TWI721973B - 新穎之ｉｌ３３型式、ｉｌ３３之突變型式、抗體、試驗及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供經分離之IL-33蛋白質、其活性片段；及針對IL-33蛋白質之抗體、其抗原結合片段。亦例如出於治療免疫及發炎性病症之目的，提供調節細胞因子活性之方法。

Description

新穎之IL33型式、IL33之突變型式、抗體、試驗及其使用方法
本發明係關於新穎IL-33型式；新穎IL-33突變；結合蛋白，諸如對該等蛋白質中之任一者具有特異性之抗體，尤其能夠調節該本發明型式之量的結合蛋白；包含蛋白質或結合蛋白，諸如根據本發明之抗體的組成物；及上述各者中之任一者尤其用於治療之用途，例如用於發炎性疾病之預防治療。本文之揭示內容亦延伸至用於識別及/或定量不同IL-33型式之試驗。
介白素-33(IL-33)亦稱為IL-1F11，其為刺激二型免疫反應之細胞、細胞因子及免疫球蛋白特徵的產生之IL-1家族細胞因子之一員。IL-33為270胺基酸蛋白，其由兩個域組成：同源域及細胞因子(IL-1樣)域。同源域含有核定位信號(NLS)。IL-33介導信號經由ST2轉導，ST2為在Th2細胞、肥大細胞及多種其他細胞類型上表現之受體。
Schmitz等人首次將IL-33識別為孤兒受體ST2之配位體(亦稱為IL-1R4)(Schmitz等人，Immunity 23(5)479-90(2005))。IL-33受體由雜二聚體分子形成。ST2及IL-1R輔助蛋白(IL-1RAcP)二聚形成IL-33受體(ST2：IL-1RAcP)。IL-1RAcP為IL-1α、IL-1β、IL-1F6、IL1F8及IL1F9之受體的共用組分。IL-1RAcP不需要結合，但對於信號傳導至關重要。IL-33受體之TIR域補充MyD88及TRAF6，且受體信號導致NFκB 及MAP激酶路徑活化(Oboki等人，Allergology International 59：143-160(2010))。IL-33受體可能與其他受體結合，且據報導在肥大細胞上與c-kit相互作用(Drube等人，Blood 115：3899-3906(2010))。
最近，已展示IL-33結合第二IL-33受體雜二聚體複合物：ST2亦與另一IL-1R家族分子「單一Ig IL-1R相關分子」(SIGIRR)(亦稱為Toll IL-1R8(TIR8))形成複合物，以形成ST2：SIGIRR。SIGIRR/TIR8視為充當IL-1R及Toll樣受體(TLR)介導之免疫反應的負調節劑(Garlanda等人，Trends Immunol.30：439-46(2009))。與ST2：IL-1RAcP相比，ST2：SIGIRR似乎充當IL-33之負調節劑(Oboki等人(2010))。
ST2受體之唯一已知配位體為IL-33(參見例如，Schmitz等人，Immunity 23(5)479-90(2005)；Chackerian等人，J.Immunol.179(4)：2551-5(2007))。ST2受體在基線由Th2細胞及肥大細胞表現，兩種細胞類型已知為過敏性哮喘之重要介質。胞外IL-33型式藉由與ST2結合且隨後活化NFκB及MAP激酶路徑，導致包括產生細胞因子及趨化因子之一系列功能性反應來刺激靶細胞。可溶性ST2(sST2)被認為是誘餌受體，阻止IL-33信號傳導。
在人類中，發現IL-33在平滑肌及支氣管上皮中組成性地表現。表現可藉由IL-1β及TNF-α在肺及真皮纖維母細胞中誘導(Schmitz等人(2005))。可溶性ST2蛋白及IL-33 mRNA/蛋白之含量在患有哮喘之患者的血清及組織中增加(Oboki等人，Allergology International 59：143-160(2010))。
在活體內，IL-33誘導IL-4、IL-5及IL-13表現，且導致黏膜器官中之嚴重病理變化。向小鼠投與IL-33具有有效致炎作用，包括大量血液嗜伊紅血球增多、血清IL-5及IgE含量增加及杯狀細胞在黏膜表面增生(Schmitz等人(2005))。向小鼠腹膜內或鼻內投與IL-33導致經由IL-13及STAT6依賴性路徑在肺及腸黏膜中誘導嗜伊紅血球炎症 (Oboki等人(2010))。因此，IL-33可能在諸如哮喘之過敏性疾病及其他發炎性氣管疾病中起作用。
文獻中之一些報導表明杯狀細胞分泌CXCL8/IL-8，且此藉由IL-33經由ST2R-ERK路徑增加，表明在具有杯狀細胞化生之哮喘氣管中增強之氣管炎症的機制(Clin Exp Allergy.2014年4月；44(4)：540-52)。
因此，已關注IL-33作為治療靶。然而，迄今為止，尚未完全明白阻斷此治療靶之治療益處。本發明人第一次確定IL-33以還原型式(在本文中亦稱為redIL-33)及氧化型式存在。本發明人已如本文所描述第一次表徵IL-33之氧化型式。本發明人之活體外及活體內研究已展示redIL-33(還原型式)之消失與氧化型IL-33之出現相關。在活體外生理流體中，redIL-33快速氧化形成二硫鍵型式。氧化型式(在本文中亦稱為IL-33-DSB)具有至少一個(例如，兩個)二硫鍵，其間有選自Cys208、Cys 227、Cys 232及Cys259之群的半胱胺酸(參照如UniProt O97560中所揭示之全長人類IL-33來編號，其殘基112至270列於SEQ ID NO.632內)。先前尚未瞭解，市售之試驗似乎顯著偵測此氧化型式。本發明人因此需要將試驗設計成選擇性偵測引起與ST2互動且驅動與IL-33釋放相關之生物活性的redIL-33。
還原型式似乎為產生信號級聯之蛋白質活性型式，且實際上在活體內似乎還原型式被轉化成氧化型式，作為終止經由ST2之信號傳導的機制。本發明人已發現redIL-33結合ST2(圖24A)。相比之下，IL-33-DSB展示無ST2結合(圖24B)。此使得本發明人假設活體內氧化可為斷開IL-33-ST2活性之機制。另外，本發明人已第一次確定IL-33氧化型式(IL-33-DSB)與晚期糖基化終點產物之受體(RAGE)結合且經由此替代路徑進行信號傳導(圖56)。
本發明人咸信此理解可用於產生更有效治療劑。在一個實施例中，本發明人已識別優先結合氧化型式，但藉由基本上催化還原型式 向氧化型式之轉化出人意料地減弱還原型式之活性的抗體。此機制宜僅增強活體內終止經由ST2之信號傳導的機制。
在另一實施例中，本發明人已識別優先以飛莫耳濃度親和力結合IL-33還原型式(redIL-33)，且減弱及/或抑制IL-33介導之經由ST2之信號傳導的抗體。此抗體第一次提供治療或預防IL-33/ST2介導之發炎性反應的機制。
在又一實施例中，本發明之抗體可減弱或抑制先前未辨識之經由RAGE之IL-33-DSB信號傳導路徑及任何IL-33/RAGE介導之效應。本發明之抗體可藉由直接結合IL-33-DSB及減弱或抑制配位體/受體與RAGE相互作用，或者可與redIL-33結合及防止或減少其轉化為IL-33-DSB，藉此間接減弱或抑制配位體/受體與RAGE相互作用來起作用。
因此，在第一態樣中，提供經分離之IL-33還原型式(redIL-33)或其結合片段。
在一個態樣中，提供一種經分離之IL-33蛋白質，其藉由防止在天然半胱胺酸之間形成二硫橋鍵之修飾法而呈還原型式來穩定。該等修飾可包含一或多個半胱胺酸殘基缺失、一或多個天然半胱胺酸經替代胺基酸置換之突變及/或與化學實體結合。
在一個實施例中，提供一種如本文所描述，尤其如SEQ ID NO：634至648中所展示之IL-33突變型式。
在一個實施例中，化學實體為生物素，其降低或消除redIL-33轉化為IL-33-DSB之能力。
在一個態樣中，提供一種突變IL-33，其中一或多個半胱胺酸經非半胱胺酸胺基酸置換，例如其中選自Cys-208、Cys-227、Cys-232及Cys-259之一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸例如經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，半胱胺酸殘基獨立地選自 Cys-208、Cys-227、Cys-232及Cys-259。因此，在一個實施例中，根據本發明之突變不能形成IL-33-DSB中的二硫鍵中之一者或兩者。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離之結合分子，其減弱根據本發明之redIL-33(包括其穩定型式)的活性，例如抑制該活性。在一個實施例中，減弱係經由特異性結合redIL-33。在一個實施例中，減弱係經由結合IL-33-DSB，及例如催化或加速redIL-33轉化為IL-33-DSB。
在一個實施例中，減弱使ST2依賴性信號傳導下調或斷開。
在某些實施例中，本發明之結合分子或抗體或其抗原結合片段抑制例如在肥大細胞中IL-33驅動之細胞因子產生。
在一個實施例中，減弱下調或防止自ST2路徑之IL-5釋放。
在一個實施例中，減弱下調或防止嗜伊紅血球活化。
在一個實施例中，減弱下調或防止NFκB釋放。在一個實施例中，減弱下調或防止IL-4釋放。在一個實施例中，減弱下調或防止IL-6釋放。在一個實施例中，減弱下調或防止IL-8釋放。在一個實施例中，減弱下調或防止IL-13釋放。
在某些實施例中，本發明之結合分子或抗體或其抗原結合片段減弱或抑制IL-33/RAGE介導之信號傳導。RAGE介導之信號傳導之減弱或抑制可使上皮遷移相對於未經調節之IL-33驅動之發炎性反應中可見的增強(參見圖58)。該增強之上皮遷移可在組織修復及傷口癒合中，尤其在諸如肺上皮之肺組織中起作用。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離之結合分子，其特異性結合於redIL-33或redIL-33結合片段。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離之結合分子，其特異性結合於redIL-33且抑制redIL-33與ST2結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離之結合分子，其特 異性結合於redIL-33且藉由以物理方式阻斷IL-33與其受體相互作用來抑制redIL-33信號傳導。
在一個實施例中，本發明係關於一種分子，其結合IL-33且催化redIL-33轉化為IL-33-DSB，藉此下調或斷開ST-2信號傳導。
在一個實施例中，本發明係關於一種具有競爭性作用模式之結合分子。
在一個實施例中，本發明係關於一種具有異位作用模式之結合分子。
在一些實施例中，本發明之結合分子包含抗體或其抗原結合片段。
下式採用單字母胺基酸代碼。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1：SYAMX (I)
其中X為胺基酸，例如S或N，諸如S。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(II)之CDRH2：X 1 IX 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 YADX 12 VKG (II)
其中：X1為A、G或S 尤其A或G，諸如A；X2為A、D、G、N、S 尤其A、D或S，諸如S；X3為A、D或G 尤其A或G，諸如G；X4不存在或為D 尤其不存在；X5不存在或為G 尤其不存在；X6為D、I或S 尤其I或S，諸如S；X7為D、F、G或S 尤其D或G，諸如G； X8為D、G、Q、S、T 尤其G、Q或T，諸如G；X9為R或S 尤其S；X10為P或T 尤其P；X11為H或Y 尤其Y；且X12為P或S 尤其S。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(III)之CDRH3：X 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 GGLRYPX 22 (III)
其中：X13為A、D、H、L或Q 尤其D或Q，諸如D；X14為K或L 尤其K；X15為F或W 尤其F；X16為I或M 尤其M；X17為Q或E 尤其Q；X18為L或N 尤其L；X19為W或Y 尤其W；X20為A、G或V 尤其G；且X21為F或L 尤其F。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(I)之CDRH1及式(II)之CDRH2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(I)之CDRH1及式(III)之CDRH3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(II)之CDRH2及式(III)之CDRH3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(I)之CDRH1及式(II)之CDRH2及式(III)之CDRH3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(IV)之CDRL1：SGEX 22 X 23 GDKYAA (IV)
其中：X22為胺基酸，例如R或G，尤其R；且X23為胺基酸，例如M或I，尤其M。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(V)之CDRL2：X24 DTKRPS (V)
其中：X24為胺基酸，例如Q或R，尤其R。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(VI)之CDRL3：X 25 VX 26 X 27 X 28 X 29 X 30 X 31 X 32 X 33 (VI)
其中：X25為E、G或Q 尤其G或Q，諸如G；X26為I、K、L或W 尤其L或W，諸如W；X27為A、D、K、Q、R或V 尤其D或K，諸如K；X28為A、D、K、Q或S 尤其Q或S，諸如S；X29為D、N或S 尤其D或S，諸如D；X30為D、S或T 尤其D或S，諸如D；X31不存在或為T 尤其不存在；X32為G或P 尤其G；且X33為I或V 尤其V。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(IV)之CDRL1及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(IV)之CDRL1及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(V)之CDRL2及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含如上文所定義的式(IV)之CDRL1及式(V)之CDRL2及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1及式(IV)之CDRL1。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(II)之CDRH2及式(IV)之CDRL1。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(II)之CDRH2及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(II)之CDRH2及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(III)之CDRH3及式(IV)之CDRL1。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(III)之CDRH3及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(III)之CDRH3及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2及式(IV)之CDRL1。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(III)之CDRH3及式(IV)之CDRL1。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(III)之CDRH3及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(III)之CDRH3及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3及式(IV)之CDRL1。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3及式(IV)之CDRL1。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3、式(IV)之CDRL1及式(V)之CDRL2。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I) 之CDRH1、式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3、式(IV)之CDRL1及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3、式(V)之CDRL2及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段包含式(I)之CDRH1、式(II)之CDRH2、式(III)之CDRH3、式(IV)之CDRL1、式(V)之CDRL2及式(VI)之CDRL3。
在一個實施例中，本發明之結合分子例如在重鏈可變區中包含獨立地選自以下之3個CDR：SEQ ID NO：3、4、5、13、14、15、23、24、25、33、34、35、43、44、45、53、54、55、63、64、65、73、74、75、83、84、85、93、94、95、103、104、105、113、114、115、153、154、155、163、164、165、173、174、175、183、184、185、193、194、195、203、204、205、213、214、215、223、224、225、233、234、235、243、244、245、253、254、255、263、264、265、273、274、275、283、284、285、293、294、295、303、304、305、313、314、315、353、354、355、363、364、365、373、374、375、383、384、385、393、394、395、403、404、405、413、414、415、453、454、455、463、464、465、473、474、475、483、484、485、493、494、495、503、504、505、513、514、515、553、554、555、563、564、565、573、574、575、583、584及585。
在一個實施例中，本發明之結合分子例如在輕鏈可變區中包含獨立地選自以下之3個CDR：SEQ ID NO：8、9、10、18、19、20、28、29、30、38、39、40、48、49、50、58、59、60、68、69、70、78、79、80、88、89、90、98、99、100、108、109、118、119、120、158、159、160、168、169、170、178、179、180、188、189、 190、198、199、200、208、209、210、218、219、220、228、229、230、238、239、240、248、249、250、258、259、260、268、269、270、278、279、280、288、289、290、298、299、300、308、309、310、318、319、320、328、329、330、338、339、340、348、349、350、358、359、360、368、369、370、378、379、380、388、389、390、398、399、400、408、409、410、418、419、420、428、429、430、438、439、440、448、449、450、458、459、460、468、469、470、478、479、480、488、489、490、498、499、500、508、509、510、518、519、520、528、529、530、538、539、540、548、549、550、558、559、560、568、569、570、578、579、580、588、589及590。
在一個實施例中，本發明之結合分子例如在重鏈可變區中包含獨立地選自以下之3個CDR：SEQ ID NO：3、4、5、13、14、15、23、24、25、33、34、35、43、44、45、53、54、55、63、64、65、73、74、75、83、84、85、93、94、95、103、104、105、113、114、115、153、154、155、163、164、165、173、174、175、183、184、185、193、194、195、203、204、205、213、214、215、223、224、225、233、234、235、243、244、245、253、254、255、263、264、265、273、274、275、283、284、285、293、294、295、303、304、305、313、314、315、353、354、355、363、364、365、373、374、375、383、384、385、393、394、395、403、404、405、413、414、415、453、454、455、463、464、465、473、474、475、483、484、485、493、494、495、503、504、505、513、514、515、553、554、555、563、564、565、573、574、575、583、584及585；及例如在輕鏈可變區中包含獨立地選自以下之3個CDR：SEQ ID NO：8、9、10、18、19、20、28、29、30、38、39、40、48、49、50、58、 59、60、68、69、70、78、79、80、88、89、90、98、99、100、108、109、118、119、120、158、159、160、168、169、170、178、179、180、188、189、190、198、199、200、208、209、210、218、219、220、228、229、230、238、239、240、248、249、250、258、259、260、268、269、270、278、279、280、288、289、290、298、299、300、308、309、310、318、319、320、328、329、330、338、339、340、348、349、350、358、359、360、368、369、370、378、379、380、388、389、390、398、399、400、408、409、410、418、419、420、428、429、430、438、439、440、448、449、450、458、459、460、468、469、470、478、479、480、488、489、490、498、499、500、508、509、510、518、519、520、528、529、530、538、539、540、548、549、550、558、559、560、568、569、570、578、579、580、588、589及590。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：3、4及5，例如SEQ ID NO：3及4、SEQ ID NO：3及5或SEQ ID NO：4及5之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：3(對於CDRH1)、SEQ ID NO：4(對於CDRH2)及SEQ ID NO：5(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：13、14及15，例如SEQ ID NO：13及14、SEQ ID NO：13及15或SEQ ID NO：14及15之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：13(對於CDRH1)、SEQ ID NO：14(對於CDRH2)及SEQ ID NO：15(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：23、24及25，例如SEQ ID NO：23及24、SEQ ID NO：23及25或SEQ ID NO：24及25之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：23(對於CDRH1)、SEQ ID NO：24(對於CDRH2)及SEQ ID NO：25(對於CDRH3)之重鏈 可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：33、34及35，例如SEQ ID NO：33及34、SEQ ID NO：33及35或SEQ ID NO：34及35之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：33(對於CDRH1)、SEQ ID NO：34(對於CDRH2)及SEQ ID NO：35(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：43、44及45，例如SEQ ID NO：43及44、SEQ ID NO：43及45或SEQ ID NO：44及45之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：43(對於CDRH1)、SEQ ID NO：44(對於CDRH2)及SEQ ID NO：45(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：53、54及55，例如SEQ ID NO：53及54、SEQ ID NO：53及55或SEQ ID NO：54及55之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：53(對於CDRH1)、SEQ ID NO：54(對於CDRH2)及SEQ ID NO：55(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：63、64及65，例如SEQ ID NO：63及64、SEQ ID NO：63及65或SEQ ID NO：64及65之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：63(對於CDRH1)、SEQ ID NO：64(對於CDRH2)及SEQ ID NO：65(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：73、74及75，例如SEQ ID NO：73及74、SEQ ID NO：73及75或SEQ ID NO：74及75之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：73(對於CDRH1)、SEQ ID NO：74(對於CDRH2)及SEQ ID NO：75(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：83、84及85，例如SEQ ID NO：83及84、SEQ ID NO：83及85或SEQ ID NO：84及85之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：83(對於CDRH1)、SEQ ID NO：84(對於CDRH2)及SEQ ID NO：85(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：93、94及95，例如SEQ ID NO：93及94、SEQ ID NO：93及95或SEQ ID NO：94及95之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：93(對於CDRH1)、SEQ ID NO：94(對於CDRH2)及SEQ ID NO：95(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：103、104及105，例如SEQ ID NO：103及104、SEQ ID NO：103及105或SEQ ID NO：104及105之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：103(對於CDRH1)、SEQ ID NO：104(對於CDRH2)及SEQ ID NO：105(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：113、114及115，例如SEQ ID NO：113及114、SEQ ID NO：113及115或SEQ ID NO：114及115之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：113(對於CDRH1)、SEQ ID NO：114(對於CDRH2)及SEQ ID NO：115(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：123、124及125，例如SEQ ID NO：123及124、SEQ ID NO：123及125或SEQ ID NO：124及125之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：123(對於CDRH1)、SEQ ID NO：124(對於CDRH2)及SEQ ID NO：125(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：133、 134及135，例如SEQ ID NO：133及134、SEQ ID NO：133及135或SEQ ID NO：134及135之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：133(對於CDRH1)、SEQ ID NO：134(對於CDRH2)及SEQ ID NO：135(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：143、144及145，例如SEQ ID NO：143及144、SEQ ID NO：143及145或SEQ ID NO：144及145之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：143(對於CDRH1)、SEQ ID NO：144(對於CDRH2)及SEQ ID NO：145(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：153、154及155，例如SEQ ID NO：153及154、SEQ ID NO：153及155或SEQ ID NO：154及155之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：153(對於CDRH1)、SEQ ID NO：154(對於CDRH2)及SEQ ID NO：155(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：163、164及165，例如SEQ ID NO：163及164、SEQ ID NO：163及165或SEQ ID NO：164及165之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：163(對於CDRH1)、SEQ ID NO：164(對於CDRH2)及SEQ ID NO：165(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：173、174及175，例如SEQ ID NO：173及174、SEQ ID NO：173及175或SEQ ID NO：174及175之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：173(對於CDRH1)、SEQ ID NO：174(對於CDRH2)及SEQ ID NO：175(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：183、184及185，例如SEQ ID NO：183及184、SEQ ID NO：183及185或SEQ ID NO：184及185之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：183(對於CDRH1)、SEQ ID NO：184(對於CDRH2)及SEQ ID NO：185(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：193、194及195，例如SEQ ID NO：193及194、SEQ ID NO：193及195或SEQ ID NO：194及195之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：193(對於CDRH1)、SEQ ID NO：194(對於CDRH2)及SEQ ID NO：195(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：203、204及205，例如SEQ ID NO：203及204、SEQ ID NO：203及205或SEQ ID NO：204及205之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：203(對於CDRH1)、SEQ ID NO：204(對於CDRH2)及SEQ ID NO：205(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：213、214及215，例如SEQ ID NO：213及214、SEQ ID NO：213及215或SEQ ID NO：214及215之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：213(對於CDRH1)、SEQ ID NO：214(對於CDRH2)及SEQ ID NO：215(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：223、224及225，例如SEQ ID NO：223及224、SEQ ID NO：223及225或SEQ ID NO：224及225之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：223(對於CDRH1)、SEQ ID NO：224(對於CDRH2)及SEQ ID NO：225(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：233、234及235，例如SEQ ID NO：233及234、SEQ ID NO：233及235或SEQ ID NO：234及235之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：233(對於 CDRH1)、SEQ ID NO：234(對於CDRH2)及SEQ ID NO：235(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：243、244及245，例如SEQ ID NO：243及244、SEQ ID NO：243及245或SEQ ID NO：244及245之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：243(對於CDRH1)、SEQ ID NO：244(對於CDRH2)及SEQ ID NO：245(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：253、254及255，例如SEQ ID NO：253及254、SEQ ID NO：253及255或SEQ ID NO：254及255之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：253(對於CDRH1)、SEQ ID NO：254(對於CDRH2)及SEQ ID NO：255(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：263、264及265，例如SEQ ID NO：263及264、SEQ ID NO：263及265或SEQ ID NO：264及265之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：263(對於CDRH1)、SEQ ID NO：264(對於CDRH2)及SEQ ID NO：265(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：273、274及275，例如SEQ ID NO：273及274、SEQ ID NO：273及275或SEQ ID NO：274及275之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：273(對於CDRH1)、SEQ ID NO：274(對於CDRH2)及SEQ ID NO：275(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：283、284及285，例如SEQ ID NO：283及284、SEQ ID NO：283及285或SEQ ID NO：284及285之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：283(對於CDRH1)、SEQ ID NO：284(對於CDRH2)及SEQ ID NO：285(對於 CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：293、294及295，例如SEQ ID NO：293及294、SEQ ID NO：293及295或SEQ ID NO：294及295之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：293(對於CDRH1)、SEQ ID NO：294(對於CDRH2)及SEQ ID NO：295(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：303、304及305，例如SEQ ID NO：303及304、SEQ ID NO：303及305或SEQ ID NO：304及305之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：303(對於CDRH1)、SEQ ID NO：304(對於CDRH2)及SEQ ID NO：305(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：313、314及315，例如SEQ ID NO：313及314、SEQ ID NO：313及315或SEQ ID NO：314及315之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：313(對於CDRH1)、SEQ ID NO：314(對於CDRH2)及SEQ ID NO：315(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：323、324及325，例如SEQ ID NO：323及324、SEQ ID NO：323及325或SEQ ID NO：324及325之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：323(對於CDRH1)、SEQ ID NO：324(對於CDRH2)及SEQ ID NO：325(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：333、334及335，例如SEQ ID NO：333及334、SEQ ID NO：333及335或SEQ ID NO：334及335之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：333(對於CDRH1)、SEQ ID NO：334(對於CDRH2)及SEQ ID NO：335(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：343、344及345，例如SEQ ID NO：343及344、SEQ ID NO：343及345或SEQ ID NO：344及345之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：343(對於CDRH1)、SEQ ID NO：344(對於CDRH2)及SEQ ID NO：345(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：353、354及355，例如SEQ ID NO：353及354、SEQ ID NO：353及355或SEQ ID NO：354及355之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：353(對於CDRH1)、SEQ ID NO：354(對於CDRH2)及SEQ ID NO：355(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：363、364及365，例如SEQ ID NO：363及364、SEQ ID NO：363及365或SEQ ID NO：364及365之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：363(對於CDRH1)、SEQ ID NO：364(對於CDRH2)及SEQ ID NO：365(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：373、374及375，例如SEQ ID NO：373及374、SEQ ID NO：373及375或SEQ ID NO：374及375之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：373(對於CDRH1)、SEQ ID NO：374(對於CDRH2)及SEQ ID NO：375(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：383、384及385，例如SEQ ID NO：383及384、SEQ ID NO：383及385或SEQ ID NO：384及385之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：383(對於CDRH1)、SEQ ID NO：384(對於CDRH2)及SEQ ID NO：385(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：393、 394及395，例如SEQ ID NO：393及394、SEQ ID NO：393及395或SEQ ID NO：394及395之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：393(對於CDRH1)、SEQ ID NO：394(對於CDRH2)及SEQ ID NO：395(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：403、404及405，例如SEQ ID NO：403及404、SEQ ID NO：403及405或SEQ ID NO：404及405之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：403(對於CDRH1)、SEQ ID NO：404(對於CDRH2)及SEQ ID NO：405(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：413、414及415，例如SEQ ID NO：413及414、SEQ ID NO：413及415或SEQ ID NO：414及415之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：413(對於CDRH1)、SEQ ID NO：414(對於CDRH2)及SEQ ID NO：415(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：423、424及425，例如SEQ ID NO：423及424、SEQ ID NO：423及425或SEQ ID NO：424及425之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：423(對於CDRH1)、SEQ ID NO：424(對於CDRH2)及SEQ ID NO：425(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：433、434及435，例如SEQ ID NO：433及434、SEQ ID NO：433及435或SEQ ID NO：434及435之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：433(對於CDRH1)、SEQ ID NO：434(對於CDRH2)及SEQ ID NO：435(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：443、444及445，例如SEQ ID NO：443及444、SEQ ID NO：443及445或SEQ ID NO：444及445之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：443(對於CDRH1)、SEQ ID NO：444(對於CDRH2)及SEQ ID NO：445(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：453、454及455，例如SEQ ID NO：453及454、SEQ ID NO：453及455或SEQ ID NO：454及455之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：453(對於CDRH1)、SEQ ID NO：454(對於CDRH2)及SEQ ID NO：455(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：463、464及465，例如SEQ ID NO：463及464、SEQ ID NO：463及465或SEQ ID NO：464及465之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：463(對於CDRH1)、SEQ ID NO：464(對於CDRH2)及SEQ ID NO：465(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：473、474及475，例如SEQ ID NO：473及474、SEQ ID NO：473及475或SEQ ID NO：474及475之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：473(對於CDRH1)、SEQ ID NO：474(對於CDRH2)及SEQ ID NO：475(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：483、484及485，例如SEQ ID NO：483及484、SEQ ID NO：483及485或SEQ ID NO：484及485之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：483(對於CDRH1)、SEQ ID NO：484(對於CDRH2)及SEQ ID NO：485(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：493、494及495，例如SEQ ID NO：493及494、SEQ ID NO：493及495或SEQ ID NO：494及495之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：493(對於 CDRH1)、SEQ ID NO：494(對於CDRH2)及SEQ ID NO：495(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：503、504及505，例如SEQ ID NO：503及504、SEQ ID NO：503及505或SEQ ID NO：504及505之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：503(對於CDRH1)、SEQ ID NO：504(對於CDRH2)及SEQ ID NO：505(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：513、514及515，例如SEQ ID NO：513及514、SEQ ID NO：513及515或SEQ ID NO：514及515之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：513(對於CDRH1)、SEQ ID NO：514(對於CDRH2)及SEQ ID NO：515(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：523、524及525，例如SEQ ID NO：523及524、SEQ ID NO：523及525或SEQ ID NO：524及525之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：523(對於CDRH1)、SEQ ID NO：524(對於CDRH2)及SEQ ID NO：525(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：533、534及535，例如SEQ ID NO：533及534、SEQ ID NO：533及535或SEQ ID NO：534及535之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：533(對於CDRH1)、SEQ ID NO：534(對於CDRH2)及SEQ ID NO：535(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：543、544及545，例如SEQ ID NO：543及544、SEQ ID NO：543及545或SEQ ID NO：544及545之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：543(對於CDRH1)、SEQ ID NO：544(對於CDRH2)及SEQ ID NO：545(對於 CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：553、554及555，例如SEQ ID NO：553及554、SEQ ID NO：553及555或SEQ ID NO：554及555之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：553(對於CDRH1)、SEQ ID NO：554(對於CDRH2)及SEQ ID NO：555(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：563、564及565，例如SEQ ID NO：563及564、SEQ ID NO：563及565或SEQ ID NO：564及565之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：563(對於CDRH1)、SEQ ID NO：564(對於CDRH2)及SEQ ID NO：565(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：573、574及575，例如SEQ ID NO：573及574、SEQ ID NO：573及575或SEQ ID NO：574及575之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：573(對於CDRH1)、SEQ ID NO：574(對於CDRH2)及SEQ ID NO：575(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：583、584及585，例如SEQ ID NO：583及584、SEQ ID NO：583及585或SEQ ID NO：584及585之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：583(對於CDRH1)、SEQ ID NO：584(對於CDRH2)及SEQ ID NO：585(對於CDRH3)之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：8、9及10，例如SEQ ID NO：8及9、SEQ ID NO：8及10或SEQ ID NO：9及10之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：8(對於CDRL1)、SEQ ID NO：9(對於CDRL2)及SEQ ID NO：10(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：18、 19及20，例如SEQ ID NO：18及19、SEQ ID NO：18及20或SEQ ID NO：19及20之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：18(對於CDRL1)、SEQ ID NO：19(對於CDRL2)及SEQ ID NO：20(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：28、29及30，例如SEQ ID NO：28及29、SEQ ID NO：28及30或SEQ ID NO：29及30之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：28(對於CDRL1)、SEQ ID NO：29(對於CDRL2)及SEQ ID NO：30(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：38、39及40，例如SEQ ID NO：38及39、SEQ ID NO：38及40或SEQ ID NO：39及40之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：38(對於CDRL1)、SEQ ID NO：39(對於CDRL2)及SEQ ID NO：40(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：48、49及50，例如SEQ ID NO：48及49、SEQ ID NO：48及50或SEQ ID NO：49及50之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：48(對於CDRL1)、SEQ ID NO：49(對於CDRL2)及SEQ ID NO：50(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：58、59及60，例如SEQ ID NO：58及59、SEQ ID NO：58及60或SEQ ID NO：59及60之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：58(對於CDRL1)、SEQ ID NO：59(對於CDRL2)及SEQ ID NO：60(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：68、69及70，例如SEQ ID NO：68及69、SEQ ID NO：68及70或SEQ ID NO： 69及70之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：68(對於CDRL1)、SEQ ID NO：69(對於CDRL2)及SEQ ID NO：70(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：78、79及80，例如SEQ ID NO：78及79、SEQ ID NO：78及80或SEQ ID NO：79及80之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：78(對於CDRL1)、SEQ ID NO：79(對於CDRL2)及SEQ ID NO：80(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：88、89及90，例如SEQ ID NO：88及89、SEQ ID NO：88及90或SEQ ID NO：89及90之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：88(對於CDRL1)、SEQ ID NO：89(對於CDRL2)及SEQ ID NO：90(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：98、99及100，例如SEQ ID NO：98及99、SEQ ID NO：98及100或SEQ ID NO：99及100之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：98(對於CDRL1)、SEQ ID NO：99(對於CDRL2)及SEQ ID NO：100(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：108、109及110，例如SEQ ID NO：108及109、SEQ ID NO：108及110或SEQ ID NO：109及110之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：108(對於CDRL1)、SEQ ID NO：109(對於CDRL2)及SEQ ID NO：110(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：118、119及120，例如SEQ ID NO：118及119、SEQ ID NO：118及120或SEQ ID NO：119及120之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：118(對於 CDRL1)、SEQ ID NO：119(對於CDRL2)及SEQ ID NO：120(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：128、129及130，例如SEQ ID NO：128及129、SEQ ID NO：128及130或SEQ ID NO：129及130之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：128(對於CDRL1)、SEQ ID NO：129(對於CDRL2)及SEQ ID NO：130(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：138、139及140，例如SEQ ID NO：138及139、SEQ ID NO：138及140或SEQ ID NO：139及140之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：138(對於CDRL1)、SEQ ID NO：139(對於CDRL2)及SEQ ID NO：140(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：148、149及150，例如SEQ ID NO：148及149、SEQ ID NO：148及150或SEQ ID NO：149及150之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：148(對於CDRL1)、SEQ ID NO：149(對於CDRL2)及SEQ ID NO：120(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：158、159及160，例如SEQ ID NO：158及159、SEQ ID NO：158及160或SEQ ID NO：159及160之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：158(對於CDRL1)、SEQ ID NO：159(對於CDRL2)及SEQ ID NO：160(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：168、169及170，例如SEQ ID NO：168及169、SEQ ID NO：168及170或SEQ ID NO：169及170之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：168(對於CDRL1)、SEQ ID NO：169(對於CDRL2)及SEQ ID NO：170(對於 CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：178、179及180，例如SEQ ID NO：178及179、SEQ ID NO：178及180或SEQ ID NO：179及180之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：178(對於CDRL1)、SEQ ID NO：179(對於CDRL2)及SEQ ID NO：180(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：188、189及190，例如SEQ ID NO：188及189、SEQ ID NO：188及190或SEQ ID NO：189及190之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：188(對於CDRL1)、SEQ ID NO：189(對於CDRL2)及SEQ ID NO：190(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：198、199及200，例如SEQ ID NO：198及199、SEQ ID NO：198及200或SEQ ID NO：199及200之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：198(對於CDRL1)、SEQ ID NO：199(對於CDRL2)及SEQ ID NO：200(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：208、209及210，例如SEQ ID NO：208及209、SEQ ID NO：208及210或SEQ ID NO：209及210之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：208(對於CDRL1)、SEQ ID NO：209(對於CDRL2)及SEQ ID NO：210(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：218、219及220，例如SEQ ID NO：218及219、SEQ ID NO：218及220或SEQ ID NO：219及220之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：218(對於CDRL1)、SEQ ID NO：219(對於CDRL2)及SEQ ID NO：220(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：228、229及230，例如SEQ ID NO：228及229、SEQ ID NO：228及230或SEQ ID NO：229及230之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：228(對於CDRL1)、SEQ ID NO：229(對於CDRL2)及SEQ ID NO：230(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：238、239及240，例如SEQ ID NO：238及239、SEQ ID NO：238及240或SEQ ID NO：239及240之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：238(對於CDRL1)、SEQ ID NO：239(對於CDRL2)及SEQ ID NO：240(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：248、249及250，例如SEQ ID NO：248及249、SEQ ID NO：248及250或SEQ ID NO：249及250之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：248(對於CDRL1)、SEQ ID NO：249(對於CDRL2)及SEQ ID NO：250(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：258、259及260，例如SEQ ID NO：258及259、SEQ ID NO：258及260或SEQ ID NO：259及260之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：258(對於CDRL1)、SEQ ID NO：259(對於CDRL2)及SEQ ID NO：260(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：268、269及270，例如SEQ ID NO：268及269、SEQ ID NO：268及270或SEQ ID NO：269及270之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：268(對於CDRL1)、SEQ ID NO：269(對於CDRL2)及SEQ ID NO：270(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：278、 279及280，例如SEQ ID NO：278及279、SEQ ID NO：278及280或SEQ ID NO：279及280之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：278(對於CDRL1)、SEQ ID NO：279(對於CDRL2)及SEQ ID NO：280(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：288、289及290，例如SEQ ID NO：288及289、SEQ ID NO：288及290或SEQ ID NO：289及290之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：288(對於CDRL1)、SEQ ID NO：289(對於CDRL2)及SEQ ID NO：290(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：298、299及300，例如SEQ ID NO：298及299、SEQ ID NO：298及300或SEQ ID NO：299及300之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：298(對於CDRL1)、SEQ ID NO：299(對於CDRL2)及SEQ ID NO：300(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：308、309及310，例如SEQ ID NO：308及309、SEQ ID NO：308及310或SEQ ID NO：309及310之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：308(對於CDRL1)、SEQ ID NO：309(對於CDRL2)及SEQ ID NO：310(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：318、319及320，例如SEQ ID NO：318及319、SEQ ID NO：318及320或SEQ ID NO：319及320之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：318(對於CDRL1)、SEQ ID NO：319(對於CDRL2)及SEQ ID NO：320(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：328、329及330，例如SEQ ID NO：328及329、SEQ ID NO：328及330或SEQ ID NO：329及330之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：328(對於CDRL1)、SEQ ID NO：329(對於CDRL2)及SEQ ID NO：330(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：338、339及340，例如SEQ ID NO：338及339、SEQ ID NO：338及340或SEQ ID NO：339及340之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：338(對於CDRL1)、SEQ ID NO：339(對於CDRL2)及SEQ ID NO：340(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：348、349及350，例如SEQ ID NO：348及349、SEQ ID NO：348及350或SEQ ID NO：349及350之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：348(對於CDRL1)、SEQ ID NO：349(對於CDRL2)及SEQ ID NO：350(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：358、359及360，例如SEQ ID NO：358及359、SEQ ID NO：358及360或SEQ ID NO：359及360之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：358(對於CDRL1)、SEQ ID NO：359(對於CDRL2)及SEQ ID NO：360(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：368、369及370，例如SEQ ID NO：368及369、SEQ ID NO：368及370或SEQ ID NO：369及370之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：368(對於CDRL1)、SEQ ID NO：369(對於CDRL2)及SEQ ID NO：370(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：378、379及380，例如SEQ ID NO：378及379、SEQ ID NO：378及380或SEQ ID NO：379及380之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：378(對於 CDRL1)、SEQ ID NO：379(對於CDRL2)及SEQ ID NO：380(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：388、389及390，例如SEQ ID NO：388及389、SEQ ID NO：388及390或SEQ ID NO：389及390之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：388(對於CDRL1)、SEQ ID NO：389(對於CDRL2)及SEQ ID NO：390(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：398、399及400，例如SEQ ID NO：398及399、SEQ ID NO：398及400或SEQ ID NO：399及400之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：398(對於CDRL1)、SEQ ID NO：399(對於CDRL2)及SEQ ID NO：400(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：408、409及410，例如SEQ ID NO：408及409、SEQ ID NO：408及410或SEQ ID NO：409及410之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：408(對於CDRL1)、SEQ ID NO：409(對於CDRL2)及SEQ ID NO：410(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：418、419及420，例如SEQ ID NO：418及419、SEQ ID NO：418及420或SEQ ID NO：419及420之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：418(對於CDRL1)、SEQ ID NO：419(對於CDRL2)及SEQ ID NO：420(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：428、429及430，例如SEQ ID NO：428及429、SEQ ID NO：428及430或SEQ ID NO：429及430之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：428(對於CDRL1)、SEQ ID NO：429(對於CDRL2)及SEQ ID NO：430(對於 CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：438、439及440，例如SEQ ID NO：438及439、SEQ ID NO：438及440或SEQ ID NO：439及440之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：438(對於CDRL1)、SEQ ID NO：439(對於CDRL2)及SEQ ID NO：440(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：448、449及450，例如SEQ ID NO：448及449、SEQ ID NO：448及450或SEQ ID NO：449及450之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：448(對於CDRL1)、SEQ ID NO：449(對於CDRL2)及SEQ ID NO：420(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：458、459及460，例如SEQ ID NO：458及459、SEQ ID NO：458及460或SEQ ID NO：459及460之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：458(對於CDRL1)、SEQ ID NO：459(對於CDRL2)及SEQ ID NO：460(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：468、469及470，例如SEQ ID NO：468及469、SEQ ID NO：468及470或SEQ ID NO：469及470之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：468(對於CDRL1)、SEQ ID NO：469(對於CDRL2)及SEQ ID NO：470(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：478、479及480，例如SEQ ID NO：478及479、SEQ ID NO：478及480或SEQ ID NO：479及480之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：478(對於CDRL1)、SEQ ID NO：479(對於CDRL2)及SEQ ID NO：480(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：488、489及490，例如SEQ ID NO：488及489、SEQ ID NO：488及490或SEQ ID NO：489及490之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：488(對於CDRL1)、SEQ ID NO：489(對於CDRL2)及SEQ ID NO：490(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：498、499及500，例如SEQ ID NO：498及499、SEQ ID NO：498及500或SEQ ID NO：499及500之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：498(對於CDRL1)、SEQ ID NO：499(對於CDRL2)及SEQ ID NO：500(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：508、509及510，例如SEQ ID NO：508及509、SEQ ID NO：508及510或SEQ ID NO：509及510之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：508(對於CDRL1)、SEQ ID NO：509(對於CDRL2)及SEQ ID NO：510(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：518、519及520，例如SEQ ID NO：518及519、SEQ ID NO：518及520或SEQ ID NO：519及520之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：518(對於CDRL1)、SEQ ID NO：519(對於CDRL2)及SEQ ID NO：520(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：528、529及530，例如SEQ ID NO：528及529、SEQ ID NO：528及530或SEQ ID NO：529及530之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：528(對於CDRL1)、SEQ ID NO：529(對於CDRL2)及SEQ ID NO：530(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：538、539及540，例如SEQ ID NO：538及539、SEQ ID NO：538及540或SEQ ID NO：539及540之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：538(對於CDRL1)、SEQ ID NO：539(對於CDRL2)及SEQ ID NO：540(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：548、549及550，例如SEQ ID NO：548及549、SEQ ID NO：548及550或SEQ ID NO：549及550之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：548(對於CDRL1)、SEQ ID NO：549(對於CDRL2)及SEQ ID NO：550(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：558、559及560，例如SEQ ID NO：558及559、SEQ ID NO：558及560或SEQ ID NO：559及560之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：558(對於CDRL1)、SEQ ID NO：559(對於CDRL2)及SEQ ID NO：560(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：568、569及570，例如SEQ ID NO：568及569、SEQ ID NO：568及570或SEQ ID NO：569及570之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：568(對於CDRL1)、SEQ ID NO：569(對於CDRL2)及SEQ ID NO：570(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：578、579及580，例如SEQ ID NO：578及579、SEQ ID NO：578及580或SEQ ID NO：579及580之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：578(對於CDRL1)、SEQ ID NO：579(對於CDRL2)及SEQ ID NO：580(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含選自SEQ ID NO：588、589及590，例如SEQ ID NO：588及589、SEQ ID NO：588及590或SEQ ID NO：589及590之至少一個CDR，諸如包含SEQ ID NO：588(對於CDRL1)、SEQ ID NO：589(對於CDRL2)及SEQ ID NO：590(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：103(對於CDRH1)、SEQ ID NO：104(對於CDRH2)及SEQ ID NO：105(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：108、109及120之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：108(對於CDRL1)、SEQ ID NO：109(對於CDRL2)及SEQ ID NO：120(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：113(對於CDRH1)、SEQ ID NO：114(對於CDRH2)及SEQ ID NO：115(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：118、119及120之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：118(對於CDRL1)、SEQ ID NO：119(對於CDRL2)及SEQ ID NO：120(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：123(對於CDRH1)、SEQ ID NO：124(對於CDRH2)及SEQ ID NO：125(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：128、129及130之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：128(對於CDRL1)、SEQ ID NO：129(對於CDRL2)及SEQ ID NO：130(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：133(對於CDRH1)、SEQ ID NO：134(對於CDRH2)及SEQ ID NO：135(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：138、139及140之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：138(對於CDRL1)、SEQ ID NO：139(對於CDRL2)及SEQ ID NO：140(對於 CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：143(對於CDRH1)、SEQ ID NO：144(對於CDRH2)及SEQ ID NO：145(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：148、149及150之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：148(對於CDRL1)、SEQ ID NO：149(對於CDRL2)及SEQ ID