-2000pM、25-1500pM、25-1000pM、25-750pM、25-500pM、25-250pM、25-100pM、25-75pM、25-50pM。在另一实施方式中，本发明的抗-IL-4Rα结合成员(包括抗体)可与IL-4Rα发生免疫特异性结合，利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(如BIAcore试验，ELISA)评估，其亲和力(KD)可以是500pM、100pM、75pM或50pM。
如实施例中更详细地描述，本发明的结合成员能高效中和IL-4Rα。“中和”是指抑制IL-4Rα介导的生物学活性。本发明的结合成员可以中和IL-4Rα所介导的一种或多种生物学活性。被抑制的生物学活性似乎是通过阻止IL-4Rα与γ链(或IL-13Rα)以及有关的可溶性配体例如IL-4或IL-13形成信号传导复合物来介导的。
可以通过抑制IL-4或IL-13刺激的TF-1细胞增殖来测定IL-4或IL-13信号传导受到其包含IL-4Rα的受体复合物的中和。
本发明的抗体所结合的人IL4Rα的表位通过组合诱变与结构域对换来定位。全结构域对换嵌合体将该表位定位在人IL4Rα的结构域1(D1)(残基M1-E119)。人IL-4Rα包含5个环区域，在晶体结构中与IL4紧邻(Hage等，Cell 97：271-281，1999)。环对换嵌合体还能够进一步地将本发明抗体所结合的人IL-4Rα表位定位在第3环中的主要组分(残基L89-N98)和第2环中的次要组分(残基V65-H72)。没有人第3环的嵌合体无法抑制人IL-4Rα与抗体的结合，而没有第2环的嵌合体的IC50比人IL-4Rα高100倍(表5)。与结构域对换数据相一致，第2环和第3环都在域1(D1)中(Hage等，Cell 97：271-281，1999)。
该抗体表位定位为人IL-4Rα的两个环区域中的18氨基酸不连续表位：V65-H72和L89-N98。表位可进一步定位至第2环的氨基酸残基L67和L68以及第3环的D92和V93(残基67、68、92和93的位置见SEQ ID NO：454或460)。D92残基是最重要的，其次是V93，因为测试的抗体仍然能够结合在第2环中缺少L67和/或L68残基的嵌合体IL-4Rα。当然，本发明的抗体似乎还结合除L67、L68、D92和V93之外的人IL-4Rα蛋白质的残基。
本发明一个方面提供一种分离的结合成员，根据SEQ ID NO：460的位置，其能够在至少一个选自位置67、68、92和93的氨基酸残基处结合人白介素-4受体α(hIL-4Rα)。本发明一个方面提供一种分离的结合成员，根据SEQ ID NO：460中的位置，其能够结合天然人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的氨基酸残基67、68、92和93的至少一个。在一特定实施方式中，根据SEQ ID NO：460中的位置，该分离的结合成员能够结合hIL-4Rα中的位置92处的氨基酸。在另一个实施方式中，该分离的结合成员能够结合D92以及选自L67、L68或V93的至少一个其它残基。在另一个实施方式中，该分离的结合成员能够结合D92和V93。在另一个实施方式中，该分离的结合成员能够结合D92、V93以及L67或L68中任意者。在另一个实施方式中，抗体能够结合L67、L68、D92和V93中的每一个。这些实施方式各自指向hIL-4Rα中的氨基酸位置，其位置可以依据SEQ ID NO：460所示hIL-4Rα氨基酸序列(从位置1到位置229)确定。在一个实施方式中，结合成员能够结合全长hIL-4Rα中所引述的表位残基(即位置67、68、92和93中的至少一个位置)。在一个实施方式中，结合成员能够结合在细胞表面表达的天然hIL-4Rα中所引述的表位残基(即位置67、68、92和93中的至少一个位置)。在一个实施方式中，结合成员能够结合重组表达的全长(229个氨基酸)hIL-4Rα中所引述的表位残基(即位置67、68、92和93中的至少一个位置)。
本发明的另一方面提供一种分离的结合成员，其能够结合人白介素-4受体α(hIL-4Rα)。在一个特定实施方式在中，结合成员是人抗体。在另一个实施方式中，结合成员能够结合短尾猴白介素-4受体α(cyIL-4Rα)。
本发明的另一个方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离结合成员，该结合成员在用18pM可溶性人IL-4蛋白的TF-1增殖试验中抑制人IL-4(hIL-4)诱导细胞增殖的IC50几何平均值小于50pM，且该结合成员还能够结合cyIL-4Rα。
在本发明这一方面的特定实施方式中，结合成员在用18pM可溶性人IL-4的TF-1增殖试验中抑制人IL-4(hIL-4)诱导细胞增殖的IC50几何平均值小于50pM、小于35pM、小于25pM、或小于20pM。在本发明这一方面的一个特定实施方式中，结合成员在用18pM可溶性人IL-4的本文描述方法(例如，实施例3.2.1)或本领域已知方法中抑制人IL-4(hIL-4)诱导细胞增殖的IC50几何平均值在1-50pM之间、在1-35pM之间、在1-25pM之间、或在1-12pM之间。
与cyIL-4Rα结合可以采用任何合适的手段测定。
类似地，使用400pM可溶性人IL-13(hIL-13)，本发明范围内的结合成员抑制人IL-13(hIL-13)-介导TF-1增殖(通过中和hIL-4Rα)的IC50几何平均值小于200pM。在一个特定实施方式中，使用400pM可溶性人IL-13(hIL-13)，抑制人IL-13(hIL-13)-介导的TF-1增殖(通过中和hIL-4Rα)的IC50几何平均值在5-75pM之间或5-45pM之间。
在一个特定实施方式中，本发明结合成员基本不能结合鼠IL-4Rα。我们的意思是，本发明的结合成员对人白介素-4受体α的结合要比对鼠IL-4Rα的结合强至少500倍(比如至少500倍、至少1000倍、至少1500倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍)(即，与鼠IL-4Rα的结合至少比与人IL-4Rα的结合弱500倍)。这可以例如通过实施例5.1.2揭示的HTRF竞争试验来测定。
几何平均值(亦称几何平均)在本发明中是指重新换算成底10的数时数据集对数值的平均数。这要求至少有两次测量，例如重复至少2次，优选至少5次，更优选至少10次。本领域技术人员会明白，重复次数越多，则几何平均值就越可靠。重复次数的选择可由本领域技术人员慎重决定。
可以部分或完全抑制生物学活性。在具体实施方式中，与没有结合成员存在下的活性相比，提供的结合成员能将IL-4Rα生物学活性抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。结合成员中和IL-4Rα的程度称为其中和效力。可采用本领域技术人员已知或本文所述或述及的一种或多种试验测定或检测效力。例如，可在以下试验中检验效力：
-荧光(例如HTRF或DELFIA)或放射形式的受体-配体结合试验
-荧光(例如HTRF或DELFIA)表位竞争试验
-基于细胞的功能试验，包括人或短尾猴PBMC的STAT6磷酸化、TF-1细胞增殖、人或短尾猴成纤维细胞系的嗜伊红粒细胞趋化蛋白释放、VCAM-1上调人内皮静脉细胞或人T细胞增殖。
实施例中还描述了其中的一些试验方法。
可将在利用第一物种(例如，人)的IL-4Rα的试验中计算的结合成员的中和效力与该结合成员在利用第二物种(例如，短尾猴)的IL-4Rα的相同试验中的中和效力作比较，从而评估该结合成员与两种物种的IL-4Rα的交叉反应程度。如果有一种结合成员，例如抗体或抗体片段，能够既结合人标靶，又结合来自另一物种的直向同源标靶，是会有巨大优势的。当结合成员发展成一种治疗产品时会产生关键优点，需要在另一个物种中进行安全研究(例如毒性)。对另一物种的效力或者亲和力，例如与人活性的差异小于10倍，是一种适当的评价。
有各种方法确定本发明的结合成员与人及“其他物种”(例如短尾猴)IL-4Rα的结合比率。一种方法即受体-配体结合试验，如实施例4.3中所用。
依据本发明结合成员的一个特定实施方式，采用受体-配体结合试验检测的结合成员作为scFv与hIL-4Rα和cyIL-4Rα的结合比率至少是6∶1。在本发明中，“至少”6∶1包括8∶1、10∶1等；但不是2∶1、1∶1。
本发明的结合成员结合人IL-4Rα及短尾猴IL-4Rα，用受体-配体结合试验确定，中和人与短尾猴IL-4Rα的效力之差小于250倍，例如小于150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍，其中结合成员是scFv形式，
如实施例4.3。
这里的数据标明，例如当抗体2、4-8、12、16、19、20、22、23、24、26、28、32、33、34、37和37GL以scFv形式在本文所述受体-配体结合试验中测定时，其分别中和人与短尾猴IL-4Rα方面的效力之差小于或等于25倍。数据示于实施例4.3和表1。因而，在一些实施方式中，受体-配体结合试验测定的本发明结合成员对人与短尾猴IL-4Rα的中和效力(scFv形式)是25倍以内。对人与短尾猴IL-4Rα的中和效力显示小于或等于10倍的本发明抗体的具体例子包括抗体2、4、5、20和22。在一个实施方式中，本发明结合成员对人与短尾猴IL-4Rα的中和效力是210倍以内；即对人IL-4Rα的结合比对短尾猴IL-4Rα的结合强不超过210倍。在另一个实施方式中，所述中和效力在5∶1和210∶1之间，比如在5∶1和100∶1之间。
对于基于细胞的功能试验，效力通常表示为以nM计的IC50值，除非另有表述。在功能试验中，IC50是将生物学(或化学)反应从其最高值降低50％的结合成员摩尔浓度。可通过绘制最高生物学反应％与log(结合成员浓度)的函数图，利用诸如图垫公司(GraphPad)的Prism或起源实验室(Origin Labs)的Origin等软件程序来计算IC50，从而能根据数据拟合S形函数以产生IC50值。
对于受体-配体结合试验，效力通常表示成Ki(抑制常数)，在没有标记配体存在的情况下占据50％的受体时的结合成员浓度。然而，取决于配体的浓度，每次试验的IC50可能有所变化，Ki是用Cheng Prusoff方程计算出的绝对值。
在本文描述的人IL-4Rα试验中，本发明的结合成员的中和效力或Ki最高为5nM。
可采用该试验测定scFV形式的结合成员的Ki。例如，Ki可以是最高5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、或0.02nM。Ki数据的示例示于实施例4.3(参见表1)，其中在受体-配体结合试验中使用的最终浓度是0.125nM人IL-4Rα和2nM IL-4，并提供了一种详尽方法。
此外，可测定IL-4Rα结合成员对IL-4Rα的结合动力学和亲和力(表示为平衡解离常数，KD)，例如采用表面等离振子共振，如BIAcore，或者可通过pA2分析估算Kd。
表面等离振子共振是测定结合成员对标靶的亲和力的惯常技术。其包括使分析物在液相中流过与支持物相连的配体，并测定分析物与配体之间的结合情况。例如，可使得重组IL-Rα在液相中流过与支持物相连的结合成员来实施等离振子共振。可根据二价分析物数据模型或单价分析物数据模型拟合表面等离振子共振数据。如本文的实施例章节所述，发现单价分析物数据模型尤其适于测定结合成员与IL-4Rα的亲和力。可采用1∶1朗格缪尔结合模型通过表面等离振子共振测定速度常数之比kd1/ka1，由该速度常数之比计算亲和力常数Kd。
采用表面等离振子共振计算的示例性IL-4Rα结合KD估算值见实施例4.7(参见表4)。这些数据证实抗体37GL对重组产生的人及短尾猴IL-4Rα有良好的结合性质。能与HEK-EBNA细胞的IL-4Rα结合证明该抗体能与天然糖基化的人IL-4Rα结合。因为抗体37GL结合天然糖基化IL-4Rα形式使人们可以预言，本发明的所有抗体(例如抗体1-42)均能结合天然糖基化的人IL-4Rα，假定这些抗体均衍生自一种亲代抗体(抗体1)，因此，相信它们均与IL-4Rα的相同或高度相似的表位结合。
因而，依据一个特定实施方式，本发明结合成员能够结合糖基化的hIL-4Rα。
如实施例4.7和表4所述，衍生自抗体1的一部分代表性抗体的表面等离振子共振确定了结合人及短尾猴IL-4Rα的交叉反应性。
本发明的结合成员可任选对IL-4Rα的特异性胜过其它结构相关性分子(例如其他白介素受体)，因此选择性结合IL-4Rα。例如，本发明的结合成员不会与IL-13Rα1或IL-13Rα2中的任何一个以及共同的γ链(γc)普通的交叉反应。这可以例如以例示于实施例4.6中的表位竞争试验确定或证实。
本发明结合成员可包含抗体分子，例如人抗体分子。结合成员包含抗体VH和/或VL结构域。结合成员的VH结构域也作为本发明的部分提供。各VH和VL结构域内是互补决定区(“CDR”)和构架区(“FR”)。VH结构域包含一组HCDR，VL结构域包含一组LCDR。抗体分子可包含含有VH CDR1、CDR2和CDR3的抗体VH结构域及构架区。或者其还可包含含有VL CDR1、CDR2和CDR3的抗体VL结构域及构架区。VH或VL结构域构架区包含散布有CDR的四个构架区FR1、FR2、FR3和FR4，结构如下：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
本发明的抗体VH和VL结构域，FR和CDR的例子见随附的构成本文一部分的序列表。本文披露的所有VH和VL序列、CDR序列、多组CDR和多组HCDR及多组LCDR代表着本发明的诸方面和实施方式。本文所述的“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3，一组LCDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有表述，“整组CDR”包括HCDR和LCDR。本发明的结合成员通常是单克隆抗体。
本发明的另一方面是包含VH结构域和/或包含VL结构域的抗体分子，所述VH结构域与随附序列表所示抗体1-42中任一种的VH结构域有至少75、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列相同性，所述VL结构域与随附序列表所示抗体1-42中任一种的VL结构域有至少75、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列相同性。阿克赛勒里公司(Accelerys)的MacVectorTM程序可以用来计算两个氨基酸序列的％相同性。
本发明的结合成员可包含非抗体分子内的抗原结合位点，通常由非抗体蛋白支架中的一个或多个CDR提供，例如HCDR3和/或LCDR3，或一组CDR，下文将进一步讨论。
如实验部分更详细描述的，本发明人分离了具有如图1(VH结构域)和2(VL结构域)所示一组CDR序列的亲代抗体分子(抗体1)。通过一个优化过程，发明人产生了包括2-20号在内的一组抗体克隆，其CDR3序列衍生自亲代CDR3序列并在图1(VH结构域)和2(VL结构域)所示的位置具有取代。因而，从图1(a和b)可以看出，抗体2具有亲代HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2序列，具有亲代LCDR3序列，其中Kabat残基95被Q置换，Kabat残基95A、95B和96各自被P置换、Kabat残基97被L置换；并具有亲代HCDR3序列，其中Kabat残基101被Y置换、Kabat残基102被N置换。
本文所述的亲代抗体分子和抗体分子2-20分别指含亲代抗体分子的CDR的抗体分子和含抗体2-20的CDR的抗体分子。经进一步的优化过程，发明人生成了一组编号21-42的抗体克隆，在整个VH和VL结构域中有其它取代。因此，例如，抗体21具有与抗体20相同的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、和HCDR3；抗体21具有抗体20的亲代HCDR2序列，但Kabat残基57被A置换了；其Kabat残基85和87(在LFW3)分别被V和F置换。
这里描述了包含图3(VH结构域)和4(VL结构域)所示抗体20的一组CDR的参比结合成员，其中HCDR1是SEQ ID NO：193(Kabat残基31-35)、HCDR2是SEQ ID NO：194(Kabat残基50-65)、HCDR3是SEQ ID NO：195(Kabat残基95-102)、LCDR1是SEQ ID NO：198(Kabat残基24-34)、LCDR2是SEQ IDNO：199(Kabat残基50-56)，而LCDR3是SEQ ID NO：200(Kabat残基89-97)。其它结合成员可以参照参比结合成员的序列来描述。
本发明的结合成员可包含本文描述的一个或多个CDR(即至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个和至少六个)，例如一个CDR3、以及任选的CDR1和CDR2以构成一组CDR。CDR或CDR组可以是亲代CDR或亲代CDR组，或者可以是抗体2-42中任一种的CDR或CDR组，或者可以是其变体，如本文所述。
例如，本发明的结合成员或VL结构域包含参比LCDR3，其中Kabat残基92-97中的一个或多个取代成另一种氨基酸。示例性取代包括：
Kabat残基92被Phe(F)、Val(V)或Ala(A)置换；
残基93被Gly(G)或Ser(S)置换；
Kabat残基94被Thr(T)置换；
Kabat残基95被Leu(L)、GLn(Q)、Pro(P)或Ser(S)置换；
Kabat残基95a被Ser(S)、Prol(P)、Ala(A)、Thr(T)、His(H)或Gly(G)置换；
Kabat残基95b被Ala(A)、Pro(P)、Ser(S)、Tyr(Y)、Met(M)、Leu(L)、Thr(T)、Arg(R)或Asp(D)置换；
Kabat残基95c被Asn(N)、Gln(Q)、His(H)、Tyr(Y)、Thr(T)、Ile(I)、Lys(K)、Arg(R)或Met(M)置换；
Kabat残基96被Tyr(Y)或Pro(P)置换；
Kabat残基97被Val(V)、Leu(L)或Ile(I)置换。
结合成员或VH结构域包含参比HCDR3，其中Kabat残基97-102中的一个或多个取代成另一种氨基酸。示例性取代包括：
Kabat残基97被Trp(W)或Leu(L)置换；
Kabat残基98被Leu(L)置换；
Kabat残基99被Leu(L)、Lys(K)、Phe(F)或Trp(W)置换；
Kabat残基101被Asp(D)、Asn(N)或Gln(Q)置换；
Kabat残基102被Tyr(Y)、Asn(N)、Pro(P)或His(H)置换。
本发明结合成员可包含抗体1-42中任一个的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或抗体1-42中任一个的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，例如图1或2所示的抗体1-42中任一个的一组CDR。结合成员可包含这些抗体之一的一组VH CDR。其还可任选包含这些抗体之一的一组VL CDR，所述VL CDR可以来自与VH CDR相同或不同的抗体。包含抗体1-42中任一个的一组HCDR的VL结构域和/或包含抗体1-42中任一个的一组LCDR的VL结构域也是本发明的各种实施方式。
VH结构域通常与VL结构域配对以提供抗体抗原-结合位点，虽然如下文进一步讨论的，VH或VL结构域可单独用于结合抗原。在一个实施方式中，抗体1VH结构域与抗体1 VL结构域配对，从而形成同时包含抗体1 VH和VL结构域的抗体抗原-结合位点。提供了本文所述其它VH和VL结构域的类似实施方式。在其它实施方式中，抗体1 VH与抗体1 VL以外的VL结构域配对。本领域熟知轻链混杂。本发明还提供了本文所述其它VH和VL结构域的类似实施方式。因此，亲代(抗体1)或抗体2-42中任意抗体的VH可以与亲代或抗体2-42中任意抗体的VL配对。
本发明的一个方面是包含VH和VL结构域的抗体，其中的VH结构域包含图1或3中揭示的序列。
本发明的一个方面是包含VH和VL结构域的抗体，其中的VH结构域包含图2或4中揭示的序列。
本发明的另一方面是包含VH结构域和VL结构域的分离抗体分子，其中的VH结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：362、442、232、422或432所示，VL结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：367、237、447、437或427所示。
结合成员可以包含亲代抗体或抗体2-42中任一种的一组H和/或L CDR，其中在所披露的H和/或L CDR组内含有12或10个或9个或更少的，例如1、2、3、4或5个取代。例如，本发明结合成员可包含抗体16或抗体20的H和/或L CDR组，其中可包含12个或更少的取代，例如7或更少的取代，例如0、1、2、3、4、565个取代。有可能对CDR组内的任何残基进行取代，可以在CDR1、CDR2和/或CDR3内。
因此，本发明一个面提供一种人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR含有相对于参比组CDR的12个或更少的氨基酸改变，其中：
HCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：153；
HCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：154；
HCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：155；
LCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：158；
LCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：159；而
LCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：160。
本实例中的参比抗体是抗体16。
分离的结合成员相对于参比组CDR可以有10个或更少的、8个或更少的、7个或更少的，例如6、5、4、3、2、1或0个氨基酸改变。具体的改变是氨基酸取代。
本发明另一方面提供一种人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR相对于参比组CDR有12个或更少的的氨基酸改变，其中：
HCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：193；
HCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：194；
HCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：195；
LCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：198；
LCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：199；而
LCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：200。
本实例中的参比抗体是抗体20。
分离的结合成员相对于参比组CDR可以有10或更少的、8个或更少的、7个或更少的，例如6、5、4、3、2、1或0个氨基酸改变。具体的改变是氨基酸取代。在一特定实施方式中，分离的结合成员相对于上述的参比组CDR有4个或更少的的氨基酸改变。
本发明另一方面提供一种人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR相对于参比组CDR有6个或更少的的氨基酸改变，其中：
HCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：363；
HCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：364；
HCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：365；
LCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：368；
LCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：369；而
LCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：370。
本实例中的参比抗体是抗体37。
取代可以是在CDR3之内，例如在抗体2-42中任意抗体的取代位置处，如图1或3(VH结构域)和2或4(VL结构域)所示。因此，所述一个或多个取代可包含以下残基处的一个或多个取代：
HCDR3中的Kabat残基97、98、99、101或102；或
LCDR3中的Kabat残基92、93、94、95、95A、95B、95C、96或97。
因此，CDR3可以例如是参比LCDR3，在Kabat残基92、93、94、95、95A、95B、95C、96或97处具有一个或多个取代。
本文它处描述了亲代/参比CDR中取代的例子。所述的取代可以包含图1-4所示的一个或多个取代。
本发明的结合成员包含参比抗体20的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，或者具有以下取代中的一个或多个：
HCDR2，其中Kabat残基53是Arg(R)；
HCDR2，其中Kabat残基57是Ala(A)；
HCDR3，其中Kabat残基97是Trp(W)或Leu(L)；Kabat残基98是Leu；Kabat残基99是Leu(L)、Lys(K)或Trp(W)；Kabat残基101是Asn(N)或Gln(Q)；和/或Kabat残基102是Tyr(Y)、Asn(N)、Pro(P)或His(H)。
本发明的结合成员包含参比抗体20的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，或者具有以下取代中的一个或多个：
LCDR1，其中Kabat残基27是Gly(G)；
Kabat残基27A是Thr(T)；
Kabat残基27B是Ser(S)；
Kabat残基31是Asn(N)；
LCDR2，其中Kabat残基56是Pro(P)；
LCDR3，其中Kabat残基92是Phe(F)、Val(V)或Ala(A)；
Kabat残基93是Gly(G)或Ser(S)；
Kabat残基94是Thr(T)；
Kabat残基95是Leu(L)、Gln(Q)、Pro(P)或Ser(S)；
Kabat残基95A是Ser(S)、Pro(P)、Ala(A)、Thr(T)、His(H)或Gly(G)；
Kabat残基95B是Ala(A)、Pro(P)、Ser(S)、Tyr(Y)、Met(M)、Leu(L)、Thr(T)、Asp(D)或Arg(R)；
Kabat残基95C是Asn(N)、Gln(Q)、His(H)、Tyr(Y)、Ile(I)、Lys(K)、Arg(R)、Thr(T)或Met(M)；
Kabat残基96是Tyr(Y)或Pro(P)；
和/或Kabat残基97是Val(V)、Leu(L)或Ile(I)。
在一特定实施方式中，参比抗体20序列，HCDR2的Kabat残基53被Arg(R)置换；
和/或HCDR2的Kabat残基57Ala(A)被置换；
和/或LCDR1的Kabat残基27被Gly(G)置换；和/或LCDR1的Kabat残基27B被Ser(S)置换；和/或LCDR3的Kabat残基95被Pro(P)置换。
依据本发明的一个特定方面，提供：
人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其中
HCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：363；
HCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：364；
HCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：365；
LCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：368；
LCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：369；而
LCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：370。
依据本发明的另一个特定方面，提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其中
HCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：233；
HCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：364；234；
HCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：235；
LCDR1有氨基酸序列SEQ ID NO：238；
LCDR2有氨基酸序列SEQ ID NO：239；而
LCDR3有氨基酸序列SEQ ID NO：240。
在本发明的结合成员中：
HCDR1的长度可以是5个氨基酸，由Kabat残基31-35构成；
HCDR2的长度可以是17个氨基酸，由Kabat残基50-65构成；
HCDR3的长度可以是9个氨基酸，由Kabat残基95-102构成；
LCDR1的长度可以是11个氨基酸，由Kabat残基24-34构成。
LCDR2的长度可以是7个氨基酸，由Kabat残基50-56构成；和/或LCDR3的长度可以是9个氨基酸，由Kabat残基89-97构成。
图1和3示出一组HCDR和LCDR的Kabat编号，其中HCDR1是Kabat残基31-35，HCDR2是Kabat残基50-65，HCDR3是Kabat残基95-102；在图2和4中，LCDR1是Kabat残基24-34，LCDR2是Kabat残基50-56，而LCDR3是Kabat残基89-97。
本发明的另一个特定方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR相对于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)存在的参比组CDR有6个或更少的的氨基酸改变.