NO：150(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：153(對於CDRH1)、SEQ ID NO：154(對於CDRH2)及SEQ ID NO：155(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：158、159及160之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：158(對於CDRL1)、SEQ ID NO：159(對於CDRL2)及SEQ ID NO：160(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：163(對於CDRH1)、SEQ ID NO：164(對於CDRH2)及SEQ ID NO：165(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：168、169及170之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：168(對於CDRL1)、SEQ ID NO：169(對於CDRL2)及SEQ ID NO：170(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：173(對於CDRH1)、SEQ ID NO：174(對於CDRH2)及SEQ ID NO：175(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：178、179及180之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：178(對於CDRL1)、SEQ ID NO：179(對於CDRL2)及SEQ ID NO：180(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：183 (對於CDRH1)、SEQ ID NO：184(對於CDRH2)及SEQ ID NO：185(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：188、189及190之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：188(對於CDRL1)、SEQ ID NO：189(對於CDRL2)及SEQ ID NO：190(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：193(對於CDRH1)、SEQ ID NO：194(對於CDRH2)及SEQ ID NO：195(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：198、199及200之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：198(對於CDRL1)、SEQ ID NO：199(對於CDRL2)及SEQ ID NO：200(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：203(對於CDRH1)、SEQ ID NO：204(對於CDRH2)及SEQ ID NO：205(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：208、209及220之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：208(對於CDRL1)、SEQ ID NO：209(對於CDRL2)及SEQ ID NO：220(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：213(對於CDRH1)、SEQ ID NO：214(對於CDRH2)及SEQ ID NO：215(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：218、219及220之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：218(對於CDRL1)、SEQ ID NO：219(對於CDRL2)及SEQ ID NO：220(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：223(對於CDRH1)、SEQ ID NO：224(對於CDRH2)及SEQ ID NO：225(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO： 228、229及230之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：228(對於CDRL1)、SEQ ID NO：229(對於CDRL2)及SEQ ID NO：230(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：233(對於CDRH1)、SEQ ID NO：234(對於CDRH2)及SEQ ID NO：235(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：238、239及240之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：238(對於CDRL1)、SEQ ID NO：239(對於CDRL2)及SEQ ID NO：240(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：243(對於CDRH1)、SEQ ID NO：244(對於CDRH2)及SEQ ID NO：245(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：248、249及250之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：248(對於CDRL1)、SEQ ID NO：249(對於CDRL2)及SEQ ID NO：250(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：253(對於CDRH1)、SEQ ID NO：254(對於CDRH2)及SEQ ID NO：255(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：258、259及260之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：258(對於CDRL1)、SEQ ID NO：259(對於CDRL2)及SEQ ID NO：260(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：263(對於CDRH1)、SEQ ID NO：264(對於CDRH2)及SEQ ID NO：265(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：268、269及270之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：268(對於CDRL1)、SEQ ID NO：269(對於CDRL2)及SEQ ID NO：270(對於 CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：273(對於CDRH1)、SEQ ID NO：274(對於CDRH2)及SEQ ID NO：275(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：278、279及280之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：278(對於CDRL1)、SEQ ID NO：279(對於CDRL2)及SEQ ID NO：280(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：283(對於CDRH1)、SEQ ID NO：284(對於CDRH2)及SEQ ID NO：285(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：288、289及290之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：288(對於CDRL1)、SEQ ID NO：289(對於CDRL2)及SEQ ID NO：290(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：293(對於CDRH1)、SEQ ID NO：294(對於CDRH2)及SEQ ID NO：295(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：298、299及300之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：298(對於CDRL1)、SEQ ID NO：299(對於CDRL2)及SEQ ID NO：300(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：303(對於CDRH1)、SEQ ID NO：304(對於CDRH2)及SEQ ID NO：305(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：308、309及320之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：308(對於CDRL1)、SEQ ID NO：309(對於CDRL2)及SEQ ID NO：320(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：313 (對於CDRH1)、SEQ ID NO：314(對於CDRH2)及SEQ ID NO：315(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：318、319及320之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：318(對於CDRL1)、SEQ ID NO：319(對於CDRL2)及SEQ ID NO：320(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：323(對於CDRH1)、SEQ ID NO：324(對於CDRH2)及SEQ ID NO：325(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：328、329及330之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：328(對於CDRL1)、SEQ ID NO：329(對於CDRL2)及SEQ ID NO：330(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：333(對於CDRH1)、SEQ ID NO：334(對於CDRH2)及SEQ ID NO：335(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：338、339及340之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：338(對於CDRL1)、SEQ ID NO：339(對於CDRL2)及SEQ ID NO：340(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：343(對於CDRH1)、SEQ ID NO：344(對於CDRH2)及SEQ ID NO：345(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：348、349及350之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：348(對於CDRL1)、SEQ ID NO：349(對於CDRL2)及SEQ ID NO：350(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：353(對於CDRH1)、SEQ ID NO：354(對於CDRH2)及SEQ ID NO：355(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO： 358、359及360之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：358(對於CDRL1)、SEQ ID NO：359(對於CDRL2)及SEQ ID NO：360(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：363(對於CDRH1)、SEQ ID NO：364(對於CDRH2)及SEQ ID NO：365(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：368、369及370之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：368(對於CDRL1)、SEQ ID NO：369(對於CDRL2)及SEQ ID NO：370(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：373(對於CDRH1)、SEQ ID NO：374(對於CDRH2)及SEQ ID NO：375(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：378、379及380之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：378(對於CDRL1)、SEQ ID NO：379(對於CDRL2)及SEQ ID NO：380(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：383(對於CDRH1)、SEQ ID NO：384(對於CDRH2)及SEQ ID NO：385(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：388、389及390之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：388(對於CDRL1)、SEQ ID NO：389(對於CDRL2)及SEQ ID NO：390(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：393(對於CDRH1)、SEQ ID NO：394(對於CDRH2)及SEQ ID NO：395(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：398、399及400之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：398(對於CDRL1)、SEQ ID NO：399(對於CDRL2)及SEQ ID NO：400(對於 CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：403(對於CDRH1)、SEQ ID NO：404(對於CDRH2)及SEQ ID NO：405(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：408、409及420之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：408(對於CDRL1)、SEQ ID NO：409(對於CDRL2)及SEQ ID NO：420(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：413(對於CDRH1)、SEQ ID NO：414(對於CDRH2)及SEQ ID NO：415(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：418、419及420之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：418(對於CDRL1)、SEQ ID NO：419(對於CDRL2)及SEQ ID NO：420(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：423(對於CDRH1)、SEQ ID NO：424(對於CDRH2)及SEQ ID NO：425(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：428、429及430之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：428(對於CDRL1)、SEQ ID NO：429(對於CDRL2)及SEQ ID NO：430(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：433(對於CDRH1)、SEQ ID NO：434(對於CDRH2)及SEQ ID NO：435(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：438、439及440之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：438(對於CDRL1)、SEQ ID NO：439(對於CDRL2)及SEQ ID NO：440(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：443 (對於CDRH1)、SEQ ID NO：444(對於CDRH2)及SEQ ID NO：445(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：448、449及450之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：448(對於CDRL1)、SEQ ID NO：449(對於CDRL2)及SEQ ID NO：450(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：453(對於CDRH1)、SEQ ID NO：454(對於CDRH2)及SEQ ID NO：455(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：458、459及460之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：458(對於CDRL1)、SEQ ID NO：459(對於CDRL2)及SEQ ID NO：460(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：463(對於CDRH1)、SEQ ID NO：464(對於CDRH2)及SEQ ID NO：465(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：468、469及470之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：468(對於CDRL1)、SEQ ID NO：469(對於CDRL2)及SEQ ID NO：470(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：473(對於CDRH1)、SEQ ID NO：474(對於CDRH2)及SEQ ID NO：475(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：478、479及480之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：478(對於CDRL1)、SEQ ID NO：479(對於CDRL2)及SEQ ID NO：480(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：483(對於CDRH1)、SEQ ID NO：484(對於CDRH2)及SEQ ID NO：485(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO： 488、489及490之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：488(對於CDRL1)、SEQ ID NO：489(對於CDRL2)及SEQ ID NO：490(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：493(對於CDRH1)、SEQ ID NO：494(對於CDRH2)及SEQ ID NO：495(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：498、499及500之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：498(對於CDRL1)、SEQ ID NO：499(對於CDRL2)及SEQ ID NO：500(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：503(對於CDRH1)、SEQ ID NO：504(對於CDRH2)及SEQ ID NO：505(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：508、509及520之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：508(對於CDRL1)、SEQ ID NO：509(對於CDRL2)及SEQ ID NO：520(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：513(對於CDRH1)、SEQ ID NO：514(對於CDRH2)及SEQ ID NO：515(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：518、519及520之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：518(對於CDRL1)、SEQ ID NO：519(對於CDRL2)及SEQ ID NO：520(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：523(對於CDRH1)、SEQ ID NO：524(對於CDRH2)及SEQ ID NO：525(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：528、529及530之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：528(對於CDRL1)、SEQ ID NO：529(對於CDRL2)及SEQ ID NO：530(對於 CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：533(對於CDRH1)、SEQ ID NO：534(對於CDRH2)及SEQ ID NO：535(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：538、539及540之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：538(對於CDRL1)、SEQ ID NO：539(對於CDRL2)及SEQ ID NO：540(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：543(對於CDRH1)、SEQ ID NO：544(對於CDRH2)及SEQ ID NO：545(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：548、549及550之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：548(對於CDRL1)、SEQ ID NO：549(對於CDRL2)及SEQ ID NO：550(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：553(對於CDRH1)、SEQ ID NO：554(對於CDRH2)及SEQ ID NO：555(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：558、559及560之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：558(對於CDRL1)、SEQ ID NO：559(對於CDRL2)及SEQ ID NO：560(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：563(對於CDRH1)、SEQ ID NO：564(對於CDRH2)及SEQ ID NO：565(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：568、569及570之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：568(對於CDRL1)、SEQ ID NO：569(對於CDRL2)及SEQ ID NO：570(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：573 (對於CDRH1)、SEQ ID NO：574(對於CDRH2)及SEQ ID NO：575(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：578、579及580之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：578(對於CDRL1)、SEQ ID NO：579(對於CDRL2)及SEQ ID NO：580(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含有包含SEQ ID NO：583(對於CDRH1)、SEQ ID NO：584(對於CDRH2)及SEQ ID NO：585(對於CDRH3)之重鏈可變區，及輕鏈可變區中獨立地選自SEQ ID NO：588、589及590之至少一個CDR，尤其包含SEQ ID NO：588(對於CDRL1)、SEQ ID NO：589(對於CDRL2)及SEQ ID NO：590(對於CDRL3)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：2之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：7之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：2之重鏈可變區及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：12之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：17之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：12之重鏈可變區及SEQ ID NO：17之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：22之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：27之可變 區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：22之重鏈可變區及SEQ ID NO：27之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：32之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：37之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：32之重鏈可變區及SEQ ID NO：37之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：52之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：57之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：52之重鏈可變區及SEQ ID NO：57之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：62之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：67之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：62之重鏈可變區及SEQ ID NO：67之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：72之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：77之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：72之重鏈 可變區及SEQ ID NO：77之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：82之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：87之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：82之重鏈可變區及SEQ ID NO：87之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：92之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：97之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：92之重鏈可變區及SEQ ID NO：97之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：102之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：107之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：102之重鏈可變區及SEQ ID NO：107之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：112之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：117之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：112之重鏈可變區及SEQ ID NO：117之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：122之可變 區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：127之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：122之重鏈可變區及SEQ ID NO：127之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：132之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：137之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：132之重鏈可變區及SEQ ID NO：137之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：152之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：157之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：152之重鏈可變區及SEQ ID NO：157之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：162之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：167之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：162之重鏈可變區及SEQ ID NO：167之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：172之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：177之可變 區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：172之重鏈可變區及SEQ ID NO：177之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：182之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：187之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：182之重鏈可變區及SEQ ID NO：187之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：192之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：197之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：192之重鏈可變區及SEQ ID NO：197之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：202之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：207之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：202之重鏈可變區及SEQ ID NO：207之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：212之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：217之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：212之重鏈 可變區及SEQ ID NO：217之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：222之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：227之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：222之重鏈可變區及SEQ ID NO：227之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：232之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：237之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：232之重鏈可變區及SEQ ID NO：237之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：242之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：247之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：242之重鏈可變區及SEQ ID NO：247之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：252之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：257之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：252之重鏈可變區及SEQ ID NO：257之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：262之可變 區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：267之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：262之重鏈可變區及SEQ ID NO：267之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：272之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：277之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：272之重鏈可變區及SEQ ID NO：277之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：282之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：287之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：282之重鏈可變區及SEQ ID NO：287之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：292之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：297之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：292之重鏈可變區及SEQ ID NO：297之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：302之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：307之可變 區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：302之重鏈可變區及SEQ ID NO：307之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：312之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：317之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：312之重鏈可變區及SEQ ID NO：317之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：322之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：327之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：322之重鏈可變區及SEQ ID NO：327之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：332之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：337之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：332之重鏈可變區及SEQ ID NO：337之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：352之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：357之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：352之重鏈 可變區及SEQ ID NO：357之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：362之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：367之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：362之重鏈可變區及SEQ ID NO：367之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：372之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：377之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：372之重鏈可變區及SEQ ID NO：377之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：382之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：387之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：382之重鏈可變區及SEQ ID NO：387之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：392之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：397之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：392之重鏈可變區及SEQ ID NO：397之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：402之可變 區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：407之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：402之重鏈可變區及SEQ ID NO：407之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：412之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：417之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：412之重鏈可變區及SEQ ID NO：417之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：422之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：427之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：422之重鏈可變區及SEQ ID NO：427之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：432之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：437之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：432之重鏈可變區及SEQ ID NO：437之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：452之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：457之可變 區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：452之重鏈可變區及SEQ ID NO：457之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：462之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：467之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：462之重鏈可變區及SEQ ID NO：467之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：472之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：477之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：472之重鏈可變區及SEQ ID NO：477之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：482之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：487之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：482之重鏈可變區及SEQ ID NO：487之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：492之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：497之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：492之重鏈 可變區及SEQ ID NO：497之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：502之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：507之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：502之重鏈可變區及SEQ ID NO：507之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：512之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：517之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：512之重鏈可變區及SEQ ID NO：517之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：522之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：527之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：522之重鏈可變區及SEQ ID NO：527之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：532之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：537之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：532之重鏈可變區及SEQ ID NO：537之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：552之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：557之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：552之重鏈可變區及SEQ ID NO：557之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：562之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：567之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：562之重鏈可變區及SEQ ID NO：567之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：572之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：577之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：572之重鏈可變區及SEQ ID NO：577之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：582之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：587之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：582之重鏈可變區及SEQ ID NO：587之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：592之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：594之可變 區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：592之重鏈可變區及SEQ ID NO：594之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：596之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：598之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：596之重鏈可變區及SEQ ID NO：598之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：600之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：602之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：600之重鏈可變區及SEQ ID NO：602之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：604之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：606之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：604之重鏈可變區及SEQ ID NO：606之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：608之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：610之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：608之重鏈可變區及SEQ ID NO：610之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：612之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：614之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：612之重鏈可變區及SEQ ID NO：614之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：616之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：618之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：616之重鏈可變區及SEQ ID NO：618之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：620之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：622之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：620之重鏈可變區及SEQ ID NO：622之輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：624之可變區，例如作為重鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：626之可變區，例如作為輕鏈中之可變區。
在一個實施例中，本發明之結合分子包含SEQ ID NO：624之重鏈可變區及SEQ ID NO：626之輕鏈可變區。
在另一實施例中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結 合片段，其特異性結合於包含VH及VL之IL-33，其中VH具有與如上文例如SEQ ID NO：182或SEQ ID NO 616所揭示之VH至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於包含VH及VL之IL-33，其中如上文例如在SEQ ID NO：182或SEQ ID NO 616中所揭示之VH具有構架中之1、2、3或4個胺基酸獨立地經不同胺基酸置換或缺失之序列。
在另一實施例中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於包含VH及VL之IL-33，其中VL具有與如上文例如SEQ ID NO：187或SEQ ID NO 618所揭示之VL至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於包含VH及VL之IL-33，其中上文例如在SEQ ID NO：187或SEQ ID NO 618中所揭示之VL具有構架中之1、2、3或4個胺基酸獨立地經不同胺基酸置換或缺失之序列。
在另一實施例中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於包含VH及VL之IL-33，其中VH具有與如上文例如SEQ ID NO：182或SEQ ID NO.616所揭示之VH至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且VL具有與如上文例如SEQ ID NO：187或SEQ ID NO 618所揭示之VL至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於包含VH及VL之IL-33，其中如上文例如SEQ ID NO：182或SEQ ID NO 616所揭示之VH具有構架中之1、2、3或4個胺基酸獨立地經不同胺基酸置換或缺失之序列，上文例如在SEQ ID NO：187或SEQ ID NO 618中所揭示之VL具有構架中之1、2、3或4個胺基酸獨立地經不同胺基酸置換或缺失之序列。
在一個實施例中，提供一種交叉阻斷結合分子之抗體或結合片段，例如根據本發明之抗體或結合片段，尤其其中該抗體或結合片段結合與本文所揭示之分子相同的抗原決定基。
在一些實施例中，結合分子或抗體或其抗原結合片段為人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。在一些實施例中，結合分子或抗體或其抗原結合片段為天然存在之抗體、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體或單鏈抗體。在一些實施例中，結合分子或抗體或其抗原結合片段為單株抗體。
在另一實施例中，本發明係關於一種聚核苷酸，其編碼本發明、尤其如本文所描述之結合分子或抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，聚核苷酸編碼本發明之抗體或其抗原結合片段之VH。在某些實施例中，聚核苷酸編碼本發明之抗體或其抗原結合片段之VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種載體，其包含本發明之聚核苷酸。
在一些實施例中，本發明係關於一種組合物，其包含本發明之聚核苷酸或載體。
在另一實施例中，提供一種宿主細胞，其包含本發明之聚核苷酸或載體。
在另一實施例中，本發明係關於一種產生抗IL-33抗體或其抗原結合片段之方法，其包含培養本發明之宿主細胞及回收該抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，本發明係關於一種抗IL-33抗體或其 抗原結合片段，其藉由本發明方法產生。
在另一實施例中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含本發明之結合分子或抗體或其抗原結合片段及載劑。
在另一實施例中，本發明係關於一種治療患有發炎性病狀之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之抑制IL-33驅動之細胞因子產生之根據本發明的抗體或抗原結合片段。
在另一實施例中，提供一種治療患有發炎性病狀之個體的方法，其包含投與本發明之結合分子或包含其的組合物。
在一個態樣中，提供一種本發明之結合分子或包含其的組合物，以供治療例如尤其如本文所描述之發炎性病狀之用。
在一個實施例中，提供本發明之結合分子或包含其的組合物之用途，其用於製造用以治療或預防發炎性病狀之藥物。
在一個實施例中，發炎性病狀選自哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性鼻竇炎、纖維增殖性疾病(例如肺纖維化)、肺嗜伊紅血球增多、胸膜惡性腫瘤、類風濕性關節炎、膠原血管疾病、動脈粥樣硬化血管疾病、蕁麻疹、發炎性腸道疾病(例如克羅恩氏病(Crohn's disease)或腹腔病)、全身性紅斑性狼瘡症、進行性全身性硬化症、韋格納氏肉芽腫(Wegner's granulomatosis)、敗血性休克及白塞氏病(Bechet's disease)。
在一些實施例中，發炎性病狀為過敏性病症，例如哮喘、慢性鼻竇炎、食物過敏、濕疹或皮炎，尤其哮喘，諸如難治癒哮喘(亦稱為重度哮喘)。
在一些實施例中，發炎性反應或病狀係在該個體之氣管中。
在一個實施例中，發炎性反應或病狀係在平滑肌中。
在另一實施例中，本發明係關於一種預防個體中發炎性反應之方法，其包含向該個體投與有效量之結合IL-33且不阻斷IL-33與ST2 結合(其中ST2信號傳導減少)之抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明係關於一種預防個體中發炎性反應之方法，其包含向該個體投與有效量之抑制IL-33驅動之細胞因子產生之根據本發明的抗體或抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明係關於一種預防個體中發炎性反應之方法，其包含向該個體投與有效量之本發明之結合分子或抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明係關於一種識別治療性抗體或其抗原結合片段之方法，其包含選擇與IL-33結合之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不阻斷IL-33與ST2結合且抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在一個實施例中，提供用形成二硫鍵之能力降低，尤其在獨立地選自Cys-208、Cys-227、Cys-232及Cys-259之一或多個位置處形成二硫鍵之能力降低之redIL-33(例如以還原型式穩定)或其突變體使宿主免疫。在一個實施例中，該方法進一步包含以下步驟：自宿主篩選抗體，例如使用功能性試驗；及自該等抗體中之至少一者分離及/或複製至少可變區。
在實施例中，提供形成二硫鍵之能力降低，尤其在獨立地選自Cys-208、Cys-227、Cys-232及Cys-259之一或多個位置處形成二硫鍵之能力降低之redIL-33(例如以還原型式穩定)或其突變體之用途，其用於識別ST2信號傳導抑制劑，尤其對redIL-33具有特異性之抗體或其結合片段。在一個實施例中，該用途使用用該蛋白質或其活性片段詢問庫，例如噬菌體呈現抗體庫。
在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段不抑制NFκB信號傳導。
在一個實施例中，提供一種使用本發明之redIL-33或突變體(在本 文中統稱為本發明蛋白質)來識別或產生本發明之結合分子的方法。在一個實施例中，該方法包含用本發明蛋白質詢問庫以識別結合分子之步驟。在一個實施例中，該方法包含用本發明蛋白質使宿主免疫。
在一個實施例中，提供一種IL-33抗原決定基，其與如本文所揭示之結合分子(諸如抗體或其結合片段)結合，尤其催化性抗原決定基，亦即其結合使IL-33還原型式向氧化型式之轉化率增強之抗原決定基。
在另一實施例中，本發明係關於一種偵測樣品中之redIL-33表現的方法。
I.定義
如本文所用之「經分離」係指尤其自自然界分離之處於非天然環境下的蛋白質，例如該術語不包括活體內蛋白質，亦不包括取自人類或動物體內之樣品中的蛋白質。蛋白質一般將處於載劑(諸如液體或介質)中，或可冷凍或冷凍乾燥調配，且在適當時所有此等型式可由「經分離」涵蓋。在一個實施例中，經分離不指呈凝膠狀之蛋白質，例如在西方墨點分析中使用的凝膠或相似物。
如本文所用之IL-33蛋白質係指介白素33，尤其哺乳動物介白素33蛋白，例如以UniProt編號O95760寄存之人類蛋白。然而，鑒於本發明人之研究結果，顯然此實體不為單一種類但取而代之以還原及氧化型式存在。鑒於還原型式在活體內例如在5分鐘至40分鐘時段內及在活體外快速氧化，一般先前技術對IL-33之提及實際上為對氧化型式之提及。此外，商業試驗似乎定量此氧化型式。
氧化型IL-33、IL-33-DSB(二硫鍵鍵結)及DSB IL-33在本文中可互換使用。
如本文所用之氧化型IL-33係指作為獨特帶可見的蛋白質，例如藉由在非還原條件下之西方墨點分析，尤其質量為4Da小於相應還原型式。特定言之，其係指在獨立地選自半胱胺酸208、227、232及259之半胱胺酸之間具有一或兩個二硫化鍵之蛋白質。在一個實施例中，氧化型IL-33展示不與ST2結合。
還原型IL-33及redIL-33在本文中可互換使用。
如本文所用之還原型IL-33係指與ST2結合且觸發ST2依賴性信號傳導之IL-33型式。特定言之，還原型式之半胱胺酸208、227、232及259並非二硫鍵鍵結。如本文所用之redIL-33活性片段係指具有類似於redIL-33之活性，例如相似程度之ST2依賴性信號傳導的片段。在一個實施例中，活性片段為全長redIL-33之活性的20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
如本文所用之ST-2依賴性信號傳導係指IL-33/ST2系統，其中由ST2辨識IL-33促進在細胞表面上與IL1-RAcP二聚及在細胞內為胞內TIR域補充受體複合物組分MyD88、TRAF6及IRAK1-4。因此，ST-2依賴性信號傳導可藉由擾動IL-33與ST2相互作用或者中斷與IL-1RAcP相互作用來中斷。
如本文所用之「以還原型式穩定」係指促進蛋白質採用或保持還原型式或防止氧化型IL-33形成之修飾。
在一個實施例中，藉由與化學實體結合，例如生物素化來穩定。redIL-33在中性pH下暴露於-SH反應試劑生物素BMCC(可購自Thermo scientific)時傾向於單生物素化。由本發明人進行之分析表明生物素化發生在Cys208。在此位置處的生物素化似乎阻斷及/或減少蛋白質氧化。雖然不希望受理論束縛，由本發明人進行之電腦模擬分析表明Cys208為構形變化及蛋白質氧化所需的活動之潛在引發劑。
在一個實施例中，穩定為在Cys208處之生物素化。
在一個實施例中，Cys208經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys227經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys232經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys259經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys208及227獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys208及232獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys208及259獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys208、227及232獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys208、227及259獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys208、232及259獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys227、232及259獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。在一個實施例中，Cys208、227、232及259獨立地經諸如絲胺酸之胺基酸置換。
如本文所用之突變係指胺基酸序列之改變或聚核苷酸序列之改變，以致由聚核苷酸編碼之胺基酸不同或達成一些其他有形的(例如)功能差異。特定言之，該變化可包含胺基殘基之缺失或取代。遺傳密碼中之密碼子優化或冗餘在本申請案之上下文中不為突變。
在本文中一般將在天然或野生型蛋白質存在胺基酸或聚核苷酸序列變化時使用突變，而在論述新穎序列變化時使用變異。
如本文所用之天然係指在野生型序列中發現或以其他方式天然存在之實體，諸如胺基酸。
如本文所用之結合係指接合兩個實體或片段之連接，例如鍵，諸如共價鍵。
如本文所用之實體係指「元素」、分子、片段、原子、組分或其類似物。
化學實體為藉由合成化學方法製備之類型的分子或片段。
在一個實施例中，藉由IL-33蛋白質之突變，例如點突變，尤其 用替代胺基酸(例如絲胺酸)置換一或多個半胱胺酸胺基酸來穩定。如在此情形下所用之替代胺基酸係指非半胱胺酸胺基酸。在一個實施例中，胺基酸為非天然存在之胺基酸。在一個實施例中，胺基酸為天然存在之胺基酸。在一個實施例中，胺基酸為蛋白質。在一個實施例中，胺基酸為絲胺酸，其為有利的，因為其為保守取代且一般在此取代之後保留蛋白質活性。
redIL-33之穩定為重要的，因為其固定IL-33在活性構形中之型式，繼而可用作工具來找到減弱蛋白質活性之結合分子。在一個實施例中，使用穩定蛋白質來詢問分子庫，諸如噬菌體抗體庫或合成抗體庫。在一個實施例中，使用穩定蛋白質使宿主免疫，藉此提供第一次機會來產生對還原型式具有特異性之抗體。
如本文所用之「減弱活性」係指減少相關活性或遏止相關活性。除非上下文另外指示，否則減弱及抑制一般在本文中可互換使用。
在一個實施例中，藉由結合redIL-33減弱。在一個實施例中，結合分子，諸如抗體或其結合片段對redIL-33具有特異性，換言之，其對redIL-33之親和力比對氧化型式更大，例如1、2、3、4、5更大親和力或以上。此在本文中稱為redIL-33特異性抗體。
在一個實施例中，redIL-33特異性抗體結合，使得其在空間上阻斷與受體ST2結合。
在一個實施例中，redIL-33特異性抗體結合，使得其在空間上阻斷與受體IL-1RAcP結合。
在一個實施例中，redIL-33特異性抗體結合，使得其異位阻斷與受體ST2結合。
在一個實施例中，redIL-33特異性抗體結合，使得其異位阻斷與受體IL-1RAcP結合。
在一個實施例中，redIL-33特異性抗體結合，使得其異位阻斷經由受體ST2之信號傳導，但可結合ST2及/或IL-1RAcP。
在一個實施例中，抗體結合IL-33氧化型式且催化還原型式向氧化型式轉化。雖然不希望受理論束縛，該過程之平衡可藉由結合氧化型式改變而促進向氧化型式轉化。
應注意，術語「一個(a/an)」實體係指一或多個彼實體；例如，「一種抗IL-33抗體」應理解為表示一或多種抗IL-33抗體。因此，術語「一個(a/an)」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，且係指由經醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)組成之分子。術語「多肽」係指兩個或兩個以上胺基酸之任何鏈，且不指產物之特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「胺基酸鏈」或用於指兩個或兩個以上胺基酸之鏈的任何其他術語包括在「多肽」之定義內，且可使用術語「多肽」替代此等術語中之任一者，或術語「多肽」可與此等術語中之任一者互換使用。術語「多肽」亦意指多肽之表現後修飾產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團衍生作用、蛋白水解分裂或藉由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物學來源或藉由重組技術產生，但不必定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成。
具有定義之三維結構的多肽稱為摺疊，且不具有定義之三維結構而是可採用許多不同構形之多肽稱為展開。如本文所用，術語醣蛋白係指與經由胺基酸殘基(例如，絲胺酸殘基或天冬醯胺殘基)之含氧或含氮側鏈連接至蛋白質之至少一個碳水化合物部分偶合之蛋白質。
「經分離」之多肽或其片段、變異體或衍生物意指不處於其天 然環境中之多肽。不需要特定的純化水準。舉例而言，經分離之多肽可自其原生或天然環境中移出。出於本發明之目的，在宿主細胞中表現之重組產生型多肽及蛋白質視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離或部分或實質上純化之天然或重組多肽亦視為經分離。
如本文所用之蛋白質係指具有二級及三級結構之多肽。
亦包括前述多肽之片段、衍生物、類似物或變異體及其任何組合作為本發明之多肽。
術語「片段」、「變異體」、「衍生物」及「類似物」例如在提及本發明之蛋白質或多肽，諸如本發明之抗IL-33抗體或抗體多肽時包括保留相應的本發明抗體或抗體多肽之至少一些抗原結合特性之任何多肽。本發明多肽之片段除包括本文中其他處所論述之特異性抗體片段外，亦包括蛋白水解片段以及缺失片段。本發明之抗IL-33抗體及抗體多肽之變異體包括如上文所描述之片段，以及具有由於胺基酸取代、缺失或插入而改變之胺基酸序列的多肽。變異體可為天然存在或非天然存在的。非天然存在之變異體可使用此項技術中已知之突變誘發技術產生。
變異體多肽可包含保守或非保守胺基酸取代、缺失或添加。變異體多肽亦可在本文中稱為「多肽類似物」。如本文所用，例如抗IL-33抗體或抗體多肽之「衍生物」係指具有藉由官能側基反應而化學衍生的一或多個殘基之主題多肽。亦包括含有二十個標準胺基酸之一或多個天然存在之胺基酸衍生物的彼等肽作為「衍生物」。舉例而言，4-羥基脯胺酸可取代脯胺酸；5-羥基離胺酸可取代離胺酸；3-甲基組胺酸可取代組胺酸；高絲胺酸可取代絲胺酸；且鳥胺酸可取代離胺酸。本發明之抗IL-33抗體及抗體多肽之衍生物可包括已改變從而展現在參考抗體或本發明之抗體多肽上未發現之額外特徵的多肽。
術語「聚核苷酸」意欲涵蓋單數核酸以及複數核酸，且係指經 分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸」係指存在於聚核苷酸中之任何一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。「經分離」之核酸或聚核苷酸意欲為已自其天然環境移出之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，包含於載體中之編碼抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段之重組聚核苷酸視為經分離。經分離之聚核苷酸之其他實例包括異源宿主細胞中所維持之重組聚核苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。經分離之RNA分子包括本發明之聚核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄物。根據本發明之經分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元素，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
如本文所用，「編碼區」為核酸中由轉譯成胺基酸之密碼子組成的一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)並未轉譯成胺基酸，其可視為編碼區之一部分，但任何側接序列，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似者不為編碼區之一部分。兩個或兩個以上本發明編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如在單一載體上，或存在於單獨聚核苷酸構築體中，例如在單獨(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或兩個以上編碼區，例如單一載體可分別編碼免疫球蛋白重鏈可變區及免疫球蛋白輕鏈可變區。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，異源編碼區與編碼抗IL-33抗體或其片段、變異體或衍生物之核酸融合或未融合。異源編碼區包括(但不限於)專門化元素或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。
在某些實施例中，聚核苷酸或核酸為DNA。在DNA之情況下， 包含編碼多肽之核酸的聚核苷酸通常可包括啟動子及/或與一或多個編碼區可操作地相關聯之其他轉錄或轉譯控制元素。可操作關聯係在基因產物(例如，多肽)之編碼區與一或多個調節序列以在調節序列之影響或控制下發起基因產物表現之方式相關聯時。若誘導啟動子功能導致編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其相關聯的啟動子)為「可操作地相關聯」。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸的轉錄，則啟動子區域將與彼核酸可操作地相關聯。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子之外的其他轉錄控制元素(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與導引細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地相關聯。適合啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。
多種轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-血球蛋白)之彼等區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。額外適合之轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及淋巴因子誘導之啟動子(例如，由干擾素或介白素誘導之啟動子)。
相似地，多種轉譯控制元素為一般技術者所知。此等元素包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及來源於小核糖核酸病毒之元素(尤其內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。
在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA(mRNA)型式。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽之額外編碼區相關聯，從而導引由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有在已引發生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網輸出之後自成熟蛋白質裂解之信號肽或分泌性前導序列。一般技術者意識到，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽N端融合之信號肽，該信號肽自完全或「全長」多肽裂解而產生分泌或「成熟」型式之多肽。在某些實施例中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或保持導引與其可操作地相關聯之多肽分泌之能力的彼序列之功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。
本發明之「結合分子」或「抗原結合分子」在其最廣泛意義上係指特異性結合抗原決定子之分子。在一個實施例中，結合分子特異性結合於IL-33，尤其redIL-33或IL-33-DSB。在另一實施例中，本發明之結合分子為抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明之結合分子包含參考抗體分子之至少一個重鏈或輕鏈CDR。在另一實施例中，本發明之結合分子包含一或多個參考抗體分子之至少六個CDR。
本發明係關於某些抗IL-33抗體，或其抗原結合片段、變異體或衍生物。
如本文所用之抗體係指如下文更詳細論述之免疫球蛋白分子，尤其全長抗體或包含全長抗體之分子，例如DVD-Ig克分子及其類似者。
結合片段為抗體片段之抗原決定基/抗原結合片段，例如包含結 合，尤其包含6個CDR，諸如重鏈可變區中之3個CDR及輕鏈可變區中之3個CDR。
除非特定提及全尺寸抗體，諸如天然存在之抗體，否則術語「抗IL-33抗體」涵蓋全尺寸抗體以及該等抗體之抗原結合片段、變異體、類似物或衍生物，例如天然存在之抗體或免疫球蛋白分子或以類似於抗體分子之方式結合抗原的經工程改造之抗體分子或片段。
如本文所用，「人類」或「完全人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體，且包括自人類免疫球蛋白庫或一或多個人類免疫球蛋白之動物轉殖基因分離且不表現內源性免疫球蛋白之抗體。完全人類抗體對於治療性治療人類患者為尤其理想的。人類抗體可藉由此項技術中已知之多種方法(包括噬菌體呈現方法)使用來源於如以下各者中所描述之人類免疫球蛋白序列的抗體庫製得：Vaughan等人，Nat.Biotech.14：309-314(1996)；Sheets等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.95：6157-6162(1998)；Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.227：381(1992)；及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581(1991))。用於產生及使用抗體噬菌體庫之技術亦描述於例如以下各者中：美國專利第5,969,108號、第6,172,197號、第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號、第6,593,081號、第6,300,064號、第6,653,068號、第6,706,484號及第7,264,963號；及Rothe等人，J.Mol.Biol.,376：1382(2008)(其中每一者均以全文引用的方式併入本文中)。另外，如此項技術中已知，人類抗體可使用不能表現功能性內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠產生。對於此技術之概述，參見Lonberg及Huszar,Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。「人類」或「完全人類」抗體亦包括包含至少重鏈可變域或至少重鏈及輕鏈可變域之抗體，其中可變域具有人類免疫球蛋白可變域之胺基酸序列。
「人類」或「完全人類」抗體亦包括如上文所描述之包含本文所描述之抗體分子(例如，VH區及/或VL區)的變異體(包括衍生物)、基本上由該等變異體組成或由該等變異體組成之「人類」或「完全人類」抗體，該等抗體或其片段免疫特異性結合於根據本發明之IL-33多肽或其片段或變異體。
可使用熟習此項技術者已知之標準技術在編碼人類抗IL-33抗體之核苷酸序列中引入突變，包括(但不限於)導致胺基酸取代之定點突變誘發及PCR介導之突變誘發。在一個實施例中，相對於參考VH區、CDRH1、CDRH2、CDRH3、VL區、CDRL1、CDRL2或CDRL3，變異體(包括衍生物)編碼少於50個胺基酸取代、少於40個胺基酸取代、少於30個胺基酸取代、少於25個胺基酸取代、少於20個胺基酸取代、少於15個胺基酸取代、少於10個胺基酸取代、少於5個胺基酸取代、少於4個胺基酸取代、少於3個胺基酸取代或少於2個胺基酸取代。
在某些實施例中，胺基酸取代為保守胺基酸取代，進一步論述於下文中。或者，突變可沿全部或部分編碼序列隨機引入，諸如藉由飽和突變誘發，且可針對生物活性篩選所得突變體來識別保留活性(例如，結合IL-33多肽，例如人類、靈長類動物、鼠類IL-33或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合的能力)之突變體。「人類」或「完全人類」抗體之該等變異體(或其衍生物)亦可稱為「優化」或「抗原結合優化」之人類或完全人類抗體，且包括(但不限於)對抗原具有改良之親和力的抗體、抗原特異性改變之抗體或潛在結構傾向性減少之抗體。
脊椎動物系統中之基本免疫球蛋白結構為相對充分理解的。參見例如，Harlow等人(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
如將在下文中更詳細論述，術語「免疫球蛋白」包含可以生物化學方式區分之各種廣泛類別之多肽。熟習此項技術者應瞭解，重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其中有一些子類(例如，γ1至γ4)。此鏈之性質將抗體之「類別」分別確定為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等充分表徵且已知賦予功能專門化。此等類別及同型中之每一者的修飾型式可由熟習此項技術者鑒於本發明容易辨別，且因此在本發明之範疇內。雖然以下論述一般將關於免疫球蛋白分子之IgG類別，所有免疫球蛋白類別顯然在本發明之範疇內。關於IgG，標準免疫球蛋白分子包含分子量為大約23,000道爾頓之兩個相同輕鏈多肽，及分子量為53,000至70,000之兩個相同重鏈多肽。四個鏈通常藉由二硫鍵以「Y」組態接合，其中輕鏈自「Y」之口開始且繼續在整個可變區中包圍重鏈。
輕鏈分類為κ或λ。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈結合。一般而言，輕鏈與重鏈彼此共價鍵結，且在免疫球蛋白由融合瘤、B細胞或經基因工程改造之宿主細胞產生時兩個重鏈之「尾」部分彼此藉由共價二硫鍵或非共價鍵鍵結。在重鏈中，胺基酸序列自Y組態之分叉端處的N端運行至各鏈之底部的C端。
抗體「Y」之基體稱為Fc(片段，可結晶)區，且由視抗體類別而定促進兩個或三個恆定域之兩個重鏈組成。因此，Fc區與特定類別之Fc受體及其他免疫分子(諸如補體蛋白)結合。將輕鏈及重鏈分成具有結構及功能同源性之區域。術語「恆定」及「可變」係在功能上使用。就此而言，應瞭解，輕鏈(Vλ或Vκ)及重鏈(VH)部分之可變域確定抗原辨識及特異性。反之，輕鏈(CL)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定域賦予重要生物特性，諸如分泌、經胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合及其類似特性。按照慣例，恆定區域之編號隨著其距離抗體之抗原結合位點或胺基末端愈遠而增大。N端部分為可變區且在C端 部分為恆定區；CH3及CL域實際上分別包含重鏈及輕鏈之羧基末端。