本发明的另一个方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一个VH序列，该序列见于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆，保藏号是：NCIMB 41600.
本发明的另一个方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一个VL序列，该序列见于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆，保藏号是：NCIMB 41600.
本发明的另一个方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含VH和VL序列，该二序列见于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆，保藏号是：NCIMB 41600.
本发明的另一个方面提供分离的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段免疫特异性结合人白介素-4受体α(hIL-4Rα)并包含：
(a)VH CDR1，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VH CDR1，或包含1、2、或3个氨基酸残基取代；
(b)VH CDR2，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VH CDR2，或包含1、2、或3个氨基酸残基取代；
(c)VH CDR3，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VH CDR3，或包含1、2、或3个氨基酸残基取代；
(d)VL CDR1，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VL CDR1，或包含1、2、或3个氨基酸残基取代；
(e)VL CDR2，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VL CDR2，或包含1、2、或3个氨基酸残基取代；而
(f)VL CDR3，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VL CDR3，或包含1、2、或3个氨基酸残基取代。
本发明的另一个方面提供分离的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段免疫特异性结合人白介素-4受体α(hIL-4Rα)并包含：
(a)VH序列，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VH序列，或包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基取代；
(b)VL序列，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏号是：NCIMB 41600)的VL序列，或包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基取代。
结合成员可以包含在抗体构架中具有一个或多个CDR，例如一组CDR的抗体分子。例如，可以将抗体的一个或多个CDR或一组CDR嫁接入构架(例如，人构架)以提供抗体分子。构架区可包含人种系基因区段序列。因此，可以将构架种系化(germlined)，从而将构架内的一个或多个残基更换以与大多数相似的人种系构架中等价位置处的残基相匹配。技术人员可以选择序列最接近种系化之前的抗体构架序列的种系区段，并在本文所述试验中测试该抗体的亲和力或活性以证实种系化未明显降低抗原结合或效力。人种系基因区段序列是本领域技术人员熟知的，并且可以通过例如Vbase编译(软件)存取(参见Tomlinson，Journal of Molecular Biology，224，487-499，1997)。
在一个实施方式中，本发明结合成员是具有包含人种系构架中一组HCDR的VH结构域，例如Vh1_DP-7_(1-46)的分离人抗体分子。因此，VH结构域构架区FR1、FR2和/或FR3可包含人种系基因区段Vh1_DP-7_(1-46)的构架区。FR4可包含人种系j区段JH1、JH4或JH5(这些j区段具有相同的氨基酸序列)的构架区，或者可包含人种系j区段JH3的构架区。VH FR1的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：442(残基1-30)。VH FR2的氨基酸序列可以是SEQ IDNO：442(残基36-49)。VH FR3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：442(残基66-94)。VH FR4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：442(残基103-113)。结合成员通常还具有VL结构域，其包含例如人种系构架，如Vλ1_DPL5中的一组LCDR。因此，VL结构域构架区FR1、FR2和/或FR3可包含人种系基因区段Vλ1_DPL5的构架区。FR4可包含人种系j区段JL2或JL3(这些j区段具有相同的氨基酸序列)的构架区。VL FR1的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：447(残基1-23)。VL FR2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：447(残基35-49)。VL FR3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：447(残基57-88)。VL FR4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：447(残基98-107)。种系化的VH或VL结构域可以在或不在一个或多个微调残基(Vernier residue)处种系化，但通常不在。
本发明的抗体分子或VH结构域可包含下组重链构架区：
FR1，SEQ ID NO：442(残基1-30)；
FR2，SEQ ID NO：442(残基36-49)；
FR3，SEQ ID NO：442(残基66-94)；
FR4，SEQ ID NO：442(残基103-113)；或者，包含的所述一组重链构架区含有1、2、3、4、5或6个氨基酸改变，例如取代。
本发明的抗体分子或VL结构域可包含下组轻链构架区：
FR1，SEQ ID NO：447(残基1-23)；
FR2，SEQ ID NO：447(残基35-49)；
FR3，SEQ ID NO：447(残基57-88)；
FR4，SEQ ID NO：447(残基98-107)；或者，包含的所述一组重链构架区含有1、2、3、4、5或6个氨基酸改变，例如取代。
氨基酸改变可以是取代、插入(添加)或缺失。最常见的改变可能是取代。
例如，本发明抗体分子可包含一组重链和轻链构架区，其中：
重链FR1是SEQ ID NO：192(残基1-30)；
重链FR2是SEQ ID NO：192(残基36-49)；
重链FR3是SEQ ID NO：192(残基66-94)；
重链FR4是SEQ ID NO：192(残基103-113)；
轻链FR1是SEQ ID NO：197(残基1-23)；
轻链FR2是SEQ ID NO：197(残基35-49)；
轻链FR3是SEQ ID NO：197(残基57-88)；
轻链FR4是SEQ ID NO：197(残基98-107)；或者，包含的所述一组重链及轻链构架区含有7个或更少的，例如6个或更少的的氨基酸改变，例如取代。例如，在所述一组重链和轻链构架区中可以有1或2个氨基酸取代。
如实施例4.2所示，抗体21-42是以抗体20为基础的，但在CDR及构架区中有特定的其它改变。像抗体20，抗体21-42结合hIL-4Rα和cyIL-4Rα。此类CDR和/或构架取代因此可以视作任选的或额外的取代，从而产生结合力可能更大的结合成员。
因而，除了在VH和VL结构域的6个CDR中任一之内的取代外，结合成员还在构架区内的以下残基处包括一个或多个氨基酸取代，使用的是标准Kabat编号：
HFW1中的11、12；
HFW2中的37、48；
HFW3中的68、84、85；
HFW4中的105、108、113；
LFW1中的1、2、3、9；
LFW2中的38、42；或
LFW3中的58、65、66、70、74、85、87。
合适的构架取代示于图1-4。本发明的结合成员可包含图1-4中的一个或多个具体取代。
本发明的抗体分子或VH结构域可以包含VH FR1，其中Kabat残基11是Val或Glu和/或Kabat残基12是Lys或Arg；本发明的抗体分子或VH结构域可以包含VH FR2，其中Kabat残基37是Ala或Val和/或Kabat残基48是Met或Val；本发明的抗体分子或VH结构域可以包含VH FR3，其中Kabat残基68是Ser、Ala或Thr和/或Kabat残基84是Ser或Pro和/或Kabat残基85是Glu或Gly；本发明的抗体分子或VH结构域可以包含VH FR4，其中Kabat残基105是Lys或Asn和/或Kabat残基108是Gln、Arg或Leu和/或Kabat残基113是Ser或Gly。
本发明的抗体分子或VL结构域可以包含VL FR1，其中Kabat残基1是Gln或Leu和/或Kabat残基2是Ser或Pro或Ala和/或Kabat残基3是Val或Ala和/或Kabat残基9是Ser或Leu；本发明的抗体分子或VL结构域可以包含VL FR2，其中Kabat残基38是Gln或Arg和/或Kabat残基42是Thr或Ala；本发明的抗体分子或VL结构域可以包含VL FR3，其中Kabat残基58是Ile或Val和/或Kabat残基65是Ser或Phe和/或Kabat残基66是Lys或Arg和/或Kabat残基70是Ser或Thr和/或Kabat残基74是Ala或Gly和/或Kabat残基87是Tyr或Phe。
与种系化抗体相比，未种系化的抗体具有相同的CDR，但构框架不同。这里的抗体序列中，24PGL和37GL的VH和VL结构域抗体是种系化的。
图5、6和7显示了抗体1-42彼此之间的复合序列相同性。复合序列是关键CDR区的比对。因此，对于图5，这6个CDR结构域(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3；6xCDR)已作比对，从而LCDR1的最后一个密码子紧邻LCDR2的第一个密码子，LCDR2的最后一个密码子紧邻LCDR3的第一个密码子，等等。这就形成了一个缺少间插构架区的序列。复合序列可以是全部的CDR区，如图5所示，或者只是重链或轻链CDR序列(分别如图6和图7)。随后可生成每一个抗体复合序列与另一抗体复合序列的序列比对，相同性得分在图5、6、7的图表中表示。从图5可以看到，关于全部的6个CDR区，抗体1-42中的任一个与另一个抗体的最低序列相同性是73％(这是抗体3与抗体23、25、37、37GL和41相比)；如果排除抗体3，序列相同性是78％。仅比较三个重链CDR(3xHCDR)区时，最低序列相同性在排除抗体3时分别是75％和79％。仅比较三个轻链CDR(3xLCDR)区时，最低序列相同性在排除抗体3时分别是65％和75％。
在一特定实施方式中，分离的结合成员与抗体1-42中任一个的6xCDR复合序列有至少73％的氨基酸序列相同性。
本发明另一个方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，该结合成员与抗体1-42任一个中直线、无任何间插构架序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的复合序列有至少73％的氨基酸序列相同性。在一个特定实施方式中，分离的结合成员与抗体1-42中任一个的复合序列有至少78％的氨基酸序列相同性。
本发明的另一个方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，该结合成员与抗体1-42中任一个的HCDR1、HCDR2、HCDR3的复合序列有至少75％的氨基酸序列相同性。
本发明的另一个方面提供人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，该结合成员与抗体1-42中任一个的LCDR1、LCDR2、LCDR3的复合序列有至少65％的氨基酸序列相同性。
本发明的结合成员可以与任何结合成员竞争结合IL-4Rα(均结合IL-4Rα)的，并包括本文披露的结合成员、VH和/或VL结构域、CDR(例如HCDR3)和/或CDR组。不难在体外检验结合成员之间的竞争，例如采用ELISA和/或用特定的报道分子给一种结合成员作标记(可在一种或多种其它未标记的结合成员存在下检测)，从而能鉴定结合相同表位或重叠表位的结合成员。例如，可采用ELISA测定竞争，其中IL-4Rα固定于平板，将标记的第一结合成员连同一种或多种未标记的其它结合成员一起加入该平板。通过标记的结合成员发出的信号降低观察到有能与标记的结合成员竞争的未标记结合成员存在。本领域普通技术人员不难知晓这些方法，本文详细描述了这些方法。在一个实施方式中，采用本文所述的表位竞争试验检验竞争结合。本发明的结合成员可包含与抗体分子竞争的抗体抗原结合位点，例如特别是包含亲代抗体或结合IL-4Rα的抗体2-42中任一个的VH和/或VL结构域、CDR(例如HCDR3)或CDR组的抗体分子。本发明的诸方面提供与本文所述任何结合成员竞争，例如与亲代抗体或抗体2-42中任一种竞争结合IL-4Rα的结合成员，例如scFv或IgG1或IgG2形式。与本文所述任何结合成员竞争结合IL-4Rα的结合成员可以具有本文披露的本发明结合成员的任一种或多种结构和/或功能特性。
在其它方面，本发明提供包含编码本发明结合成员，如VH结构域和/或VL结构域的分离核酸，以及制备本发明结合成员，如VH结构域和/或VL结构域的方法，包括：在所述结合成员如VH结构域和/或VL结构域能产生的条件下表达所述核酸，以及回收。
本发明另一方面提供编码本文披露的VH CDR或VL CDR序列的核酸，通常是分离的。
另一方面提供含有本发明核酸或用本发明核酸转化的宿主细胞。
本发明其它方面提供含有本发明结合成员的组合物，和它们在抑制和/或中和IL-4Rα的方法中的应用，包括治疗人或动物体的方法。
本发明的结合成员可用于治疗或诊断人或动物体的方法，例如治疗(可包括预防性治疗)人患者的疾病或病症的方法，该方法包括给予所述患者有效量的本发明结合成员。可按照本发明治疗的病症包括IL-4Rα、IL-4和/或IL-13在其中起作用的任何病症，如本文它处详述的。
下文进一步详述了本发明的这些和其它方面。
术语
本文中应指出，本文使用“和/或”之处应理解成具体公开了两种所述特征或组分的每一种，包括或不包括另一种。例如，“A和/或B”应该理解成具体公开了(i)A、(ii)B及(iii)A和B中每一种，就如同各自在本文中专门列出一样。
IL-4Rα
IL-4Rα是白介素-4受体α。除非另有表述，述及IL-4Rα通常是指人IL-4Rα。野生型成熟人IL-4Rα的序列以登录号P24394保藏(Swiss-Prot)，其显示包含信号肽的全长IL-4Rα。
还对短尾猴IL-4Rα作了内部测序，短尾猴IL-4Rα的cDNA序列如SEQID NO：455所示。
如本文它处所述，IL-4Rα可以是重组体和/或可以是糖基化或非糖基化的。IL-4Rα在体内表达为N-连接的糖基化形式天然。糖基化IL-4Rα还可在重组系统，例如在HEK EBNA细胞中表达。IL-4Rα还可在大肠杆菌细胞中表达为非糖基化形式。
结合成员
该术语描述了彼此结合的一对分子中的一个成员。结合对的成员可以天然产生或完全或部分合成产生。分子对的一个成员在其表面具有一定区域或空腔，从而能结合该分子对的另一成员，因此与之在特定空间和极性结构上互补。各类型的结合对的例子是抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体型反应。
结合成员通常包括具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以是抗体分子或含有抗原结合位点的非抗体蛋白。
可通过在例如纤连蛋白或细胞色素B等非抗体蛋白支架上排列CDR(Haan和Maggos，BioCentury，12(5)：A1-A6，2004；Koide，Journal of MolecularBiology，284：1141-1151，1998；Nygren等，Current Opinion in Structural Biology，7：463-469，1997)，或通过使蛋白支架内环的氨基酸残基随机化或突变来提供抗原结合位点，从而能赋予对所需靶标的结合特异性。Nygren等(同上)详细回顾了用于工程改造蛋白质中新型结合位点的支架。抗体模拟物的蛋白支架披露于通过引用全文纳入本文的WO/0034784，其中发明人描述了包含具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。可通过免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供要嫁接入一个或多个CDR，例如一组HCDR或一个HCDR和/或LCDR3的合适支架。所述支架可以是人或非人蛋白。非抗体蛋白支架的优点之一是其可在至少比一些抗体分子更小和/或更易于制备的支架分子中提供抗原结合位点。结合成员的体积小可赋予有用的生理学特性，例如能进入细胞、更深地穿透入组织或到达其它结构内的靶标，或结合靶抗原的蛋白质空腔内。Wess在2004年回顾了抗原结合位点在非抗体蛋白支架中的应用。蛋白质通常具有稳定的骨架和一个或多个可变环，其中所述一个或多个环的氨基酸序列经专门或随机突变从而产生与靶抗原结合的抗原结合位点。这些蛋白质包含金黄色葡萄球菌A蛋白、转铁蛋白、四连接素、纤连蛋白(例如，第10个III型纤连蛋白结构域)和脂笼蛋白的IgG-结合结构域。其它方法包括西莱科股份有限公司(Selecore GmbH)的合成“微体”，以环肽(cyclotide)为基础的——含有分子内二硫键的小蛋白质。
除了抗体序列和/或抗原结合位点，本发明的结合成员可包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，如折叠域，或赋予该分子除结合抗原的能力以外的另一种功能特征。本发明结合成员可携带可检测标记物，或者可与毒素或靶向部分或酶偶联(例如，通过肽键或接头)。例如，结合成员可包含催化位点(例如，在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中所述抗原结合位点与抗原结合，因此将催化位点靶向抗原。催化位点可以，例如通过切割来抑制抗原的生物学功能。
虽然知道非抗体支架可携带CDR，但携带CDR，例如CDR3或本发明的一组CDR的结构通常是抗体重链或轻链序列或其实质部分，其中CDR或CDR组位于重排的免疫球蛋白基因编码的天然产生VH和VL抗体可变域的CDR或CDR组的相应位置。可以参照Kabat((Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第4版。US Department of Health andHuman Devices(美国健康的人类服务部)，1987)，及其更新，比如第5版(免疫学感兴趣的蛋白质的序列，第5版。美国健康的人类服务部，公益服务，NIH，华盛顿，1991年)确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置。
除非有相反指示，本发明中的特定残基以及CDR和构架区的位置使用Kabat编号体系。
依Kabat等的定义(同上)，CDR区域或CDR是指示免疫球蛋白的重链和轻链的超变区。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文利用术语CDR表示(视情形而定)这些区域中的一个或几个或甚至全部，这些区域含有负责通过抗体与其识别的抗原或表位的亲和力来结合的大多数氨基酸残基。
在6个短CDR序列中，重链的第三CDR(HCDR3)的体积可变性较大(主要是因为产生它的基因重排机制而导致差异较大)。其可短至2个氨基酸，虽然已知的最大长度是26。从功能看，HCDR3在决定抗体特异性方面有部分作用(Segal等，PNAS，71：4298-4302，1974；Amit等，Science，233：747-753，1986；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901-917，1987；Chothia等，Nature，342：877-883，1989；等，J.Immunol.，144：1965-1968，1990；Sharon等，PNAS，87：4814-4817，1990(a)；Sharon等，J.Immunol.，144：4863-4869，1990；Kabat等，J.Immunol.，147：1709-1719，1991b)。
HCDR1的长度可以是5个氨基酸，由Kabat残基31-35构成。
HCDR2的长度可以是17个氨基酸，由Kabat残基50-65构成。
HCDR3可以是7个氨基酸长，由Kabat残基95-102构成。
LCDR1的长度可以是13个氨基酸，由Kabat残基24-34构成。
LCDR2可以是7个氨基酸长，由Kabat残基50-56构成。
LCDR3可以是12个氨基酸长，由Kabat残基89-97。
抗体分子
该术语描述了无论天然或部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖包含抗体抗原-结合位点的任何多肽或蛋白质。在本文中必须知道，本发明不涉及天然形式的抗体，即它们不处于其天然环境中，但它们能经纯化从天然来源分离或获得，或者可通过遗传重组或化学合成获得，它们随后可含有非天然氨基酸，下文将进一步描述。含有抗体抗原-结合位点的抗体片段包括但不限于：诸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fd等分子；和双抗体(diabody)。
本发明的抗体分子可以是IgG，例如IgG1、IgG4、IgG2或无糖基(aglycosyl)IgG2.