如上文所指出，可變區允許抗體選擇性辨識及特異性結合抗原上之抗原決定基。亦即，抗體之VL域及VH域或此等可變域內的互補決定區(CDR)之子集組合形成界定三維抗原結合位點之可變區。此四級抗體結構形成存在於Y之各臂末端之抗原結合位點。更特定言之，抗原結合位點由VH及VL鏈中之每一者上的三個CDR界定。在例如來源於駱駝物種或基於駱駝免疫球蛋白經工程改造之某些免疫球蛋白分子之一些情況下，完整免疫球蛋白分子可僅由重鏈組成，無輕鏈。參見例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)。
在天然存在之抗體中，各抗原結合域中存在之六個「互補決定區」或「CDR」為胺基酸的非鄰接短序列，在抗體假設為其水性環境中之三維組態時，該等序列特異性定位以形成抗原結合域。抗原結合域中之胺基酸的其餘部分稱為「構架」區，展示較少分子間變化性。構架區主要採用β-摺疊構形且CDR形成環，該等環連接β-摺疊結構且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分。因此，構架區用於形成骨架，該骨架藉由鏈間非共價相互作用提供CDR在正確方向中之定位。藉由定位之CDR形成的抗原結合域界定與免疫反應性抗原上之抗原決定基互補的表面。此互補表面促進抗體與其同源抗原決定基非共價結合。一般技術者可容易識別分別包含CDR及構架區之胺基酸的任何給定重鏈或輕鏈可變域，因為其已被精確定義(參見下文)。
在存在兩種或兩種以上在此項技術中所用及/或所接受之術語的定義之情況下，除非相反地明確陳述，否則如本文所用之術語的定義意欲包括所有此類含義。特定實例為使用術語「互補決定區」(「CDR」)來描述重鏈及輕鏈多肽之可變區內存在的非鄰接抗原組合位點。此特定區域已由Kabat等人(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 及Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述，以上兩者以引用的方式併入本文中，其中在相對於彼此比較時定義包括重疊或胺基酸殘基之子集。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任何定義的應用意欲處於如本文所定義及所用之術語的範疇內。涵蓋如上文所引用之參考文獻中之每一者所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表1中作為比較。涵蓋特定CDR之確切殘基數目將視CDR之序列及尺寸而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定的情況下，熟習此項技術者可以常規方式確定哪些殘基包含特定CDR。
Figure 105110432-A0202-12-0079-923
1表1中之所有CDR定義之編號均根據Kabat等人所闡述之編號約定(參見下文)。
Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變域序列編號系統。一般技術者可將此「Kabat編號」系統明確地分配給任何可變域序列，而不依賴於除序列本身以外的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」所闡述之編號系統。除非另外說明，否則對本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物中的特定胺基酸殘基位置之編號的參考係根據Kabat編號系統。
本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物包括(但不限於)多株、單株多特異性小鼠、人類、人類化、靈長類化或嵌合抗體；單鏈抗體；抗原決定基結合片段，例如Fab、Fab'及F(ab')2、Fd、 Fvs、單鏈Fvs(scFv)、二硫鍵連接之Fvs(sdFv)、包含VL或VH域之片段、由Fab表現庫產生之片段；及抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如本文所揭示之抗Id抗體至抗IL-33抗體)。ScFv分子為此項技術中已知且描述於例如美國專利第5,892,019號中。本發明之免疫球蛋白或抗體分子可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2等)或子類別之免疫球蛋白分子。
如本文所用，術語「重鏈部分」包括來源於免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列。包含重鏈部分之多肽包含以下中之至少一者：CH1域、鉸鏈(例如，上部、中部及/或下部鉸鏈區)域、CH2域、CH3域或其變異體或片段。舉例而言，適用於本發明之結合多肽可包含：包含CH1域之多肽鏈；包含CH1域、至少一部分鉸鏈域及CH2域之多肽鏈；包含CH1域及CH3域之多肽鏈；包含CH1域、至少一部分鉸鏈域及CH3域之多肽鏈；或包含CH1域、至少一部分鉸鏈域、CH2域及CH3域之多肽鏈。在另一實施例中，本發明之多肽包含有包含CH3域之多肽鏈。此外，適用於本發明之結合多肽可能缺乏至少一部分CH2域(例如，全部或部分CH2域)。如上文所闡述，一般技術者應理解，此等域(例如，重鏈部分)可經修飾，使得其胺基酸序列不同於天然存在之免疫球蛋白分子。
在本文所揭示之某些抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物中，多聚體之一個多肽鏈之重鏈部分與多聚體之第二多肽鏈上之彼等重鏈部分相同。或者，本發明之含重鏈部分單體不相同。舉例而言，各單體可包含不同靶結合位點，形成例如雙特異性抗體。
本文所揭示之適用於診斷及治療方法之結合分子之重鏈部分可來源於不同免疫球蛋白分子。舉例而言，多肽之重鏈部分可包含來源於IgG1分子之CH1域及來源於IgG3分子之鉸鏈區。在另一實例中，重 鏈部分可包含部分來源於IgG1分子且部分來源於IgG3分子之鉸鏈區。在另一實例中，重鏈部分可包含部分來源於IgG1分子且部分來源於IgG4分子之嵌合鉸鏈。
如本文所用，術語「輕鏈部分」包括來源於免疫球蛋白輕鏈，例如κ或λ輕鏈之胺基酸序列。較佳地，輕鏈部分包含VL或CL域中之至少一者。
本文所揭示之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可就抗原決定基或抗原部分，例如其辨識或特異性結合之本文所揭示之靶多肽(例如，全長或成熟IL-33)而言進行描述或指定。靶多肽之與抗體之抗原結合域特異性相互作用之部分為「抗原決定基」或「抗原決定子」。視抗原之尺寸、構形及類型而定，靶多肽可包含單一抗原決定基，但通常包含至少兩個抗原決定基，且可包括任何數目之抗原決定基。此外，應注意，靶多肽上之「抗原決定基」可為或可包括非多肽元素，例如抗原決定基可包括碳水化合物側鏈。
抗體之肽或多肽抗原決定基之最小尺寸被認為是約四至五個胺基酸。肽或多肽抗原決定基較佳含有至少七個，更佳至少九個且最佳至少約15至約30個胺基酸。由於CDR可辨識三級型式之抗原性肽或多肽，包含抗原決定基之胺基酸不必鄰接，且在一些情況下甚至可不在同一肽鏈上。由本發明之抗IL-33抗體辨識之肽或多肽抗原決定基可含有IL-33之至少4、至少5、至少6、至少7、更佳至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25或約15至約30個鄰接或非鄰接胺基酸之序列。
「特異性結合」一般意謂抗體經由其抗原結合域與抗原決定基結合，且該結合在抗原結合域與抗原決定基之間需要一些互補性。根據此定義，當抗體經由其抗原結合域結合於彼抗原決定基比其將結合於隨機不相關抗原決定基更容易時，則抗體稱為「特異性結合」於抗 原決定基。術語「特異性」在本文中用於限定某一抗體與某一抗原決定基結合之相對親和力。舉例而言，可認為抗體「A」比抗體「B」對給定抗原決定基具有更高特異性，或抗體「A」可據稱以高於其對相關抗原決定基「D」之特異性結合於抗原決定基「C」。
在一個實施例中，抗體或其結合片段優先結合IL-33。「優先結合」意謂抗體特異性結合於抗原決定基比其將結合於相關、相似、同源或類似抗原決定基更容易。因此，「優先結合」於給定抗原決定基之抗體將更可能結合於彼抗原決定基而非相關抗原決定基，儘管此類抗體可與相關抗原決定基交叉反應。
作為非限制性實例，若抗體以小於第二抗原決定基之抗體的KD之解離常數(KD)結合第一抗原決定基，則抗體可視為優先結合該第一抗原決定基。在另一非限制性實例中，若抗體以小於第二抗原決定基之抗體的KD之至少一個數量級的親和力結合第一抗原決定基，則抗體可視為優先結合第一抗原。在另一非限制性實例中，若抗體以小於第二抗原決定基之抗體的KD之至少兩個數量級的親和力結合第一抗原決定基，則抗體可視為優先結合第一抗原決定基。
在另一非限制性實例中，若抗體以小於第二抗原決定基之抗體的k(解離)之解離率(k(解離))結合第一抗原決定基，則抗體可視為優先結合第一抗原決定基。在另一非限制性實例中，若抗體以小於第二抗原決定基之抗體的k(解離)之至少一個數量級的親和力結合第一抗原決定基，則抗體可視為優先結合第一抗原決定基。在另一非限制性實例中，若抗體以小於第二抗原決定基之抗體的k(解離)之至少兩個數量級的親和力結合第一抗原決定基，則抗體可視為優先結合第一抗原決定基。
在一個實施例中，根據本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可據稱以小於或等於5×10-1sec-1、10-1sec-1、5×10-2 sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1之解離速率(k(解離))結合本文所揭示之靶多肽(例如IL-33，例如人類、靈長類動物、鼠類IL-33或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合)或其片段或變異體。舉例而言，本發明之抗體可據稱以小於或等於5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1之解離速率(k(解離))結合本文所揭示之靶多肽(例如IL-33，例如人類、靈長類動物、鼠類IL-33或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合)或其片段或變異體。
在一個實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可據稱以大於或等於103M-1 sec-1、5×103M-1 sec-1、104M-1 sec-1或5×104M-1 sec-1之締合速率(k(締合))結合本文所揭示之靶多肽(例如IL-33，例如人類、靈長類動物、鼠類IL-33或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合)或其片段或變異體。舉例而言，本發明之抗體可據稱以大於或等於105M-1 sec-1、5×105M-1 sec-1、106M-1 sec-1或5×106M-1 sec-1或107M-1 sec-1之締合速率(k(締合))結合本文所揭示之靶多肽(例如IL-33，例如人類、靈長類動物、鼠類IL-33或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合)或其片段或變異體。
如本文所用之交叉反應性意指結合分子，例如抗體或其結合片段結合同一抗原決定基或重疊抗原決定基。如本文所用之競爭性抑制結合為交叉反應性之一種型式。
若抗體在其以一定程度阻斷參考抗體與抗原決定基結合之程度上優先結合於給定抗原決定基，則抗體據稱競爭性抑制參考抗體與彼抗原決定基結合。競爭性抑制可藉由此項技術中已知之任何方法確定，例如固相試驗(諸如競爭ELISA試驗)、解離增強鑭系螢光免疫試驗(DELFIA®,Perkin Elmer)及放射性配位體結合試驗。抗體可據稱競爭性使參考抗體與給定抗原決定基之結合抑制了至少90%、至少 80%、至少70%、至少60%或至少50%。
如本文所用，術語「親和力」係指個別抗原決定基與免疫球蛋白分子之CDR的結合強度之量測。參見例如，Harlow等人(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版)第27-28頁。如本文所用，術語「親合力」係指免疫球蛋白群體與抗原之間的複合物之總體穩定性，亦即，免疫球蛋白與抗原混合物之功能性結合強度。參見例如，Harlow第29-34頁。親合力係關於群體中個別免疫球蛋白分子與特定抗原決定基之親和力，以及免疫球蛋白及抗原之價數。舉例而言，二價單株抗體與具有高度重複抗原決定基結構之抗原(諸如聚合物)之間的相互作用將為具有高親合力之例子。
本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物亦可就其交叉反應性而言進行描述或指定。如本文所用，術語「交叉反應性」係指對一種抗原具有特異性之抗體與第二抗原反應之能力；兩種不同抗原性物質之間的相關性量測。因此，若抗體與除誘導其形成之抗原決定基以外的抗原決定基結合，則抗體為交叉反應的。交叉反應性抗原決定基一般含有許多相同互補結構特徵作為誘導抗原決定基，且在一些情況下可實際上比原始更適合。
舉例而言，某些抗體具有一定程度之交叉反應性，因為其結合相關但不相同之抗原決定基，例如與參考抗原決定基具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%及至少50%一致性(如使用此項技術中已知及本文所描述之方法計算)之抗原決定基。若抗體不結合與參考抗原決定基具有小於95%、小於90%、小於85%、小於80%、小於75%、小於70%、小於65%、小於60%、小於55%及小於50%一致性(如使用此項技術中已知及本文所描述之方法計算)之抗原決定基，則抗體可據稱幾乎不 具有或無交叉反應性。若抗體不結合某一抗原決定基之任何其他類似物、直系同源物或同系物，則抗體可被認為對彼抗原決定基具有「高度特異性」。
本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物亦可就其對本發明之多肽(例如IL-33，例如人類、靈長類動物、鼠類IL-33或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合)的結合親和力而言進行描述或指定。較佳結合親和力包括解離常數或Kd為小於5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M之彼等結合親和力。
本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可為「多特異性」，例如雙特異性、三特異性或具有更大多特異性，意謂其辨識且同時結合於存在於一或多種不同抗原(例如，蛋白質)上的兩個或兩個以上不同抗原決定基。因此，抗IL-33抗體是否為「單特異性」或「多特異性」(例如，「雙特異性」)係指與結合多肽反應之不同抗原決定基的數目。多特異性抗體可對本文所描述之靶多肽之不同抗原決定基具有特異性，或可對靶多肽以及異源抗原決定基(諸如異源多肽或固體支撐材料)具有特異性。
如本文所用，術語「價數」係指潛在結合域，例如存在於結合多肽或IL-33結合分子(例如，抗體或其抗原結合片段)中之抗原結合域的數目。各結合域特異性結合一個抗原決定基。當結合多肽或IL-33結合分子包含一個以上結合域時，各結合域可特異性結合相同抗原決定基(對於具有兩個結合域之抗體)，稱為「二價單特異性」，或特異性結合不同抗原決定基(對於具有兩個結合域之抗體)，稱為「二價雙 特異性」。抗體或其抗原結合片段之各特異性亦可為雙特異性及二價(稱為「雙特異性四價抗體」)。在另一實施例中，可製得四價微型抗體或域缺失抗體。
雙特異性二價抗體及其製造方法描述於例如美國專利第5,731,168號、第5,807,706號、第5,821,333號；及美國專利申請公開案第2003/020734號及第2002/0155537號中，以上所有者之揭示內容均以引用的方式併入本文中。雙特異性四價抗體及其製造方法描述於例如WO 02/096948及WO 00/44788中，兩者之揭示內容以引用的方式併入本文中。一般而言，參見PCT公開案WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)；美國專利第4,474,893號、第4,714,681號、第4,925,648號、第5,573,920號、第5,601,819號；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
如先前所指示，各種免疫球蛋白類別之恆定區之亞單位結構及三維組態為熟知的。如本文所用，術語「VH域」包括免疫球蛋白重鏈之胺基末端可變域，且術語「CH1域」包括免疫球蛋白重鏈之第一(大部分胺基末端)恆定區域。CH1域與VH域相鄰，且為免疫球蛋白重鏈分子之胺基末端鉸鏈區。
如本文所用，術語「CH2域」包括重鏈分子之例如自抗體之使用習知編號方案之約殘基244延伸至殘基360的部分(殘基244至360，Kabat編號系統；及殘基231-340，EU編號系統；參見Kabat EA等人)。CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。實際上，兩個N-連接分支鏈碳水化合物鏈插入於完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。亦有據可查的為CH3域自IgG分子之CH2域延伸至C端，且包含大約108個殘基。
如本文所用，術語「鉸鏈區」包括接合CH1域與CH2域之重鏈分 子之部分。此鉸鏈區包含大約25個殘基且為柔性的，因此允許兩個N端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可細分為三個不同域：上部、中部及下部鉸鏈域(Roux等人，J.Immunol.161：4083(1998))。
如本文所用，術語「二硫鍵」包括在兩個硫原子之間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸包含可與第二硫醇基形成二硫鍵或橋之硫醇基。在大多數天然存在之IgG分子中，在對應於使用Kabat編號系統之239及242的位置(位置226或229，EU編號系統)處，CH1區及CL區藉由二硫鍵連接且兩個重鏈藉由兩個二硫鍵連接。
如本文所用，術語「嵌合抗體」將被認為意謂免疫反應區域或位點獲得或來源於第一物種且恆定區(根據本發明，其可為完整、部分或經修飾的)獲自第二物種之任何抗體。在某些實施例中，靶結合區或位點將來自非人類來源(例如，小鼠或靈長類動物)，且恆定區為人類。
如本文所用，術語「經工程改造之抗體」應指重鏈或輕鏈或兩者中之可變域藉由至少一個胺基酸置換改變之人類抗體。在一個實施例中，構架殘基之胺基酸置換將藉由使構架殘基變為生殖系來降低潛在免疫原性。在另一實施例中，構架或CDR殘基之胺基酸置換可移除可能導致產物不穩定、聚集或異質性之潛在結構傾向。不合需要之傾向的實例包括未配對半胱胺酸(其可導致二硫鍵加擾或可變硫氫基加合物形成)、N-連接糖基化位點(產生結構及活性之異質性)以及脫醯胺(例如，NG、NS)、異構化(DG)、氧化(暴露之甲硫胺酸)及水解(DP)位點。在另一實施例中，CDR及構架殘基藉由靶向或隨機突變誘發方法之胺基酸置換可產生具有增強之結合、效力或特異性特徵之抗體。在另一實施例中，「經工程改造之抗體」係指重鏈或輕鏈或兩者中之可變域藉由至少部分置換具有已知特異性之抗體的一或多個CDR且在必要時藉由部分構架區置換及序列改變而改變之抗體。雖然CDR可來源 於類別或甚至子類與構架區所來源之抗體相同的抗體，據設想，CDR將來源於不同類別之抗體且較佳來源於不同物種之抗體。
如本文所用，術語「人類化抗體」應指來源於非人類物種抗體(在本文中亦稱為供體抗體)之抗體分子，其結合具有來自非人類物種之一或多個互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區的所要抗原(在本文中亦稱為受體抗體)。可能無需用來自供體可變域之完整CDR置換所有CDR以將一個可變域之抗原結合能力轉移至另一者。實際上，可能僅需轉移為維持靶結合位點活性所必需的彼等殘基。
進一步認識到，人類化抗體之重鏈或輕鏈或兩者中之可變域內的構架區可僅包含人源殘基，在該情況下人類化抗體之此等構架區稱為「完全人類構架區」。或者，在必要時供體可變域之構架區之一或多個殘基可在人類化抗體之重鏈或輕鏈或兩者中的可變域之人類構架區之相應位置內經工程改造以維持適當結合或增強結合於IL-33抗原。已以此方式經工程改造之人類構架區將因此包含人類及供體構架殘基之混合物，且在本文中稱為「部分人類構架區」。
舉例而言，抗IL-33抗體之人類化可基本上藉由此項技術中已知之方法(例如，Winter及同事之方法(Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988))用嚙齒動物或突變嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗IL-33抗體之相應序列來進行。亦參見美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,859,205號，其以引用的方式併入本文中。所得人類化抗IL-33抗體將在人類化抗體之重鏈及/或輕鏈可變域之完全人類構架區內包含至少一個嚙齒動物或突變嚙齒動物CDR。在一些情況下，人類化抗IL-33抗體之一或多個可變域之構架區內的殘基經相應的非人類(例如， 嚙齒動物)殘基置換(參見例如，美國專利第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第6,180,370號)，在該情況下，所得人類化抗IL-33抗體將在重鏈及/或輕鏈可變域內包含部分人類構架區。
此外，人類化抗體可包含在接受者抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能(例如，獲得所要親和力)。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有的至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR對應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR，且所有或實質上所有構架區為人類免疫球蛋白序列之彼等構架區。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。對於其他細節，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)；其以引用的方式併入本文中。因此，該等「人類化」抗體可包括實質上少於完整人類可變域已經非人類物種之相應序列取代之抗體。實際上，人類化抗體通常為一些CDR殘基及可能一些構架殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。參見例如，美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,859,205號。亦參見美國專利第6,180,370號及國際公開案第WO 01/27160號，其中揭示人類化抗體及用於生產對預定抗原具有改良之親和力的人類化抗體之技術。
如本文所用，術語「連接」、「融合(fused/fusion)」可互換使用。此等術語係指藉由包括化學結合或重組手段之任何手段使兩種以上元素或組分接合在一起。「框內融合」係指兩個或兩個以上聚核苷酸開放閱讀框架(ORF)以維持原始ORF之正確轉譯閱讀框架之方式接合形成連續較長ORF。因此，重組融合蛋白為含有對應於由原始ORF編碼之多肽的兩個或兩個以上區段之單一蛋白質(該等區段通常在自然界 中並非如此接合)。雖然在整個融合區段中如此連續製得閱讀框架，該等區段可藉由例如框內連接子序列在物理或空間上分離。舉例而言，編碼免疫球蛋白可變區之CDR的聚核苷酸可在框內融合，但藉由編碼至少一個免疫球蛋白構架區或額外CDR區之聚核苷酸分離，只要「融合」CDR共轉譯為連續多肽之一部分即可。
在多肽之情形下，「直鏈序列」或「序列」為多肽中在胺基至羧基末端方向上的胺基酸之順序，其中序列中彼此相鄰之殘基在多肽之一級結構中鄰接。
如本文所用之術語「表現」係指基因產生生物化學物質(例如多肽)之過程。該過程包括細胞內基因之功能性存在的任何表現形式，包括(但不限於)阻斷基因表現以及短暫表現及穩定表現。其包括(但不限於)基因轉錄成信使RNA(mRNA)及該mRNA轉譯成多肽。若最終所要產物為生物化學物質，則表現包括彼生物化學物質及任何前驅體之形成。基因表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸，例如藉由基因轉錄產生之信使RNA，或為自轉錄物轉譯之多肽。本文所描述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如，聚腺苷酸化)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如，甲基化、糖基化、脂質添加、與其他蛋白質亞單位結合、蛋白水解分裂及其類似修飾)之多肽。
如本文所用，術語「治療(treat/treatment)」係指治療性治療及防治性或預防性措施，其中目標為預防或減慢(減輕)不希望的生理變化或病症，諸如發炎性病狀之進展。有益或所要的臨床結果包括(但不限於)症狀緩解、疾病程度減輕、疾病狀態穩定(亦即，未惡化)、疾病進展延緩或減慢、疾病狀態改善或緩和及緩解(部分抑或全部緩解)，無論是可檢測抑或不可檢測的。「治療」亦可意謂與在不接受治療時之預計存活期相比延長存活期。需要治療之彼等者包括已患有病狀或病症之彼等者，以及易於患有病狀或病症之彼等者，或體內病狀或病 症待預防之彼等者。
「個體(subject/individual)」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意謂需要診斷、預後或治療之任何個體，尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類；家畜；農畜；及動物園、運動或寵物動物，諸如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。
如本文所用，諸如「將受益於抗IL-33抗體之投與的個體」及「需要治療之動物」之片語包括將受益於所用抗IL-33抗體之投與，例如用於偵測抗IL-33多肽(例如，用於診斷程序)，及/或受益於用抗IL-33抗體治療(亦即，緩和或預防疾病)的個體，諸如哺乳動物個體。
II. 靶多肽描述
如本文所用，術語「IL-33」及「IL-33多肽」可互換使用。在某些實施例中，IL-33為全長。在另一實施例中，IL-33為成熟截短IL-33(胺基酸112-270)。近期研究表明全長IL-33具活性(Cayrol及Girard,Proc Natl Acad Sci U S A 106(22)：9021-6(2009)；Hayakawa等人，Biochem Biophys Res Commun 387(1)：218-22(2009)；Talabot-Ayer等人，J Biol Chem.284(29)：19420-6(2009))。然而，N端處理或截短IL-33包括(但不限於)可具有增強活性之胺基酸72-270、79-270、95-270、99-270、107-270、109-270、111-270、112-270(Lefrancais 2012、2014)。在另一實施例中，IL-33可包括全長IL-33、其片段或IL-33突變或變異多肽，其中IL-33片段或IL-33變異多肽保留活性IL-33之一些或所有功能特性。
人類IL-33為270胺基酸蛋白(寄存編號O95760)，由兩個域組成：同源域及細胞因子(IL-1樣)域。同源域含有核定位信號(NLS)。IL-33最初被識別為「DVS27」基因，其在蛛網膜下出血之後在血管痙攣腦動脈中上調(Onda等人，J.Cereb.Blood Flow Metab.19：1279-88(1999))，且識別為「高內皮微靜脈核因子(NF-HEV)」，其在內皮細胞 核中表現(Baekkevold等人，Am.J.Pathol 163：69-79(2003))。IL-33(亦稱為IL-1F11)現被視為細胞因子IL-1家族之第11個成員，該家族亦包括IL-α、IL1β及IL-18。參見Oboki等人，Allergology International 59：143-160(2010)。
Schmitz等人首次將IL-33識別為孤兒受體ST2之配位體(亦稱為IL-1R4)(Schmitz等人，Immunity 23(5)：479-90(2005))。ST2受體之唯一已知配位體為IL-33(Schmitz等人(2005))。IL-33受體由雜二聚體分子形成，雜二聚體分子由ST2及IL-1R輔助蛋白(IL-1RAcP)組成。IL-1RAcP為IL-1α、IL-1β、IL-1F6、IL1F8及IL1F9之受體的共用組分。IL-33結合於IL-33受體，該受體為ST2與IL-1RAcP之二聚體。IL-1RAcP不為結合所需，但對於信號傳導至關重要。IL-33受體之TIR域補充MyD88及TRAF6，且受體信號導致NFκB及MAP激酶路徑活化(Oboki等人(2010))。IL-33受體可能與其他受體結合，且據報導在人類及小鼠肥大細胞中使受體酪胺酸激酶c-Kit交叉活化(Drube等人，Blood 115：3899-906(2010))。此交叉活化之結構基礎為c-Kit、ST2及IL-1RAcP之間的複合物形成。C-Kit與IL-1RAcP組成性相互作用，且在配位體結合之後ST2接合此複合物。
最近，已展示IL-33結合第二IL-33受體雜二聚體複合物。ST2與另一IL1R家族分子「單一Ig IL-1R相關分子」(SIGIRR)(亦稱為Toll IL-1R8(TIR8))形成複合物。SIGIRR/TIR8視為充當IL-1R及Toll樣受體(TLR)介導之免疫反應的負調節劑(Garlanda等人，Trends Immunol.30：439-46(2009))。與ST2：IL-1RAcP相比，ST2：SIGIRR似乎充當IL-33之負調節劑。
ST2在基線由Th2細胞及肥大細胞表現，兩種細胞類型已知為過敏性哮喘之重要介質。IL-33能夠刺激此等(及各種其他細胞)產生一系列功能性反應，包括細胞因子及趨化因子。
抗IL-33抗體
在某些實施例中，本發明之結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，例如抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180及33_640076-4B、33_640081-AB、33_640082-6B、33_640082-7B、33_640084-2B、33_640086-6B、33_640087-7B、33_640201-2B及33_640237-2B結合於IL-33且抑制IL-33驅動之自肥大細胞、內皮細胞釋放細胞因子及TF-1細胞增殖。
在某些實施例中，本發明之抗體包含結合於IL-33之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，例如抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180及33_640076-4B、33_640081-AB、33_640082-6B、33_640082-7B、33_640084-2B、33_640086-6B、33_640087-7B、33_640201-2B及33_640237-2B。在某些實施例中，抗IL-33抗體結合人類、靈長類動物、鼠類IL-33，或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合。在某些實施例中，抗IL-33抗體抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在一個實施例中，本發明提供一種經分離之結合分子，例如抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於與抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149或IL330180及33_640076-4B、33_640081-AB、33_640082-6B、33_640082-7B、33_640084-2B、33_640086-6B、33_640087-7B、33_640201-2B及33_640237-2B相同的IL-33抗原決定基。在另一實施例中，本發明提供一種經分離之結合分子，例如抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於IL-33，且競爭性抑制抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149或IL330180及33_640076-4B、33_640081-AB、33_640082-6B、33_640082-7B、33_640084-2B、33_640086-6B、33_640087-7B、33_640201-2B及33_640237-2B特異性結合於IL-33，例如人類、靈長 類動物、鼠類IL-33，或人類、靈長類動物及鼠類IL-33之任何組合。
在某些實施例中，本發明之結合分子具有與參考抗IL-33抗體分子之胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%序列一致性之胺基酸序列。在另一實施例中，結合分子與參考抗體共用至少96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在某些實施例中，參考抗體為IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149或IL330180及33_640076-4B、33_640081-AB、33_640082-6B、33_640082-7B、33_640084-2B、33_640086-6B、33_640087-7B、33_640201-2B及33_640237-2B。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含免疫球蛋白重鏈可變域(VH域)，主要由免疫球蛋白重鏈可變域組成或由免疫球蛋白重鏈可變域組成，其中VH域之至少一個CDR具有與上文所揭示之VH CDR的CDR1、CDR2或CDR3區至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或完全一致之胺基酸序列，其中包含經編碼之VH域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含免疫球蛋白重鏈可變域(VH域)，主要由免疫球蛋白重鏈可變域組成或由免疫球蛋白重鏈可變域組成，其中VH域之至少一個CDR具有與上文所揭示之VH CDR至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或完全一致之胺基酸序列，其中包含經編碼之VH域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，經分離之抗體進一步包含免疫球蛋白輕鏈可變域(VL域)。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含免疫球蛋白重鏈可變域(VH域)，主要由免疫球蛋白重鏈可變域組成或由免疫球蛋白重鏈可變域組成，其中VH域之至少一個CDR具有與上文所揭示之VH CDR一致(1、2、3、4或5個保守胺基酸取代除外)之胺基酸序列，其中包含經編碼之VH域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，經分離之抗體進一步包含VL域。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含VH域，主要由VH域組成或由VH域組成，VH域具有與胺基酸序列SEQ ID NO：2、12、22、32、42或52之VH至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，其中包含經編碼之VH域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，經分離之抗體進一步包含VL域。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含免疫球蛋白輕鏈可變域(VL域)，主要由免疫球蛋白輕鏈可變域組成或由免疫球蛋白輕鏈可變域組成，其中VL域之至少一個CDR具有與上文所揭示之VH胺基酸序列SEQ之CDR1、CDR2或CDR3區至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或完全一致之胺基酸序列，其中包含經編碼之VL域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，經分離之抗體進一步包含VH域。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合 片段，其包含免疫球蛋白輕鏈可變域(VL域)，主要由免疫球蛋白輕鏈可變域組成或由免疫球蛋白輕鏈可變域組成，其中VL域之至少一個CDR具有與上文所揭示之VL CDR至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或完全一致之胺基酸序列，其中包含經編碼之VL域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，經分離之抗體進一步包含VH域。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含免疫球蛋白輕鏈可變域(VL域)，主要由免疫球蛋白輕鏈可變域組成或由免疫球蛋白輕鏈可變域組成，其中VL域之至少一個CDR具有與上文所揭示之VL CDR一致(1、2、3、4或5個保守胺基酸取代除外)之胺基酸序列，其中包含經編碼之VL域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，經分離之抗體進一步包含VH域。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明包括一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含VL域，主要由VL域組成或由VL域組成，VL域具有與上文所揭示之VL胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，其中包含經編碼之VL域的抗體或其抗原結合片段特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，經分離之抗體進一步包含VH域。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
可在本發明方法中使用本發明之抗IL-33抗體之適合生物活性變異體。該等變異體將保留親本抗IL-33抗體之所要結合特性。製造抗體變異體之方法一般在此項技術中可獲得。
突變誘發及核苷酸序列改變之方法在此項技術中為熟知的。參見例如，Walker及Gaastra編，(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York)；Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人，Methods Enzymol.154：367-382(1987)；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor,N.Y.)；美國專利第4,873,192號；及其中所引用之參考文獻；其以引用的方式併入本文中。關於不影響相關多肽之生物活性之適當胺基酸取代的指導可見於Dayhoff等人(1978)在Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)，第345-352頁之模型，其以全文引用的方式併入本文中。Dayhoff等人之模型使用點接受突變(PAM)胺基酸相似性矩陣(PAM 250矩陣)確定適合之保守胺基酸取代。保守取代，諸如一個胺基酸經具有相似特性之另一胺基酸交換可為較佳的。如由Dayhoff等人模型之PAM 250矩陣教示之保守胺基酸取代之實例包括(但不限於)Gly
Figure 105110432-A0202-12-0097-65
Ala、Val
Figure 105110432-A0202-12-0097-66
Ile
Figure 105110432-A0202-12-0097-67
Leu、Asp
Figure 105110432-A0202-12-0097-68
Glu、Lys
Figure 105110432-A0202-12-0097-69
Arg、Asn
Figure 105110432-A0202-12-0097-70
Gln及Phe
Figure 105110432-A0202-12-0097-71
Trp
Figure 105110432-A0202-12-0097-72
Tyr。
在構築抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、相關多肽之變異體中，進行修飾使得變異體繼續具有所要特性，例如能夠特異性結合於IL-33且在某些實施例中不阻斷IL-33與ST2結合。顯然，在編碼變異多肽之DNA中進行的任何突變必須不能將序列置於閱讀框架外且較佳將不形成可產生二級mRNA結構之互補區。
量測抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段之結合特異性的方法包括(但不限於)標準競爭性結合試驗、ELISA試驗、BIACORE試驗、功能性試驗(諸如增殖或因子釋放)及其類似方法。參見例如，揭示於WO 93/14125；Shi等人，Immunity 13：633-642(2000)；Kumanogoh等人，J Immunol 169：1375-1381(2002)；Watanabe 等人，J Immunol 167：4321-4328(2001)；Wang等人，Blood 97：3498-3504(2001)；及Giraudon等人，J Immunol 172(2)：1246-1255(2004)中之該等試驗，以上所有者均以引用的方式併入本文中。
如本文所論述，其中任何特定多肽，包括本文所揭示之恆定區、CDR、VH域或VL域與另一多肽至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%一致，一致性%可使用此項技術中已知之方法及電腦程式/軟體測定，諸如(但不限於)BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Unix第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,Wis.53713)。BESTFIT使用Smith及Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489之局部同源性算法找到兩個序列之間的最佳同源性區段。當使用BESTFIT或任何其他序列比對程序判定特定序列是否與根據本發明之參考序列例如95%一致時，參數之設置當然使得一致性百分比係在參考多肽序列之全長內計算且允許參考序列中高達5%之胺基酸總數的同源性空隙。
出於本發明之目的，序列一致性%可使用Smith-Waterman同源性搜索算法使用空隙開放罰分為12且空隙擴展罰分為2之仿射空隙搜索(BLOSUM 62矩陣)確定。Smith-Waterman同源性搜索算法教示於Smith及Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489中。變異體與參考抗IL-33抗體(例如，IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149或IL330180)之不同之處可例如在於少至1至30個胺基酸殘基，少至1至15個胺基酸殘基，少至1至10個胺基酸殘基，諸如6-10個、少至5個、少至4個、3個、2個或甚至1個胺基酸殘基。
能夠特異性結合IL-33且保留所要活性之多肽之精確化學結構視多種因素而定。由於可電離胺基及羧基存在於分子中，可獲得呈酸性或鹼性鹽或中性型式之特定多肽。在置於適合環境條件中時保留其生 物活性之所有該等製劑包括於如本文所用之抗IL-33抗體的定義中。此外，多肽之一級胺基酸序列可藉由衍生作用使用糖部分(糖基化)或藉由其他補充分子(諸如脂質、磷酸鹽、乙醯基及其類似物)增強。其亦可藉由與醣結合來增強。該增強之某些態樣係經由生產宿主之轉譯後處理系統實現；其他該等修飾可在活體外引入。在任何情況下，該等修飾包括於本文所用之抗IL-33抗體的定義中，只要不破壞抗IL-33抗體之所要特性即可。預期在各種試驗中該等修飾可藉由增強或降低多肽活性來定量或定性影響活性。此外，鏈中之個別胺基酸殘基可藉由氧化、還原或其他衍生作用修飾，且多肽可裂解獲得保留活性之片段。不破壞所要特性(例如，對IL-33之結合特異性、結合親和力及結合活性，例如抑制IL-33驅動之自肥大細胞、內皮細胞釋放細胞因子及TF-1細胞增殖的能力)之該等變化不自如本文所用之相關抗IL-33抗體的定義移除多肽序列。
此項技術提供關於製備及使用多肽變異體之實質性指導。在製備抗IL-33結合分子(例如抗體或其抗原結合片段、變異體)中，熟習此項技術者可容易確定對天然蛋白核苷酸或胺基酸序列之何種修飾將產生適合於用作在本發明方法中使用的醫藥組合物之治療活性組分的變異體。
已知Fc區之變異(例如，胺基酸取代及/或添加及/或缺失)可增強或削弱抗體之效應功能，且可改變抗體之藥物動力學特性(例如，半衰期)。舉例而言，參見美國專利第6,737,056B1號及美國專利申請公開案第2004/0132101A1號，其揭示優化與Fc受體結合之抗體之Fc突變。
在某些抗IL-33抗體中，可使用此項技術中已知之技術使Fc部分突變以降低效應功能。舉例而言，例如藉由點突變或胺基酸取代來改變恆定區域可減少循環中之經修飾抗體之Fc受體結合，藉此使效應細 胞或補體所介導對表現或呈現標靶的細胞之清除或損害減至最小。舉例而言，一組特定之取代，三重突變L234F/L235E/P331S(『TM』)使人類IgG1分子與人類C1q、CD64、CD32A及CD16之結合活性大幅降低。參見例如，Oganesyan等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.64：700-704(2008)。
在其他情況下，與本發明一致之恆定區修飾可延長血清半衰期。包含Fc區之蛋白質的血清半衰期可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力來延長。如本文所用之術語「抗體半衰期」意謂抗體之藥物動力學特性，其為抗體分子在投與後之平均存活時間的量測值。抗體半衰期可依患者身體(或其他哺乳動物)或其特定區室(例如如在血清中所量測，亦即循環半衰期)或其他組織中已知數量之免疫球蛋白消除50%時所需的時間表示。一種免疫球蛋白或一類免疫球蛋白與另一種免疫球蛋白或另一類免疫球蛋白之半衰期可能不同。一般而言，抗體半衰期延長導致所投與抗體在循環中之平均滯留時間增加。
半衰期延長使得給與患者之藥物的量減少以及投與頻率降低。為延長抗體之血清半衰期，如此項技術中已知，吾人可將救助受體結合抗原決定基併入抗體(尤其抗體片段)中。如本文所用，術語「救助受體結合抗原決定基」係指引起IgG分子之活體內血清半衰期延長之IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區抗原決定基。亦可藉由修飾被識別為參與Fc與FcRn受體之間相互作用的胺基酸殘基而產生延長半衰期之抗體。舉例而言，將三重突變M252Y/S254T/T256E(『YTE』)引入人類免疫球蛋白G(IgG)分子之CH2域中，使其與人類新生兒Fc受體(FcRn)之結合增加。參見美國專利第7,083,784號，其內容以全文引用的方式併入本文中。
另外，在一些實施例中，Fc區在選自由以下組成之群的一或多個位置(如利用如Kabat中所闡述之EU索引編號)處包含修飾(例如，胺 基酸取代、胺基酸插入、胺基酸缺失)：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440及443。視情況，Fc區可在此項技術中已知之額外及/或替代位置處包含非天然存在之胺基酸殘基。
在其他實施例中，Fc區包含選自由以下組成之群的至少一個取代(如利用如Kabat中所闡述之EU索引編號)：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241 L、241Y、241E、241 R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、 329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y及434W。視情況，Fc區可包含此項技術中已知之額外及/或替代的非天然存在之胺基酸殘基。
在額外實施例中，Fc區在選自由234、235及331組成之群的一或多個位置處包含至少一個修飾(例如，胺基酸取代、胺基酸插入、胺基酸缺失)。在一些實施例中，非天然存在之胺基酸係選自由以下組成之群：234F、235F、235Y及331S。本文提供Fc變異體，其中Fc區在選自由239、330及332組成之群的一或多個位置處包含至少一個非天然存在之胺基酸。在一些實施例中，非天然存在之胺基酸係選自由以下組成之群：239D、330L及332E。
在其他實施例中，Fc區在選自由252、254及256組成之群的一或多個位置處包含至少一個非天然存在之胺基酸。在某些實施例中，非天然存在之胺基酸係選自由以下組成之群：252Y、254T及256E，描述於美國專利第7,083,784號中，該專利之內容以全文引用的方式併入本文中。
然而恆定區之其他修飾可用於修飾二硫鍵聯或寡醣部分，從而因抗原特異性或抗體柔性增強而使定位增強。修飾之所得生理特徵、生物可用性及其他生物化學效果(諸如生物分佈及血清半衰期)可容易使用熟知免疫技術而無需過多實驗來量測及定量。
本發明之抗IL-33抗體亦包括例如藉由使任何類型之分子與抗體共價連接使得共價連接不阻止抗體特異性結合於其同源抗原決定基而 經修飾之衍生物。舉例而言(而非作為限制)，抗體衍生物包括已例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、已知保護/阻斷基團之衍生作用、蛋白水解分裂、與細胞配位體或其他蛋白質連接等經修飾之抗體。多個化學修飾中之任一者可藉由已知技術進行，包括(但不限於)特定化學裂解、乙醯化、甲醯化等。另外，衍生物可含有一或多個非經典的胺基酸。
「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有含有相似電荷之側鏈的胺基酸殘基置換之胺基酸取代。具有含有相似電荷之側鏈的胺基酸殘基家族已在此項技術中定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。或者，可沿全部或部分編碼序列，諸如藉由飽和突變誘發隨機引入突變，且可針對生物活性篩選所得突變體以識別保留活性(例如，結合抗IL-33多肽之能力)之突變體。
舉例而言，有可能僅在抗體分子之構架區中或僅在抗體分子之CDR區中引入突變。所引入之突變可為沉默或中性錯義突變，亦即，對抗體結合抗原之能力不具有影響或幾乎無影響。此等類型之突變可用於優化密碼子使用，或改良融合瘤之抗體產生。或者，非中性錯義突變可改變抗體結合抗原之能力。大多數沉默及中性錯義突變之位置有可能是在構架區中，而大多數非中性錯義突變之位置有可能是在CDR中，但此不為絕對要求。熟習此項技術者將能夠設計及測試具有所要特性之突變體分子，諸如抗原結合活性未改變或結合活性未改變(例如，抗原結合活性改良或抗體特異性改變或最終分子之穩定性/均 質性增強)。在突變誘發之後，經編碼之蛋白質可常規地表現，且經編碼之蛋白質之功能及/或生物活性(例如，免疫特異性結合IL-33多肽之至少一個抗原決定基的能力)可使用本文所描述之技術或藉由此項技術中已知之常規修飾技術確定。
在某些實施例中，本發明之抗體可藉由修飾定位於維尼爾區(vernier region/zone)中之構架殘基或所提出之支撐CDR區結構的殘基來優化(參見例如，Foote,J.及G.Winter,J Mol.Biol.224.2：487-99(1992)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol 31.3：169-217(1994))。在一些實施例中，此等修飾可藉由使用標準分子生物學方法使用PCR介導之定點突變誘發來構築。可如本文所揭示測試經修飾之抗體的結合親和力。在另一實施例中，亦可藉由在CDR區中引入胺基酸取代或藉由定點突變誘發進行進一步優化，例如回復突變或親和力成熟。
在某些實施例中，本發明之抗IL-33抗體包含至少一個經優化之互補決定區(CDR)。「經優化之CDR」意指序列係基於持久或改良之結合親和力及/或賦予給包含經優化之CDR的抗IL-33抗體之抗IL-33活性所選之已經修飾及優化之CDR。「抗IL-33活性」可包括例如調節以下與如下各者相關聯之活性中之一或多者的活性：IL-33，例如IL-33驅動之自肥大細胞、內皮細胞釋放細胞因子及TF-1細胞增殖；自嗜鹼性血球、嗜伊紅血球、Th2細胞、NK、NKT細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞釋放介質(例如，細胞因子或趨化因子)；調節細胞表面受體；調節抗原呈現；或與IL-33相關聯之任何其他活性。抗IL-33活性亦可歸因於與IL-33表現及/或釋放相關聯之疾病發病率或嚴重程度降低，包括(但不限於)某些類型之發炎性病狀，例如過敏性病症，諸如在個體氣管中之哮喘或其他發炎性反應。修飾可涉及在CDR內之胺基酸殘基置換，使得抗IL-33抗體對IL-33抗原保留特異性且具有改良之結合親和力及/或改良之抗IL-33活性。
IV. 編碼抗IL-33抗體之聚核苷酸
本發明亦提供編碼本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之核酸分子。
在一個實施例中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼免疫球蛋白重鏈可變域(VH域)之核酸，主要由編碼免疫球蛋白重鏈可變域之核酸組成或由編碼免疫球蛋白重鏈可變域之核酸組成，其中VH域之至少一個CDR由與選自由以下組成之群的VH編碼序列之CDRH 1、2或3聚核苷酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或完全一致之核酸序列編碼：SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、5421、531、541、551、561、571及581。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在其他實施例中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼免疫球蛋白VH域之核酸，主要由編碼免疫球蛋白VH域之核酸組成或由編碼免疫球蛋白VH域之核酸組成，其中VH域之至少一個CDR之序列係選自由以下組成之群：(a)CDRH1序列，其包含以下各者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、183、193、203、213、223、233、243、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、383、393、403、413、423、433、443、453、463、473、483、493、503、513、5423、533、543、553、563、573及583；(b)CDRH2序列，其包含以下各者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64、74、 84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、5424、534、544、554、564、574及584；及(c)CDRH3序列，其包含以下各者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、255、265、275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、385、395、405、415、425、435、445、455、465、475、485、495、505、515、5425、535、545、555、565、575及585。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明包括一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼VH域之核酸，主要由編碼VH域之核酸組成或由編碼VH域之核酸組成，VH域具有與包含以下各者之參考VH域多肽序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、5422、532、542、552、562、572及582，其中包含經編碼之VH域的抗IL-33抗體特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在一個實施例中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼免疫球蛋白輕鏈可變域(VL域)之核酸，主要由編碼免疫球蛋白輕 鏈可變域之核酸組成或由編碼免疫球蛋白輕鏈可變域之核酸組成，其中VL域之至少一個CDR由與選自由以下組成之群的VL編碼序列之CDRL 1、2或3聚核苷酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或完全一致之核酸序列編碼：SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、5426、536、546、556、566、576及586。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在其他實施例中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼免疫球蛋白VL域之核酸，主要由編碼免疫球蛋白VL域之核酸組成或由編碼免疫球蛋白VL域之核酸組成，其中VL域之至少一個CDR之序列係選自由以下組成之群：(a)CDRL1序列，其包含以下各者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、118、128、138、148、158、168、178、188、198、208、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、388、398、408、418、428、438、448、458、468、478、488、498、508、518、5428、538、548、558、568、578及588；(b)CDRL2序列，其包含以下各者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、5429、539、549、559、569、579及589；及(c)CDRL3序列，其包含以下各者中所闡述 之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、5420、530、540、550、560、570、580及590。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
在另一實施例中，本發明包括一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼VL域之核酸，主要由編碼VL域之核酸組成或由編碼VL域之核酸組成，VL域具有與包含以下各者之參考VL域多肽序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、5427、537、547、557、567、577及587，其中包含經編碼之VL域的抗IL-33抗體特異性或優先結合於IL-33。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生。
上文所描述之聚核苷酸中之任一者可進一步包括編碼例如信號肽(以導引經編碼之多肽分泌)、如本文所描述之抗體恆定區或如本文所描述之其他異源多肽的額外核酸。此外，如在本文其他處更詳細描述，本發明包括包含上文所描述之聚核苷酸中之一或多者的組合物。
在一個實施例中，本發明包括包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸之組合物，其中該第一聚核苷酸編碼如本文所描述之VH域且其中該第二聚核苷酸編碼如本文所描述之VL域。特定言之，一種組合 物，其包含以下兩者、主要由以下兩者組成或由以下兩者組成：編碼VH域之聚核苷酸，如以下各者中所闡述：SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、5421、531、541、551、561、571或581；及編碼VL域之聚核苷酸，例如如以下各者中所闡述之編碼VL域之聚核苷酸：SEQ ID NO：66、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、5426、536、546、556、566、576或586。
本發明亦包括本發明聚核苷酸之片段，如在其他處描述。另外，本發明亦涵蓋如本文所描述之編碼融合多肽、Fab片段及其他衍生物之聚核苷酸。
聚核苷酸可藉由此項技術中已知之任何方法生產或製造。舉例而言，若抗體之核苷酸序列為已知的，則編碼抗體之聚核苷酸可由化學合成之寡核苷酸組裝(例如，如Kutmeier等人，BioTechniques 17：242(1994)中所描述)，其簡言之涉及合成含有編碼抗體之序列的部分之重疊寡核苷酸、黏接及接合彼等寡核苷酸且隨後藉由PCR擴增所接合之寡核苷酸。
或者，編碼本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之聚核苷酸可自適合來源之核酸產生。若含有編碼特定抗體之核酸的純系不可獲得，但抗體分子之序列已知，則編碼抗體之核酸可以化學方式合成，或自適合來源(例如，抗體cDNA庫，或自表現該抗 體或其他抗IL-33抗體之任何組織或細胞(諸如經選擇以表現抗體之融合瘤細胞)產生的cDNA庫，或自該組織或細胞分離的核酸(較佳poly A+RNA))，藉由使用可與序列之3'及5'端雜交的合成引子之PCR擴增或藉由使用對特定基因序列具有特異性之寡核苷酸探針來識別例如來自編碼該抗體或其他抗IL-33抗體之cDNA庫的cDNA純系而獲得。由PCR產生之擴增核酸可隨後使用此項技術中熟知之任何方法來選殖至可複製的選殖載體中。
在確定抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之核苷酸序列及相應胺基酸序列之後，可使用此項技術中熟知之核苷酸序列操縱方法操縱其核苷酸序列，例如重組DNA技術、定點突變誘發、PCR等(參見例如，Sambrook等人(1990)Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)及Ausubel等人編，(1998)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,NY)中所描述之技術，兩者均以全文引用的方式併入本文中)，產生具有不同胺基酸序列之抗體，例如形成胺基酸取代、缺失及/或插入。
編碼抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之聚核苷酸可由可為未經修飾之RNA或DNA或經修飾之RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸組成。舉例而言，編碼抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之聚核苷酸可由單鏈及雙鏈DNA、為單鏈及雙鏈區之混合物的DNA、單鏈及雙鏈RNA及為單鏈及雙鏈區之混合物的RNA、包含DNA及RNA之雜交分子(DNA及RNA可為單鏈或更通常雙鏈或單鏈及雙鏈區之混合物)組成。另外，編碼抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之聚核苷酸可由包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者之三鏈區組成。編碼抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、 變異體或衍生物之聚核苷酸亦可含有一或多個經修飾之鹼基或出於穩定性或其他原因經修飾之DNA或RNA主鏈。「經修飾」之鹼基包括例如三苯甲基化鹼基及不尋常鹼基(諸如肌苷)。可對DNA及RNA進行多種修飾；因此，「聚核苷酸」包涵以化學方式、以酶促方式或以代謝方式經修飾之型式。
經分離之編碼來源於免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重鏈部分或輕鏈部分)的多肽之非天然變異體的聚核苷酸可藉由將一或多個核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白之核苷酸序列中使得將一或多個胺基酸取代、添加或缺失引入經編碼之蛋白質中來形成。突變可藉由標準技術引入，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發。較佳地，在一或多個非必需胺基酸殘基處進行保守胺基酸取代。
V. 融合蛋白及抗體結合物
如在本文其他處更詳細論述，抗IL-33結合分子，例如本發明抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可進一步與異源多肽在N端或C端重組融合或以化學方式結合(包括共價及非共價結合)多肽或其他組合物。舉例而言，抗IL-33抗體可重組融合或結合於在偵測試驗中適用作標記之分子及諸如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素之效應分子。參見例如，PCT公開案WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624；美國專利第5,314,995號；及EP 396,387。
本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可包括經修飾之衍生物，亦即，藉由任何類型之分子與抗體共價連接使得共價連接不阻止抗體與IL-33結合。舉例而言(而非作為限制)，抗體衍生物包括已例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、已知保護/阻斷基團之衍生作用、蛋白水解分裂、與細胞配位體或其他蛋白質連接等經修飾之抗體。多個化學修飾中之任一者可藉由已知技術進行，包括(但不限於)特定化學裂解、乙醯化、甲醯化等。 另外，衍生物可含有一或多個非經典的胺基酸。
抗IL-33結合分子，例如本發明抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可由彼此藉由肽鍵或經修飾之肽鍵(亦即，肽電子等排體)接合之胺基酸組成，且可含有除經20個基因編碼之胺基酸以外的胺基酸。舉例而言，抗IL-33抗體可藉由天然過程(諸如轉譯後處理)或此項技術中熟知之化學修飾技術來修飾。該等修飾充分描述於基本文字及更詳細專論以及大量研究文獻中。修飾可發生在抗IL-33結合分子中之任何處，包括肽主鏈、胺基酸側鏈及胺基或羧基端，或在諸如碳水化合物之部分上。應瞭解，相同類型之修飾可以相同或不同程度呈現於給定抗IL-33結合分子中之幾個位點處。此外，給定抗IL-33結合分子可含有多種類型之修飾。抗IL-33結合分子可例如由於泛素化而為分支鏈的，且其在具有或不具有分支鏈之情況下可為環狀。環狀分支鏈及分支鏈環狀抗IL-33結合分子可由轉譯後天然過程產生或可藉由合成方法製得。修飾包括乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素共價連接、血紅素部分共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物共價連接、脂質或脂質衍生物共價連接、磷脂醯肌醇共價連接、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯形成、半胱胺酸形成、焦麩胺酸鹽形成、甲醯化、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、轉運RNA介導之胺基酸添加至蛋白質中(諸如精胺醯化)及泛素化。(參見例如，Proteins--Structure and Molecular Properties,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,NY；第2版(1993)；Johnson編，(1983)Posttranslational Covalent Modification of Proteins(Academic Press,NY)，第1-12頁；Seifter等人，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann.NY Acad.Sci.663：48-62(1992))。
本發明亦提供融合蛋白，其包含抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物及異源多肽。與抗體融合之異源多肽可適用於起作用或適用於靶向表現抗IL-33多肽之細胞。
在一個實施例中，本發明之融合蛋白包含具有本發明抗體之VH域中的任何一或多者之胺基酸序列或本發明抗體或其片段或變異體之VL域中的任何一或多者之胺基酸序列及異源多肽序列的多肽，主要由該多肽組成或由該多肽組成。
在另一實施例中，適用於本文所揭示之診斷及治療方法之融合蛋白包含具有抗IL-33抗體或其片段、變異體或衍生物之VH域的任何一個、兩個、三個CDR之胺基酸序列或抗IL-33抗體或其片段、變異體或衍生物之VL域的任何一個、兩個、三個CDR之胺基酸序列及異源多肽序列的多肽，主要由該多肽組成或由該多肽組成。
在一個實施例中，融合蛋白包含具有本發明抗IL-33抗體之至少一個VH域的胺基酸序列及本發明抗IL-33抗體或其片段、衍生物或變異體之至少一個VL域的胺基酸序列及異源多肽序列的多肽。較佳地，融合蛋白之VH及VL域對應於特異性結合至少一個IL-33抗原決定基之單源抗體(或scFv或Fab片段)。
在又一實施例中，適用於本文所揭示之診斷及治療方法之融合蛋白包含具有抗IL-33抗體之VH域的任何一個、兩個、三個或三個以上CDR之胺基酸序列及抗IL-33抗體或其片段或變異體之VL域的任何一個、兩個、三個或三個以上CDR之胺基酸序列及異源多肽序列的多肽。較佳地，VH域或VL域之兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上CDR對應於本發明之單源抗體(或scFv或Fab片段)。本發明亦涵蓋編碼此等融合蛋白之核酸分子。
文獻中所報導之例示性融合蛋白包括T細胞受體(Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))、CD4(Capon等人， Nature 337：525-531(1989)；Traunecker等人，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl等人，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；及Byrn等人，Nature 344：667-670(1990))、L-選擇素(歸巢受體)(Watson等人，J.Cell.Biol.130：2221-2229(1990)；及Watson等人，Nature 349：164-167(1991))、CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))、CD28及B7(Linsley等人，J.Exp.Med.173：721-730(1991))、CTLA-4(Lisley等人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))、CD22(Stamenkovic等人，Cell 66：1333-1344(1991))、TNF受體(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；及Peppel等人，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))及IgE受體a(Ridgway及Gorman,J.Cell.Biol.第135卷，Abstract編號1448(1991))之融合物。
如在本文其他處論述，抗IL-33結合分子，例如本發明抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可與異源多肽融合以增加多肽之活體內半衰期或適用於使用此項技術中已知之方法的免疫試驗。舉例而言，在一個實施例中，PEG可結合於本發明之抗IL-33抗體以增加其活體內半衰期。參見Leong等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
此外，抗IL-33結合分子，例如本發明抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可與標記序列(諸如肽)融合以促進其純化或偵測。在較佳實施例中，標記胺基酸序列為六組胺酸肽，諸如尤其在pQE載體中提供之標籤(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91313)，其中許多為市售的。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)中所描述，例如六組胺酸提供融合蛋白之適宜純化。適用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)「HA」標籤，其對應於 來源於流感紅血球凝集素蛋白質之抗原決定基(Wilson等人，Cell 37：767(1984))；及「flag」標籤。
融合蛋白可使用此項技術中熟知之方法製備(參見例如美國專利第5,136,964號及第5,225,538號)。可憑經驗選擇進行融合之精確位點以優化融合蛋白之分泌或結合特徵。隨後使編碼融合蛋白之DNA轉染至宿主細胞中用於表現。
抗IL-33結合分子，例如本發明抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可以非結合型式使用或可結合於多種分子中之至少一者，例如改良分子之治療特性、促進靶偵測或使患者成像或治療患者。抗IL-33結合分子，例如本發明抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可在純化之前或之後或在進行純化時標記或結合。
特定言之，本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可結合於治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、病毒、脂質、生物反應調節劑、醫藥試劑或PEG。
熟習此項技術者應瞭解，視所選擇之待結合試劑而定，結合物亦可使用多種技術組裝。舉例而言，例如藉由使結合多肽與活化之生物素酯(諸如生物素N-羥基丁二醯亞胺酯)反應來製備與生物素之結合物。相似地，可在例如本文所列之彼等偶合劑的偶合劑存在下或藉由與異硫氰酸酯(較佳地，螢光素-異硫氰酸酯)反應來製備與螢光標記之結合物。以類似方式製備本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之結合物。
本發明進一步涵蓋與診斷劑或治療劑結合之抗IL-33結合分子，例如本發明抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物。抗IL-33抗體，包括其抗原結合片段、變異體及衍生物可診斷地用於例如監測疾病之發展或進展作為臨床測試程序之一部分，例如確定給定治療及/或預防方案之功效。舉例而言，可藉由使抗IL-33抗體或其抗原結合 片段、變異體或衍生物與可偵測物質偶合來促進偵測。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性物質、使用各種正電子發射斷層攝影之正電子發射金屬及非放射性順磁性金屬離子。對於用於根據本發明之診斷學用途之可結合於抗體之金屬離子，參見例如美國專利第4,741,900號。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光物質之實例包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括魯米諾(luminol)；生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白；且適合放射性物質之實例包括125I、131I、131In、90Y或99Tc。
抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物亦可藉由使其與化學發光化合物偶合來可偵測地標記。隨後藉由偵測在化學反應過程期間產生的螢光之存在來確定化學發光標記之抗IL-33結合分子的存在。尤其適用之化學發光標記化合物之實例為魯米諾、螢光素、異魯米諾(isoluminol)、熱吖錠酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖錠鹽及草酸酯。
抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可為可偵測地標記之方式之一為藉由連接其與酶且在酶免疫試驗(EIA)中使用連接產物(Voller,A.,「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)」Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersville,Md.；Diagnostic Horizons 2：1-7(1978)；Voller等人，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler,Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio編，(1980)Enzyme Immunoassay,CRC Press,Boca Raton,Fla.；Ishikawa等人編，(1981)Enzyme Immunoassay(Kgaku Shoin,Tokyo)。與抗IL-33抗體結合之酶將與適當基質(較佳發色基質)反應，以此方式產生可例如藉由分光光度法、螢光法或視覺手段偵測到之化學部分。可用於可偵測地標記抗體之酶包括(但不限於)蘋果酸去氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構酶、酵母醇去氫酶、α-甘油磷酸去氫酶、丙醣磷酸異構酶、辣根過氧化酶、鹼磷酸酶、天冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸去氫酶、澱粉酶及乙醯膽鹼酯酶。另外，偵測可藉由使用酶發色基質之比色法實現。另外，偵測可藉由螢光方法實現，從而螢光發射金屬(諸如152Eu)或其他鑭系元素直接或間接結合於抗IL-33抗體。偵測亦可藉由與相似地製備之標準品相比，視覺比較基質之酶促反應程度來實現。
偵測亦可使用多種其他免疫試驗中之任一者實現。舉例而言，藉由放射性標記抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，有可能經由使用放射免疫試驗(RIA)偵測結合分子(參見例如，Weintraub(1986年3月)Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques(The Endocrine Society)，其以引用的方式併入本文中)。放射性同位素可藉由如下手段偵測，包括(但不限於)γ計數器、閃爍計數器或自動放射照像術。
抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物亦可使用螢光發射金屬(諸如152Eu)或其他鑭系元素可偵測地標記。可使用諸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之金屬螯合基將此等金屬連接至結合分子。
使不同部分與抗體(例如，抗IL-33抗體)或其抗原結合片段、變異體或衍生物結合之技術為熟知的，參見例如，Amon等人(1985)「Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy」於Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld等人編(Alan R.Liss,Inc.)，第243-56頁；Hellstrom等人(1987)「Antibodies for Drug Delivery」於Controlled Drug Delivery,Robinson等人編(第2版；Marcel Dekker,Inc.)，第623-53頁)；Thorpe(1985)「Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy：A Review」於Monoclonal Antibodies '84：Biological and Clinical Applications,Pinchera等人編，第475-506頁；「Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy」於Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,Baldwin等人編，Academic Press，第303-16頁(1985)；及Thorpe等人(1982)「The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates」Immunol.Rev.62：139-58。
VI. 抗體多肽之表現
編碼抗體之輕鏈及重鏈之DNA序列可根據熟知方法同時或分別使用逆轉錄酶及DNA聚合酶製得。可藉由共同恆定區引子或藉由基於所公佈之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列之更特定引子引發PCR。如上文所論述，PCR亦可用於分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，庫可藉由共同引子或更大同源探針(諸如小鼠恆定區探針)篩選。
DNA，通常質體DNA可使用此項技術中已知之技術自細胞分離，根據例如與重組DNA技術相關之前述參考文獻中詳細闡述之標準熟知技術進行限制映射及測序。當然，在分離過程或後續分析期間的任何時刻，根據本發明DNA可為合成的。
在操縱經分離之遺傳物質以提供本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之後，編碼抗IL-33抗體之聚核苷酸通常插入表現載體中使得引入可用於產生所要數量之抗IL-33抗體的宿主 細胞中。
抗體或其片段、衍生物或類似物，例如結合於本文所描述之靶分子(例如，IL-33)之抗體的重鏈或輕鏈之重組表現需要構築含有編碼抗體之聚核苷酸的表現載體。在已獲得本發明之編碼抗體分子或抗體重鏈或輕鏈或其部分(較佳含有重鏈或輕鏈可變域)之聚核苷酸之後，可使用此項技術中熟知之技術藉由重組DNA技術產生用於產生抗體分子之載體。因此，本文描述藉由表現含有編碼核苷酸序列之抗體的聚核苷酸來製備蛋白質之方法。可使用熟習此項技術者熟知之方法構築含有抗體編碼序列及適當轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內遺傳重組。因此，本發明提供可複製載體，其包含編碼本發明抗體分子或其可操作地連接於啟動子之重鏈或輕鏈或重鏈或輕鏈可變域之核苷酸序列。該等載體可包括編碼抗體分子之恆定區之核苷酸序列(參見例如，PCT公開案WO 86/05807；PCT公開案WO 89/01036；及美國專利第5,122,464號)，且抗體之可變域可被選殖至此類載體中用於表現完整重鏈或輕鏈。
術語「載體」或「表現載體」在本文中用於意謂根據本發明用作媒劑用於引入宿主細胞中及在宿主細胞中表現所要基因之載體。如熟習此項技術者已知，該等載體可容易選自由以下組成之群：質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒。一般而言，與本發明相容之載體將包含選擇標記、適當限制位點以促進所要基因之選殖及進入真核或原核細胞及/或在真核或原核細胞中複製之能力。
出於本發明之目的，可使用多個表現載體系統。舉例而言，一類載體利用來源於動物病毒，諸如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒之DNA元素。其他涉及具有內部核糖體結合位點之多順反 子系統的使用。另外，可藉由引入允許選擇經轉染之宿主細胞之一或多個標記來選擇DNA已整合至其染色體中之細胞。標記可向營養缺陷型宿主提供原營養，提供殺生物劑抗性(例如，抗生素)或對重金屬(諸如銅)之耐性。可選標記基因可直接連接於待表現之DNA序列，或藉由共轉化引入相同細胞中。mRNA之最佳合成亦可能需要額外元素。此等元素可包括信號序列、剪接信號以及轉錄啟動子、增強子及終止信號。