可能利用单克隆抗体或其它抗体并采用重组DNA技术等技术来产生结合靶抗原的其它抗体或嵌合型分子。这些技术可包括将编码某抗体的免疫球蛋白可变区，或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见，例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，和大量的后续文献。可对产生抗体的杂交瘤或其它细胞作出遗传突变或其它改变，从而可改变或不改变所产生抗体的结合特异性。
由于可以多种方式修饰抗体，术语“抗体分子”应理解成涵盖具有所需特异性，具有抗体抗原-结合位点和/或能与抗原结合的任何结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段和衍生物，包括含有抗体抗原-结合位点的任何多肽，而无论其是天然或完全或部分合成的。因此包括包含抗体抗原-结合位点并与另一多肽(例如，衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚类)融合的嵌合型分子，或其等价物。EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量的后续文献描述了嵌合型抗体的克隆和表达。
抗体工程改造领域中可用的其它技术能分离人和人源化抗体。例如，人杂交瘤的制作方法可以参见Kontermann和Dubel(Antibody Engineering(抗体工程改造)，S-V公司(Springer-Verlag)纽约，LLC出版；2001年，ISBN：3540413545)。例如以下许多出版物详细描述了产生结合成员的另一种现有技术-噬菌体展示：WO92/01047(下文进一步讨论)和美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404，Kontermann和Dubel(同上)。可利用小鼠抗体基因被灭活并功能性替换为人抗体基因、但小鼠免疫系统的其它组分维持完好的转基因小鼠分离人抗体(Mendez等，Nature Genet，15(2)：146-156，1997)。
可借助寡核苷酸合成并在合适的表达载体中装配产生基因，通过表达基因产生合成的抗体分子，如Knappik等，(J.Mol.Biol.296，57-86，2000)或Krebs等，(Journal ofImmunological Methods，254：67-84，2001)所述。
现已证明完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域构成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段；(iv)由VH或VL结构域构成的dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546，1989；McCafferty等，Nature，348：552-554，1990；Holt等，Trends in Biotechnology 21，484-490，2003)；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab′)2片段，其是包含两个连接的Fab片段的一种二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头相连，从而能连接两个结构域以形成抗原结合位点(Bird等，Science，242，423-426，1988；Huston，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)通过基因融合构建的“双抗体”，其是多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等，PNAS USA90：6444-6448，1993a)。可通过包含连接VH和VL结构域的二硫键来稳定Fv、scFv或双抗体分子(Reiter等，Nature Biotech，14：1239-1245，1996)。还可制备包含与CH3结构域相连的scFv的小体(minibody)(Hu等，Cancer Res.，56，3055-3061，1996)。结合片段的其它例子是Fab’，其与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基末端加入少许残基，包含抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸，以及Fab’-SH，其是恒定区的半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab’片段。
可通过例如酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或化学还原以切割二硫键等方法，从本文所述的任何抗体分子，例如包含VH和/或VL结构域或抗体1-42中任一个的CDR的抗体分子开始获得本发明的抗体片段。在另一种方式中，可通过本领域技术人员熟知的遗传重组等技术，或者借助，例如自动肽合成仪，如应用生物系统公司(Applied Biosystems)等公司提供的那些仪器通过肽合成或通过核酸合成和表达来获得本发明的抗体片段。
本发明的功能性抗体片段包括通过化学修饰，特别是通过PEG化，或通过掺入脂质体而增加半衰期的任何功能性片段。
dAb(结构域抗体)是抗体的小单体性抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区(Holt等，Trends in Biotechnology 21，484-490，2003)。VH dAb在驼科动物(例如，骆驼、美洲驼)中天然产生，并可通过用靶抗原免疫驼类动物，分离抗原特异性B细胞和直接克隆各B细胞的dAb基因来产生。还可在细胞培养物中产生dAb。体积小、溶解性良好和温度稳定性使得它们在生理学上特别有用，从而适于选择和亲和力成熟。本发明的结合成员可以是包含基本上如本文所述的VH或VL结构域或包含基本上如本文所述一组CDR的VH或VL结构域的dAb。
本文所用的短语“基本上所述”表示本文所述结合成员的VH或VL结构域的相关CDR的特征与本文所述序列的特定区域相同或高度相似。如本文所述，对于一个或多个可变区的指定区域，短语“高度相似”包括在VH或VL结构域的CDR中可进行1-约12个，例如1-8，包括1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个氨基酸取代。
本发明的抗体包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体构成将两个不同的可变区组合在同一分子中的第二代单克隆抗体(Holliger，P.和Winter，G.1999Cancer and metastasis rev.18：411-419，1999)。现已证明它们因能募集新的效应功能或靶向肿瘤细胞表面的几种分子而可用于诊断领域和治疗领域。如果要利用双特异性抗体，这些抗体可以是用各种方法(Holliger等，PNAS USA90：6444-6448，1993b)，例如化学方法制备或从杂交瘤制备的常规双特异性抗体，或者可以是上述双特异性抗体片段的任一种。这些抗体可以通过化学方法获得(Glennie等，1987 J.Immunol.139，2367-2375；Repp等，J.Hemat.377-382，1995)或通过体细胞法(Staerz U.D.和Bevan M.J.PNAS 83，1986；等，MethodEnzymol.121：210-228，1986)，但也可类似地采用遗传工程技术，其强制进行异源二聚化，因而便于所需抗体的纯化过程(Merchand等，Nature Biotech，16：677-681，1998)。双特异性抗体的例子包括BiTETM技术获得的那些抗体，其中可以利用特异性不同的两种抗体的结合结构域并通过短的柔韧性肽直接相连。该抗体在短的单一多肽链上组合两种抗体。可只利用可变区构建不含Fc区的双抗体和scFv，从而可能降低抗独特型反应的效应。
可将双特异性抗体构建成完整的IgG、双特异性Fab′2、Fab′PEG、双抗体或者双特异性scFv。此外，可采用本领域已知的常规方法连接两个双特异性抗体以形成四价抗体。
与完整的双特异性抗体相比，双特异性双抗体可能还特别有用，因为它们不难在大肠杆菌中构建并表达。采用噬菌体展示(WO94/13804)不难从文库中选择结合特异性合适的双抗体(和许多其它多肽，例如抗体片段)。如果要将双抗体的一根臂维持恒定，例如对IL-4Rα的特异性，则可制备另一臂不同的文库并选择特异性合适的抗体。可如Ridgeway等(Protein Eng.，9：616-621，1996)所述通过交替工程改造方法制备完整的双特异性抗体。
本领域可采用各种方法获得针对IL-4Rα的抗体。这些抗体可以是单克隆抗体，特别是人、鼠科、嵌合型或人源化来源的，这些抗体可通过本领域技术人员熟知的标准方法获得。
就制备单克隆抗体或它们的功能片段，特别是鼠源的而言，通常可能指手册“Antibodies(抗体)”(Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(ColdSpring Harbor)纽约，第726页，1988)特别描述的技术或如Kohler和Milstein(Nature，256：495-497，1975)所述从杂交瘤制备的技术。
单克隆抗体可以从，例如用IL-4Rα或含有所述单克隆抗体识别的表位的它们片段之一免疫的动物细胞获得。尤其可按照常规方法，通过自含有编码IL-4Rα或其片段的cDNA序列的核酸序列开始的遗传重组，通过自包含在IL-4Rα和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列开始的肽合成来制备所述IL-4Rα或其片段之一。单克隆抗体可以利用，例如亲和柱纯化，所述亲和柱上已经固定了含有所述单克隆抗体识别的表位的IL-4Rα或其片段之一。更具体地说，可通过A蛋白和/或G蛋白层析，然后进行或不进行离子交换层析以除去自身中残留蛋白污染物以及DNA和LPS，再进行或不进行琼脂糖凝胶排阻层析以除去因存在二聚体或其它多聚体而导致的潜在凝聚体来纯化单克隆抗体。在一个实施方式中，可以同时或连续采用所有这些技术。
抗原结合位点
该术语描述了分子中结合靶抗原的全部或部分并与之互补的部分。在抗体分子中，该术语表示抗体抗原-结合位点，包括抗体中结合靶抗原的全部或部分并与之互补的部分。如果抗原较大，抗体可以只结合该抗原的特定部分，该部分称为表位。可以由一个或多个抗体可变区提供抗体抗原-结合位点。抗体抗原-结合位点可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
分离的
该术语表示本发明的结合成员，或编码这种结合成员的核酸通常合乎本发明的状态。因此，提供的本发明结合成员，包括VH和/或VL结构域和编码核酸分子及载体，可以是例如从其天然环境分离的和/或纯化的、基本上纯的或均质的形式，或者在核酸的情形中，为不含或基本上不含编码具有所需功能的多肽的序列以外来源的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸不含或基本上不含天然与其相连的物质，例如在其天然环境或在体外或体内实施重组DNA技术之时在其制备环境(例如细胞培养液)中发现的其它多肽或核酸。可用稀释剂或佐剂配制诸成员和核酸，但为实际目的仍是分离的-例如，如果用于包被免疫测定所用的微量滴定板，通常将这些成员与明胶或其它载体混合，或者用于诊断或治疗中时，将其与药学上可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可以天然地或通过异源真核细胞(例如，CHO或NS0(ECACC 85110503))的系统而糖基化，或者它们可以是(例如，如果在原核细胞中表达)非糖基化的。
包含抗IL-4Rα抗体分子的异质制品也构成本发明的一部分。例如，这些制品可以是抗体混合物，所述抗体具有全长重链、缺乏C-末端赖氨酸的重链、糖基化程度不同和/或具有衍生化的氨基酸，例如N-末端谷氨酸环化以形成吡咯型谷氨酸残基。
如上所述，本发明结合成员能调节并可能中和IL-4Rα的生物学活性。如本文所述，可以优化本发明的IL-4Rα结合成员的中和效力。效力优化通常包括使选择的结合成员的序列(通常是抗体的可变区序列)突变以产生结合成员文库，然后检验效力并选择更强效的结合成员。因此，选择的“效力优化的”结合成员的效力可能高于产生文库的结合成员。然而，还可不经优化获得高效力结合成员，例如可从最初的筛选，例如生物化学中和试验直接获得高效力结合成员。“效力优化的”结合成员指结合或中和IL-4Rα的特定活性或下游功能的效力得到优化的结合成员。本文它处更详细描述了试验和效力。本发明提供效力优化的和未优化的结合成员，以及优化所选结合成员效力的方法。因此，本发明使得技术人员能产生高效结合成员。
虽然可采用效力优化从给定的结合成员中产生效力较高的结合成员，但应该注意甚至可以不用效力优化而获得高效结合成员。
在另一方面，本发明提供获得能结合抗原的一种或多种结合成员的方法，该方法包括使本发明的结合成员文库与所述抗原接触，选择该文库中能结合所述抗原的一种或多种结合成员。
该文库可展示在颗粒或分子复合物上，例如可复制的遗传包装体(replicable genetic package)，如酵母菌、细菌或细菌噬菌体(例如，T7)颗粒、病毒、细胞或共价、核糖体或其它体外展示系统，各颗粒或分子复合物含有编码展示于其上的抗体VH可变区和任选展示的VL结构域(如果存在的话)的核酸。以下文献描述了噬菌体展示：WO92/01047和例如，美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404，各篇文献通过引用的方式全文纳入本文。
选择能结合抗原并展示在细菌噬菌体或其它文库颗粒或分子复合物上的结合成员后，可从展示所述选择的结合成员的细菌噬菌体或其它颗粒或分子复合物上获得核酸。这种核酸随后可用于通过表达含有从展示所述选择的结合成员的细菌噬菌体或其它颗粒或分子复合物获得核酸序列的核酸来产生结合成员或抗体VH或VL可变区。
含所述选择的结合成员的抗体VH区的氨基酸序列的抗体VH区可以是分离形式，例如可以是包含这种VH结构域的结合成员。
还可以进一步测试结合IL-4Rα的能力和/或与例如亲代抗体分子(例如抗体1)或优化抗体分子，抗体分子2-42(例如，scFv形式和/或IgG形式，如IgG1、IgG2或IgG4)竞争结合IL-4Rα的能力。中和IL-4Rα的能力可如本文它处所述测试。
本发明结合成员结合IL-4Rα的亲和力与抗体1-42之一(例如，scFv或IgG1或IgG2或IgG4形式)相同或更好。
本发明结合成员中和IL-4Rα的生物学活性的效力与抗体1-42之一(例如，scFv或IgG1或IgG2或IgG4形式)相同或更好。
可以在合适条件下比较不同结合成员的结合亲和力与中和效力。
可以制备本文公开的抗体分子的变体并用于本发明。遵循计算化学中将多变量数据分析技术应用到结构/性质-活性关系中去的最新潮流(Wold等，Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics-Mathematics and Statisticsin Chemistry(化学中的多变量数据分析.化学计量学-化学中的数学和统计学)(B.Kowalski著)，DR出版公司(D.Reidel Publishing Company)，荷兰多德雷赫特市(Dordrecht)，1984(ISBN 90-277-1846-6))，抗体的定量活性-性质关系可以用众所周知的数学技术来推导，比如统计回归、模式识别和分类(Norman等，Applied Regression Analysis(应用回归分析).W-I公司(Wiley-Interscience)；第3版(1998年4月)ISBN：0471170828；Kandel，Abraham和Backer，Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis(簇分析中计算机辅助的推理).PHP公司(Prentice Hall PTR)，(1995年5月11日)，ISBN：0133418847；Principles of Multivariate Analysis：A User’s Perspective(多变量分析远离：用户观点)(牛津统计学丛书(Oxford Statistical Science Series，No 22(纸件)).牛津大学出版社；(2000年12月)，ISBN：0198507089；Witten和Frank，Data Mining：Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations.(数据挖掘：Java实施的实际机器学习工具和技术)MK公司(Morgan Kaufmann)；(1999年10月11日)，ISBN：1558605525；Denison DGT.(著者)，Holmes，CC.等，Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression(非线性分类和回归的贝叶斯方法)(威利出版社概率论与统计学丛书(Wiley Series inProbability and Statistics))，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)；(2002年7月)，ISBN：0471490369；Ghose，AK.和Viswanadhan，VN.CombinatorialLibrary Design and Evaluation Principles，Software，Tools，and Applications inDrug Discovery(药物发现中组合文库设计和评估原理、软件、工具和应用).ISBN：0-8247-0487-8)。可从抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如，分析可能接触的残基或计算的理化特性)获得抗体的特性，这些特性可单独考虑，也可组合考虑。
由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原-结合位点通常由6个多肽环形成：3个来自轻链可变区(VL)，3个来自重链可变区(VH)。对原子结构已知的抗体的分析阐明了序列和抗体结合位点的三维结构之间的关系(Chothia等，Journal Molecular Biology，1992227，799-817；Al-Lazikani等，Journal MolecularBiology 273(4)：927-948，1997)。这些关系暗示，除了VH结构域中的第三区(环)外，结合位点环具有少量主链构象：经典结构之一。在特定环中形成经典结构显示由其大小和在环及框架区的关键位点中存在某些残基决定(Chothia等，Journal Molecular Biology 1992227，799-817，1992；Al-Lazikani同上)。
可采用这种序列-结构关系研究预测序列已知但三维结构未知的抗体中，对于维持其CDR环的三维结构从而维持结合特异性至关重要的那些残基。通过比较预测与前导优化实验的结果可支持这些预测。在结构方法中，使用任何可以免费获取或购得的软件包，例如WAM(Whitelegg和Rees，Prot.Eng.，12：815-824，2000年)可产生抗体分子的模型(Chothia等，Science，223：755-758，1986年)。然后可采用蛋白质目测和分析软件包，例如阿克赛勒里公司(Accelerys，Inc.)的Insight II或Deep View(Guex和Peitsch，Electrophoresis，(1997)18，2714-2723)评估CDR中各位置处可能的取代。然后可利用该信息进行可能对活性的影响最小或有利的取代。
在CDR、抗体VH或VL结构域和结合成员的氨基酸序列内进行取代所需的技术是本领域广为普及的。可以制备含有取代的变体序列，测试其结合和/或中和IL-4Rα的能力和/或任何其它所需特性，其中的取代可以预计或无法预计对活性的影响是最小的或有利的。
本发明可利用序列由本文特别公开的任何VH和VL结构域的可变区氨基酸序列变体，如本文所述。具体变体可以包含一个或多个氨基酸序列改变(一个氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，可以小于约20个改变，小于约15个改变、小于约12个改变、小于约10个改变、或小于约6个改变，可以是5、4、3、2或1个。可以在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中作出改变。改变通常不导致功能丧失，因此包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可保留结合和/或中和IL-4Rα的能力。例如，其可保留与未作改变的结合成员同样的定量结合和/或中和能力，例如在本文所述试验中测得。包含如此改变的氨基酸序列的结合成员结合和/或中和IL-4Rα的能力可能提高。的确，从抗体20的随机诱变生成的抗体21-42相对于抗体20显示有取代发生，主要是在各框架区域内，而且其中的每一个仍然结合和/或中和IL-4Rα，事实上有一些还表现出改善的结合和/或中和IL-4Rα的能力。
改变可包括用非天然产生或非标准氨基酸替代一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然产生或非标准形式，或者将一个或多个非天然产生或非标准氨基酸插入序列。本文它处描述了本发明序列中改变的示例性数目和位置。天然产生的氨基酸包括20种“标准”L-氨基酸，根据它们的标准单字母密码鉴别为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括可掺入多肽主链中的任何其它残基或由现有氨基酸残基修饰产生。非标准氨基酸可以是天然产生的或非天然产生的。本领域已知几种天然的非标准氨基酸，例如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰基丝氨酸等(Voet和Voet，Biochemistry(生物化学)，第2版，1995，威利公司(Wiley))。在其N-α位置衍生的那些氨基酸残基只位于氨基酸序列的N-末端。在本发明中，氨基酸通常是L-氨基酸，但在一些实施方式中，也可以是D-氨基酸。因此，改变包括将L-氨基酸修饰成D-氨基酸，或用D-氨基酸替代L-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式也是已知的，在本发明中，氨基酸可进行这种修饰。
本发明的抗体结构域和结合成员的氨基酸序列可包含上述非天然或非标准氨基酸。在一些实施方式中，可以在合成期间将非标准氨基酸(例如，D-氨基酸)掺入氨基酸序列，虽然在其它实施方式中，可以在合成氨基酸序列后通过修饰或替代“原始的”标准氨基酸的方式引入非标准氨基酸。
利用非标准和/或非天然产生的氨基酸能增加结构和功能差异，因此能增加本发明结合成员获得所需IL-4Rα结合与中和特性的可能性。此外，与标准L-氨基酸相比，D-氨基酸和类似物已显示更好的药代动力学分布概况，因为具有L-氨基酸的多肽在给予动物，例如人后会体内降解。
可采用随机诱变一个或多个选择的VH和/或VL基因以在整个可变区中产生突变，从而产生本发明的携带CDR衍生序列的新型VH或VL结构域。Gram等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：3576-3580，1992)描述了这种技术，他采用易错PCR。在一些实施方式中，在整个可变区或CDR组中作出一个或两个氨基酸取代。可采用的另一种方法是直接诱变VH或VL基因的CDR区域。Barbas等(Proc.Natl.Acad.Sci.，91：3809-3813，1994)和Schier等(J.Mol.Biol.263：551-567，1996)公开了这些技术。
本领域已知所有上述技术，技术人员能采用这些技术，从而能利用本领域常规方法提供本发明结合成员。
本发明另一方面提供获得IL-4Rα的抗体抗原结合位点的方法，该方法包括通过将一个或多个氨基酸添加、删除、取代或插入本文所示VH结构域的氨基酸序列来提供VH结构域，其是本文所示VH结构域的氨基酸序列变体，任选组合如此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域，并测试该VH结构域或一种或多种VH/VL组合以鉴定IL-4Rα的结合成员或抗体抗原结合位点，和任选一种或多种功能特性，例如中和IL-4Rα活性的能力。所述VL结构域的氨基酸序列基本上如本文所示。可采用类似方法，其中本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
如上所述，所携带的基本上如本文所示的CDR氨基酸序列可以是人抗体可变区中的CDR或其实质性部分。基本上如本文所示的HCDR3序列代表着本发明的诸多实施方式，例如携带的各这些序列可以是人重链可变域中的HCDR3或其实质性部分。
本发明所用的可变域可以从任何种系或重排人可变域获得或衍生，或者可以是基于已知人可变域的共有或实际序列的合成可变域。可变区可以衍生自非人抗体。可以采用重组DNA技术将本发明的CDR序列(例如，CDR3)引入缺乏CDR(例如，CDR3)的可变区库(repertoire)。例如，Marks等(Bio/Technology，10：779-783，1992)描述了产生抗体可变区库的方法，其中可变区5’端处或与之毗邻的共有引物与人VH基因的第三构架区的共有引物连用以提供缺乏CDR3的VH可变区库。Marks等还描述了如何将该库与特定抗体的CDR3组合。采用类似的技术，本发明的CDR3衍生序列可以与缺乏CDR3的VH或VL结构域库改组，改组的完整VH和VL结构域与同源VL或VH结构域组合以提供本发明的结合成员。然后可以在合适的宿主系统中展示该库，因而可以选择合适的结合成员，其中的宿主系统可以是通过引用方式全文纳入本文的WO92/01047或包括Kay、Winter和McCafferty的文献(Phage Display ofPeptides and Proteins：A Laboratory Manual(肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册)，圣迭戈：学术出版社，1996)在内的大量后续文献中的噬菌体展示系统。一个库可由104以上单个成员的构成，例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个成员。其它合适的宿主系统包括但不限于：酵母菌展示、细菌展示、T4展示、病毒展示、细胞展示、核糖体展示和共价展示。
Stemmer (Nature，370：389-391，1994)还公开了类似改组或重组技术，他描述的是涉及β-内酰胺酶基因的技术，但指出该方法可以用于生成抗体。
提供了制备IL-4Rα抗原的结合成员的方法，该方法包括：
(a)提供编码VH结构域的核酸起始库，所述核酸包含待替代的CDR3或缺乏CDR编码区；
(b)将所述核酸库与编码基本上如本文所示VH CDR3的氨基酸序列的供体核酸组合，从而将所述供体核酸插入核酸库的CDR3区域，进而提供编码VH结构域的核酸产物库；
(c)表达所述产物库的核酸；
(d)选择IL-4Rα的结合成员；和
(e)回收所述结合成员或其编码核酸。
还可采用类似方法，其中本发明的VL CDR3与编码VL结构域的核酸库组合，所述核酸包含待替代的CDR3或缺乏CDR3编码区。
类似地，可以利用本文公开的其它VH和VL结构域，多组CDR和多组HCDR和/或多组LCDR。
类似地，可以将一个或多个或所有3个CDR嫁接入VH或VL结构域库，然后筛选该库中IL-4Rα的一种或多种结合成员。
或者，编码本发明任一结合成员例如抗体1-42中的VH和/或VL域的核酸可经诱变(例如靶向的或随机的)生成一种或多种突变型核酸。随后可以生成由这些序列编码的结合成员。
在一个实施方式中，可以采用抗体1-42HCDR1、HCDR2和HCDR3、或抗体1-42组HCDR中的一种或多种，和/或可以采用抗体1-42LCDR1、LCDR2和LCDR3或抗体1-42组LCDR中的一种或多种。
本发明一个方面提供一种生产结合IL-4Rα的结合成员的方法，该方法包括：
提供编码VH结构域或VL结构域的起始核酸，或各自编码VH结构域或VL结构域的核酸起始库，其中的VH结构域或VL结构域或者包含即将被置换的CDR1、CDR2和/或CDR3或者缺乏CDR1、CDR2和/或CDR3编码区；
将所述起始核酸或起始核酸库与编码抗体1-42中任一抗体的CDR1、CDR2、和/或CDR3的氨基酸序列或由其突变所产生的一种或多种供体核酸组合，从而使一个或多个所述供体核酸插入起始核酸或起始核酸库中的CDR1、CDR2和/或CDR3区，以便提供编码VH或VL域的产物核酸库；
表达所述产物库中的核酸，产生产物VH或VL结构域；
可任选地，将所述产物VH或VL结构域与一个或多个陪伴VL或VH结构域(companion VL or VH domain)合并；
选择一个IL-4Rα结合成员，该结合成员包括产物VH或VL结构域以及任选的陪伴VL或VH结构域；以及
回收所述结合成员或其编码核酸。
在特定实施方式中，供体核酸通过VH或VL结构域或其中的任意CDR区的靶向或随机诱变产生。
在另一个实施方式中，产物VH或VL结构域连接于抗体恒定区。
在另一个实施方式中，产物VH结构域或VL结构域以及陪伴VL结构域或VH结构域分别包含在IgG、scFV或Fab抗体分子中。
在另一个实施方式中，测试回收的结合成员或抗体分子中和IL-4Rα的能力。
在另一个实施方式中，抗体分子配制成包含至少一种附加组分的组合物。例如，这样的组分可以是惰性药物赋形剂或载体。
在一个实施方式中，免疫球蛋白可变域的实质性部分包含至少所述三个CDR区，以及它们的间插框架区。该部分还可包含至少约50％的第一或第四构架区或二者，所述50％是第一构架区的C-末端50％和第四构架区的N-末端50％。可变区的实质性部分的N-末端或C-末端处其它残基可以是通常不与天然产生的可变区相连的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建本发明的结合成员可导致将引入以促进克隆或其它操作步骤的接头所编码的N-或C-末端残基引入。其它操作步骤包括引入接头以连接本发明的可变区与包含抗体恒定区、其它可变区(例如，在双抗体的产生中)或可检测/功能标记物的其它蛋白质序列，如本文它处详述的。
虽然在本发明的一些方面，结合成员包含一对VH和VL结构域，但基于VH或VL结构域序列的单一结合结构域构成本发明的其它方面。已知单一免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域能以特定方式结合靶抗原。例如，参见以上dAb的讨论。
在每一种单一结合结构域的情形中，可用这些结构域筛选能形成与IL-4Rα能结合的两维结合成员的互补结构域。可采用以引用方式全文纳入的WO92/01047公开的所谓分级双重组合方案，通过噬菌体展示筛选方法实施，其中含有H或L链克隆的各集落用于感染编码另一链(L或H)的克隆的完整文库，按照噬菌体展示技术，例如该参考文献中描述的那些技术选择得到的双链结合成员。Marks等(Bio/Technology，10：779-783，1992)也披露了该技术。
本发明的结合成员还可包含抗体恒定区或其诸部分，例如人抗体恒定区或其诸部分。例如，可将VL结构域在其C-末端与包括人Cκ或Cλ链，例如Cλ链在内的抗体轻链恒定区相连。类似地，基于VH结构域的结合成员可以在其C-末端与衍生自任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgD、IgE、IgY和IgM和任何同种型亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2；特别是IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分(例如，CH1结构域)相连。IgG1因其效应功能和便于操作而优选。具有这些特性并稳定可变区的任何合成或其它恒定区变体也可用于本发明实施方式中。
术语“同种型”指抗体的重链或轻链恒定区的分类。抗体的恒定区不参与抗原结合，但具有各种效应功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，可将给定的人抗体或免疫球蛋白指定为物种主要免疫球蛋白类型之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类型中的若干类型可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、和IgG4(γ4)以及IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的结构和三维构型是众所周知的。在各种人免疫球蛋白分子类型中，已知只有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM能激活补体。已知人IgG1和IgG3在人体中介导ADCC。人轻链恒定区可分成两个主要类型，即κ和λ。
抗体形式
本发明还包括具有修饰的IgG恒定结构域的本发明结合成员，特别是本发明的抗体。
在本发明的某些实施方式中，使用了具有诸如血清半衰期长且能够介导各种效应功能的功能特征的人IgG类型的抗体(单克隆抗体：原理和应用(Monoclonal Antibodies：Principles and Applications)，威利斯公司(Wiley-Liss，Inc.)，第1章(1995))。人IgG类抗体还可分为以下四种子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。迄今为止，进行了有关IgG类抗体效应物功能ADCC和CDC的大量研究，曾报道在IgG类抗体中，IgG1子类在人体中的ADCC活性和CDC活性最高(Chemical Immunology，65，88(1997))。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用摂和“ADCC”指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)能识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。在一个实施方式中，这类细胞是人细胞。虽然不希望受任何特定作用机理的限制，但介导ADCC的这些细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。介导ADCC的原始细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)小结了造血细胞上的FcR表达情况。为了评估分子的ADCC活性，可进行体外ADCC实验，如美国专利5,500,362或5,821,337所述。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或此外，可在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在Clynes等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)所述的动物模型中进行评价。
“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”指某分子启动补体活化和在补体存在下裂解靶点的能力。通过补体系统第一组分(C1q)与复合关联抗原的分子(如抗体)结合，启动补体激活途径。为了评估补体激活，可进行CDC测定，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202：163(1996)所述。
人IgG1亚类抗体的ADCC活性和CDC活性的表现通常包括抗体Fc区与效应细胞如杀伤细胞、天然杀伤细胞或活化的巨噬细胞表面上的该抗体受体(下文中称为“FcγR”)结合。可结合各种补体组分。关于结合，有文献提示抗体的绞链区和C区第二结构域(下文中称为“Cγ2结构域”)中的若干氨基酸残基至关重要(Eur.J.Immunol.，23，1098(1993)，Immunology，86，319(1995)，ChemicalImmunology，65，88(1997))，Cγ2结构域中的糖链也很重要(ChemicalImmunology，65，88(1997))。
“效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。该细胞至少表达FcγRI、FCγRII、FcγRIII和/或FcγRIV并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。
使用术语“Fc受体”或“FcR”描述结合于抗体Fc区的受体。在一个实施方式中，FcR是天然序列人FcR。而且，在某些实施方式中，FcR结合于IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亚型的受体，包括这些受体的等位基因变体和另路剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要是其胞质结构域不同。活化受体FcγRIIA的胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见，Annu.Rev.Immunol.，15：203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods，4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41(1995)对FcR进行了综述。本文所用术语“FcR”还涵盖其他FcR，包括那些将来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等，Immunol.，117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.，24：249(1994))。
可修饰抗-IL-4Rα抗体的效应功能，以提高该抗体的ADCC和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸取代实现这一目的。也可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。这样，可产生内化能力提高和/或补体介导的细胞杀伤能力和ADCC增强的同源二聚体抗体(Caron等，J.Exp.Med.，176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，148：2918-2922(1992))。也可利用异源双功能交联剂产生抗肿瘤活性提高的同源二聚体抗体(Wolff等，Cancer Research，53：2560-2565(1993))。也可对抗体进行工程改造，使其具有两个或更多个Fc区，从而增强补体裂解和ADCC能力(Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design，(3)219-230(1989))。
本领域已知工程改造抗体Fc区以改变效应功能的其它方法(例如，Koenig等的美国专利公开号20040185045和PCT公开号WO 2004/016750，它们描述了改变Fc区以便与FCγRIIA结合亲和力相比，提高与FcγRIIB的结合亲和力；另参见Armour等的PCT公开号WO 99/58572、Idusogie等的WO 99/51642和Deo等的美国6,395,272；通过引用将其全文纳入本文)。本领域也了解修饰Fc区以降低与FcγRIIB的结合亲和力的方法(例如，Ravetch等的美国专利公开号20010036459和PCT公开号WO 01/79299，通过引用将其全文纳入本文)。也记载过具有与野生型Fc区相比，与FcγRIIIA和/或FcγRIIA结合亲和力提高的变异Fc区的修饰抗体(如，Stavenhagen等的PCT公开号WO 2004/063351，通过引用将其全文纳入本文)。
已发现至少四种不同类型的FcγR，它们分别称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIV。在人中，FcγRII和FcγRIII还分别分为FcγRIIa和FcγRIIb，以及FcγRIIIa和FcγRIIIb。FcγR是属于免疫球蛋白超家族的膜蛋白，FcγRII、FcγRIII和FcγRIV具有胞外区含有两个免疫球蛋白样结构域的α链作为结构组分，FcγRI具有胞外区含有三个免疫球蛋白样结构域的α链作为结构组分，α链与IgG结合活性有关。此外，FcγRI和FcγRIII具有γ链或ζ链结构组分，其是具有α链相关信号转导功能的组成型组分(Annu.Rev.Immunol.，18，709(2000)，Annu.Rev.Immunol.，19，275(2001))。Bruhns等，Clin.Invest.Med.(加拿大)27：3D(2004)记载了FcγRIV。
为了评估感兴趣抗-IL-4Rα抗体的ADCC活性，可采用体外ADCC实验，如美国专利号US5500362或US5821337所述。也可采用市售试剂盒，如CytoTox(普洛麦格公司(Promega))进行该实验。可用于这类测得的效应物细胞包括但不限于：外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞和NK细胞系。表达转基因Fc受体(如CD16)和相关信号转导多肽(如FCεRI-γ)的NK细胞系也可用作效应细胞(参见例如Campbell的WO 2006/023148A2)。例如，可测定特定抗体通过补体活化和/或ADCC介导靶细胞裂解的能力。在体外培养和标记感兴趣的细胞；将抗体与免疫细胞加入细胞培养物中，所述免疫细胞可以是由抗原抗体复合物激活的免疫细胞，即参与ADCC应答的效应细胞。也可检测抗体的补体激活。在任一种情况下，通过裂解细胞释放的标记来检测靶细胞的细胞裂解。可通过检测释放到上清液中的胞质蛋白(如LDH)来确定靶细胞裂解程度。实际上，可利用患者自身的血清作为补体和/或免疫细胞来源来筛选抗体。然后，将能够在体外实验中介导人ADCC的抗体用于治疗该特定患者。也可在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：652-656(1998)所述的动物模型中进行评价。而且，调节(即提高或降低)抗体的ADCC水平和任选的CDC活性的技术是本领域熟知的。参见例如，美国专利US6194551。本发明抗体可能能够或可能经修饰而能够诱导ADCC和/或CDC。可利用人效应细胞进行测定ADCC功能的实验，以评估人ADCC功能。这类实验也可包括用于筛选通过坏死和/或凋亡机制诱导、介导、增强、阻断细胞死亡的抗体的实验。这类方法包括利用活细胞染料的实验、检测和分析胱冬酶的方法以及测定DNA断裂的实验，它们可用于评估与感兴趣抗-IL-4Rα抗体一起体外培养的细胞的凋亡活性。
例如，可以如Decker等，Blood(USA)103：2718-2725(2004)所述进行膜联蛋白V或TdT-介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)实验来检测凋亡活性。TUNEL实验包括将培养感兴趣细胞与荧光素标记的dUTP一起培养，使荧光素标记的dUTP掺入DNA链断裂处。然后加工处理细胞，以便用流式细胞术进行分析。膜联蛋白V实验利用偶联荧光素的膜联蛋白V检测凋亡细胞的质膜外侧出现的磷脂酰丝氨酸(PS)，所述偶联荧光素的膜联蛋白V能特异性识别暴露的PS分子。可并行使用活细胞染料如碘化丙锭，以排除晚期凋亡细胞。用标记的膜联蛋白V对细胞染色并用流式细胞术进行分析。
因此，本发明的又一方面提供结合成员，具体是抗体，其经修饰从而改变，例如提高、降低或去除结合成员的生物效应功能，例如Fc区经修饰的抗体。在一些实施方式中，在此揭示的结合成员或抗体可以经修饰以提升其固定补体和参与补体依赖性细胞毒性反应(CDC)的能力。在其它实施方式中，结合成员或抗体可以经过修饰以提升其活化效应细胞和参与补体依赖性细胞毒性反应(CDC)的能力。在另一些实施方式中，在此揭示的结合成员或抗体可以经过修饰同时提升其活化效应细胞和参与抗体依赖性细胞毒性反应(ADCC)的能力以及提升其固定补体并参与补体依赖性细胞毒性反应(CDC)的能力。
在一些实施方式中，在此揭示的结合成员或抗体可经修饰以降低其固定补体和参与补体依赖性细胞毒性反应(CDC)的能力。在其它实施方式中，结合成员或抗体可以经修饰以降低其活化效应细胞并参和抗体依赖性细胞毒性反应(ADCC)的能力。在另一些实施方式中，在此揭示的结合成员或抗体可经修饰同时降低其活化效应细胞和参与抗体依赖性细胞毒性反应(ADCC)的能力以及降低其固定补体和参与补体依赖性细胞毒性反应(CDC)的能力。
在一个实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员ADCC活性增强。在一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员ADCC活性比可比分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍或至少100倍。在另一具体实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcγRIIIA的结合增强且ADCC活性增强。在其它实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员ADCC活性提高、血清半衰期延长。
在一个实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员的ADCC活性下降。在一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员的ADCC活性比可比分子低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍或至少100倍。在另一具体实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcγRIIIA的结合水平降低且ADCC活性下降。在其它实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员ADCC活性下降但血清半衰期延长。
在一个实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员CDC活性增强。在一个具体实施方式中，有Fc变异且的结合成员CDC活性比可比分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍或至少100倍。在其它实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员ADCC活性提高且血清半衰期延长。
在一个实施方式中，相对于可比分子，有Fc变体区的结合成员对一种或多种Fc配体的结合水平降低。在另一实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc配体的亲和力比可比分子低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍或至少200倍。在一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc受体的结合水平降低。在另一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcγRIIIA的结合水平降低。在一个具体实施方式中，本文所述的有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcγRIIIA的亲和力比可比分子的低至少5倍，其中所述Fc变体与Fc受体FcγRIIB的亲和力是可比分子亲和力的约2倍以内。在又一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcRn的结合水平降低。在再一具体实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员与C1q的结合水平降低。
在一个实施方式中，相对于可比分子，有Fc变体区的结合成员对一种或多种Fc配体的结合水平增高。在另一实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc配体的亲和力比可比分子的高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍或至少200倍。在一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc受体的结合水平增高。在另一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcγRIIIA的结合水平增高。在又一具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcγRIIB的结合增强。在再一个具体实施方式中，有Fc变体区的结合成员与Fc受体FcRn的结合水平增高。在又一个具体实施方式中，与可比分子相比，有Fc变体区的结合成员与C1q的结合水平增高。
在一个实施方式中，本发明抗-IL-4Rα抗体包含变异Fc结构域，其中与可比的非变异Fc结构域相比，所述变异Fc结构域与Fcγ受体IIB的结合亲和力增强。在另一实施方式中，本发明抗-IL-4Rα抗体包含变异Fc结构域，其中与可比的非变异Fc结构域相比，所述变异Fc结构域与Fcγ受体IIB的亲和力高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍或至少200倍。
在一个实施方式中，本发明提供有Fc变体区的结合成员或包含这些物质的制剂，其中Fc区在一个或多个选自下组的位置上包含非天然产生的氨基酸残基：228、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443，它们是按照Kabat沉述的EU索引编号的。任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的其它和/或另选的位置上包含非天然氨基酸残基(参见例如，美国专利US5624821、US6277375、US6737056；PCT专利公开WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925和WO 06/020114)。
我们用“非天然氨基酸残基”表示在天然产生的蛋白质中引述位置上不存在的氨基酸残基。通常，这就意味着该或某天然/自然的氨基酸残基被一个或多个其它残基取代了，这可能包含其它20个天然产生的(普通)氨基酸或非经典氨基酸或化学氨基酸同系物。非经典氨基酸一般包括但不限于：普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。
在一个具体实施方式中，本发明提供有Fc变体区的结合成员或包含这种有Fc变体区的结合成员的制剂，其中该Fc区包含至少一个选自下组的非天然的氨基酸残基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R.243W、243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W，它们是按照Kabat陈述的EU索引编号的。任选地，Fc区可包含本领域技术人员已知的其它和/或替换的非天然氨基酸残基(参见例如，美国专利5624821、6277375、6737056；PCT专利公开WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752和WO 05/040217)。
应理解，本文所用的Fc区包括含有除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的N末端柔性绞链区。对IgA和IgM，Fc可包括J链。就IgG而言，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的绞链区。虽然Fc区的边界可变，但人IgG重链Fc区通常被定义为羧基末端包括残基C226或P230，其中编号是按照Kabat等所述的EU索引进行的。(1991，NIH出版物91-3242，弗吉尼亚州斯普林菲尔德的国家技术信息服务中心(Naional TechnicalInformation Service，Springfield，VA))。“Kabat所述的EU索引”指Kabat等(同上)所述的人IgG1EU抗体的残基编号。Fc可单独指该区域，或抗体、抗体片段或Fc融合蛋白中的这个区域。变体Fc蛋白可以是抗体、Fc融合物或包含Fc区的任何蛋白质或蛋白质结构域，包括但不限于：包含变体Fc区即Fc的非天然变体的蛋白质。
本发明包括有Fc变体区的结合成员，其相对于可比分子(如除了含有野生型Fc区之外其它的氨基酸序列相同的蛋白质)对Fc配体(如Fc受体，C1q)的结合特性发生了改变。结合特性的例子包括但不限于：结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和结合速率(分别是K解离和K结合)、结合亲和力和/或亲合力。通常应理解，具有低KD的结合分子(例如变异Fc蛋白，如抗体)可能更优于具有高KD的结合分子。然而，在一些情况下，K解离和K结合值可能比KD值更相关。本领域技术人员可确定对给定抗体应用而言哪一个动力学参数最重要。
可通过本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即Fc区与FcγR的特异性结合的各种体外测定法(生化或免疫测定法)确定Fc区与其配体的亲和力和结合特性，这些方法包括但不限于：平衡法(如酶联免疫吸附实验(ELISA)；或放射性免疫实验(RIA))或动力学方法(如分析)，以及其它方法，如直接结合实验、竞争性抑制实验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(如凝胶过滤)。这些和其它方法可利用所检测的一种或多种组分上的标记和/或利用各种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。有关结合亲和力和动力学的详细描述可参见Paul，W.E.编，Fundamental Immunology(基础免疫学)，第4版，Lippincott-Raven，费城(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。可通过提高Fc区与FcRn的结合亲和力来延长含有Fc区的蛋白质的血清半衰期。在一个实施方式中，与可比分子相比，Fc变体蛋白的血清半衰期延长。