在尤其較佳實施例中，將選殖可變區基因連同如上文所論述合成之重鏈及輕鏈恆定區基因(較佳人類)一起插入表現載體中。當然，能夠在真核細胞中引發表現之任何表現載體可用於本發明。適合載體之實例包括(但不限於)質體pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF 1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1及pZeoSV2(可購自Invitrogen,San Diego,Calif.)及質體pCI(可購自Promega,Madison,Wis.)。一般而言，針對大量轉化細胞篩選表現適當高含量之免疫球蛋白重鏈及輕鏈的細胞為可例如藉由機器人系統進行之常規實驗。
更一般而言，在已製備編碼抗IL-33抗體之單體亞單位之載體或DNA序列之後，表現載體可引入適當宿主細胞中。質體引入宿主細胞中可藉由熟習此項技術者熟知之各種技術實現。此等技術包括(但不限於)轉染(包括電泳及電穿孔)、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、包膜DNA細胞融合、顯微注射及感染完整病毒。參見Ridgway(1988)「Mammalian Expression Vectors」於Vectors,Rodriguez及Denhardt編(Butterworths,Boston,Mass.)，第24.2章，第470-472頁。通常，質體經由電穿孔引入宿主中。具有表現構築體之宿主細胞係在適於產生輕鏈及重鏈之條件下生長，且分析其重鏈及/或輕鏈蛋白質合成。例示性試驗技術包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫試驗(RIA)或螢 螢光活化細胞分類器分析(FACS)、免疫組織化學及其類似試驗技術。
藉由習知技術將表現載體轉移至宿主細胞中，且隨後藉由習知技術培養經轉染之細胞以產生適用於本文所描述之方法的抗體。因此，本發明包括含有編碼本發明抗體或其可操作地連接於異源啟動子之重鏈或輕鏈之聚核苷酸的宿主細胞。在表現雙鏈抗體之較佳實施例中，編碼重鏈及輕鏈之載體可在宿主細胞中共表現以表現完整免疫球蛋白分子，如下詳述。
如本文所用，「宿主細胞」係指具有使用重組DNA技術構築且編碼至少一個異源基因之載體的細胞。在自重組宿主分離抗體之過程的描述中，除非另外明確指定，否則術語「細胞」及「細胞培養物」可互換地用於表示抗體來源。換言之，多肽自「細胞」回收可意謂自快速離心全細胞或含有介質及懸浮細胞之細胞培養物回收。
多種宿主表現載體系統可用於表現適用於本文所描述之方法的抗體分子。該等宿主表現系統表示可產生且隨後純化相關編碼序列之媒劑，且亦表示可在經適當的核苷酸編碼序列轉化或轉染時原位表現本發明抗體分子之細胞。此等包括(但不限於)經重組噬菌體DNA、質體DNA或含有抗體編碼序列之黏質體DNA表現載體轉化之微生物，諸如細菌(例如，大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis))；經含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉化之酵母(例如，酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母(Pichia))；感染有含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如，桿狀病毒)之昆蟲細胞系統；感染有重組病毒表現載體(例如，花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV))或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如，Ti質體)轉化之植物細胞系統；或具有含有來源於哺乳動物細胞基因組之啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒 7.5K啟動子)的重組表現構築體之哺乳動物細胞系統(例如，COS、CHO、BLK、293、3T3細胞)。較佳地，細菌細胞(諸如大腸桿菌)且更佳尤其用於表現整個重組抗體分子之真核細胞用於表現重組抗體分子。舉例而言，與載體(諸如來自人類巨細胞病毒之主要中間早期基因啟動子元素)結合之哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO))為抗體之有效表現系統(Foecking等人，Gene,45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology,8：2(1990))。
用於蛋白質表現之宿主細胞株通常為哺乳動物來源；熟習此項技術者被認為具有能力優先確定最適合於將在其中表現之所要基因產物的特定宿主細胞株。例示性宿主細胞株包括(但不限於)CHO(中國倉鼠卵巢)、DG44及DUXB13(中國倉鼠卵巢細胞株，DHFR負型)、HELA(人類子宮頸癌)、CVI(猴腎細胞株)、COS(具有SV40 T抗原之CVI衍生物)、VERY、BHK(幼倉鼠腎)、MDCK、293、WI38、R1610(中國倉鼠纖維母細胞)BALBC/3T3(小鼠纖維母細胞)、HAK(倉鼠腎細胞株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛內皮細胞)、RAJI(人類淋巴細胞)及293(人類腎)。宿主細胞株通常可自商業服務、美國組織培養物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或所公佈之文獻獲得。
另外，可選擇調節插入序列之表現或以所需特定方式修飾及處理基因產物之宿主細胞菌株。蛋白質產物之該等修飾(例如，糖基化)及處理(例如，裂解)可能對蛋白質之功能為重要的。不同宿主細胞具有蛋白質及基因產物之轉譯後處理及修飾之特徵及特定機制。可選擇適合細胞株或宿主系統以確保所表現之外源蛋白質之正確修飾及處理。為此目的，可使用具有適當處理初級轉錄物、基因產物之糖基化及磷酸化的細胞機制之真核宿主細胞。
為長期高產量產生重組蛋白，較佳為穩定表現。舉例而言，穩 定表現抗體分子之細胞株可經工程改造。宿主細胞可經藉由適當表現控制元素(例如，啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)及可選標記控制之DNA轉化，而非使用含有病毒複製來源之表現載體轉化。引入外源DNA之後，可使經工程改造之細胞在富集培養基中生長1-2天，且隨後換成選擇性培養基。重組質體中之可選擇標記賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長形成焦點，焦點繼而可選殖及擴展至細胞株中。此方法可能宜用於工程改造穩定表現抗體分子之細胞株。
可使用多種選擇系統，分別可在tk-、hgprt-或aprt-細胞中使用包括(但不限於)單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 13：223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska及Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人，Cell 22：817(1980))基因。此外，抗代謝物抗性可用作以下基因之選擇基礎：dhfr，其賦予甲胺喋呤以抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其賦予黴酚酸以抗性(Mulligan及Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其賦予胺基醣苷G-418以抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu及Wu,Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan,Science 260：926-932(1993)；及Morgan及Anderson,Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH 13(5)：155-215(1993年5月))；及hygro，其賦予潮黴素以抗性(Santerre等人，Gene 30：147(1984)。重組DNA技術領域中通常已知之可使用之方法描述於Ausubel等人(1993)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,NY)；Kriegler(1990)「Gene Transfer and Expression」in A Laboratory Manual(Stockton Press,NY)；Dracopoli 等人(編)(1994)Current Protocols in Human Genetics(John Wiley & Sons,NY)第12章及第13章；Colberre-Garapin等人(1981)J.Mol.Biol.150：1中，以上各者均以全文引用的方式併入本文中。
抗體分子之表現量可藉由載體擴增增加(關於綜述，參見Bebbington及Hentschel(1987)「The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning」(Academic Press,NY)第3卷。當在表現抗體之載體系統中的標記可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑含量增加將增加標記基因之複本數。由於擴增區與抗體基因相關聯，抗體之產生亦將增加(Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
活體外產生允許按比例擴大，得到大量所要多肽。在組織培養條件下之哺乳動物細胞培養技術為此項技術中已知，且包括均勻懸浮培養物，例如在氣升式反應器或連續攪拌反應器中，或固定或包埋細胞培養物，例如在中空纖維、微囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷濾筒上。在必要及/或需要時，多肽溶液可藉由習用層析法純化，例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素層析或(免疫)親和層析，例如在合成鉸鏈區多肽之優先生物合成之後或在本文所描述之HIC層析步驟之前或之後。
編碼本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之基因亦可在諸如昆蟲、細菌或酵母或植物細胞之非哺乳動物細胞中表現。容易吸收核酸之細菌包括腸內菌科之成員，諸如大腸桿菌或沙門氏菌(Salmonella)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)(諸如枯草芽孢桿菌)、肺炎球菌(Pneumococcus)、鏈球菌(Streptococcus)及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)之菌株。應進一步瞭解，當在細菌中表現時，異源多肽通常變為包涵體之一部分。異源多肽必須經分離、純化且隨後組裝成功能性分子。當需要四價型式之抗體時，隨後將亞單位 自組裝成四價抗體(WO 02/096948A2)。
在細菌系統中，多個表現載體可能宜視所表現之抗體分子的預期用途而選擇。舉例而言，當要產生大量此類蛋白質時，為產生抗體分子之醫藥組合物，導引高含量之容易純化的融合蛋白產物之表現的載體可為理想的。該等載體包括(但不限於)大腸桿菌表現載體pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗體編碼序列可在具有lacZ編碼區之框架中單獨接合至載體中使得產生融合蛋白；pIN載體(Inouye及Inouye,Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke及Schuster,J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；及其類似載體。pGEX載體亦可用於將外源多肽表現為具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白。一般而言，該等融合蛋白為可溶的，且可藉由吸附及結合於麩胱甘肽瓊脂糖珠粒基質隨後在游離麩胱甘肽存在下溶離而容易地自溶解細胞純化。pGEX載體被設計成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點使得可自GST部分釋放選殖靶基因產物。
除原核生物之外，亦可使用真核微生物。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見麵包酵母為真核微生物當中最常用的，但多種其他菌株通常為可獲得的，例如畢赤酵母(Pichia pastoris)。
對於在酵母屬中之表現，例如質體YRp7(Stinchcomb等人，Nature 282：39(1979)；Kingsman等人，Gene 7：141(1979)；Tschemper等人，Gene 10：157(1980))為常用的。此質體已含有TRP1基因，該基因為缺乏在色胺酸中生長之能力的突變酵母菌株提供選擇標記，例如ATCC編號44076或PEP4-1(Jones,Genetics 85：12(1977))。trp1病變呈現為酵母宿主細胞基因組之特徵隨後提供藉由在色胺酸不存在下之生長來偵測轉化之有效環境。
在昆蟲系統中，通常使用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV) 作為載體來表現外源基因。病毒生長於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞中。可將抗體編碼序列單獨選殖至病毒之非必需區(例如多角體蛋白基因)中且置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)之控制下。
在本發明之結合分子已重組表現之後，其可藉由此項技術中已知之純化免疫球蛋白分子之任何方法純化，例如藉由層析(例如，離子交換；親和力，尤其在蛋白A之後對特定抗原之親和力；及篩分管柱層析)、離心、差示溶解度或藉由純化蛋白質之任何其他標準技術。或者，增加本發明抗體之親和力的較佳方法揭示於美國專利申請公開案第2002 0123057 A1號中。
VII. 使用治療性抗IL-33抗體之治療方法
本發明方法係關於使用抗IL-33結合分子，例如抗體(包括其抗原結合片段、變異體及衍生物)治療患有與IL-33表現或表現IL-33之細胞相關之疾病的患者。「表現IL-33之細胞」意指表現IL-33抗原之細胞。用於偵測IL-33在細胞中表現之方法為此項技術中熟知且包括(但不限於)PCR技術、免疫組織化學、流式細胞術、西方墨點法、ELISA及其類似方法。
雖然以下論述涉及診斷方法及用本發明之抗IL-33抗體治療各種疾病及病症，本文所描述之方法亦適用於此等抗IL-33抗體之抗原結合片段、變異體及衍生物，其保留本發明抗IL-33抗體之所要特性，例如能夠特異性結合IL-33及中和IL-33致病活性。
在一個實施例中，治療包括在個體或患者患有疾病、具有疾病症狀或易患疾病時向個體或患者施加或投與本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段，或向個體或患者之分離組織或細胞株施加或投與抗IL-33結合分子。在另一實施例中，治療亦意欲包括向個體或患者施加或投與包含本發明之抗IL-33結合分子(例如，抗體 或其抗原結合片段)之醫藥組合物，或向個體或患者之分離組織或細胞株施加或投與包含抗IL-33結合分子之醫藥組合物，該個體或患者患有疾病，具有疾病症狀或易患疾病。
本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其結合片段適用於治療各種發炎性病狀。「消炎活性」意指在表現IL-33之細胞中發炎性反應速率降低，且因此在治療期間產生之組織炎症減輕。舉例而言，用至少一個抗IL-33抗體治療引起生理反應，例如發炎性反應減少，其相對於與人類中表現IL 33之細胞相關之疾病病況的治療為有益的。
在一個實施例中，本發明係關於根據本發明之抗IL-33結合分子(例如，抗體或其結合片段)作為藥物之用途，其尤其用於治療或預防發炎性反應或用於治療發炎性病狀(例如，哮喘或COPD)。在某些實施例中，本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其結合片段用於治療過敏性病症。在某些實施例中，本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其結合片段用於治療個體或患者之氣管發炎性反應。
根據本發明方法，如本文其他處所定義之至少一個抗伊利諾斯州-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段用於促進相對於發炎性反應之陽性治療反應。相對於炎症治療之「陽性治療反應」意指與此等結合分子(例如，抗體或其片段)之消炎活性相關之疾病改善及/或與該疾病相關之症狀改善。亦即，可觀測到消炎效果，進一步炎症預防及/或現有炎症減輕，及/或與疾病相關之一或多種症狀減少。因此，舉例而言，疾病改善可表徵為完全反應。「完全反應」意指在標準化任何先前測試結果之情況下不存在臨床上可偵測之疾病。此類反應必須在根據本發明方法治療之後持續至少一個月。或者，疾病改善可歸類為部分反應。
本文所描述之抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段亦可用於治療與表現IL-33之細胞相關之免疫系統發炎性疾病及缺陷或 病症。發炎性疾病之特徵為炎症及組織破壞或其組合。「消炎活性」意指炎症減輕或預防。「發炎性疾病」包括任何發炎性免疫介導過程，其中免疫反應之引發事件或標靶涉及非自身抗原，包括例如同種抗原、異種抗原、病毒抗原、細菌抗原、未知抗原或過敏原。在一個實施例中，發炎性疾病為氣管發炎性病症，例如哮喘或COPD。
哮喘被視為常見氣管發炎性疾病，其例如藉由可變及經常性症狀，可逆氣流堵塞及支氣管痙攣表徵。哮喘症狀可包括喘息、咳嗽、胸悶及呼吸短促。症狀可藉由暴露於過敏原或刺激物觸發。哮喘可基於症狀是否藉由過敏原(異位性/非異位性)沈澱而分類為異位性(外源性)或非異位性(內源性)。急性哮喘惡化通常稱為「哮喘發作」。可在哮喘發作期間發生之其他跡象包括使用呼吸輔助肌(頸部胸鎖乳突肌及斜角肌)，可能存在反常脈衝(在吸入期間較弱且在呼出期間較強)及胸部過度膨脹。藍色皮膚及指甲可能因缺氧而發生。
根據本發明方法，如本文其他處所定義之至少一個抗IL-33結合分子(例如，抗體或其抗原結合片段)用於促進相對於治療或預防發炎性疾病之陽性治療反應。相對於發炎性疾病之「陽性治療反應」意指與此等抗體之消炎活性或其類似者相關之疾病改善，及/或與該疾病相關之症狀改善。亦即，可觀測到發炎性反應減少，其包括(但不限於)發炎性細胞因子、黏附分子、蛋白酶、免疫球蛋白、其組合及其類似物之分泌減少；消炎蛋白質之產生增加；自體反應細胞之數目減少；免疫耐受性增加；自體反應細胞存活率抑制；細胞凋亡減少；內皮細胞遷移減少；自發單核細胞遷移增加；藉由刺激表現IL-33之細胞所介導之一或多種症狀減輕及/或減少。該等陽性治療反應不限於投與途徑。
臨床反應可使用篩選技術評估，該等篩選技術為諸如磁共振成像(MRI)掃描、x放射線成像、電腦斷層(CT)掃描、流式細胞術或螢光 活化細胞分類器(FACS)分析、組織學、宏觀病理學及血液化學，包括(但不限於)可由ELISA、RIA、層析及其類似方法偵測之變化。除此等陽性治療反應之外，進行用抗IL-33結合分子(例如，抗體或其抗原結合片段)治療之個體亦可經歷與疾病相關之症狀改善之有益效果。
本發明之抗IL-33結合分子(例如，抗體或其結合片段)可結合用於發炎性疾病之任何已知治療劑使用，包括任何試劑或已知適用之試劑的組合，或已用於或目前正在用於治療發炎性疾病(例如，哮喘或COPD)之治療劑。用於治療哮喘之試劑分為兩個通用類：用於治療急性症狀之快速緩解藥物；及用於防止進一步惡化之長期控制藥物。快速起效治療包括例如短效β-2腎上腺素受體促效劑(SABA)(例如，沙丁胺醇)；抗膽鹼能藥(例如，異丙托溴銨)、腎上腺素能促效劑(例如，腎上腺素)。長期控制治療包括例如糖皮質激素(例如，丙酸氟替卡松)；長效β-2腎上腺素受體促效劑(LABA)；白三烯拮抗劑(例如，紮魯司特(zafirlukast))；及肥大細胞穩定劑(例如，色甘酸鈉)。快速起效及長期控制治療通常藉由吸入投與。
因此，在組合療法包含投與抗IL-33結合分子以及投與另一治療劑時，本發明方法涵蓋使用單獨調配物或單一醫藥調配物共投與及以任一順序連續投與。在本發明之一些實施例中，本文所描述之抗IL-33抗體與消炎藥組合投與，其中抗體或其抗原結合片段及治療劑可以任一順序依次或同時(亦即，並行或在同一時間範圍內)投與。
本發明之另一實施例為抗IL-33結合分子(例如，抗體或其抗原結合片段)之用途，其用於診斷監測組織中之蛋白質含量作為臨床測試程序之一部分，例如確定給定治療方案之功效。舉例而言，可藉由使抗體與可偵測物質偶合來促進偵測。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質及放射性物質。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼 酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光物質之實例包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括魯米諾；生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白；且適合放射性物質之實例包括125I、131I、35S或3H。
VIII. 醫藥組合物及投與方法
製備及向有需要之個體投與本發明之抗IL-33結合分子(例如，抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)之方法為熟習此項技術者所熟知或容易由熟習此項技術者確定。抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之投與途徑可為例如經口、非經腸、藉由吸入或局部。如本文所用之術語非經腸包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道投與。雖然所有此等投與型式明確涵蓋於本發明之範疇內，投與型式之另一實例將為注射用溶液，尤其用於靜脈內或動脈內注射或滴注之注射用溶液。通常，本發明之適合醫藥組合物可包含緩衝劑(例如，乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑)、界面活性劑(例如，聚山梨醇酯)、視情況穩定劑(例如，人類白蛋白)等。然而，在與本文中之教示相容之其他方法中，本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可直接遞送至不良細胞群體之位點，藉此增加患病組織暴露於治療劑。在一個實施例中，直接投與至氣管，例如藉由吸入或鼻內投與。
如本文所論述，本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可以藥學有效量投與，用於活體內治療表現IL-33之細胞介導之疾病，諸如某些類型之發炎性疾病。就此而言，應瞭解，所揭示之本發明結合分子將經調配使得促進投與且促進活性劑穩定性。較佳地，根據本發明之醫藥組合物包含醫藥學上可接受之無毒無菌載劑(諸如生理鹽水)、無毒緩衝劑、防腐劑及其類似 物。出於本申請案之目的，抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(結合或非結合)之藥學有效量應被認為意謂足以達成與標靶有效結合及達成例如改善疾病或病狀之症狀或偵測物質或細胞之益處的量。
用於本發明中之醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑，包括例如水；離子交換劑；氧化鋁；硬脂酸鋁；卵磷脂；血清蛋白，諸如人類血清白蛋白；緩衝物質，諸如磷酸鹽；甘胺酸；山梨酸；山梨酸鉀；飽和植物脂肪酸、水、鹽或電解質之部分甘油酯混合物，諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素類物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。
用於投與之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。水性載劑包括例如水、酒精性/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。在本發明中，醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)0.01-0.1M且較佳0.05M磷酸鹽緩衝劑或0.8%鹽水。其他常見非經腸媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏溶液(lactated Ringer's)或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充劑)及其類似媒劑。亦可存在防腐劑及其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及其類似物。
更特定言之，適合於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在可溶於水時)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。在該等情況下，組合物必須為無菌的且流動性應達到存在 易於注射能力之程度。其應在製造及儲存條件下為穩定的，且應較佳保存而免受微生物(諸如細菌及真菌)之污染行為。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由維持所需粒度(在分散液之情況下)及藉由使用界面活性劑來維持。適用於本文所揭示之治療方法之調配物描述於Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)第16版(1980)中。
微生物作用之防止可藉由各種抗細菌及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可藉由使組合物中包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)實現可注射組合物之延長吸收。
在任何情況下，無菌可注射溶液可藉由在具有本文所列舉之成分之一或組合的適當溶劑中併入所需量之活性化合物(例如，抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，單獨或與其他活性劑組合)，視需要隨後過濾滅菌來製備。一般而言，藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分的散劑。將注射用製劑處理，填充至諸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶之容器中，且根據此項技術中已知之方法密封在無菌條件下。此外，可將製劑包裝且以套組形式出售。此類製品將較佳具有標籤或包裝說明書，指示相關組合物適用於治療罹患或易患疾病或病症之個體。
非經腸調配物可為單次劑量輸注或裝載單次劑量隨後維持劑 量。此等組合物可以特定固定或可變之時間間隔，例如一日一次，或基於「按需要」來投與。
用於本發明中之某些醫藥組合物可以可接受之劑型經口投與，該劑型包括例如膠囊、錠劑、水性懸浮液或溶液。某些醫藥組合物亦可藉由經鼻氣霧劑或吸入投與。該等組合物可使用苯甲醇或其他適合防腐劑、增強生物可用性之吸收促進劑及/或其他習知溶解劑或分散劑在鹽水中製備成溶液。
可與載劑物質組合產生單一劑型之抗IL-33結合分子(例如，抗體或其片段、變異體或衍生物)之量將視所治療個體及特定投與模式而變化。組合物可以單次劑量、多次劑量或以輸注方式在確定時間段內投與。亦可調整給藥方案以提供最佳所要反應(例如，治療或預防反應)。
在與本發明之範疇一致下，本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可根據前述治療方法以足以產生治療效果之量投與人類或其他動物。本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可以藉由根據已知技術使本發明之抗體或其抗原結合片段與習知醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑組合而製備之習知劑型投與該人類或其他動物。熟習此項技術者應認識到，醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑之型式及特徵係藉由與其組合之活性成分的量、投與途徑及其他熟知變數指示。熟習此項技術者應進一步瞭解，包含本發明之抗IL-33結合分子(例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的一或多種物質之混合物可被證明為尤其有效。
「治療有效劑量或量」或「有效量」意指在投與時引起相對於治療患有欲治療之疾病或病狀的患者之陽性治療反應之抗IL-33結合分子(例如抗體或其抗原結合片段)的量。
本發明亦提供抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、 變異體或衍生物之用途，其用於製造用以治療發炎性疾病(包括例如哮喘或COPD)之藥物。
本發明亦提供本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之用途，其用於製造用以治療個體、治療發炎性疾病之藥物，其中該藥物在已用至少一種其他療法預治療之個體中使用。「預治療(pretreated/pretreatment)」意指個體在接受包含抗IL-33結合分子(例如，抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的藥物之前已接受一或多種其他療法(例如，已用至少一種其他消炎療法治療)。「預治療」包括在開始用包含抗IL-33結合分子(例如，抗體其或抗原結合片段、變異體或衍生物)的藥物治療之前的2年內、18個月內、1年內、6個月內、2個月內、6週內、1個月內、4週內、3週內、2週內、1週內、6天內、5天內、4天內、3天內、2天內或甚至1天內已用至少一種其他療法治療之個體。個體不一定為用一或多種先前療法進行預治療之反應者。因此，接受包含抗IL-33結合分子(例如，抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的藥物之個體可對先前療法之預治療或對預治療包含多種療法之一或多種先前療法起反應，或可能未能起反應。
IX. 診斷學
本發明進一步提供一種在診斷表現IL-33之細胞所介導之疾病(諸如某些類型之發炎性疾病，包括例如哮喘)期間適用之診斷方法，其涉及量測個體之組織或其他細胞或體液中IL-33蛋白質或轉錄物之表現量及將所量測之表現量與正常組織或體液中之標準IL-33表現量進行比較，藉此與標準相比之表現量增加指示病症。
本發明之抗IL-33抗體及其抗原結合片段、變異體及衍生物可用於使用熟習此項技術者已知之經典的免疫組織化學方法試驗生物樣品中之IL-33蛋白質含量(例如，參見Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101：976- 985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。其他適用於偵測IL-33蛋白質表現之基於抗體之方法包括免疫試驗，諸如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫沈澱或西方墨點法。在本文其他處更詳細描述適合試驗。
「試驗IL-33多肽之表現量」意指直接(例如藉由確定或估算絕對蛋白質含量)或相對(例如藉由與第二生物樣品中之疾病相關之多肽含量比較)定性或定量量測或估算第一生物樣品中IL-33多肽之含量。較佳地，量測或估算第一生物樣品中之IL-33多肽表現量且與標準IL-33多肽含量比較，標準係取自獲自未患病症之個體的第二生物樣品或藉由來自未患病症之個體群體之平均含量確定。如此項技術中應瞭解，在「標準」IL-33多肽含量為已知時，其可重複用作比較標準。
「生物樣品」意指自個體、細胞株、組織培養物或可能表現IL-33之細胞的其他來源獲得之任何生物樣品。用於自哺乳動物獲得組織活檢體及體液之方法為此項技術中所熟知。
X. 免疫試驗
本發明之抗IL-33結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可藉由此項技術中已知之任何方法試驗免疫特異性結合。結合試驗可作為直接結合試驗或競爭結合試驗進行。僅舉幾例，可使用之免疫試驗包括(但不限於)ELISA(酶聯免疫吸附試驗)、西方墨點法、免疫細胞化學、免疫沈澱、親和力層析、生物層干涉法Octet,ForteBio)及生物化學試驗，諸如解離增強鑭系螢光免疫試驗(DELFIA®,Perkin Elmer)、福斯特共振能量轉移(Förster resonance energy transfer，FRET)試驗(例如，均相時間分辨螢光(HTRF®,Cis Biointernational)及放射性配位體結合試驗。亦可在細胞試驗中例如藉由流式細胞術及螢光微量試驗技術(FMAT®,Applied Biosystems)偵測結合。在直接結合試驗中，測試候選抗體之與IL-33抗原結合。另一 方面，競爭結合試驗評估候選抗體與已知抗IL-33抗體或片段或其他化合物(諸如ST2)競爭結合於IL-33之能力。該等試驗為常規的且為此項技術中所熟知(參見例如，Ausubel等人編，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)第1卷，其以全文引用的方式併入本文中)。例示性免疫試驗簡要地描述於下文中(但不意欲作為限制)。
免疫沈澱方案一般包含在補充有蛋白磷酸酶及/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、釩酸鈉)之溶解緩衝劑，諸如RIPA緩衝劑(1% NP-40或曲拉通(Triton)X-100、1%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸鈉(pH為7.2)、1%抑肽酶)中溶解細胞群體；添加相關抗體至細胞溶解物中；在4℃下培育一段時間(例如，1-4小時)；添加蛋白A及/或蛋白G瓊脂糖珠粒至細胞溶解物中；在4℃下培育約一小時或一小時以上；在溶解緩衝劑中洗滌珠粒；及使珠粒再懸浮於SDS/樣品緩衝劑中。相關抗體使特定抗原免疫沈澱之能力可藉由例如西方墨點分析評估。熟習此項技術者將知曉可經修飾以增加抗體與抗原結合及減少背景(例如，用瓊脂糖珠粒預清除細胞溶解物)之參數。對於關於免疫沈澱方案之進一步論述，參見例如Ausubel等人編，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)第1卷在10.16.1處。
西方墨點分析一般包含製備蛋白樣品；蛋白樣品在聚丙烯醯胺凝膠中電泳(例如，視抗原之分子量而定，8%-20% SDS-PAGE)；蛋白樣品自聚丙烯醯胺凝膠轉移至諸如硝化纖維、PVDF或耐綸之膜；在阻斷溶液(例如，具有3% BSA或脫脂牛奶之PBS)中阻斷膜；在洗滌緩衝劑(例如，PBS-吐溫20(Tween 20))中洗滌膜；用在阻斷緩衝液中稀釋之一級抗體(相關抗體)使膜阻斷；在洗滌緩衝劑中洗滌膜；用在阻斷緩衝液中稀釋之結合於酶促基質(例如，辣根過氧化酶或鹼性磷酸 酶)或放射性分子(例如，32P或125I)之二級抗體(其辨識一級抗體，例如抗人類抗體)使膜阻斷；在洗滌緩衝劑中洗滌膜；及偵測抗原之存在。熟習此項技術者將知曉可經修飾以增加所偵測之信號及減少背景噪音之參數。對於關於西方墨點法方案之進一步論述，參見例如Ausubel等人編，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)第1卷在10.8.1處。
ELISA包含製備抗原；用抗原塗佈96孔微量滴定盤之孔；將結合於可偵測化合物(諸如酶促基質(例如，辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶))之相關抗體添加至孔中且培育一段時間；及偵測抗原之存在。在ELISA中，相關抗體不必須結合於可偵測化合物；取而代之，可將結合於可偵測化合物之第二抗體(其辨識相關抗體)添加至孔中。此外，替代用抗原塗佈孔，可將抗體塗佈至孔。在此情況下，在添加相關抗原至經塗佈之孔中之後，可添加結合於可偵測化合物之第二抗體。熟習此項技術者將知曉可經修飾以增加所偵測之信號以及此項技術中已知之其他ELISA變化的參數。對於關於ELISA之進一步論述，參見例如Ausubel等人編，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)第1卷在13.2.1處。
本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物另外可在組織學上使用，如用於免疫螢光、免疫電子顯微鏡或非免疫試驗中，用於原位偵測IL-33蛋白質或其保守變異體或肽片段。原位偵測可藉由自患者移出組織學樣品且對其施加經標記之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，較佳藉由使標記抗體(或片段)覆蓋至生物樣品上之施加來實現。經由使用此類程序，有可能不僅確定IL-33蛋白質或保守變異體或肽片段之存在，亦可確定其在所檢查組織中之分佈。使用本發明，一般技術者將容易察覺各種組織學方法(諸如染色程序)中之任一者均可進行修改以達成此類原位偵測。
IL-33基因產物或其保守變異體或肽片段之免疫試驗及非免疫試驗將通常包含在能夠結合於IL-33或其保守變異體或肽片段之可偵測地經標記之抗體存在下培育樣品，諸如生物流體、組織提取物、新鮮收集細胞或已在細胞培養物中培育之細胞溶解物，及藉由此項技術中熟知之多種技術中之任一者偵測結合性抗體。
可使生物樣品接觸及固定至固相支撐物或載體(諸如硝化纖維)或能夠固定細胞、細胞粒子或可溶性蛋白之其他固體支撐物上。支撐物隨後可用適合緩衝劑洗滌，隨後用可偵測地經標記之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物處理。固相支撐物隨後可第二次用緩衝劑洗滌以移除未結合抗體。抗體視情況隨後經標記。固體支撐物上所結合之標記的量隨後可藉由習知手段偵測。
「固相支撐物或載體」意指能夠結合抗原或抗體之任何支撐物。熟知支撐物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐綸、澱粉酶、天然及經修飾之纖維素、聚丙烯醯胺、輝長岩及磁鐵礦。載體之性質可為在一定程度為可溶的或出於本發明之目的為不溶的。支撐材料可具有幾乎任何可能的結構組態，只要偶合分子能夠結合於抗原或抗體即可。因此，支撐物組態可為球形，如同珠粒，或圓柱形，如同試管內表面或桿外表面。或者，表面可為平坦的，諸如薄片、測試條等。較佳支撐物包括聚苯乙烯珠粒。熟習此項技術者將知道許多其他適合於結合抗體或抗原之載體，或將能夠藉由使用常規實驗確定適合於結合抗體或抗原之載體。
亦可使用此項技術中已知之適合方法進行溶液相結合試驗，該等方法舉例而言為(但不限於)福斯特共振能量轉移(FRET)試驗(例如，均相時間分辨螢光(HTRF®,Cis Biointernational)。HTRF®試驗為在緊密接近之供體與受體螢光團之間利用螢光共振能量轉移之均相試驗技術(Mathis,G.,Clin Chem 41(9)：1391-7(1995))。該試驗可用於藉 由使相關分子之一與供體螢光團(例如銪(Eu3+)穴狀化合物)直接或間接偶合及使另一相關分子與受體螢光團(例如XL665(穩定交聯別藻藍蛋白))偶合來量測大分子相互作用。供體分子之激發導致螢光發射。此發射之能量可轉移至受體螢光團，在最緊密接近供體螢光團時導致特定長壽命螢光發射。
給定批次之抗IL-33抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之結合活性可根據熟知方法確定。熟習此項技術者將能夠藉由使用常規實驗確定每次測定之操作及最佳分析條件。
存在可用於量測抗體抗原間相互作用之親和力的多種方法，但相對少數方法用於確定速率常數。大多數該等方法依賴於標記抗體或抗原，必然使常規量測複雜且引入量測數量之不確定性。
抗體與抗原之結合親和力及抗體抗原間相互作用之解離速率可藉由競爭性結合試驗確定。競爭性結合試驗之一個實例為放射免疫試驗，其包含在增加量之未標記抗原存在下培育經標記之抗原(例如，3H或125I)與相關抗體，及偵測與經標記之抗原結合之抗體。相關抗體對特定抗原之親和力及結合解離速率可由斯卡查德作圖分析(scatchard plot analysis)之資料確定。與第二抗體之競爭亦可使用放射免疫試驗確定。在此情況下，在增加量之未標記第二抗體存在下，抗原與相關抗體一起培育，結合於經標記之化合物(例如，3H或125I)。
如在BIACORE®上進行之表面電漿子共振(SPR)提供優於量測抗體抗原間相互作用之親和力的習知方法之多個優點：(i)不要求標記抗體或抗原；(ii)抗體不需要預先純化，可直接使用細胞培養上清液；(iii)即時量測能夠實現且足以用於許多評估目的，即時量測允許快速半定量比較不同單株抗體相互作用；(iv)生物特異性表面可再生使得一系列不同單株抗體可容易在相同條件下進行比較；(v)分析程序完全自動，且廣泛系列之量測可在無使用者干預之情況下進行。BIA應 用手冊(BIAapplications Handbook)，版本AB(1998年重印)，BIACORE®編碼號BR-1001-86；BIA技術手冊(BIAtechnology Handbook)，版本AB(1998年重印)，BIACORE®編碼號BR-1001-84。基於SPR之結合研究需要結合對之一個成員固定於感測器表面上。固定之結合搭配物稱為配位體。呈溶解狀態之結合搭配物稱為分析物。在一些情況下，配位體經由與另一固定分子(其稱為捕捉分子)結合間接連接至表面。SPR反應反映在偵測器表面在分析物結合或解離時質量濃度變化。
基於SPR，即時BIACORE®量測在相互作用發生時直接監測相互作用。該技術非常適合於確定動力學參數。比較親和力排序易於進行，且動力學及親和力常數可來源於感測器圖譜資料。
當分析物在整個配位體表面以離散脈衝注射時，所得感測器圖譜可分為三個基本階段：(i)在樣品注射期間使分析物與配位體結合；(ii)在樣品注射期間平衡或穩定狀態，其中分析物之結合速率藉由自複合物解離來平衡；(iii)在緩衝劑流動期間分析物自表面解離。
結合及解離階段提供關於分析物配位體間相互作用之動力學(ka及kd，複合物形成及解離之速率，kd/ka=KD)的資訊。平衡階段提供關於分析物配位體間相互作用之親和力(KD)的資訊。
BIA評估軟體為使用數值積分及全局擬合算法之曲線擬合提供全面設施。藉由對資料之適合分析，相互作用之分離速率及親和力常數可自簡單BIACORE®研究獲得。可藉由此技術量測之親和力的範圍為mM至pM之非常廣泛範圍。
此類方法之另一實例包括使用可例如使用KinExa儀器(Sapidyne Instruments)進行之動力學排除試驗量測平衡解離常數「KD」。簡言之，抗IL33抗體之溶液相平衡解離常數KD可藉由預混合不同濃度之抗體與IL-33直至達到平衡來確定。隨後藉由使用經IL-33塗佈之珠粒捕 捉游離抗體，洗掉未結合物質及使用螢光標記物質特異性抗體偵測結合性抗體，使用KinExa量測游離抗體之量。將在各IL-33濃度下偵測之游離抗體的量相對於IL-33濃度標繪，且使用KinExa軟體計算平衡解離常數(KD)。