本文所述术语“抗体半衰期”指抗体的一个药代动力学特性，是给药后抗体分子平均残留时间的衡量。抗体的半衰期可表示为从病人体内或其特定部位将已知量的免疫球蛋白清除50％所需时间，例如在血清或血浆中测量，即循环半衰期，或在其它组织中测量。一种免疫球蛋白或一类免疫球蛋白的半衰期与另一种不同。通常，增加抗体半衰期引起所给抗体在循环中的平均滞留时间(MRT)增加。
在某些实施方式中，本发明组合物和方法的抗IL-4Rα抗体的半衰期为至少约4-7天。在某些实施方式中，本发明组合物和方法的抗IL-4Rα抗体的平均半衰期为至少约2-5天、3-6天、4-7天、5-8天、6-9天、7-10天、8-11天、8-12、9-13、10-14、11-15、12-16、13-17、14-18、15-19或16-20天。在其它实施方式中，本发明组合物和方法的抗IL-4Rα抗体的平均半衰期为至少约17-21天、18-22天、19-23天、20-24天、21-25天、22-26天、23-27天、24-28天、25-29天或26-30天。在其它实施方式中，本发明组合物和方法的抗IL-4Rα抗体的半衰期可以是至多约50天。在某些实施方式中，可通过本领域已知方法延长本发明组合物和方法的抗体的半衰期。这种延长可进而降低抗体组合物的给予量和/或频率。体内半衰期改善的抗体及其制备方法参见美国专利号US6277375、US7083784和国际公开号WO 98/23289和WO 97/3461。
也可利用或不用多功能接头，通过PEG与抗体N末端或C末端的位点特异性偶联或通过赖氨酰残基上的ε-氨基，将惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)连接于抗体，从而延长抗-IL-4Rα抗体的体内血清循环时间。可利用导致生物活性损失最小的线型或分支聚合物衍生化。通过SDS-PAGE和质谱密切监测偶联程度，以确保PEG分子适当地偶联于所述抗体。可通过大小排阻或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG偶联物分开。可利用本领域技术人员已知的方法，例如本文所述的免疫实验检测PEG-衍生抗体的结合活性及体内功效。
另外，可将本发明组合物和方法的抗体与白蛋白偶联，以制备在体内更稳定或体内半衰期更长的抗体。本领域熟知这些技术，参见例如国际公开号WO93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；以及欧洲专利号EP 413,622，通过引用将所有这些文献纳入本文。
在某些实施方式中，本文所述结合成员或抗体以及本发明组合物的半衰期为至少约4-7天。在某些实施方式中，本文所述结合成员或抗体和本发明组合物的平均半衰期为至少约2-5天、3-6天、4-7天、5-8天、6-9天、7-10天、8-11天、8-12、9-13、10-14、11-15、12-16、13-17、14-18、15-19或16-20天。在其它实施方式中，本文所述结合成员或抗体和本发明组合物的平均半衰期为至少约17-21天、18-22天、19-23天、20-24天、21-25天、22-26天、23-27天、24-28天、25-29天或26-30天。在另一些实施方式中，本文所述结合成员或抗体以及本发明组合物的半衰期为至多约50天。在某些实施方式中，可通过本领域已知方法延长本发明抗体以及组合物的半衰期。这种延长可进而降低抗体组合物的给予量和/或频率。体内半衰期改善的抗体及其制备方法参见美国专利号US6277375、US7083784和国际公开号WO 1998/23289和WO 1997/3461。
在另一实施方式中，本发明提供结合成员，特别是有Fc变体区的抗体，或包含这些物质的组合物，其中所述Fc区在选自按照Kabat所述EU索引编号的239、330或332的一个或多个位置上包含至少一个非天然修饰。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E的非天然氨基酸，它们是按照Kabat陈述的EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自按照Kabat所述EU索引编号的252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然氨基酸。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E(按照Kabat陈述的EU索引编号)的非天然氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat陈述的EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然氨基酸。
在另一实施方式中，本发明提供结合成员，特别是有Fc变体区的抗体，或包含这些物质的组合物，其中所述Fc区在选自按照Kabat所述EU索引编号的234、235或331的一个或多个位置上包含至少一个非天然氨基酸。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S的非天然的氨基酸，它们是按照Kabat陈述的EU索引编号的。在另一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含234F、235F和331S氨基酸残基，它们是按照Kabat陈述的EU索引编号的。在另一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含234F、235Y和331S氨基酸残基，它们是按照Kabat陈述的EU索引编号的。任选地，所述Fc区还可在选自按照Kabat所述EU索引编号的252、254或256的一个或多个位置上包含其它非天然氨基酸残基。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然氨基酸。
在一个具体实施方式中，本发明提供有变体Fc区的结合成员，其中该变体在位置252包含酪氨酸(Y)、在位置254包含苏氨酸(T)、在位置256包含谷氨酸(E)，按照Kabat所述的EU索引编号。
据报道，下称为YTE突变的M252Y、S254T和T256E突变(按照Kabat所述的EU索引编号)会提高特定IgG1抗体分子的血清半衰期(Dall’Acqua等，J.Biol.Chem.281(33)：23514-23524，2006)。
在又一实施方式中，本发明提供有变体Fc区的结合成员，其中该变体在位置252包含酪氨酸(Y)、在位置254包含苏氨酸(T)、在位置256包含谷氨酸(E)、在位置241包含脯氨酸(P)，按照Kabat所述的EU索引编号。
据报道，下文称为P突变的丝氨酸228脯氨酸突变(S228P)(按照Kabat所述的EU索引编号)会提高特定IgG4分子的稳定性(Lu等，J PharmaceuticalSciences 97(2)：960-969，2008)。注：在Lu等人的文章中，其指位置241，因为他们使用的是Kabat编号体系，而不是Kabat所述的“EU索引”。
该P突变可以与L235E组合，进一步敲除ADCC。下文将这种突变组合称为双突变(DM)。
在一具体实施方式中，本发明提供有变体Fc区的结合成员，其中该变体在位置234包含苯丙氨酸(F)残基、在位置235包含苯丙氨酸(F)或谷氨酸(E)残基、在位置331包含丝氨酸(S)残基，按照Kabat所述的EU索引编号。下文将这样一种突变组合称为三突变(TM)。
依据又一实施方式，本发明提供在Fc区有YTE突变的IgG1形式的抗体。
依据又一实施方式，本发明提供在Fc区有TM突变的IgG1形式的抗体。
依据又一实施方式，本发明提供在Fc区有YTE突变及TM突变的IgG1形式的抗体。
依据一实施方式，本发明提供在Fc区有YTE突变及P突变的IgG4形式的抗体。
依据一实施方式，本发明提供在Fc区有YTE突变及DM突变的IgG4形式的抗体。
依据本发明的具体实施方式，提供选自下组形式的抗体：IgG1 YTE、IgG1TM、IgG1 TM+YTE、IgG4P、IgG4 DM、IgG4 YTE、IgG4P+YTE和IgG4DM+YTE。
按照所用命名法，应当明白，DM+YTE意味着恒定区Fc区同时拥有双突变(S228P和L235E)以及YTE突变(M252Y、S254T和T256E)。
产生非天然产生的Fc区的方法是本领域众所周知的。例如，可通过诱变法产生氨基酸取代和/或缺失，诱变法包括但不限于：定位诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492，1985)、PCR诱变(Higuchi，刊于″PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications″(《PCR实验方案：方法和应用指南》)，Academic Press(学术出版社)，圣迭戈，第177-183页(1990))和盒式诱变(Wells等，Gene 34：315-323(1985年))。优选地，通过重叠延伸PCR方法进行定位诱变(Higuchi，刊于″PCR Technology：Principles and Applications for DNAAmplification″(《PCR技术：用于DNA扩增的原理和应用》)，纽约斯托克顿出版社(Stockton Press，New York)，第61-70页(1989年))。可利用重叠衍生PCR的技术(Higuchi，同上)，将任何所需突变引入靶序列(初始DNA)。或者，重叠延伸法中的第一轮PCR包括用外部引物(引物1)和内部诱变引物(引物3)扩增靶序列，分别用第二种外部引物(引物4)和内部引物(引物2)扩增，产生两种PCR节段(节段A和B)。设计内部诱变引物(引物3)，以使靶序列含有指向所需突变的错配。在第二轮PCR中，用两种外部引物(引物1和4)借助PCR扩增第一轮PCR的产物(节段A和B)。用限制性酶消化得到的全长PCR节段(节段C)，将得到的限制性片段克隆入合适载体中。诱变的第一个步骤是，将初始DNA(如编码Fc融合蛋白、抗体或Fc区的DNA)操作性克隆到诱变载体中。设计引物，以反应所需的氨基酸取代。本领域已知用于产生变异Fc区的其它方法(参见例如，美国专利5624821、5885573、5677425、6165745、6277375、5869046、6121022、5624821、5648260、6528624、6194551、6737056、6821505、6277375、美国专利公开号2004/0002587和PCT公开WO 94/29351、WO 99/58572、WO00/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249、WO 04/063351、WO06/23403)。
在本发明的一些实施方式中，修饰本文提供的结合成员的糖基化模式以增强ADCC和CDC效应功能。(参见Shields RL等，JBC，277：26733-26740，2002；Shinkawa T等，JBC.278：3466-3473，2003；以及Okazaki A等，J.Mol.Biol.，336：1239，2004)。在一些实施方式中，Fc变体蛋白包含一种或多种工程改造的糖形式(glycoform)，即共价连接于含有Fc区的分子的碳水化合物组分。工程改造的糖形式可用于各种目的，包括但不限于提高或降低效应功能。工程改造的糖形式可通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，采用工程改造或变异的表达株，与一种或多种酶如DI N-胰腺葡糖胺基转移酶III(GnTI11)共同表达，在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达含有Fc区的分子，或者在含有Fc区的分子表达后修饰碳水化合物。本领域已知产生工程改造的糖形式的方法，包括但不限于Umana等，Nat.Biotechnol 17：176-180，1999年；Davies等，Biotechnol Bioeng 74：288-294，2007年；Shields等，J Biol Chem277：26733-26740，2002年；Shinkawa等，J Biol Chem 278：3466-3473，2003年；美国专利6602684；美国专利申请序列号10/277370；美国专利申请序列号10/113929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO02/311140A1；PCT WO 02/30954A1所述的方法；PotillegentTM技术(新泽西州普林斯顿的波娃公司(Biowa，Inc.Princeton，N.J.))；GlycoMAbTM糖基化工程技术(瑞士苏黎世的GLYCART生物技术公司(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland))。参见例如WO 00/061739、EA01229125、US 20030115614、Okazaki等的JMB，336：1239-49，2004。
可用可检测或功能标记物标记本发明的结合成员。标记物可以是能产生或经诱导产生信号的任何分子，包括但不限于：荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度来检测和/或测量结合情况。
合适的标记物包括(示例性而非限制性)酶，例如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)和辣根过氧化物酶；染料；荧光剂，例如荧光素、罗丹明化合物、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、荧光团，例如穴合镧系化合物和螯合剂(帕金埃尔默公司和CIS生物国际公司(PerkinElmer and Cis Biointernational))；化学发光剂，例如异氨基苯二酰肼；致敏剂；辅酶；酶底物；放射性标记，包括但不限于125I、131I、35S、32P、14C、3H、57Co、99Tc和75Se，和本文所述的其它放射性标记；颗粒，例如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞，等等，还可用染料、催化剂或其它可检测基团进一步标记。合适的酶和辅酶公开于美国专利4275149和美国专利4318980，其各自以引用的方式全文纳入本文。合适的荧光剂和化学发光剂公开于以引用的方式全文纳入本文的美国专利4275149。标记物还包括化学部分，例如可通过与特定的相关可检测部分，如标记的亲和素或链霉亲和素结合来检测的生物素。可检测标记物可以采用本领域已知的常规化学方法连接于本发明抗体。
可以通过许多方法使标记物产生可通过外部方法检测的信号，例如通过目测、电磁辐射、加热和化学试剂。所述标记物还可与结合本发明抗体的另一结合成员结合，或与支持物结合。
标记物可直接产生信号，因此，无需其它组分来产生信号。许多有机分子，例如荧光剂能吸收紫外线和可见光，吸收的光将能量转移给这些分子并将它们提高到激发能级。然后该吸收的能量通过发射第二波长的光而消散。该第二波长的射线也能将能量转移给标记的接受分子，得到的能量通过发射光，例如荧光共振能量转移(FRET)而从接受分子消散。直接产生信号的其它标记物包括放射性同位素和染料。
或者，标记物可能需要其它组分来产生信号，那么信号产生系统将包括产生可检测信号所需的所有组分，包括底物、辅酶、增强剂、其它酶、与酶产物反应的物质、催化剂、激活剂、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子和结合信号产生物质所需的特定结合物质。合适的信号产生系统的详述见以引用方式全文纳入本文的美国专利5185243。
存在的结合成员、抗体或其功能片段之一可以是免疫偶联物的形式，从而能获得可检测和/或可定量的信号。免疫偶联物可以与酶偶联，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖6-磷酸脱氢酶，或通过例如生物素、洋地黄毒苷或5-溴脱氧尿苷等分子偶联。荧光标记物可同样与本发明的免疫偶联物或它们的功能片段偶联，尤其包括荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明及其衍生物、GFP(GFP即“绿色荧光蛋白”)、丹酰、伞形酮、镧系金属鳌合物或穴合物，例如铕等。
免疫偶联物或它们的功能片段可通过本领域技术人员已知的方法制备。它们可以直接或通过间隔基团或连接基团，例如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)的中介作用，或在偶联剂，例如以上治疗性偶联物所述那些偶联剂存在下偶联于酶或荧光标记物。含有荧光素型标记物的偶联物可以通过与异硫氰酸酯反应来制备。同样地，其它免疫偶联物可包括化学发光标记物如鲁米诺和二氧杂环丁烷，生物发光标记物如萤光素酶和萤光素，或其它放射性标记物如碘123、碘125、碘126、碘131、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、硫35、磷32、碳14、氚(氢3)、钴57、硒75、钌95、钌97、钌103、钌105、汞107、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、氟8、钇199。本领域技术人员已知将治疗性放射性同位素直接或通过螯合剂，例如上述EDTA、DATA偶联于抗体的现有方法可利用诊断所用的放射性元素。还可能通过氯胺T方法(Hunter和Greenwood，Nature，194：495，1962年)用Na[I 125]标记，或通过Crockford等的技术(以引用方式全文纳入本文的美国专利号4424200)用锝99m标记或通过Hnatowich(以引用方式全文纳入本文的美国专利号4479930)所述经DPTA相连。其它免疫偶联物可包含毒素部分，例如选自下组的毒素部分：假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒素片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒素片段或突变体、肉毒杆菌毒素A-F、蓖麻毒蛋白或其细胞毒素片段或突变体、相思豆毒素或其细胞毒素片段、皂草毒蛋白或其细胞毒素片段、商陆抗病毒毒素或其细胞毒素片段和异株泻根毒蛋白1或其细胞毒素片段。
本发明提供的方法包括使得本文提供的结合成员与IL-4Rα结合。应注意，这种结合可在体内发生，例如在给予结合成员或编码结合成员的核酸后，或者可在体外发生，例如在ELISA、蛋白质印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层析和生物化学或细胞试验，例如本文所述的。本发明还能利用本发明结合成员，例如在生物传感器系统中直接检测抗原水平。
例如，本发明包括检测和/或测量与IL-4Rα的结合情况的方法，包括(i)使所述结合成员与IL-4Rα接触和(ii)检测所述结合成员与IL-4Rα的结合情况，其中采用本文所述任何方法或可检测标记物检测结合情况。该方法和本文所述的任何其它结合检测方法可直接由实施该方法的人员解读，例如目测观察可检测标记物。或者，该方法或本文所述的任何其它结合检测方法可产生放射自显影照片、照片、计算机打印输出、流式细胞术报道、图片、图表、含有结果的试管或容器或孔、或该方法结果的任何其它可见或物理表现形式的报道。
可以测定结合成员与IL-4Rα的结合量。定量测定可与测试样品中诊断感兴趣的抗原量有关。筛选IL-4Rα结合情况和/或其定量测定可用于，例如筛选IL-4Rα相关疾病或病症的患者，例如本文它处所述。在一个实施方式中，本发明诊断方法包括(i)获得对象的组织或液体样品；(ii)使所述组织或液体样品与一种或多种本发明结合成员接触；和(iii)与对照样品相比，检测结合的IL-4Rα等步骤，其中与对照相比，IL-4Rα结合量增加可表明IL-4Rα表达或活性水平异常。待测试的组织或液体样品包括怀疑含有IL-4Rα水平异常的血液、血清、尿、生物活检材料、肿瘤或任何组织。经测试IL-4Rα水平或活性异常的阳性对象还可受益于本文随后公开的治疗方法。
借鉴本文公开的方法，本领域技术人员可根据他们的偏好和普通知识选择测定结合成员与抗原结合的合适方式。
可通过任何合适的方式测定样品中结合成员的反应性。放射免疫测定(RIA)是可能的一种。放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合，使之与结合成员结合。将结合的抗原与未结合的抗原物理分离，测定与结合成员结合的放射性抗原量。测试样品中的抗原越多，与结合成员结合的放射性抗原越少。还可采用含非放射性抗原的竞争性结合试验，利用与报道分子相连的抗原或类似物。报道分子可以是具有光谱学上分开的吸收或发射特征的荧光染料、磷或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白、德克萨斯红和镧系螯合剂或穴合物。合适的生色染料包括二氨基联苯胺。
其它报道分子包括大分子胶态颗粒或颗粒材料，例如有色的、磁性或顺磁性的乳胶珠和能直接或间接产生可通过目测观察、电子检测或其它方式记录的可检测信号的生物学或化学活性剂。例如，这些分子可以是酶，其催化反应以产生或改变颜色或导致电子特性改变。它们可以是可激发的分子，因而能级之间的电子转移可导致特征性吸收光谱或发射光谱。它们可包括与生物传感器联用的化学实体。可以采用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。
可利用各结合成员-报道分子偶联物产生的信号获得样品(普通和测试)中与结合成员结合情况有关的可定量绝对或相对数据。
本发明一方面还提供包含本发明任何方面或实施方式的结合成员的试剂盒。在试剂盒中，可标记结合成员，从而能测定其在样品中的反应性，例如下文所述。结合成员还可与或不与固体支持物相连。试剂盒的诸组分通常是无菌的，放置在密封小瓶或其它容器中。试剂盒可用于利用结合成员的诊断分析或其它方法。试剂盒可装有在某方法，例如本发明方法中使用这些组分的使用说明书。本发明试剂盒中可装有辅助物质从而能协助或实施这种方法。辅助物质包括第二种不同的结合成员，其能结合第一结合成员并偶联于可检测标记物(例如，荧光标记物、放射性同位素或酶)。抗体试剂盒还可装有用于实施免疫沉淀的珠。试剂盒的各组分通常装在自身的合适容器中。因此，这些试剂盒通常包含适合于各结合成员的不同容器。此外，这些试剂盒可装有实施试验及解读和分析实施试验所得数据的方法的使用说明书。
本发明还提供以上结合成员在竞争试验中检测抗原水平的应用，即在竞争试验中利用本发明提供的结合成员检测样品中抗原水平的方法。这可能无需物理分离结合的与未结合的抗原。将报道分子连接于结合成员，从而结合时可能发生物理或光学改变。报道分子可以直接或间接产生可定量的可检测信号。可以直接或间接，共价，例如通过肽键或非共价连接报道分子。经由肽键连接可能是重组表达编码抗体或报道分子的基因融合所致。
例如，本发明包括鉴定IL-4Rα结合化合物的方法，包括(i)将IL-4Rα固定于支持物，(ii)使所述固定的IL-4Rα同时或分步接触至少一种标记的本发明结合成员和一种或多种未标记的测试结合化合物，和(iii)通过观察标记的结合成员的结合标签量的降低来鉴定新IL-4Rα结合化合物。
鉴定IL-4Rα结合化合物的另一种方法可包括(i)将结合成员固定于支持物，(ii)使所述固定的结合成员同时或分步接触标记的IL-4Rα和一种或多种未标记的测试结合成员或结合化合物，和(iii)通过观察标记的IL-4Rα的结合标签量降低来鉴定新IL-4Rα结合化合物。
可采用多孔或阵列形式，以高通量方式实施这些方法。还可在溶液中进行这些试验，例如实施例4.3描述的试验。例如，参见以引用方式全文纳入本文的US5814468。如上所述，结合的检测可以直接由实施该方法的人员解读，例如通过目测观察可检测标记物，或其存在量降低。或者，本发明的结合成员可产生放射自显影照片、照片、计算机打印输出、流式细胞术报道、图片、图表、含有结果的试管或容器或孔、或该方法结果的任何其它可见或物理表现形式的报道。
竞争试验还可用于表位作图。在一个例子中，表位作图可用于鉴定IL-4Rα结合成员所结合的表位，所述结合成员可任选具有优化的中和和/或调节特征。这种表位可以是线形表位或构象表位。构象表位可包含至少两个不同的IL-4Rα片段，其中当IL-4Rα折叠成其三级或四级结构以形成IL-4Rα抑制剂，例如IL-4Rα结合成员识别的构象表位时所述片段的位置彼此毗邻。在测试竞争时，可利用抗原的肽片段，特别是包含感兴趣表位或基本上由其构成的肽。可利用具有表位序列并在各端加有一个或多个氨基酸的肽。本发明结合成员可以如下所示，即它们与抗原的结合被具有或包含所给定序列的肽抑制。
本发明还提供编码本发明结合成员的分离核酸。核酸可包含DNA和/或RNA。在一方面，本发明提供编码上述本发明的CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原-结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG，如IgG1、IgG2或IgG4的核酸。
本发明还提供质粒、载体、转录或表达盒形式的构建物，其包含至少一种上述多核苷酸。
本发明还提供包含以上一种或多种构建物的重组宿主细胞。编码提供的任何CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原-结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG1、IgG2或IgG4的核酸本身构成本发明的一个方面，这与产生所编码产物的方法一样，该方法包括表达其编码核酸。在合适的条件下培养含有该核酸的重组宿主细胞不难实现表达。通过表达产生后，可采用任何合适的技术分离和/或纯化VH或VL结构域或结合成员，然后适当使用。
本发明核酸可包含DNA或RNA，其可以是完全或部分合成的。除非另有表述，述及本文所示核苷酸序列包括具有所示序列的DNA分子，还包括具有所示序列的RNA分子，其中U取代T。
还有另一方面提供产生抗体VH可变区的方法，该方法包括表达编码核酸。该方法可包括在产生所述抗体VH可变区的条件下培养宿主细胞。
产生VL结构域和包含VH和/或VL结构域的结合成员的类似方法是本发明的其它方面。
制备方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。制备方法可包括将产物配制成含有至少一种其它组分，例如药学上可接受的赋形剂的组合物。
熟知在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母菌和杆状病毒系统及转基因植物和动物。本领域熟知在原核细胞中表达抗体和抗体片段。综述可参见Plückthun 1991。常用的细菌宿主是大肠杆菌。
作为制备结合成员的另一选择，本领域技术人员还能在培养的真核细胞中表达，例如Chadd和Chamow，Current Opinion in Biotechnology 12：188-194，2001)，Andersen和Krummen(Current Opinion in Biotechnology 13：117，2002)，Larrick和Thomas(Current Opinion in Biotechnology 12：411-418，2001)。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其它细胞。
可以选择或构建含有合适的调节序列的合适载体，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它序列(如果需要的话)。载体可以是质粒，例如噬菌粒，或病毒，例如噬菌体(如果需要的话)。其它细节可参见例如Sambrook和Russell(Molecular Cloning：a Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版，2001年，冷泉港实验室出版社)。Ausubel等编著的Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology(分子生物学简便方法：最新分子生物学方法概要)(约翰威利父子公司，第4版，1999)详细描述了操作核酸的许多已知技术和方法，例如制备核酸构建物、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及分析蛋白质。
本发明的另一方面提供含有本文公开的核酸的宿主细胞。这种宿主细胞可以在体外并可处于培养物中。这种宿主细胞可以在体内。宿主细胞的体内存在可以将本发明结合成员表达成“胞内抗体”或细胞内的抗体。胞内抗体可用于基因疗法。
还有另一方面提供了包括将本发明核酸引入宿主细胞的方法。可采用任何合适的技术实施这种引入。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和利用逆转录病毒或其它病毒的转导，例如痘苗病毒，或者就昆虫细胞而言是杆状病毒。将核酸引入宿主细胞，特别是真核细胞可利用病毒或质粒系统。质粒系统可以维持于附加体或可掺入宿主细胞或掺入人工染色体。掺入可以是将一份或多份拷贝随机或靶向整合在单一或多个基因座处。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和利用细菌噬菌体转染。
引入后可表达核酸，例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。可通过本领域技术人员已知的方法纯化表达的产物。
在一个实施方式中，本发明核酸整合入宿主细胞的基因组(例如，染色体)。按照标准技术，纳入促进与基因组重组的序列可促进整合。
本发明还提供包括在表达系统中利用上述构建物以表达上述结合成员或多肽的方法。
本发明结合成员可用于诊断或治疗人或动物对象，例如人的方法中。例如，结合成员可用于诊断或治疗IL-4Rα相关疾病或病症，其例子如本文它处所述。
可利用本发明结合成员治疗或诊断的具体病症包括：哮喘、COPD(包括慢性支气管炎、小气道疾病、和肺气肿)、炎性肠病、纤维化病症(包括全身性硬皮病、肺纤维化、寄生虫诱发的肝纤维化、囊性纤维变性)、变态反应(包括例如特应性皮炎和食物变态反应)、防止抑制排异的抑制疗法、以及遏制延迟型过敏性或接触过敏性反应、作为变态反应的佐剂以及作为疫苗佐剂。
因此，本发明结合成员可用作治疗涉及IL-4、IL-13或IL-4Rα表达和/或活性的病症的治疗剂。其中的一种实施方式是一种治疗方法，包括将有效量的本发明结合成员给予有此需要的患者，其中IL-4Rα活化的功能结果(functionalconsequences)降低。其中的另一种实施方式是一种治疗方法，包括(i)鉴定显露IL-4、IL-13和IL-4Rα表达或活性的患者，例如采用上述诊断方法，和(ii)将有效量的本发明结合成员给予该患者，其中IL-4Rα活化的功能结果减弱。本发明的有效量是能调节IL-4Rα活化的功能结果的用量，从而能调节(例如减少或减轻)所治疗疾病或病症的至少一种症状的严重性，但不一定治愈该疾病或病症。因此，本发明的一个实施方式是治疗或减轻本文所述任何疾病的至少一种症状的严重程度的方法，包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独或以组合治疗方案与本领域已知或本文所述的另一种合适药物联合给予有此需要的患者，从而能降低所述疾病的至少一种症状的严重程度。其中本发明的另一种实施方式是拮抗IL-4Rα的至少一种效应的方法，包括接触或给予有效量的一种或多种本发明结合成员，从而能拮抗IL-4Rα的所述至少一种效应，例如IL-4Rα与IL-4形成复合物(有效信号传导的前体)的能力。
因此，本发明的其它方面提供治疗方法，包括给予所提供的结合成员、或包含这种结合成员的药物组合物，和/或这种结合成员在制备给予的药物中的应用，例如制备药物或药物组合物的方法，包括用药学上可接受的赋形剂配制结合成员。药学上可接受的赋形剂可以是化合物或化合物的组合，其可纳入药物组合物但不会造成继发性反应并能，例如促进活性化合物的给予，增加其体内寿命和/或其效力，增加其在溶液中的溶解度或者延长其储存时间。这些药学上可接受的载体是熟知的，本领域技术人员可改进这些载体以适应所选择活性化合物的性质和给药方式。
本发明结合成员通常以药物组合物的形式给予，所述组合物可包含除结合成员外的至少一种成分。因此，为用于本发明，除活性成分外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。这些物质应无毒，不应干扰活性成分的效力。载体或其它物质的精确性质取决于给药途径，其可以是口服、吸入或经注射，例如静脉内给药。在一个实施方式中，该组合物是无菌的。
本发明还考虑了口服给予的药物组合物，例如纳米体(nanobody)等。这种口服制剂可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成的油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其它糖溶液或甘油，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内注射，或在病患部位注射，活性成分可以是胃肠外可接受的水溶液形式，其不含热原，pH、等渗性和稳定性合适。本领域相关技术人员能利用，例如等渗载体，例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制备合适的溶液。如果需要，可利用防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂，包括缓冲液，例如磷酸、柠檬酸、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化苯甲烃铵，氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3’-戊醇；和间-甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
根据分子的理化特性和递送途径，可将本发明结合成员配制成液体、半固体或固体形式。制剂可包含，例如以下赋形剂或赋形剂的组合：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂包含的抗体浓度和pH范围很广。可通过，例如冷冻干燥、喷雾干燥或超临界液体技术干燥来制备固体制剂。抗-IL-4Rα的制剂取决于所需递送途径：例如，肺部递送的制剂可由颗粒构成，其物理特性确保在吸入后能透入肺深部；局部制剂可包含能延长药物在作用部位停留时间的粘性改性剂。在某些实施方式中，可用能防止结合成员快速释放的载体制备结合成员，例如控释制剂，包括植入体、透皮贴剂和微囊化递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。本领域技术人员已知制备这些制剂的许多方法。参见，例如Robinson，1978。
可口服(例如，纳米体)、通过注射(例如，皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内)、通过吸入、通过囊泡内途径(滴注入膀胱)或通过局部(例如，眼内、鼻内、直肠、给予入伤口或给予皮肤上)给予利用本发明结合成员的抗-IL-4Rα治疗。可通过脉冲输注，特别是以剂量渐降的结合成员来给予治疗。可以通过治疗的理化特征、通过疾病的具体考虑因素或优化效力或尽可能降低副作用的要求来决定给药途径。一种具体的给药途径是静脉内。给予本发明药物组合物的另一种途径是皮下。可以设想，抗-IL-4Rα治疗将不局限于在医院或诊所中使用，而可以包括家庭和工作场所。因此，优选利用无针头装置的皮下注射。
依据待治疗的疾病，组合物可以单独或与其它治疗组合，同时或依次或作为含另一种治疗剂或多种药剂的组合制品给予。
IL-4Rα的结合成员可用作与其它药物组分联用的组合治疗的一部分。可采用组合治疗提供明显的协同作用，特别是抗-IL-4Rα结合成员与一种或多种其它药物的组合。就治疗本文所述的一种或多种疾病而言，IL-4Rα的结合成员可同时或依次或作为含另一种或多种治疗剂的组合制品而给予。
可以组合或加入了一种或多种以下药剂的形式提供本发明结合成员：
-细胞因子或者细胞因子功能的激动剂或拮抗剂(例如，作用于细胞因子信号传导途径的药剂，例如SOCS系统的调节剂)，例如α-、β-和/或γ-干扰素；I型胰岛素样生长因子(IGF-1)、其受体和相关结合蛋白；白介素(IL)，例如IL-1-33中的一种或多种，和/或白介素拮抗剂或抑制剂，例如阿那白滞素；白介素家族成员的受体的抑制剂或这些受体的特定亚单位的抑制剂；肿瘤坏死因子α(TNF-α)抑制剂，例如抗-TNF单克隆抗体(例如，英夫利昔单抗；阿达木单抗和/或CDP-870)、和/或TNF受体拮抗剂，例如免疫球蛋白分子(例如依那西普)和/或低分子量药剂，例如已酮可可碱(pentoxyfylline)；
-B细胞调节剂，例如靶向B-淋巴细胞(例如CD20(利妥昔单抗)或MRA-aIL16R)或T-淋巴细胞(例如CTLA4-Ig、或阿巴西普(Abatacept))的单克隆抗体；
-抑制破骨细胞活性的调节剂，例如RANKL的抗体；
-趋化因子或趋化因子受体功能的调节剂，例如以下趋化因子的拮抗剂：CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11(就C-C家族而言)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5或CXCR6(就C-X-C家族而言)和CX3CR1(就C-X3-C家族而言)；
-基质金属蛋白酶(MMP)，即以下一种或多种的抑制剂：间质溶解素、胶原酶和明胶酶以及聚集蛋白聚糖酶；特别是胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶-2(MMP-8)、胶原酶-3(MMP-13)、间质溶解素-1(MMP-3)、间质溶解素-2(MMP-10)和/或间质溶解素-3(MMP-11)和/或MMP-9和/或MMP-12，例如强力霉素等药剂；
-白三烯生物合成抑制剂、5-脂肪氧合酶(5-LO)抑制剂或5-脂肪氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗剂，例如：齐留通；ABT-761；芬留顿；替泊沙林；Abbott-79175；Abbott-85761；N-(5-取代的)-噻吩-2-烷基磺酰胺；2，6-二叔丁基苯酚腙；甲氧基四氢吡喃，例如泽尼卡ZD-2138；化合物SB-210661；吡啶基-取代的2-氰基萘化合物，例如L-739,010；2-氰基喹啉化合物，例如L-746,530；吲哚和/或喹啉化合物，例如MK-591、MK-886和/或BAY x 1005；
-白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受体拮抗剂，选自：吩噻嗪-3-1s，例如L-651,392；脒基化合物，例如CGS-25019c；氨基苯并恶唑类(benzoxalamines)，例如昂唑司特；苄脒类(benzenecarboximidamides)，例如BIIL 284/260；和诸如扎鲁司特、阿鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、维鲁司特(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特(CGP 45715A)和BAY x 7195等化合物；
-磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，例如甲基黄嘌呤(methylxanthanine)，如茶碱和/或氨茶碱；和/或选择性PDE同工酶抑制剂，例如PDE4抑制剂和/或同种型PDE4D的抑制剂，和/或PDE5抑制剂；
-1型组胺受体拮抗剂，例如西替立嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿伐斯汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴司汀、氯苯那敏、普鲁本近、赛克利嗪和/或咪唑斯汀(通常口服、局部或胃肠外应用)；
-质子泵抑制剂(例如奥美拉唑)或胃保护性组胺2型受体拮抗剂；
-组胺4型受体拮抗剂；
-α-1/α-2肾上腺素受体激动剂、血管收缩剂、拟交感神经药，例如环己丙甲胺、苯福林、苯丙醇胺、麻黄素、伪麻黄碱、盐酸萘甲唑啉、盐酸氧甲唑啉、盐酸四氢唑啉、盐酸木甲唑啉、盐酸曲马唑啉和盐酸乙基去甲肾上腺素；
-抗胆碱能药，例如毒蕈碱受体(M1、M2、M3、M4和M5)拮抗剂，例如阿托品、东莨菪碱、甘罗溴铵(glycopyrrrolate)、异丙托溴铵、噻托溴铵、氧托溴铵、哌仑西平和替仑西平；
-β-肾上腺素受体激动剂(包括β受体亚型1-4)，例如异丙肾上腺素、柳丁氨醇、福莫特罗、沙美特罗、叔丁喘宁、间羟异丙肾上腺素、双甲苯喘定甲磺酸盐和/或吡布特罗，例如它们的手性对映体；
-色酮，例如色甘酸钠和/或奈多罗米钠；
-糖皮质激素，例如氟尼缩松、曲安西龙缩丙酮、二丙酸氯地米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、环索奈德和/或糠酸莫米松；
-调节核激素受体的药剂，例如PPAR；
-免疫球蛋白(Ig)或Ig制品或调节Ig功能的拮抗剂或抗体，例如抗-IgE(例如，奥玛立珠单抗(奥马珠单抗))；
-其它全身性或局部应用的抗炎药，例如沙利度胺或其衍生物、类维生素A、蒽三酚和/或卡泊三醇；
-氨基水杨酸盐和磺胺吡啶的组合，例如柳氮磺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮和奥沙拉秦；免疫调节剂，例如巯基嘌呤(thiopurines)和皮质类固醇，例如布地奈德；
-抗菌剂，例如青霉素衍生物、四环素、大环内酯类、β-内酰胺、氟喹诺酮、甲硝哒唑和/或吸入性氨基糖苷类；和/或抗病毒剂，例如阿昔洛维、泛昔洛韦、缬昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦；三环癸烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那米韦和/或奥塞米韦；蛋白酶抑制剂，例如印地那韦、那非那韦、利托那韦和/或沙奎那韦；核苷逆转录酶抑制剂，例如地达诺新、拉米夫定、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定；非核苷逆转录酶抑制剂，例如奈韦拉平、依法韦仑；
-心血管药物，例如钙通道阻断剂、β-肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂；降脂剂，例如他汀类和/或贝特类；血细胞形态的调节剂，例如已酮可可碱；溶解血栓和/或抗凝剂，例如血细胞聚集抑制剂；
-CNS药，例如抗抑郁药(例如舍曲林)、抗-帕金森药(例如塞利吉林、左旋多巴、罗平尼咯、普拉克索、MAOB抑制剂，如塞乐金(selegine)和雷沙吉兰、comP抑制剂，如托卡朋、A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱激动剂、多巴胺激动剂和/或神经元一氧化氮合酶抑制剂)和抗阿尔茨海默病药物，例如多奈哌齐、利凡斯的明、他克林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或美曲磷酯；
-治疗急性和慢性疼痛的药剂，例如中枢或外周作用的镇痛剂，例如阿片类似物或衍生物、卡巴米嗪、苯妥英、丙戊酸钠、阿米替林(amitryptiline)或其它抗抑郁药、对乙酰氨基酚或非类固醇抗炎药；
-胃肠外或局部-应用的(包括吸入的)局部麻醉剂，例如利诺卡因或其类似物；
-抗-骨质疏松剂，例如激素药物，如雷洛昔芬或双膦酸盐，如阿伦膦酸盐；
(i)胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板活化因子(PAF)拮抗剂；(iii)白介素转换酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)粘附分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂(例如，Btk、Itk、Jak3MAP抑制剂的例子可包括吉非替尼(Gefitinib)、甲磺酸伊马替尼)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，MAP激酶，如p38、JNK、蛋白激酶A、B和C及IKK的抑制剂)、或参与细胞周期调节的激酶(例如，依赖周期蛋白的激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽-B 1-和/或B2-受体拮抗剂；(x)抗-痛风药剂，例如秋水仙素；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如别嘌呤醇；(xii)排尿酸剂，例如，丙磺舒、苯磺唑酮和/或苯溴马隆；(xiii)生长激素促分泌素；(xiv)转化生长因子(TGFβ)；(xv)血小板衍生的生长因子(PDGF)；(xvi)成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；(xvii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；(xviii)辣椒碱乳膏；(xix)速激肽NK1和/或NK3受体拮抗剂，例如NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和/或D-4418；(xx)弹性蛋白酶抑制剂，例如UT-77和/或ZD-0892；(xxi)TNF-α转化酶抑制剂(TACE)；(xxii)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂或(xxiii)表达在TH2细胞上的化学引诱物受体-同源分子，(例如，CRTH2拮抗剂)；(xxiv)P38的抑制剂；(xxv)调节Toll-样受体(TLR)的功能的药剂和(xxvi)调节嘌呤能受体活性的药剂，例如P2X7；(xxvii)转录因子活化的抑制剂，例如NFkB、API和/或STATS。
抑制剂可以是特异性抑制剂或可以是混合型抑制剂，例如靶向上述多种分子(例如受体)或分子类型的抑制剂。
结合成员还可以共同给予或免疫偶联物的形式与化疗剂或另一种酪氨酸激酶抑制剂联用。所述抗体非片段还可用在通过重组机制或生物化学偶联获得的双特异性抗体中，从而能结合上述抗体的特异性与其它抗体的特异性，所述其它抗体能识别涉及IL-4Rα有关活性的其它分子。
为了治疗炎性疾病，例如类风湿性关节炎、骨性关节炎、气喘、变应性鼻炎、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、或牛皮癣，本发明结合成员可与一种或多种药物联用，诸如非类固醇抗炎药(下称NSAID)，包括无选择性环加氧酶(COX)-1/COX-2抑制剂(无论局部应用或全身性应用)，例如吡罗昔康、双氯芬酸、丙酸类如甲氧萘丙酸、氟联苯丙酸、苯氧苯丙酸、酮洛芬和布洛芬、灭酸酯类如甲灭酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑酮，例如苯丁唑酮、水杨酸盐，例如阿司匹林)；选择性COX-2抑制剂(例如，美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、陆玛考昔(lumarocoxib)、帕瑞考昔和艾托考昔)；抑制一氧化氮供体的环加氧酶(CINOD)；糖皮质激素(无论通过局部、口服、肌肉内、静脉内或关节内途径)；甲氨蝶呤、来氟米特；羟氯喹、d-青霉胺、金诺芬或其它胃肠外或口服金制品；镇痛剂；双醋瑞因；关节内治疗，例如透明质酸衍生物；和营养添加剂，例如葡糖胺。
本发明结合成员还可与治疗癌症的现有治疗剂组合使用。可组合使用的合适药剂包括：
(i)用于医学肿瘤学的抗增殖/抗肿瘤药物和它们的组合，例如格列卫(甲磺酸伊马替尼)、烷化剂(例如，顺铂、碳铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、瘤可宁、白消安和亚硝基脲)；抗代谢物(例如，抗叶酸剂，如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羟基脲、吉西他滨和紫杉醇；抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类抗生素，如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素)；抗(有丝分)裂剂(例如，长春花碱，如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨及紫杉烷，如紫杉酚和泰索帝)；和拓扑异构酶抑制剂(例如，鬼臼乙叉甙，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康及喜树碱)；
(ii)细胞抑制药，例如抗雌激素(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和吲哚昔芬(iodoxyfene))、雌激素受体下调剂(例如，氟维司群)、抗雄激素(例如，比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙氯地孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如，醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5α-还原酶的抑制剂，例如非那雄胺；
(iii)抑制癌细胞侵袭的药剂(例如，金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能的抑制剂)；
(iv)生长因子功能的抑制剂，例如，这种抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如，抗-erbb2抗体，曲妥珠单抗和抗-erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法尼基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如，表皮生长因子家族抑制剂(例如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼、AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼(埃罗替尼)、OSI-774)和6-丙烯基酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如，血小板衍生的生长因子家族的抑制剂和例如，肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管生成药剂，例如抑制血管内皮生长因子的作用的那些药剂，(例如，抗血管内皮生长因子抗体贝伐珠单抗、国际专利申请WO 97/22596、WO97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354公开的化合物，各份专利全文纳入本文)和以其它机制起作用的化合物(例如，利诺胺、整联蛋白αvα3功能的抑制剂和血管他丁)；
(vi)血管破坏剂，例如考布他汀A4和国际专利申请WO 99/02166、WO00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中公开的化合物(通过引用将各份专利全文纳入本文)；
(vii)反义治疗，例如，针对上述靶标的那些，如ISIS 2503、抗-ras反义；
(viii)基因治疗方法，包括例如，替代异常基因，如异常p53或异常BRCA1或BRCA2的方法、GDEPT(基因指导的酶前药治疗)方法，例如利用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些方法和增加患者对化疗或放疗耐受性的方法，例如多药抗性基因治疗；和
(ix)免疫治疗方法，包括例如，离体和体内方法以增加患者肿瘤细胞的免疫原性，如用细胞因子，如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子转染，降低T细胞无反应性的方法，利用转染的免疫细胞，例如细胞因子转染的树突细胞的方法，利用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法和利用抗独特型抗体的方法。
本发明的结合成员和一种或多种上述其它医学组分可用于制备药物。药物可以单独或组合给予个体，因此可包含结合成员和其它组分，例如组合制品或单独的制品。单独的制品可用于促进单独且依次或同时给药，并能通过不同途径，例如口服和胃肠外给药而给予诸组分。
按照本发明，提供的组合物可给予哺乳动物。给药可以是足以向患者显示益处的“治疗有效量”。这种益处可以至少缓解至少一种症状。所给予的实际量和给药速度及时程取决于所治疗疾病的性质和严重程度，所治疗的具体哺乳动物，各患者的临床情况，疾病的诱因，组合物的递送部位，结合成员的类型，给药方法，给药时间表和医学从业人员已知的其它因素。普通开业人员和其它医生负责治疗处方，例如剂量的决定等，其取决于所治疗疾病症状的严重程度和/或进展。抗体的恰当剂量在本领域是众所周知的(Ledermann等，Int.J.Cancer47：659-664，1991；Bagshawe等，Antibody，Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals 4：915-922，1991)。可利用适合于所给予药物类型的本文所述或Physician′s Desk Reference(医师案头参考)(2003年版)的具体剂量。可通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来测定本发明结合成员的治疗有效量或合适剂量。已知将小鼠和其它测试动物中的有效剂量外推至人的方法。精确剂量取决于许多因素，包括抗体是用于诊断、预防还是治疗，治疗区域的大小和部位，抗体的精确性质(例如，全抗体、片段或双抗体)和任何可检测标记物或与抗体相连的其它分子的性质。对于全身性给药，典型抗体剂量是100μg-1g，对于局部应用是1μg-1mg。可以先给予较高的加载剂量，然后给予一次或多次较低剂量。抗体一般是全抗体，例如IgG1同种型。这是成年患者单次治疗的剂量，对于儿童和婴儿可作适当调整，对于其它抗体形式也可根据分子量成比例地调节。治疗可遵医嘱以每日一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复。治疗可以是每2-4周皮下给予和每4-8周静脉内给予。在本发明的一些实施方式中，治疗是周期性的，给药之间的时期约为两周或更长，例如约3周或更长，约4周或更长，或约每月一次。在本发明的其它实施方式中，治疗可以在外科手术之前和/或之后给予，可以直接给予或应用于外科手术治疗的解剖部位。
以下非限制性实施例和附图对本发明作出进一步描述，其中：
图1是抗体2-42与抗体1的VH结构域的比对(分为表a和表b)。
图2是抗体2-42与抗体1的VL结构域的比对(分为表a和表b)。
图3是抗体1-19和21-42与抗体20的VH结构域的比对(分为表a和表b)。
图4是抗体1-19和21-42与抗体20的VL结构域的比对(分为表a和表b)。
图5是6xCDR的序列相同性表(分为a、b、和c)。
图6是3xVH CDR的序列相同性表(分为a、b、和c)。
图7是3xVL CDR的序列相同性表(分为a、b、和c)。
实施例
实施例1
1.1人IL-4Rα胞外结构域的克隆
使用基于人IL-4RαcDNA序列(RefSeq NM_000418)的引物，经PCR从HUVEC cDNA文库扩增编码人IL-4Rα胞外结构域序列(氨基酸残基1-229，Swiss-Prot保藏号P24394)的cDNA。所得cDNA遵循生产商(英杰公司(Invitrogen))的使用说明书亚克隆到pDONR201中。
编码IL-4Ra胞外结构域的cDNA片段随后用LR反应(英杰公司)转移到哺乳动物表达载体pDEST12.2(英杰公司)。pDEST12.2载体已经修饰，包含人IgG1Fc编码区，聚组氨酸(His6)标签与插入的感兴趣基因同框，还通过插入pCEP4载体(英杰公司)的oriP复制起点，从而在转染入细胞系后(比如HEK293-EBNA细胞)附加质粒能复制进而表达EBNA-1基因产物。
人IL-4RαmRNA的公共数据库登录号是NM-000418；感兴趣的关键区在该数据库序列中是243-929。所得人IL-4Rα/Fc的预见性氨基酸序列示于SEQID NO：454。
1.1.1表达与纯化
HEK-EBNA细胞用PEI转染。依次采用G蛋白层析和尺寸排阻层析从条件化的培养液纯化蛋白质。
1.2重组短尾猴IL-4Rα及人IL-4RαI75V突变体的克隆
使用以下寡核苷酸作为引物，通过聚合酶链反应(PCR)从短尾猴胸腺和淋巴结(BC股份有限公司(BioCat GmbH))扩增短尾猴IL-4Rα亚基：
5’ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctttaacttt aagaaggaga tataaccatg gggtggctttgctctgggct cctgttgcct gtgagc-3’(SEQ ID NO：451)
5’-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctgctcgaag ggctccctgt aggagttgta cca-3’(SEQ ID NO：452)
所得cDNA遵循生产商(英杰公司)的使用说明书亚克隆到pDONR201中。短尾猴IL-4Rα胞外结构域的序列示于SEQ ID NO：455。
1.3人IL-4RαI75V变体的克隆
使用包含人IL-4Rα编码序列(氨基酸残基1-229NP_000409)的pDONR201载体产生的人IL-4Rα，I75V的多态性。利用以下寡核苷酸作为突变引物，使用斯特拉塔基因公司的快变多定点诱变试剂盒(QuikChange Multisite-directed mutagenesis kit，Stratagene)将氨基酸位置75处的异亮氨酸突变为缬氨酸：5’-gaagcccacacgtgtgccctgagaacaacgga-3’(SEQ ID NO：453)
1.4产生短尾猴和I75V变体IL-4Rα/Fc的重组杆状病毒
短尾猴IL-4Rα和人IL-4RαI75V变体随后插入含有人IgG1Fc编码区的Gateway适应的pFastBac载体(内部)。短尾猴IL4Rα/Fc核苷酸和蛋白序列分别示于SEQ ID NO：456和SEQ ID NO：457。I75V IL4Rα/Fc核苷酸及蛋白质序列分别示于SEQ ID NO：458和SEQ ID NO：459。重组杆状病毒穿梭载体的产生如下所示：转化DH10Bac大肠杆菌(英杰公司)，用选择培养基涂覆在LB琼脂上。Sfp细胞用重组杆状病毒穿梭载体转染，得到高滴度重组杆状病毒。
1.5人I75V及短尾猴Fc标记IL-4Rα蛋白变体的表达和纯化
在SF-900II SFM培养基(英杰公司)中，用病毒MOI 1感染的Sf21细胞(400ml)表达蛋白质，细胞密度3x106细胞/毫升。分别在72和96小时后收获含有分泌的IL-4Rα-Fc融合蛋白的培养液。将Sf21细胞(400ml)的生长培养液调节至pH 8.0。依次用G蛋白层析和尺寸排阻层析纯化蛋白质。
2.实施例2.先导物分离
2.1选择
利用克隆入基于丝状噬菌体M13的噬菌粒载体的原初人单链Fv(scFv)噬菌体展示文库进行选择(Vaughan等，Nature Biotechnology 14(3)：309-314，1996年；Hutchings，C.Generation ofHuman Antibody Libraries(产生原初人抗体文库)，刊于Antibody Engineering(抗体工程改造)，R.Kontermann和S.Dubel编，2001，斯普林格实验室手册(Springer Laboratory Manuals)，伯林，第93页)。基本如以前Vaughan等(Vaughan，TJ.等，Nature Biotechnology 14(3)：309-14，1996)和Hawkins等(Journal ofMolecular Biology 226：889-896，1992)所述，利用一系列重组人IL-4RαFc的选择循环由噬菌体展示文库分离抗IL-4Rα特异性scFv抗体。简言之，为淘选，将PBS(杜贝克(Dulbecco)PBS，pH 7.4)配制的人IL-4RαFc吸附至ImmobilizerTM微量滴定板(Nunc)的各孔上，4℃过夜。用PBS洗涤各孔，然后用PBS-Marvel(3％w/v)封闭1小时。将包含10倍过量的无关Fc标记蛋白质的PBS-Marvel(3％w/v)配制的纯化噬菌体加入各孔，使之与包被的抗原结合1小时。用PBS-吐温(0.1％v/v)和PBS进行多轮洗涤以除去未结合的噬菌体。洗脱结合的噬菌体颗粒，感染入大肠杆菌TG1细菌并拯救以进行下一轮选择(Vaughan等，Nature Biotechnology 14(3)：309-314，1996)。
2.2用未纯化的scFv抑制IL4与IL-4受体结合在两个平行进行的时间分辨的均一荧光受体-配体实验中筛选周质制品中的未纯化scFv，以测定对人和短尾猴IL4Rα的抑制活性。在人试验中，未纯化的scFv样品和人生物素化IL4(Peprotec，进行内部生物素化)竞争与人IL4Rα-Fc受体结合(R&D系统公司(R and D Systems)，604-4R)。在短尾猴试验中，未纯化的scFv样品和短尾猴生物素化IL4(内部大肠杆菌表达，内部生物素化)竞争与短尾猴IL4Rα-Fc-HIS6结合(内部HEK表达)。详细的试验方法参见材料和方法章节(2.4)。
对作为未纯化的周质提取物在人及短尾猴受体-配体试验中对IL4结合IL4Rα显示抑制作用的ScFv进行DNA测序(参见：Osbourn等，Immunotechnology.2：181-196，1996)。在细菌中表达有独特序列的scFv，并通过亲和层析纯化(如Bannister等所述，Biotechnology and bioengineering，94.931-937，2006)。
2.3纯化的scFv抑制IL-4与IL-4受体结合
通过将一系列的纯化scFv稀释制品与IL4竞争结合IL4Rα来测定了scFv样品的效力。平行进行人及短尾猴受体-配体试验，如材料与方法章节2.4所述。抗体1的纯化scFv制品抑制人IL4与IL4Rα的结合，Ki值是12nM(95％Cl8.7，16.6)。抗体1对短尾猴IL4与IL4Rα结合的抑制不完全，观测到10％的试验信号抑制。因此，不可能由所得结果计算准确的Ki效力数据。
2.4材料和方法
抑制IL4与IL4Rα结合的受体-配体试验
高通量筛选
在两个平行进行的时间分辨的均一荧光受体-配体试验中筛选选择结果，以测定对人和短尾猴IL4Rα的抑制活性。
在这两个试验中，选择结果作为在50mM MOPS缓冲剂pH 7.4、0.5mMEDTA及0.5M蔗糖中配制的含scFv的未稀释或稀释的未纯化细菌周质提取物进行筛选。所有稀释在含有0.4M氟化钾和0.1％BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(试验缓冲液)中进行。
3.2nM的铕穴合物标记的山羊抗人Fc抗体(CIS生物国际公司(CIS BioInternational)61HFCKLB)与0.5nM的人IL4Rα/Fc(R&D系统公司604-4R)进行预混(预混“A”)。10nM的XL665-偶联的链霉亲和素(CIS生物国际公司611SAXLB)与4nM的人生物素化IL4预混(Peprotec，经内部生物素化)(预混“B”)。
对于短尾猴试验，同时将3.2nM的铕穴合物标记的山羊抗人Fc抗体(CIS生物国际公司61HFCKLB)与0.5nM的短尾猴IL4Rα/Fc(分离/Sf21表达的)或短尾猴IL4Ra/Fc HIS6(优化/HEK-表达的)进行预混(预混“A”)。10nM的XL665-偶联的链霉亲和素(CIS生物国际公司611SAXLB)与3nM的短尾猴生物素化IL4预混(经内部大肠杆菌表达及内部生物素化)(预混“B”)。
对于每一试验，将5μl的预混“A”添加到384孔低体积试验平板(Costar3676)。随后添加5μl未纯化的scFv样品。之后添加10μl的预混“B”。
对于人和短尾猴IL4Rα受体-配体结合试验，分别利用最终10nM的单克隆小鼠IgG2a克隆25463(R&D系统公司)或最终50nM的短尾猴IL4(内部大肠杆菌表达)定义非特异性结合。
然后在室温下将试验平板温育4小时，再用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))读取620nm和665nm发射波长的时间-分辨荧光。
通过计算各样品的％ΔF值分析数据。按照方程1测定ΔF。
方程1：
随后用％ΔF值计算％特异性结合，如方程2所述。
方程2：
Ki确定
制备一系列稀释浓度的纯化scFv，以在人和短尾猴试验中确定scFv效力Ki值。5μl的预混“A”添加到384孔低体积试验平板(Costar 3676)。随后添加5μl的scFv稀释样品。之后添加10μl的预混“B”。
对于人和短尾猴IL4Rα受体-配体结合试验，分别利用最终10nM的单克隆小鼠IgG2a克隆25463(R&D系统公司)或最终50nM的短尾猴IL4(内部大肠杆菌表达)定义非特异性结合。
然后在室温下将试验平板温育4小时，再用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)读取620nm和665nm发射波长的时间-分辨荧光。
通过计算各样品的％ΔF值分析数据。按照方程1测定ΔF。
方程1：
随后用％ΔF值计算％特异性结合，如方程2所述。
方程2：
利用4-参数逻辑方程(方程3)，采用图垫公司Prism软件通过曲线拟合测定IC50值。
方程3：
Y＝底+(顶-底)/(1+10^((LogEC50-X)*斜率(HillSlope)))
X是浓度的对数。Y是特异性结合。
Y从“底”开始，以S形上升到“顶”。
IC50值用方程式4描述的Cheng-Prusoff方程转换为Ki：
方程4：
Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)
实施例3：将scFv变型(reformatting)成IgG2
3.1
通过将VH和VL结构域分别亚克隆入表达完整的抗体重链和轻链的载体而将克隆从scFv转换成IgG形式。将VH结构域克隆入含有人重链恒定区和调节元件的载体(pEU9.2)以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG重链。类似地，将VL结构域克隆入表达人λ轻链恒定结构区和调节元件的载体(pEU4.4)，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG轻链。Persic等(Gene 187：9-18，1997)首先描述了表达重链和轻链的载体。可简单地通过引入OriP元件工程改造这些载体。为获得IgG，将重链和轻链IgG表达载体转染入EBNA-HEK293哺乳动物细胞(英杰公司R620-07-)。IgG经表达分泌入培养基。合并收集物，过滤后纯化。采用A蛋白层析纯化IgG。将培养物上清液加载于大小合适的A蛋白陶瓷柱(生物谱公司(BioSepra))上，用50mM Tris-HCl pH 8.0，250mM NaCl洗涤。利用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)将结合的IgG从柱上洗脱，加入Tris-HCl(pH 9.0)中和。利用Nap10柱(安玛西亚公司(Amersham)，第17-0854-02号)将洗脱物质的缓冲液替换成PBS，利用基于IgG的氨基酸序列的消光系数，通过分光光度法测定IgG的浓度(Mach等，Anal Biochem.200(1)：20-26，1992)。采用SEC-HPLC和SDS-PAGE分析纯化IgG的凝聚或降解。
3.2IgG对IL-13和IL-4诱导的TF-1细胞增殖的抑制
利用TF-1细胞增殖试验评估纯化IgG制品对人IL-13和IL-14生物活性的中和效力。TF-1是从红白血病患者建立的人早幼粒细胞系(premyeloid cell line)(Kitamura等，J.Cell Physiol.140(2)：323-34，1989)。TF-1细胞系的存活和增殖依赖某些因子。TF-1细胞能对人IL-13和IL-4起反应(派普罗泰克公司(Peprotech)，大肠杆菌来源)。通过检测氚化胸苷向分裂细胞的新合成DNA中掺入减少来确定IL-4和IL-13依赖性增殖的抑制。该方法的详述参见材料和方法章节3.2.1。
抗体1的变型IgG制品以浓度依赖性方式抑制IL-13和IL-14诱导的TF-1细胞增殖。抗体1对IL-13和IL-4的IC50几何平均值的计算值分别是18nM和38nM。
3.2.1材料和方法-纯化IgG对IL-13和IL-4诱导的TF-1细胞增殖的抑制
按照提供的方案培养TF-1细胞(R&D系统公司)。测定培养基包括含有GLUTAMAX I(英杰公司)、5％胎牛血清(JRH)、1％丙酮酸钠(西格玛公司(Sigma))、1-2％青霉素/链霉素的RPMI-1640。各测定前，300xg离心5分钟以沉淀TF-1细胞，吸除培养基，将细胞重悬于测定培养基。利用以2x105个细胞/毫升的终浓度重悬于测定培养基的细胞重复该过程两次。用100微升/孔的密度将细胞接种于96孔测定板。用测定培养基将IgG测试溶液(一式两份)滴定至所需浓度。不针对IL-4Rα的无关抗体用作阴性对照。试验以竞争形式设定，各为50微升的细菌衍生重组人IL-4或IL-1313(派普罗泰克公司)和恰当的测试抗体滴定液依次添加到100微升细胞中。试验中最终试验体积是200微升/孔，浓度为18pM(IL-4)或400pM(IL-13)。IL-4和IL-13的浓度选定为产生最大增殖反应的约50％时的剂量。在37℃和5％CO2下培育平板72小时。然后，在各测定点加入20μl氚标记的胸苷(5μCi/ml)，然后将平板放回培养箱再温育4-5小时。用细胞收获器在玻璃纤维滤板(帕金埃尔默公司)上收获细胞。用帕克托克(Packard TopCount)微孔板液体闪烁计数器测定胸苷掺入。然后，用图垫公司Prism软件分析数据。
实施例4：抗体优化
4.1通过靶向诱变优化亲代克隆
发现并开发对另一物种例如短尾猴的直向同源蛋白也显示交叉活性的人IL-4Rα抗体是有利和有益的。这样的抗体有助于表征此类抗体的药理学和体内安全性。效力和对另一物种的亲和力，例如与人活性的差异小于10倍，是一种适当的评价。
为实现所需的物种交叉反应，对亲代抗体(抗体1)进行优化，改善对人及短尾猴IL4Rα的亲和力。这可以采用靶向诱变法通过基于亲和力的噬菌体展示选择实现。对于靶向诱变方法，采用Clackson和Lowman(A PracticalApproach(实用方法)，2004年牛津大学出版社)所述的标准分子生物学技术，通过寡核苷酸指导的可变重链(VH)和轻链(VL)互补决定区3(CDR3)诱变产生衍生自抗体1的scFv-噬菌体大文库。
对这些文库进行基于亲和力的噬菌体展示选择以选择对IL-4Rα的人和短尾猴形式亲和力较高的变体。基本上如前所述(Thompson，Journal ofMolecularBiology.256：77-88，1996)进行选择。简言之，scFv噬菌体颗粒用重组生物素化人或短尾猴IL-4Rα在溶液(bio-huIL-4RαFLAG HIS或bio-cyno-IL-4RαFcHIS，均为内部HEK-EBNA衍生的)中培育。所用抗原的种类在每一轮选择中交替使用。然后按照生产商的推荐用链霉亲和素包被的顺磁性珠(M280)捕捉与抗原结合的scFv-噬菌体。所选scFv-噬菌体颗粒随后按先前描述(Osbourn，JK.等，Immunotechnology，2(3)：181-96，1996)拯救，选择过程在bio-huIL-4Rα或bio-cyno-IL-4Rα浓度下降的情况下重复进行，在每轮选择之间交替种类(500nM-250pM，6轮)。
完成6轮选择后，则合并VH和VL随机化文库以形成单一文库，其中的克隆含有随机配对的单独随机化的VH和VL序列。如前所述，选择随后在bio-huIL-4Rα或bio-cyno-IL-4Rα浓度下降的情况下(2.5nM-0.5pM，另外5轮)继续进行，适当时交替抗原的种类。
4.2通过随机诱变优化抗体
采用随机诱变方式进一步优化抗体之一(抗体20)，以鉴定抗体序列中会改善与人及短尾猴IL4Rα结合的关键残基。在抗体20scFv序列的整个可变区引入随机突变，生成大的scFv-噬菌体文库。利用DiversifyTM PCR随机诱变试剂盒(BD生物科学公司(BD biosciences))，按照生产商说明书进行两轮诱变，以便在每轮诱变中，在每一千个核酸序列的碱基中平均掺入8.1个突变。该策略中的方案与国际专利申请公开WO2006/072801(剑桥抗体技术公司(Cambridge Antibody Technology))一致。对这些文库进行基于亲和力的噬菌体展示选择以选择对IL-4Rα的人和短尾猴形式亲和力较高的变体。
基本上如前所述(Thompson，Journal of Molecular Biology.256：77-88，1996)进行选择。简言之，scFv噬菌体颗粒用重组生物素化的人或短尾猴IL-4Rα在溶液(bio-huIL-4RαFLAG HIS或bio-cyno-IL-4RαFc HIS，均为内部HEK-EBNA衍生的)中培育。在人与短尾猴之间交替抗原的种类以便相应地改善对特定IL-4Rα的亲和力。然后按照生产商的推荐用链霉亲和素包被的顺磁性珠M280)捕捉与抗原结合的scFv-噬菌体。所选scFv-噬菌体颗粒随后按先前描述(Osbourm，JK.等，Immunotechnology，2(3)：181-96，1996)拯救，选择过程在bio-huIL-4Rα或bio-cyno-IL-4Rα浓度下降的情况下重复进行(20nM-1pM，4轮)。
4.3采用受体-配体结合试验从随机诱变鉴定改善的克隆
来自靶向及随机诱变选择的scFv在细菌周质中表达并在两个平行进行的时间分辨的均一荧光受体-配体试验中筛选，以测定对人和短尾猴IL4Rα的抑制活性。详细的测定方法参见材料和方法章节2.4。对在两个试验中显示出显著抑制效果的ScFv进行DNA测序，有独特序列的scFv制备成纯制品。
通过将一系列的纯化scFv稀释制品与IL4竞争结合IL4Rα来测定纯化scFv抗体的效力。平行进行人及短尾猴受体-配体试验，参见测量与方法章节2.4。
各样品的scFv示例性效力数据见表1。
  抗体8   0.4   9.4   抗体30   69pM   3.6
抗体9   0.1(0.1，0.3) 12.9(9.0，19) 抗体31   44pM(26，76)   2.2(1.4，3.4)
  抗体10   0.5   19.6   抗体32   75pM   1.3
  抗体11   0.7   26.1   抗体33   92pM   1.4
  抗体12   0.3   7.2   抗体34   56pM   1.2
  抗体13   0.3   22.2   抗体35   71pM   2.6
抗体14   0.6(0.4，0.9) 27.7 抗体36 0.1 5.3
  抗体15   1.0(0.8，1.2)   32.3   抗体37   40pM(30，51)   0.8(0.7，1.0)
  抗体16   0.4(0.2，1.0)   8.7   抗体37GL   61pM(40，92)   0.7(0.5，1.1)
  抗体17   0.9   43.5   抗体38   66pM   2.7
  抗体18   0.7   56.5   抗体39   27pM   1.6
抗体19   0.8(0.4，1.6) 18.5 抗体40 31pM 6.5
  抗体20   0.7(0.6，0.8) 4.2(3.4，5.3) 抗体41 53pM 2.7
  抗体21   31pM(13，76) 1.0(0.5，1.9) 抗体42   27pM(16，49)   2.5(1.4，4.5)
  抗体22   0.3   2.6
  抗体23   0.2   4.8
4.4优化克隆对IL-13和IL-4诱导的TF-1细胞增殖的抑制
在TF-1增殖试验中还测定了纯化scFv抗体效力。
TF-1增殖试验中效力最强的克隆如先前所述转化成IgG，并在TF-1增殖试验中重新测试。各样品的IgG示例性效力数据见表2。
表2：用TF-1细胞增殖试验测试时改善型克隆的示例性效力
12B5＝依据WO 01/92340的教导制备基准抗体(benchmark antibody)。
4.5.种系化
将优化的抗-IL-4Rα抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列与VBASE数据库(蛋白质工程改造MRC中心(MRC Centre For Protein Engineering))中的已知人种系序列比对，通过序列相似性鉴定最接近的种系。对于优化抗体谱系的VH结构域，其是Vh1_DP-7_(1-46)。对于VL结构域，其是Vλ1_DPL5。
如果不考虑并未曾发生改变的微调残基(Foote&Winter，J Mol Biol.Mar20：224(2)：487-99，1992)，抗体37的VH结构域的构架中有三个改变，VL结构域中有2个改变，它们都回复成最接近的种系序列以便等同匹配人抗体。对于最接近的人种系匹配，抗体24在VH结构域有1个改变，在VL结构域中有2个改变。VH结构域中Kabat 37位处的改变以及VL结构域中Kabat 73位处的改变回复成最接近的人种系匹配时的。为保持效力，VL结构域中87号位置处的氨基酸改变保留不动(抗体24PGL)。氨基酸残基的种系化采用标准定位诱变技术以恰当的诱变引物进行。
将抗体37GL scFv序列克隆进克隆载体、转化入大肠杆菌Top10细胞(F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZΔM 15ΔlacX74recA 1araD139Δ(araleu)7697galU galK rpsL(StrR)endA1nupG)并根据布达佩斯条约于2008年12月9日在NCIMB(苏格兰阿伯丁)交付保藏。申请人的克隆标记是“抗体37GL”，而NCIMB登录号是NCIMB 41600。
然后，在IL-4和IL-13诱导的TF-1增殖实验中再次评估种系化IgG，以确认效力未降低。种系化的(GL)抗体的示例性效力见表3。
表3：在IL-4和IL-13诱导的TF-1细胞增殖实验中评估时种系化的优化克隆的示例性效力数据
数据表示为几何平均值，置信区间95％
4.6在表位竞争试验中优化抗体的选择性和物种交叉反应性采用表位竞争试验确立了抗体对IL-4Rα和结构相关性分子IL13Rα1Fc、IL13Rα2Fc及共同的γ链(IL-2Rγ)的物种交叉反应性以及选择性。该试验通过检测结合于各固定的抗-IL-4Rα抗体的生物素化IL-4RαHISFLAG(内部HEK-EBNA衍生的)的抑制作用来测定相对交叉反应性法。
在各试验中检测纯化的IL13Rα1Fc、IL13Rα2Fc及共同的γ链(IL-2Rγ)(均来自R&D系统公司)的滴度，以确定各结构相关蛋白质的特异性状况，如试验中IC50值所测的。
在各试验中测试包括短尾猴IL-4RαHIS Fc(内部HEK-EBNA衍生的)、人IL-4RαI75V Fc(AstraZeneca公司)、人IL-4RαFc、和鼠IL-4Rα(均来自R&D系统公司)在内的各种IL-4Rα物质的滴度，以确定这些抗体的物种交叉反应性。未生物素化的人IL-4RαHIS FLAG用作阳性对照。人及短尾猴IL-4RαHIS Fc连同人IL-4RαI75V Fc得到重叠的抑制曲线，IC50值不确定。测试的鼠IL-4Rα或相关人蛋白质未观察到抑制作用。结果表明，抗体37GL对于短尾猴IL-4Rα和人IL-4RαI75V有交叉反应性，但并不结合鼠IL-4Rα或与人IL-4Rα最相关的任何人源蛋白质。该方法的详述参见材料和方法章节4.6.1。
4.6.1材料和方法-表位竞争试验
在PBS中将纯化的IgG吸附到96-孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)上，其浓度为当将生物素化人IL-4RαHIS FLAG大致以该特定IgG的估计KD加入时能获得明显的信号。用PBS-吐温(0.1％v/v)洗去过量的IgG，用PBS-Marvel(3％w/v)封闭各孔1小时。用PBS配制以下竞争物中各自的系列稀释液，起始浓度是生物素化人IL-4Rα和各自IgG之间相互作用的KD值的约400倍：的人IL-4RαFc(R&D系统公司，604-4R-050)、人IL-4RαI75V Fc(阿斯特拉赞卡公司(AstraZeneca))、短尾猴IL-4RαHIS Fc(内部)、鼠IL4RαFc(R&D系统公司530-MR-100)、人共同γ链(sIL-2Rγ)(R&D系统公司384-RG-050-CF)、人IL-13Rα1Fc(R&D系统公司，146-IR-100)、人IL-13Rα2Fc(R&D Systems，614-IR-100)。未生物素化的人IL-4RαHIS FLAG用作阳性对照。向该系列稀释液中加入浓度约是KD两倍的等体积生物素化重组人IL-4Rα(获得竞争抗原：生物素化人IL-4Rα的起始比例约为200∶1的连续稀释液)。然后将这些混合物转移到封闭的IgG上，平衡1.5小时。用PBS-吐温(0.1％v/v)洗涤除去未结合的抗原，而用链霉亲和素-铕3+偶联物(检测，帕金埃尔默公司)检测剩下的生物素化人IL-4Rα。利用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)检测620nm的时间-分辨荧光。将荧光数据转换为％特异性结合(100％是从含有生物素化人IL-4Rα但不含竞争物的对照孔测定，0％是从含有生物素化人IL-4Rα和超过100倍的未生物素化人IL-4Rα的孔测定)。利用图垫公司(Graphpad)的Prism曲线拟合软件分析得到的数据以测定IC50值。
4.7利用BIAcore计算优化克隆的亲和力数据
基本如参考文献Karlsson等(J.Immunol.Methods，145(1-2)：229-240，1991)所述，通过表面等离振子共振，利用BIAcore 2000生物传感器(比阿可公司(BIAcore AB))测定代表性的部分抗体的纯化IgG样品与人和短尾猴IL-4Rα的结合亲和力。简言之，根据生产商的使用说明书(比阿可公司)，利用标准胺连接试剂将G’蛋白(西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma Aldrich)，P4689)共价偶联于CM5传感器芯片表面。G’蛋白表面用于通过Fc结构域俘获恒定量的纯化抗IL4Rα抗体或同种型对照。用HBS-EP缓冲液(比阿可公司)配制浓度范围在100nM和0.2nM之间的人或短尾猴IL-4RαHIS FLAG，使其流过传感器芯片表面。在抗体的每次注射之间用10mM、pH为1.75的甘氨酸使表面再生。用BIA评估软件4.1版评估得到的传感器图，并拟合至1∶1朗格缪尔结合模型，以提供相对结合数据。实验在至少不同的三天的时程里进行，以便计算平均的单价亲和力。从获得的数据拟合，抗体37GL与人及短尾猴IL-4Rα的亲和力分别测定为大约504pM和4.4nM，见表4。
表4：代表性的部分抗体与人及短尾猴IL4Rα结合的示例性动力学分析
实施例5使用嵌合人/鼠IL4Ra胞外结构域对IL-4Rα：抗体相互作用进行表位作图
5.1产生全结构域对换嵌合IL-4Rα分子
本发明的结合成员强力结合人IL-4Rα，但对鼠IL-4Rα结合极差，几乎观察不到。利用这个性质，产生了嵌合IL-4Rα分子进行表位作图。全结构域对换嵌合体的形成是通过用相应的鼠IL-4Rα序列置换人IL-4Rα胞外域中的结构域1(D1)(M1-E119)或结构域2(D2)(H120-F229)。环对换嵌合体的生成是通过用鼠IL-4Rα的相应区域置换人IL-4Rα中已知与IL4相互作用的环区(Hage等，Cell 97：271-281，1999)。采用HTRF(时间分辨的均一荧光)竞争试验测定嵌合体与抗体的结合。在试验中，Eu3+穴合物标记的抗体与生物素标记的人IL-4Rα相互作用。这种相互作用通过Eu3+穴合物和XL665标记的链霉亲和素之间的FRET(荧光共振能转移)信号检测(Mathis等，Clin Chem 41：1391-1397，1995)。
5.1.1材料和方法-嵌合体克隆化、表达和纯化
编码人IL-4Rα胞外结构域(氨基酸残基1-229NP_000409)和鼠IL-4Rα胞外结构域(氨基酸残基1-230NP_001008700)的嵌合体的cDNA分子通过引物延伸PCR克隆合成并克隆入pDONR221(英杰公司目录号12536-017)。随后根据生产商的使用说明书(英杰公司目录号12538-120)，用LR Gateway Clonase II酶将编码IL-4Rα胞外结构域的cDNA片段转移到哺乳动物表达载体pDEST12.2(英杰公司)。pDEST12.2载体已经修饰，包含FLAG 10xhis标签(DYKDDDDKAAHHHHHHHHHH；例如参见SEQ ID NO：460，位置252-261)，框内插有感兴趣的基因，还插入了pCEP4载体(英杰公司的入oriP复制起点，从而在转移进入表达EBNA-1基因产物的细胞系(比如HEK293-EBNA细胞)后附加质粒能复制。HEK293-EBNA上清液中的表达蛋白质依次采用Ni-NTA亲和层析(Histrap HP柱(GE保健公司(GE Healthcare)目录号17-5248-02))和尺寸排阻层析(Superdex 200柱(GE保健公司目录号17-1069-01))进行纯化。
人IL-4Rα胞外结构域(位置1-229；同样的在NP_000409中)、载体编码序列(位置230-241)、FLAG标签(位置242-249)以及10xhis标签(位置252-261)，见SEQ ID NO：460。鼠IL-4Rα胞外结构域(位置1-230；同样的在NP_001008700中)、载体编码序列(位置233-242)、FLAG标签(位置243-250)以及10xhis标签(位置253-262)，见SEQ ID NO：461。
5.1.2抗体与IL-4Rα嵌合体的结合
根据生产商的使用说明书，用Eu3+穴合物标记试剂盒对抗体进行穴合物标记(Cis生物国际公司目录号62EUSPEA)，IL-4Rα/Fc(R&D系统公司目录号604-4R-050)，根据生产商的使用说明书，用EZ Link NHS-生物素进行生物素标记(PB公司(Perbio)目录号20217)。试验条件是0.4nM穴合物标记的抗体、0.25nM生物素标记的IL-4Rα/Fc、2.5nM链霉亲和素XL665(Cis生物国际公司目录号611SAXLB)，用1x DPBS、0.1％BSA、0.4M氟化钾配制成总体积为20μl，用384孔微孔板(吉内公司(Greiner))。向试验添加的测试蛋白的系列稀释液(从1000nM到0.017nM)，并将其在4℃C温育过夜。采用PerkinElmerEnVision读板器用320nm激发过滤器以及620nm和665nm发射过滤器检测FRET信号。从665/620比例计算结果，表示成特异性结合(specific binding)百分数(无竞争抗原时的信号)。采用图垫软件公司的Prism(GraphPad Software)用S形剂量反应模型分析这些结果。
5.2结果
嵌合体分子的抗体结合在HTRF(时间分辨的均一荧光)竞争试验中测试。在与人IL-4Rα相同的互补位结合抗体的分子抑制结合相互作用，导致信号下降。从抑制曲线计算人IL-4Rα、鼠IL-4Rα和嵌合分子的IC50值(表5)。如果一个分子不完全抑制结合，则计算最高浓度时观察到的抑制百分数。产生类似于天然人IL-4Rα的IC50的嵌合体仍然含有相关表位。未完全地抑制IL-4Rα与抗体的结合，或者IC50值有所增长的嵌合体不含有全部表位。这些数据可以定位抗体表位。
  嵌合体   NP_000409的序列   NP_001008700的序列   竞争试验中的IC50(nM
  HuIL-4Rα   M1-F229   0.673
  MoIL-4Rα   M1-L230   45％抑制*
  HuD 1MoD2IL-4Rα   M1-E119   N121-L230   3.4
  MoD 1HuD2IL-4Rα   H120-F229   M1-G120   34％抑制*
  MoLoop 1HuIL-4Rα   M1-Y38；S42-F229   I39-T41   1.9
  MoLoop2HuIL-4Rα   M1-L64；T73-F229   M65-L73   23
  MoLoop3HuIL-4Rα   M1-L88；Y99-F229   E90-R99   58％抑制*
  MoLoop4HuIL-4Rα   M1-W143；N151-F229   N145-N151   0.663
  MoLoop5HuIL-4Rα   M1-W204；T211-F229   S206-G211   1.4
  AllMoLoopsHuIL-4Rα   M1-Y38；S42-L88；Y99-W143；   I39-T41；M65-173；E90-R99；N145-N151；   41％抑制*
 N151-W204；T211-F229   S206-G211
表5：与人IL-4Rα竞争结合抗体的嵌合IL-4Rα分子的IC50(单位：nM)。测试了包含人(NP_000409)和鼠(NP_001008700)IL-4Rα的氨基酸序列的嵌合体人IL-4Rα竞争结合抗体的能力。在获得完全竞争曲线时计算IC50值。*当嵌合体无法完全抑制人IL-4Rα结合抗体时，显示的是在嵌合体最高浓度(1000nM)观察到的抑制百分数。
嵌合的人/鼠IL-4Rα嵌合体的结合作用能够定位抗体所结合的人IL-4Rα表位。全结构域对换嵌合体将表位定位在人IL-4Rα的D1(残基M1-E119)，因为人D1-鼠D2嵌合体能够与人IL-4Rα竞争，而鼠D1-人D2嵌合体无法完全抑制人IL-4Rα结合(表5)。表位几乎完全由环区组成，由于AllMoLoops嵌合体和MoIL-4Rα显示非常类似的抑制百分数(表5)。
人IL-4Rα包含5个环区域，其在晶体结构中与IL4紧邻(Hage等，Cell97：271-281，1999)。环对换嵌合体还能够将人IL-4Rα表位定位在第3环中的主要组分(残基L89-N98)和第2环中的次要组分(残基V65-H72)。没有人第3环的嵌合体无法抑制人IL-4Rα与抗体的结合，而没有第2环的嵌合体得到比人IL-4Rα高100倍的IC50(表5)。与结构域对换数据相一致，第2环和第3环都在D1中(Hage等，Cell 97：271-281，1999)。
从这些数据将该抗体表位定于人IL-4Rα的两个环区域，V65-H72和L89-N98中18氨基酸的不连续表位。
5.3采用MoLoop2Hu IL-4Rα和MoLoop3HuIL-4Rα的突变体进一步定位抗体的IL-4Rα表位
为定位人IL-4Rα抗体表位的重要残基，生成了MoLoop2HuIL-4Rα和MoLoop3HuIL-4Rα的突变体，并在HTRF竞争试验中测试活性。
MoLoop2HuIL-4Rα(表5)经突变使鼠残基转化回人。当表位重要的残基发生突变，IC50值就比MoLoop2HuIL-4Rα的低(表6)。三个突变体(构建物EM18、EM22和EM23)得到类似于MoLoop2HuIL-4Rα的IC50值(表6)。除此之外，当鼠残基N72和L73被置换成人IL-4Rα时，所得嵌合分子能够强力抑制人IL-4Rα/抗体相互作用(表6)。这些数据表明，人IL-4Rα残基V65、A71和H72不是抗体表位中的重要部分。
第2环的其余三个小鼠残基(F67、E68、F69)对应于两个人残基(L67、L68)。在MoLoop2HuIL-4Rα突变体中，当两个小鼠苯丙氨酸残基中的任一个被人赖氨酸残基置换时，IC50下降(表6)。当小鼠E68从MoLoop2HuIL-4Rα除去时，IC50也下降，表明鼠第2环中的酸性谷氨酸残基是抗体表位的阻滞部分。除此之外，当所有的三个小鼠残基(F67、E68、F69)置于人IL-4Rα中时，嵌合体仅微弱抑制人IL-4Rα/抗体相互作用(表6)。这些数据显示，人残基L67和L68是人IL-4Rα的抗体交换表位的部分。
  构建物名称   第2环序列   竞争试验中的IC50(nM)
  人IL-4Rα   VfL-LseAH   0.673
  MoLoop2HuIL-4Rα   MfFEFseNL   25
  EM18   VfFEFseNL   20
  EM19   MfLEFseNL   4.5
  EM20   MfF-FseNL   3.8
  EM21   MfFELseNL   5.7
  EM22   MfFEFseA L   19
  EM23   MfFEFseNH   56
  EM24   VfFEFseAH   13
  EM25   VfL-LseNL   0.448
表6：与人IL-4Rα竞争结合抗体的嵌合IL-4Rα分子的IC50(单位：nM)。测试了包含人IL-4Rα(NP_000409)的M1-L64和T73-F229氨基酸、带有不同第2环区域的嵌合体与人IL-4Rα竞争结合抗体的能力。人与小鼠之间的保守性残基用小写表示，与小鼠残基不同的人残基用大写粗体斜体表示，不同于人残基的小鼠残基用普通大写表示。在获得完全竞争曲线时计算IC50值。
对于第3环，构建了人IL-4Rα的突变体，其中个别残基变成了小鼠残基(表7)。当表位重要性残基发生突变时，观察到IC50比人IL-4Rα低。
两个突变体的阻滞人IL-4Rα/抗体相互作用的能力急剧下降，表明它们是表位的一部分。当人IL-4RαD92突变成R(在突变体EM03中)，该突变型蛋白在1000nM时也不能够阻滞IL-4Rα/抗体相互作用。当人IL-4RαV93突变成P(在突变体EM04中)，IC50值比人IL-4Rα高20倍(表7)。比较而言，人IL-4Rα突变体L89E、D91N、S95Q、A96V和N98R(嵌合体EM01、EM02、EM05、EM06和EM07)都得到类似人IL-4Rα的IC50值(表3)。这些数据表明，抗体表位包含人IL-4RαD92和V93，且D92是人IL-4Rα/抗体相互作用最重要的残基。
  构建物名称   第3环序列   竞争试验中的IC50(nM)
  人IL-4Rα   LmDDVvSAdN   0.673
  MoLoop3HuIL-4Rα   EmNRPvQSdR   45％抑制*
  EM01   EmDDVvSAdN   0.71
  EM02   LmNDVvSAdN   2.25
  EM03   LmDRVvSAdN   29％抑制*
  EM04   LmDDPvSAdN   15
  EM05   LmDDVvQAdN   1.65
  EM06   LmDDVvSSdN   3.25
  EM07   LmDDVvSAdR   1.41
表7：与人IL-4Rα竞争结合抗体的嵌合IL-4Rα分子的IC50(单位：nM)。测试了包含人IL-4Rα(NP_000409)的M1-L88和Y99-F229氨基酸、带有不同第3环区域的嵌合体与人IL-4Rα竞争结合抗体的能力。人与小鼠之间的保守性残基用小写表示，与小鼠残基不同的人残基用大写粗体斜体表示，不同于人残基的小鼠残基用普通大写表示。在获得完全竞争曲线时计算IC50值。*当嵌合体无法完全抑制人IL-4Rα对抗体的结合时，显示的是在嵌合体最高浓度(1000nM)观察到的抑制百分数。
结构域对换和诱变将抗体表位定位在人IL-4Rα的第2环(残基65-72)和第3环(残基89-98)。表位可进一步定位至第2环的氨基酸残基L67和L68以及第3环的D92和V93(残基67、68、92和93的位置见SEQ ID NO：454)。
本发明的抗体对短尾猴IL-4Rα也有交叉反应性。令人感兴趣的事实是，表位残基D92和V93同样出现在短尾猴IL-4Rα中。
序列
本发明对换成员的序列显示在所附的序列表中，其中SEQ ID编号对应如下：
  序列   描述
  1   抗体1VH DNA
  2  抗体1VH PRT
  3  抗体1CDR1 PRT
  4  抗体1CDR2 PRT
  5  抗体1CDR3 PRT
  6  抗体1VL DNA
  7  抗体1VL PRT
  8  抗体1CDR1 PRT
  9  抗体1CDR2 PRT
  10  抗体1CDR3 PRT
  11  抗体2VH DNA
  12  抗体2VH PRT
  13  抗体2CDR1 PRT
  14  抗体2CDR2 PRT
  15  抗体2CDR3 PRT
  16  抗体2VL DNA
  17  抗体2VL PRT
  18  抗体2CDR1 PRT
  19  抗体2CDR2 PRT
  20  抗体2CDR3 PRT
  21  抗体3VH DNA
  22  抗体3VH PRT
  23  抗体3CDR1 PRT
  24  抗体3CDR2 PRT
  25  抗体3CDR3 PRT
  26  抗体3VL DNA
  27  抗体3VL PRT
  28  抗体3CDR1 PRT
  29  抗体3CDR2 PRT
  30  抗体3CDR3 PRT
  31  抗体4VH DNA
  32  抗体4VH PRT
  33  抗体4CDR1 PRT
  34  抗体4CDR2 PRT
  35  抗体4CDR3 PRT
  36  抗体4VL DNA
  37  抗体4VL PRT
  38  抗体4CDR1 PRT
  39  抗体4CDR2 PRT
  40  抗体4CDR3 PRT
  41  抗体5VH DNA
  42  抗体5VH PRT
  43  抗体5CDR1 PRT
  44  抗体5CDR2 PRT
  45  抗体5CDR3 PRT
  46  抗体5VL DNA
  47  抗体5VL PRT
  48  抗体5CDR1 PRT
  49  抗体5CDR2 PRT
  50  抗体5CDR3 PRT
  51  抗体6VH DNA
  52  抗体6VH PRT
  53  抗体6CDR1 PRT
  54  抗体6CDR2 PRT
  55  抗体6CDR3 PRT
  56  抗体6VL DNA
  57  抗体6VL PRT
  58  抗体6CDR1 PRT
  59  抗体6CDR2 PRT
  60  抗体6CDR3 PRT
  61  抗体7VH DNA
  62  抗体7VH PRT
  63  抗体7CDR1 PRT
  64  抗体7CDR2 PRT
  65  抗体7CDR3 PRT
  66  抗体7VL DNA
  67  抗体7VL PRT
  68  抗体7CDR1 PRT
  69  抗体7CDR2 PRT
  70  抗体7CDR3 PRT
  71  抗体8VH DNA
  72  抗体8VH PRT
  73  抗体8CDR1 PRT
  74  抗体8CDR2 PRT
  75  抗体8CDR3 PRT
  76  抗体8VL DNA
  77  抗体8VL PRT
  78  抗体8CDR1 PRT
  79  抗体8CDR2 PRT
  80 抗体8CDR3 PRT
  81 抗体9VH DNA
  82 抗体9VH PRT
  83 抗体9CDR1 PRT
  84 抗体9CDR2 PRT
  85 抗体9CDR3 PRT
  86 抗体9VL DNA
  87 抗体9VL PRT
  88 抗体9CDR1 PRT
  89 抗体9CDR2 PRT
  90 抗体9CDR3 PRT
  91 抗体10VH DNA
  92 抗体10VH PRT
  93 抗体10CDR1 PRT
  94 抗体10CDR2 PRT
  95 抗体10CDR3 PRT
  96 抗体10VL DNA
  97 抗体10VL PRT
  98 抗体10CDR1 PRT
  99 抗体10CDR2 PRT
  100 抗体10CDR3 PRT
  101 抗体11VH DNA
  102 抗体11VH PRT
  103 抗体11CDR1 PRT
  104 抗体11CDR2 PRT
  105 抗体11CDR3 PRT
  106 抗体11VL DNA
  107 抗体11VL PRT
  108 抗体11CDR1 PRT
  109 抗体11CDR2 PRT
  110 抗体11CDR3 PRT
  111 抗体12VH DNA
  112 抗体12VH PRT
  113 抗体12CDR1 PRT
  114 抗体12CDR2 PRT
  115 抗体12CDR3 PRT
  116 抗体12VL DNA
  117 抗体12VL PRT
  118 抗体12CDR1 PRT
  119   抗体12CDR2 PRT
  120   抗体12CDR3 PRT
  121   抗体13VH DNA
  122   抗体13VH PRT
  123   抗体13CDR1 PRT
  124   抗体13CDR2 PRT
  125   抗体13CDR3 PRT
  126   抗体13VL DNA
  127   抗体13VL PRT
  128   抗体13CDR1 PRT
  129   抗体13CDR2 PRT
  130   抗体13CDR3 PRT
  131   抗体14VH DNA
  132   抗体14VH PRT
  133   抗体14CDR1 PRT
  134   抗体14CDR2 PRT
  135   抗体14CDR3 PRT
  136   抗体14VL DNA
  137   抗体14VL PRT
  138   抗体14CDR1 PRT
  139   抗体14CDR2 PRT
  140   抗体14CDR3 PRT
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  363   抗体37CDR1 PRT
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  368   抗体37CDR1 PRT
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  397   抗体40VL PRT
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  405   抗体41CDR3 PRT
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  408   抗体41CDR1 PRT
  409   抗体41CDR2 PRT
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  412   抗体42VH PRT
  413   抗体42CDR1 PRT
  414   抗体42CDR2 PRT
  415   抗体42CDR3 PRT
  416   抗体42VL DNA
  417   抗体42VL PRT
  418   抗体42CDR1 PRT
  419   抗体42CDR2 PRT
  420   抗体42CDR3 PRT
  421   抗体24PGLVH DNA
  422   抗体24PGLVH PRT
  423   抗体24PGLCDR1 PRT
  424   抗体24PGLCDR2 PRT
  425   抗体24PGLCDR3 PRT
  426   抗体24PGLVL DNA
  427   抗体24PGLVL PRT
  428   抗体24PGLCDR1 PRT
  429   抗体24GLCDR2 PRT
  430   抗体24GLCDR3 PRT
  431   抗体24GLVH DNA
  432   抗体24GLVH PRT
  433   抗体24GLCDR1 PR
  434   抗体24GLCDR2 PRT
  435   抗体24GLCDR3 PRT
  436   抗体24GLVL DNA
  437   抗体24GLVL PRT
  438   抗体24GLCDR1 PRT
  439   抗体24GLCDR2 PRT
  440   抗体24GLCDR3 PRT
  441   抗体37GLVH DNA
  442   抗体37GLVH PRT
  443   抗体37GLCDR1 PRT
  444   抗体37GLCDR2 PRT
  445   抗体37GLCDR3 PRT
  446   抗体37GLVL DNA
  447   抗体37GLVL PRT
  448   抗体37GLCDR1 PRT
  449   抗体37GLCDR2 PRT
  450   抗体37GLCDR3 PRT
  451   短尾猴IL4R引物1
  452   短尾猴IL4R引物2
  453   I75V寡核苷酸突变引物
  454   人IL-4Rα/Fc蛋白
  455   短尾猴IL-4RαcDNA核苷酸
  456   短尾猴IL-4Rα/Fc cDNA核苷酸
  457   短尾猴IL-4Rα/Fc cDNA蛋白质
  458   人I75V IL-4Rα/Fc cDNA核苷酸序列
  459   人I75V IL-4Rα/Fc蛋白质
  460   人IL-4Rα/FLAG/HIS标签氨基酸序列
  461   小鼠IL-4Rα/FLAG/HIS标签氨基酸序列

Claims (19)

1.一种特异结合人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的抗体，其中：
HCDR1是氨基酸序列SEQ ID NO:363；
HCDR2是氨基酸序列SEQ ID NO:364；
HCDR3是氨基酸序列SEQ ID NO:365；
LCDR1是氨基酸序列SEQ ID NO:368；
LCDR2是氨基酸序列SEQ ID NO:369；和
LCDR3是氨基酸序列SEQ ID NO:370。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括抗体VH结构域和抗体VL结构域，其中所述VH结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和第一构架区，所述VL结构域包含LCDR1、LCDR2、LCDR3和第二构架区。
3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体分子是scFv。
4.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体分子包含抗体恒定区。
5.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体分子是IgG1、IgG2或IgG4分子。
6.一种组合物，其包含如权利要求1所述分离的抗体和药学上可接受的赋形剂。
7.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求1所述的抗体的核苷酸序列。
8.一种用如权利要求7所述核酸分子体外转化的宿主细胞。
9.一种特异结合人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的分离的抗体，其包含VH和VL结构域，其中所述VH结构域是氨基酸序列SEQ ID NO:442且所述VL结构域是氨基酸序列SEQ ID NO:447。
10.如权利要求9所述的抗体，其特征在于，所述抗体分子是scFv。
11.如权利要求9所述的抗体，其特征在于，所述抗体分子包含抗体恒定区。
12.如权利要求9所述的抗体，其特征在于，所述抗体分子是IgG1、IgG2或IgG4分子。
13.一种组合物，其包含如权利要求9所述分离的抗体和药学上可接受的赋形剂。
14.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求9所述的抗体的核苷酸序列。
15.一种用如权利要求14所述核酸分子体外转化的宿主细胞。
16.如权利要求1-5和9-12中任一项所述分离的抗体在制造治疗个体中异常IL-4Rα表达和/或IL-4Rα活性相关疾病的药物中的用途，所述疾病选自下组：变态反应、气喘、支气管炎、COPD、炎性肠病、纤维变性病症或移植排异。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述变态反应选自延迟型过敏或接触过敏性反应。
18.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述疾病是哮喘。
19.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述疾病是特应性皮炎。
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