適合於確定所呈現之經分離之抗體或其抗原結合片段或其改變/突變衍生物(下文論述)之結合特徵的方法及試劑為此項技術中已知及/或市售的。設計用於此類動力學分析之設備及軟體為市售的(例如，BIAcore、BIA評估軟體、GE Healthcare；KinExa Software,Sapidyne Instruments)。
抗原決定基特異性為單株抗體之重要特徵。與使用放射免疫試驗、ELISA或其他表面吸附方法之習知技術相比，用BIACORE®進行抗原決定基定位不需要標記或純化抗體，且允許使用一連串幾個單株抗體進行多位點特異性測試。另外，大量分析可自動處理。
成對結合實驗測試兩個MAb同時結合於同一抗原之能力。針對單獨抗原決定基之MAb將獨立結合，而針對相同或密切相關抗原決定基之MAb將干擾彼此之結合。此等利用BIACORE®之結合實驗可簡單進行。
舉例而言，吾人可使用捕捉分子結合第一Mab，隨後依次添加抗原及第二MAb。感測器圖譜將顯示：(1)多少抗原結合於第一Mab；(2)第二MAb與表面連接抗原之結合程度；(3)若第二MAb不結合，則成對測試之順序逆轉是否改變結果。
肽抑制為用於抗原決定基定位之另一技術。此方法可補充成對抗體結合研究，且可在抗原之一級序列為已知時使功能性抗原決定基與結構特徵相關。對肽或抗原片段測試不同MAb與固定抗原之結合抑制。假定干擾給定MAb結合之肽在結構上與由彼MAb定義之抗原決定基相關。
除非另外指示，否則將使用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技術實施本發明，此等習知技術屬於此項技術之技能範圍內。該等技術充分解釋於文獻中。
本文所引用之所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。
提供以下實例作為說明，而非作為限制。
序列概述
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Figure 105110432-A0202-12-0150-925
Figure 105110432-A0202-12-0151-926
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實例 實例1 IL-33抗體分離 選殖、表現及純化人類、小鼠及獼猴之成熟IL-33
自Swiss Prot獲得IL-1RAcP及ST2之蛋白質序列。編碼成熟IL-33組分之抗IL-33 scFv抗體cDNA分子之分離及識別係藉由引子延伸PCR合成，且選殖至pJexpress404(DNA 2.0)中。對應於人類及小鼠IL-33之資料庫序列資訊之寄存編號展示於表2中。因此，基於獼猴與恆河猴之間的高同源性，無獼猴序列可獲得，恆河猴序列(寄存編號ENSMMUT00000030043)用於設計能夠擴增獼猴中IL-33基因之編碼序列的引子。將恆河猴基因序列與人類IL-33 cDNA序列(寄存編號NM_033439)比對，此展現恆河猴序列為錯組裝的且缺失外顯子1。使用人類外顯子1針對恆河猴基因組序列進行BLAST搜索，且識別恆河猴序列匹配外顯子1。額外引子被設計成擴增外顯子1。
成熟IL-33編碼序列經修飾以在蛋白質之C端含有FLAG® 10xhis抗原決定基標籤(DYKDDDDKAAHHHHHHHHHH；SEQ ID NO.627)。對應於成熟Flag®His標記之人類、獼猴及小鼠IL-33之SEQ ID NO展示於表2中。
Figure 105110432-A0202-12-0163-938
將載體轉化為BL21(DE3)勝任細胞(Merck Biosciences,69450)且用1mM IPTG誘導表現。所收集之細胞用Bugbuster(Merck Biosciences,70584)溶解，且使用Ni-NTA親和層析(Histrap HP管柱：GE Healthcare,17-5248-02)隨後尺寸排阻層析(Superdex 75管柱：GE Healthcare,17-1068-01)純化所表現之蛋白質。
蛋白質修飾
使用EZ連接磺基-NHS-LC-生物素(Thermo/Pierce,21335)經由游離胺對本文所用之IgG及經修飾之受體蛋白進行生物素標記，將生物素試劑溶解於無水二甲基甲醯胺中且用1M NaHCO3/D-PBS(杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水)將基於PBS之蛋白質溶液調節至pH為約8。使用EZ連接生物素-BMCC(Perbio/Pierce，產品編號21900)經由游離半胱胺酸對本文所用之IL-33蛋白質進行生物素標記。將生物素試劑溶解於無水二甲基甲醯胺及混合PBS蛋白質溶液中。在所有情況下藉由MALDI-TOF質譜評估標記併入，且使用PBS平衡之一次性Sephadex G25管柱藉由緩衝劑交換清除未反應試劑。對於生物素標記，使用由胺基酸序列計算之消光係數藉由280nm吸光度確定最終蛋白質濃度。
選擇
使用基於自成年原生供體之人類B細胞分離且基於絲狀噬菌體M13選殖至噬菌粒載體中之可變(V)基因之大單鏈Fv(scFv)人類抗體庫進行選擇(Hutchings,C.,「Generation of Naïve Human Antibody Libraries」in Antibody Engineering,Dubel.Berlin,Springer Laboratory Manuals：第93頁(2001)；Lloyd等人，Protein Eng.Des.Sel.22(3)：159- 68(2009))。IL-33特異性scFv抗體係在重組人類及/或小鼠IL-33之一系列重複選擇週期中自噬菌體呈現庫分離，基本上如Vaughan等人(Nat.Biotechnol.14(3)：309-14(1996))中所描述。本文所用之IL-33試劑之清單展示於表3中。
Figure 105110432-A0202-12-0164-939
簡言之，scFv-噬菌體粒子與生物素標記重組IL-33溶液(使用EZ連接生物素-BMCC(Perbio/Pierce，產品編號21900)經由游離半胱胺酸進行生物素標記)一起培育。粒子與100nM生物素標記重組IL-33一起培育2小時。隨後遵循製造商之建議在經抗生蛋白鏈菌素塗佈之順磁珠粒(Dynabeads®,M-280)上捕捉與抗原結合之scFv。在一系列洗滌週期中使用PBS-吐溫洗掉未結合噬菌體。將保留在抗原上之噬菌體粒子溶離，感染細菌且獲救使得用於下一輪選擇。通常，以此方式進行兩輪或三輪選擇。
藉由噬菌體ELISA識別IL-33特異性結合子
使來自在上文所描述之兩輪或三輪選擇之後的選擇輸出之代表性數目的個別純系在96孔培養盤中生長。單鏈Fv片段在噬菌體粒子上顯示且在結合試驗中測試以確定對一組重組人類、小鼠及獼猴IL-33抗原之交叉反應性及特異性。如下在96孔深孔培養盤中產生噬菌體顯示之scFv上清液樣品。將96孔主培養盤各孔之5μl培養物轉移至含有 500μl 2TYAG(2TY+100μg/ml安比西林(ampicillin)+2%葡萄糖)培養基之格雷內爾(Greiner)深孔培養盤，且在37℃、280rpm下培育5小時。隨後以100微升/孔添加K07 M13輔助噬菌體(在2TYAG中稀釋至1.5×1011pfu/ml)，且在37℃、150rpm下培育培養盤以使得感染。培養盤在3200rpm下快速離心10分鐘且移出上清液。使細菌集結粒再懸浮於500微升/孔2TYAK(2TY+100μg/ml安比西林+50μg/ml卡那黴素(kanamycin))中，且在25℃、280rpm下培育培養盤隔夜。在早晨，將500μl含6%(w/v)脫脂奶粉之2倍PBS添加至各孔中，且在室溫下培育培養盤1小時。培養盤隨後在3200rpm下離心10分鐘，且經阻斷之噬菌體顯示之scFv上清液直接用於ELISA實驗。
對於EC50測定，通常在含3%(w/v)奶粉之PBS(PBS-M)中3倍稀釋經純化之IgG，得到11個濃度點。使用96孔格雷內爾聚丙烯培養盤(Greiner,650201)用於稀釋液製備。一般而言，各稀釋液一式兩份地製備。使IgG稀釋液在PBS-M中在室溫下阻斷1小時，隨後直接用於ELISA實驗。
IL-33結合試驗為基本上如下進行之基於培養盤之ELISA。上表3展示用於此等實驗之抗原。並非所有抗原用於每一實驗，但在所有情況下測試人類、小鼠及獼猴IL-33抗原。相關對照抗原(適當時，牛胰島素加IL-4Rα FLAG®His)亦用於測試非特異性結合。除牛胰島素之外，所有抗原均為生物素標記的(參見上文子部分1.1)且所有均使用細菌表現產生。產生用作對照抗原之IL-4Rα FLAG®His的方法描述於WO/2010/070346中。
用0.5μg/ml生物素標記抗原/PBS塗佈抗生蛋白鏈菌素培養盤(Thermo Scientific,AB-1226)，且在4℃下培育隔夜。培養盤用PBS洗滌3次且用300微升/孔阻斷緩衝液(PBS-M)阻斷1小時。培養盤用PBS洗滌1次且在室溫下以50微升/孔添加經阻斷之樣品持續1小時。培養 盤用PBS-T(PBS+1%(v/v)吐溫-20)洗滌3次，且在室溫下以50微升/孔添加呈1：5000稀釋度(在PBS-M中)之偵測試劑[分別用於偵測IgG或噬菌體顯示scFv之抗人類IgG HRP(Sigma,A0170)或抗M13-HRP抗體(Amersham,27-9421-01)]持續1小時。培養盤用PBS-T洗滌3次且用50微升/孔TMB(Sigma,T0440)顯影。用50微升/孔0.1M H2SO4淬滅反應物，隨後在EnVisionTM盤式讀取器或相似設備上在450nm下讀取。
使用Prism(Graphpad)曲線擬合軟體標繪IgG滴定之劑量反應曲線。若吸光度450nm>0.5且對於同一對照樣品(胰島素及IL-4Rα Flag®His)為<0.2，則認為噬菌體顯示之scFv結合IL-33抗原。
選殖、表現及純化人類及小鼠之ST2 ECD
編碼人類及小鼠之ST2胞外域(ECD)之cDNA分子係藉由引子延伸PCR選殖合成，且選殖至pDONR221(Invitrogen,12536-017)中。使用人類及小鼠ST2之資料庫序列(參見表4)。根據製造商之說明書使用LR閘道選殖酶II將pDONR221中之ST2 ECD cDNA純系轉移至哺乳動物表現載體pDEST12.2。pDEST12.2載體已經修飾以含有人類IgG1 Fc編碼區、框內具有所插入相關基因之聚組胺酸(His6)標籤，且亦藉由插入pCEP4載體之oriP複製起點，在轉染至表現EBNA-1基因產物之細胞株(諸如HEK293-EBNA細胞)中之後允許游離型質體複製。
Figure 105110432-A0202-12-0166-940
使用蛋白A親和層析(HiTrap蛋白A管柱(GE Healthcare,17-0402-01))隨後尺寸排阻層析(Superdex 200管柱(GE Healthcare,17-1069-01))純化HEK293-EBNA上清液中之表現ST2.Fc蛋白。
未純化scFv抑制IL-33與ST2結合
使來自在上文所描述之兩輪或三輪選擇之後的選擇輸出之代表 性數目的個別純系在96孔培養盤中生長。ScFv在細菌周質中表現(Kipriyanov等人，J Immunol Methods 200(1-2)：69-77(1997))，且在基於均相FRET(螢光共振能量轉移)HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)之IL-33：ST2結合試驗中針對其抑制活性進行篩選。在此試驗中，樣品與人類或小鼠ST2.Fc競爭結合於FLAG®His標記之人類、獼猴或小鼠IL-33。
HTRF®試驗為在緊密接近之供體與受體螢光團之間使用螢光共振能量轉移之均相試驗技術(Mathis等人，Clin Chem 41(9)：1391-7(1995))。該試驗用於藉由使相關分子之一與供體螢光團銪(Eu3+)穴狀化合物直接或間接偶合及使另一相關分子與受體螢光團XL665(穩定交聯別藻藍蛋白)偶合來量測大分子相互作用。穴狀化合物分子之激發(在337nm下)導致在620nm下螢光發射。將此發射之能量轉移至最緊密接近穴狀化合物之XL665，導致特定長壽命螢光(在665nm下)自XL665發射。量測供體(在620nm下)及受體(在665nm下)之特定信號，允許計算665/620nm比率，在該試驗中彌補有色化合物之存在。
藉由添加10微升各抗體測試樣品稀釋液至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3676)中來測試未純化抗IL-33 scFv樣品對FLAG®-His標記之IL-33結合ST2-Fc之抑制。接著，製備含有2nM人類或小鼠ST2-Fc及3nM抗人類Fc穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,61HFCKLB)之溶液，且添加5微升混合物至試驗培養盤中。此後添加含有1.2nM FLAG®-His標記之人類、獼猴或小鼠IL-33以及20nM抗FLAG® XL665偵測劑(Cisbio International,61FG2XLB)之5微升溶液。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(BDH 103444T)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,Sigma A9576)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育1小時隨後在4℃下培育16小時，隨後使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm及665nm發射波長下 之時差式螢光。
藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值來分析資料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干擾：
Figure 105110432-A0202-12-0168-943
隨後使用方程式2計算各樣品之△F%：
Figure 105110432-A0202-12-0168-942
陰性對照(非特異性結合)藉由用在由含有0.1%牛血清白蛋白(BSA,Sigma A9576)的杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)組成之稀釋緩衝劑中製備之150nM非標記人類或小鼠IL-33(Axxora，人類ALX522-098、小鼠ALX-522-101)置換測試樣品來定義。
△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合%：
Figure 105110432-A0202-12-0168-941
藉由使用四參數對數方程式(方程式4)之曲線擬合使用GraphPad Prism軟體測定IC50值。
方程式4：Y=底部+(頂部-底部)/(1+10^((LogEC50-X)×斜率))
X為濃度對數。
Y為特異性結合
Y在底部開始且以S形達到頂部。
圖1展示藉由單點篩選中之未純化scFv周質提取物抑制由結合於人類ST2之人類IL-33產生之FRET信號。周質提取物之最終濃度為50% v/v。孔B04(未純化IL330004 scFv)展示例示性『命中』且管柱12含有如所指示之對照孔。
純化之scFv抑制IL-33與ST2結合
對展示作為未純化周質提取物對IL-33：ST2相互作用之抑制效果 或藉由上述噬菌體結合實驗展現理想的物種交叉反應性及特異性特徵之單鏈Fv純系進行DNA測序(Osbourn等人， Immunotechnology 2(3)：181-96(1996)；Vaughan等人， Nat Biotechnol 14(3)：309-14(1996))。獨特scFv再次在細菌中表現且藉由親和層析純化(如WO01/66754中所描述)。此等樣品之效力係藉由經純化製劑之稀釋系列與人類或小鼠ST2.Fc競爭結合於如上文所描述之FLAG®His標記之人類、獼猴或小鼠IL-33來確定。選擇能夠比陰性對照在更大程度上抑制IL-33：ST2相互作用之經純化之scFv製劑用於轉化為IgG格式(例如，scFv抗體IL330002、IL330004、IL330020及IL330071
圖2A：展示在增加IL-33 scFv抗體IL330002、IL330004、IL330020及IL330071之濃度的情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
圖2B：展示在增加IL-33 scFv抗體IL330002、IL330004、IL330020及IL330071之濃度的情況下對由獼猴IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
識別IL330004之搭配物抗體
藉由噬菌體ELISA展現陽性結合於人類IL-33之彼等純系之scFv周質提取物係藉由八位位組試驗(八位位組RED 384系統)篩選以識別結合IL-33同時IL330004之抗體。在Nickel NTA生物感測器上捕捉純製備樣品，且進行IL-33(200nM)隨後IL330004(200nM)之依序結合。使生物感測器再生以最小化使用。感測器在甘胺酸(10mM，pH 1.7)中再生，在緩衝劑(PBS+1mg/ml(0.1%)BSA+0.02%吐溫20)中中和且用NiS04(10mM)重新裝載以在生物感測器表面上補充鎳。識別IL330425及IL330428且轉化為完整免疫球蛋白G1(IgG1)抗體格 式。
scFv重新格式化為IgG1
將根據IL-33：ST2結合試驗具有理想特性之單鏈Fv純系加藉由結合實驗具有理想特異性之一組噬菌體顯示scFv轉化為完整免疫球蛋白G1(IgG1)抗體格式，基本上如Persic等人(Gene 187(1)：9-18(1997))所描述，其中具有以下修改。OriP片段包括於表現載體中以促進與CHO短暫細胞一起使用及允許游離型複製。將可變重鏈(VH)域選殖至含有人類重鏈恆定域及調節元素之載體(pEU1.3)中以在哺乳動物細胞中表現完整IgG1重鏈。相似地，將可變輕鏈(VL)域選殖至表現人類輕鏈(λ)恆定域及調節元素之載體(pEU4.4)中以在哺乳動物細胞中表現完整IgG輕鏈。為獲得IgG，將重鏈及輕鏈IgG表現載體轉染至CHO短暫哺乳動物細胞中(Daramola等人Biotechnol Prog 30(1)：132-41(2014))。使IgG表現且分泌至培養基中。收集物在純化之前過濾，隨後使用蛋白A層析純化IgG。將培養上清液裝載於適當尺寸之陶瓷蛋白A管柱(BioSepra)上且用50mM Tris-HCl pH 8.0、250mM NaCl洗滌。使用0.1M檸檬酸鈉(pH 3.0)自管柱溶離結合IgG且藉由添加Tris-HCl(pH 9.0)中和。使用Nap10管柱(Amersham,#17-0854-02)將溶離物質緩衝交換至PBS中，且使用基於IgG胺基酸序列之消光係數以分光光度法測定IgG濃度(Mach等人，Anal.Biochem.200(1)：74-80(1992))。使用SEC-HPLC且藉由SDS-PAGE分析經純化之IgG之聚集及降解純度。對應於抗體IL330002、IL330004、IL330020、IL330071、IL330125及IL330126之不同區域的SEQ ID NO展示於表5中。
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Figure 105110432-A0202-12-0171-945
純化之IgG抑制IL-33與ST2結合
在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗(其原理描述於上文中)中評估抗IL-33抗體抑制FLAG®-His標記之IL-33結合於ST2受體之能力。
藉由經純化IgG之稀釋系列與生物素標記人類或小鼠ST2.Fc競爭結合於FLAG®His標記之人類、獼猴或小鼠IL-33來確定經純化之IgG製劑的活性。
藉由添加10微升各抗體測試樣品稀釋液至384孔小體積試驗培養盤(Costar 3676)中來測試經純化或未純化之抗IL-33抗體樣品對FLAG®-His標記之IL-33結合ST2-Fc之抑制。接著，製備含有4nM生物素標記人類或小鼠ST2-Fc及20nM抗生蛋白鏈菌素XL665偵測劑(Cisbio International,611SAXLB)之溶液，且添加5微升混合物至試驗培養盤中。此後添加含有1.2nM FLAG®-His標記之人類、獼猴或小鼠IL-33以及1.72nM抗FLAG®穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,61FG2KLB)之5微升溶液。在由含有0.8M氟化鉀(BDH 103444T)及0.1% BSA(Sigma A9576)的杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)組 成之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育2小時隨後在4℃下培育16小時，隨後使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm及665nm發射波長下之時差式螢光。
使用方程式1至3如上文所描述分析資料。
陰性對照(非特異性結合)藉由用在由含有0.1%牛血清白蛋白(BSA,Sigma A9576)的杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)組成之稀釋緩衝劑中製備之100nM非生物素標記ST2置換測試樣品來定義。
經純化之IgG抗體IL330002、IL330004、IL330020、IL330071、IL330125及IL330126之代表性效力(IC50)展示於表6中。
Figure 105110432-A0202-12-0172-946
展示所有經純化之IgG製劑(亦即，IL330002、IL330004、IL330020、IL330071、IL330125及IL330126)抑制人類IL-33：人類ST2相互作用。圖3A：展示在增加IL-33 IgG1抗體IL330002、IL330004、IL330020、IL330071、IL330125及IL330126之濃度的情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
亦展示IL330002、IL330004及IL330071 IgG製劑抑制獼猴IL-33：人類ST2相互作用。圖3B：展示在增加IL-33 IgG1抗體IL330002、IL330004、IL330020及IL330071、IL330125及IL330126之濃度的情況下對由獼猴IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。在小鼠IL-33 FLAG®-His+小鼠ST2-Fc競爭試驗中未偵測到上述測試抗體中之任一者的抑制。
IgG在海拉(Hela)ST2報導細胞中抑制NFκB信號傳導
使用報導子試驗，使用與ST2及NFκB反應螢光素酶報導子構築體共轉染之海拉細胞評估抗IL-33抗體IL330002、IL330004、IL330020、IL330071、IL330125及IL330126對IL-33誘導之NFκB信號傳導的抑制。在測試抗體存在或不存在下使細胞暴露於IL-33，且藉由量測隨後產生之螢光素酶的活性來偵測NFκB信號傳導。含有螢光素酶報導子構築體之海拉細胞來源於Panomics。將人類ST2序列選殖至來自System Biosciences之慢病毒載體中。慢病毒粒子係在Ad293細胞(Stratagene)中產生且用於轉導海拉-螢光素酶報導細胞。
在報導子試驗中，ST2受體經IL-33刺激導致NFκB信號傳導路徑活化，且經由NFκB啟動子引發螢光素酶表現。在細胞溶解之後，添加螢光素酶基質，其在螢光素酶存在下經歷化學反應，產生發光產物。自細胞溶解物偵測之光的量係使用Envision盤式讀取器(PerkinElmer)定量且用作IL-33介導之NFκB信號傳導的直接量測。
將海拉經轉染細胞維持在含有潮黴素B之培養基中以維持穩定受體表現。在測試抗體存在或不存在下使細胞暴露於IL-33，且藉由量測隨後產生之螢光素酶的活性來偵測NFκB信號傳導。
將經轉染海拉細胞在含有10% v/v胎牛血清(加熱不活化)及100微克/毫升潮黴素B(Invitrogen 10687-010)之DMEM培養基(Invitrogen,41966)中以1×104個細胞/孔(50微升/孔)接種至384孔黑色壁之經Poly-D-離胺酸塗佈之培養盤(Greiner,781946)中。培養盤在37攝氏度、5% CO2下培育18-24小時，且隨後自各孔輕輕地抽吸細胞培養基，隨後添加測試樣品。
樣品之連續稀釋液係藉由在含有10% v/v FBS(加熱不活化)及100 微克/mL潮黴素B(Invitrogen,10687-010)之DMEM培養基(Invitrogen 41966)中稀釋來製備。一式兩份地添加十五微升測試樣品至細胞中。在含有10% v/v FBS(加熱不活化)及100微克/mL潮黴素B(Invitrogen 10687-010)之DMEM培養基(Invitrogen,41966)中將IL-33 FLAG®-His稀釋至0.6nM，且添加15微升至細胞及測試樣品中。此濃度表示報導細胞回應於IL-33 FLAG®-His之EC50值(幾何平均值0.32nM，95%信賴區間0.25-0.40nM，n=5)。藉由添加含有10% v/v FBS(加熱不活化)及100微克/毫升潮黴素B(Invitrogen,10687-010)之30微升DMEM培養基(Invitrogen,41966)來定義背景反應。培養盤在37攝氏度、5% CO2下培育4小時且在室溫下培育1小時。
為量測回應於NFκB信號傳導之螢光素酶產生，添加30微升Bright Glo®溶解緩衝劑以及螢光素酶基質(Promega,E2620)至培養盤中且在室溫下培育5分鐘。使用EnVision盤式讀取器(PerkinElmer)讀取因基質被螢光素酶氧化而產生之螢光。
隨後使用相對光單位(RLU)值計算如方程式5中所描述之特異性反應%：
Figure 105110432-A0202-12-0174-947
藉由使用四參數對數方程式(方程式4)之曲線擬合使用GraphPad Prism軟體測定IC50值：展示抗體IL330002、IL330004、IL330020、IL330071、IL330125及IL330126之經純化之IgG製劑抑制NFκB驅動之螢光素酶活性，其中代表性效力(IC50)展示於表7中。
Figure 105110432-A0202-12-0174-948
Figure 105110432-A0202-12-0175-949
圖4A展示在螢光素酶NFκB報導子試驗中IL-33抗體IL330002、IL330004、IL330020、IL330071、IL330125及IL330126相比於陰性對照IgG對NFκB活性之抑制。
IgG抑制在Huvec中之NFκB信號傳導
由藉由免疫螢光染色偵測之p65/RelA NFkB亞單位之核易位評估人類臍靜脈內皮細胞(Huvec)中回應於IL-33之NFκB信號傳導。在ArrayScan VTi HCS讀取器(Cellomics)上進行核染色強度之成像及定量。
Huvec係獲自Cambrex且根據所推薦方案維持於完全EBM-2培養基(Lonza)中。Huvec係收集自含急性酶(accutase)(PAA,#L11-007)燒瓶，且在培養基[EBM-2(Lonza,#CC-3156)與EGM-2 SingleQuot Kit Suppl.& Growth Factors(Lonza,#CC-4176)]中以1×104個/100微升/孔接種至96孔黑色壁、透明平底之經膠原蛋白I塗佈之培養盤(Greiner)中，且在37℃、5% CO2下培育18-24小時。此後，抽吸培養基，使細胞單層完整，且用如下製備之試驗測試樣品置換。
在96孔U形底聚丙烯培養盤(Greiner,650201)中之完全培養基中將經純化之IgG之測試樣品(一式兩份)稀釋至所要濃度。在與適當測試抗體混合之完全培養基中製備IL-33(Adipogen)，得到總體積為120微升/孔之最終1ng/mL IL-33濃度。所有樣品在37℃下培育30min，隨後將100μl IL-33/抗體混合物轉移至試驗培養盤。在37℃下培育30分鐘後，抽吸培養基，使細胞單層完整，且用已預溫熱至37℃之3.7%甲醛溶液使細胞固定15分鐘。抽吸固定劑且用100微升/孔PBS洗滌細胞兩次。
根據製造商之說明書使用Cellomics NFκB試驗套組(Thermo Scientific,#8400492)染色細胞之NFκB。簡言之，使細胞在室溫下滲透15分鐘，阻斷15分鐘且用體積為50μL之一級抗體溶液染色1小時。培養盤在阻斷緩衝液中洗滌2次且在室溫下用二級抗體溶液染色1小時，二級抗體溶液包括赫斯特(Hoechst)核染色劑以及二級抗體。培養盤在PBS中洗滌2次。將細胞儲存於最終體積為150微升/孔之PBS中且用黑色遮光密封件(Perkin Elmer,#6005189)覆蓋，隨後在ArrayScan VTi HCS讀取器上讀取。使用適合算法計算核染色強度。使用Graphpad Prism軟體分析資料。藉由使用四參數對數方程式(方程式4)之曲線擬合確定IC50值。
圖4B展示在Huvec NFκB易位試驗中IL-33抗體IL330004相比於抗NIP IgG1陰性對照抗體NIP228對NFκB活性之抑制。p65/RelA NFκB之核易位受抗體IL330004抑制。當作為經純化之IgG測試時，抗體IL330004之IC50經計算為12nM。
使用BIAcore計算IL-33抗體之結合親和力
使用BIAcore 2000生物感測器(BIAcore AB)，藉由表面電漿子共振確定例示性結合成員之經純化之IgG樣品與人類及獼猴IL-33之結合親和力，基本上如Karlsson等人，J Immunol Methods 145(1-2)：229-40(1991)所描述。簡言之，根據製造商之說明書使用標準胺偶合試劑(BIAcore)使蛋白G'(Sigma Aldrich,P4689)與CM5感測器晶片表面共價偶合。蛋白G'表面用於經由Fc域捕捉經純化之抗IL-33抗體，提供每個週期大約290 RU表面密度。使在HBS-EP緩衝劑(BIAcore AB)中製備之在600nM與18.75nM之間的一系列濃度之人類或獼猴IL-33通過感測器晶片表面。在每次抗體注射之間使用pH 1.7及pH 1.5之兩個10mM甘胺酸洗液使表面再生。所得感測器圖譜使用BIA評估3.1軟體評估且擬合至1：1朗格繆爾(Langmuir)結合模型，提供相對結合資料。結合於人類或獼猴IL-33之抗體IL330002及IL330004之結合結果(KD、Ka 及Kd)展示於表8中。
Figure 105110432-A0202-12-0177-950
IL-33抗體與胞內IL-33結合
上文所描述之選擇及活性研究使用重組或商業來源之成熟IL-33(胺基酸112-270)。研究表明全長IL-33亦可為活性的(Cayrol等人，Proc Natl Acad Sci U S A 106(22)：9021-6(2009)；Hayakawa等人，Biochem Biophys Res Commun 387(1)：218-22(2009)；Talabot-Ayer等人，J Biol Chem.284(29)：19420-6(2009))。藉由初級支氣管平滑肌細胞(BSMC)之免疫螢光染色確定抗體與全長(「天然」)IL-33之結合。
BSMC係獲自Cambrex且根據製造商之說明書維持於完全平滑肌生長培養基(SmBM®,Lonza)中。細胞係收集自含急性酶(PAA #L11-007)燒瓶，且在培養基[SMBM(Lonza # CC-3181)與SMGM SingleQuot Kit Suppl.& Growth Factors(Lonza # CC-4149)]中以2×104個/100微升/孔接種至96孔黑色壁、透明平底之經膠原蛋白I塗佈之培養盤(Greiner)中，且在37℃、5% CO2下培育18-24小時。此後，抽吸培養基，使細胞單層完整，且用已預溫熱至37℃之3.7%甲醛溶液使細胞固定15分鐘。抽吸固定劑且用100微升/孔PBS洗滌細胞兩次。使細胞在室溫下使用可滲透緩衝劑(Thermo Scientific,#8400492)滲透15分鐘，在PBS中洗滌2次且在室溫下用100微升/孔PBS/1% BSA(Sigma,#A9576)阻斷30-60分鐘。將阻斷緩衝液移去，且藉由已在阻斷緩衝液中稀釋之抗IL-33抗體或適合之同型對照抗體在室溫下滴定1小時來置換。
培養盤在PBS中洗滌2次且在室溫下用二級抗體溶液染色1小時， 二級抗體溶液包括以1：10000稀釋之赫斯特染料(10mg/mL；Thermo Scientific)以及以1：1000稀釋之二級抗體(抗人類IgG(H+L)，Alexa Fluor® 488結合物2mg/mL；Invitrogen,#A11013)。培養盤在PBS中洗滌三次。將細胞儲存於最終體積為150微升/孔之PBS中且用黑色遮光密封件(Perkin Elmer,#6005189)覆蓋，隨後在ArrayScan VTi HCS讀取器上成像。
用商業多株抗體(R&D Systems,#AF3625)確認經培養之BSMC之IL-33表現，用抗山羊IgG(H+L)，Alexa Fluor® 488結合物2mg/mL；Invitrogen,#A11055)偵測。圖5展示IL-33抗體IL330004(右圖)相比於CAT-002陰性對照(左圖)，藉由免疫螢光染色偵測支氣管平滑肌細胞中之內源性IL-33。抗體IL330004展示清楚的BSMC核染色，與全長IL-33之預期定位一致且用商業pAb偵測。
實例2 抗IL-33 scFv抗體之分離及識別 藉由噬菌體ELISA識別IL-33特異性結合子
試劑及選擇描述於實例1中。單鏈Fv片段顯示於噬菌體粒子上且在單點ELISA篩選中經測試為未純化製劑。若吸光度450nm>0.5且對於同一對照樣品(胰島素及IL-4Rα Flag®His)為<0.1-0.2，則認為噬菌體顯示之scFv結合IL-33抗原。
圖6展示針對人類IL-33、獼猴IL-33及胰島素篩選之單個培養盤之資料。一個特定人類/獼猴交叉反應IL-33結合子展示於孔C4中，且孔A12及B12含有對照IL-33結合純系。
藉由Axxora IL33305B競爭識別IL-33結合子
Axxora IL33305B競爭試驗為利用螢光微量試驗技術(FMAT)之均相試驗。該試驗評估在384孔格式中在粗scFv上清液樣品或經純化之scFv及IgG存在下Axxora IL33305B mAb(Axxora/Adipogen,#AG-20A-0041-C050)與重組生物素標記人類IL-33 Flag®His之結合的抑制。
ScFv在細菌周質中表現，且在針對已知生物活性IL33305B mAb之FMAT抗原決定基競爭試驗中針對其抑制活性進行篩選。使生物素標記IL-33固定於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之珠粒(Spherotec,#SVP-60-5)上，且使用山羊抗小鼠Alexafluor®-647標記之抗體(Molecular Probes A21236)偵測與Axxora IL33305B Ab之相互作用。FMAT系統為巨大共焦成像器，其量測與珠粒相關之紅色螢光。
在Applied Biosystems細胞偵測系統8200讀取器上讀取培養盤。氦氖激發雷射在孔底部之100μm深度內聚焦，掃描1mm2區域。珠粒沈降在孔底部，且在633nm下雷射激發之後具有結合螢光團之彼等珠粒(其中螢光團之局部濃度與未結合螢光團相比相對較高)在使用PMT1量測之650-685nm下發射信號。未結合螢光團之溶液在激發深度之外或局部濃度相對較低，且因此不發射顯著信號。有效阻斷IL33305B與IL-33結合之scFv或IgG樣品將因此使孔底部之珠粒：IL-33：IL33305B：抗小鼠Alexafluor®-647標記之抗體複合物的量減少，導致所量測之螢光減少。
對於試驗設置，製備以下各者：
(1)IL33305B與抗小鼠AF647混合物，在試驗緩衝劑[含有0.1% BSA(Sigma,#A9576)及0.1%吐溫-20(Sigma,P2287)之PBS(Gibco,14190-094)]中將IL33305B稀釋至2.25nM且與在試驗緩衝劑中稀釋至2μg/ml(最終400ng/ml)之抗小鼠AF647混合。
(2)IL-33與珠粒混合物，將2.5nM生物素標記人類IL-33 FLAG®His添加至含0.0095% w/v抗生蛋白鏈菌素珠粒之試驗緩衝劑中且在室溫下在旋轉下培育1小時，在使用之前，使此等粒子在2000rpm下快速離心15分鐘且再懸浮於原始體積試驗緩衝劑中。
(3)樣品製劑，在96深孔培養盤中產生粗scFv上清液樣品。將96孔主培養盤各孔之5μl培養物轉移至含有900μl 2TY+100μg/ml安比 西林+0.1%葡萄糖培養基之格雷內爾深孔培養盤，且在37℃、280rpm下培育5小時。隨後以100微升/孔添加10mM IPTG/TY，且培養盤在30℃、280rpm下培育隔夜。第二天早晨，使培養盤在3200rpm下快速離心15分鐘。對於高通量篩選，將深孔培養盤之scFv上清液直接轉移至試驗培養盤以達成20%最終濃度。
對於IC50測定，通常一式兩份地在試驗緩衝劑中3倍稀釋經純化之seFv或IgG，得到11個濃度點。使用96孔格雷內爾聚丙烯(Greiner,650201)培養盤用於稀釋液製備。
向384孔透明底部非結合表面黑色培養盤(Costar,#3655)之行1-22中添加以下各者：10μl樣品、20μl IL33305B/抗小鼠AF647混合物及20μl IL-33/珠粒混合物。在所有情況下，總孔體積為40μl。通常在此等實驗中使用之對照包括：添加IL-33/珠粒混合物加抗小鼠AF647(非特異性結合)；IL330305B/抗小鼠AF647混合物加IL-33/珠粒混合物(總結合)。密封培養盤且在室溫下在暗處培育四個小時，且隨後在Applied Biosystems細胞偵測系統8200讀取器上讀取。用速算法分析資料，選通設置為顏色比<0.4，尺寸<15且分鐘計數20。粗scFv上清液樣品之命中被定義為與總結合對照孔相比展示50%或更大信號抑制。使用Prism(Graphpad)曲線擬合軟體標繪經純化之scFv及IgG滴定之劑量反應曲線。
scFv重新格式化為IgG1
對如藉由噬菌體顯示之scFv結合實驗所測定顯示理想的物種交叉反應性及特異性特徵或在抗原決定基競爭試驗中展示針對Axxora I133305B之抑制效果(如上文所描述)的scFv進行DNA測序(Osbourn等人，Immunotechnology 2(3)：181-96(1996)；Vaughan等人，Nat.Biotechnol.14(3)：309-14(1996))。首先，將具有理想特性之scFv轉化為完整免疫球蛋白G1(IgG1)或無效應同型IgG1 TM(併入突變 L234F、L235E及P331S之IgG1 Fc序列)，如實例1中所描述之抗體格式。對應於抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180之不同區域的SEQ ID NO展示於表9中。
Figure 105110432-A0202-12-0181-952
對於IgG之結合試驗
使用基於培養盤之ELISA確定抗IL-33抗體之物種交叉反應性。用0.5μg/ml生物素標記抗原/PBS塗佈抗生蛋白鏈菌素培養盤(Thermo Scientific,AB-1226)。用抗人類IgG HRP(Sigma,A0170)偵測經純化之IgG製劑之結合。結合曲線之EC50資料展示於表10中。
Figure 105110432-A0202-12-0181-951
在噬菌體顯示之scFv格式中確定IL330180結合於人類IL-33而非獼猴或小鼠IL-33。
抗IL-33抗體抑制IL-33功能性反應 IgG抑制TF-1細胞增殖
使用細胞生存力試驗評估抗IL-33抗體對IL-33誘導之TF-1細胞增殖/存活率之抑制。CellTiter-Glo®發光細胞生存力試驗(Promega)為基於所存在之ATP的定量(其指示代謝活性細胞之存在)測定培養物中活細胞數量之均相法。在測試抗體存在或不存在下使細胞暴露於IL-33。在用IL-33刺激72小時之後藉由CellTiter-Glo量測細胞生存力。
特定言之，使用增殖試驗評估抗IL-33抗體對IL-33誘導之TF-1細胞增殖之抑制。TF-1細胞為來自R&D Systems之禮物且根據製造商之說明書維持。分析培養基包含含有5%胎牛血清(加熱不活化，γ照射)、1%丙酮酸鈉(Sigma,S8636)、1-2%青黴素/鏈黴素(Invitrogen,15140-122)之RPMI-1640與GLUTAMAX I(Invitrogen,61870)。在各試驗之前，TF-1細胞藉由在300×g下離心5分鐘而粒化，藉由抽吸移出培養基，且隨後使細胞再懸浮於分析培養基中。此過程重複兩次，細胞以2×105個細胞/毫升之最終濃度再懸浮於分析培養基中。在96孔U形底聚丙烯培養盤(Greiner,650201)中之分析培養基中將IgG測試溶液(一式兩份)滴定至所要濃度範圍，且將50μL轉移至96孔平底組織培養物處理培養盤(Costar,#3598)。添加重組人類IL-33(Alexis,ALX-522-098-3010)至適當測試抗體滴定液中，得到100微升/孔總體積。隨後添加100μl細胞懸浮液至100μl IL-33或IL-33及抗體混合物中，得到200微升/孔總試驗體積及20,000個/孔總細胞數。在該試驗中使用100ng/mL IL-33最終試驗濃度，選擇該濃度作為提供大約80%最大增殖反應之劑量。培養盤在37℃及5% CO2下培育72小時。小心地自試驗培養盤移出100μL上清液。每孔添加根據製造商之說明書復原之100μL CellTiter-Glo(Promega,G7571)。培養盤在培養盤震盪器上在500rpm下震盪5分鐘，且在EnVision盤式讀取器(PerkinElmer)上讀取螢光。使 用Graphpad Prism軟體分析資料。藉由使用三參數或四參數對數方程式之曲線擬合確定IC50值。
對於達成完整抑制曲線之彼等抗體，計算IC50值且概述於下表11中。經純化之IgG製劑能夠抑制回應於IL-33之TF-1增殖。圖7A展示IL330065及IL330101(相比於對照mAb及hST2/Fc)對於TF-1增殖試驗之抑制%，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比。
IL-33抗體抑制Huvec IL-6釋放
使用細胞因子釋放試驗評估抗IL-33抗體對IL-33誘導之人類臍靜脈內皮細胞(Huvec)IL-6產生之抑制。在測試抗體存在或不存在下使細胞暴露於IL-33。
Huvec係獲自Cambrex且根據製造商之方案維持於完全EBM-2培養基(Lonza)中。細胞係收集自含急性酶(PAA,#L11-007)燒瓶，且在培養基(EBM-2(Lonza,#CC-3156)與EGM-2 SingleQuot Kit Suppl.& Growth Factors(Lonza,#CC-4176))中以1×104個/100微升/孔接種至96孔平底組織培養物處理培養盤(Costar,#3598)中，且在37℃、5% CO2下培育18-24小時。此後，抽吸培養基，使細胞單層完整，且用如下文所論述之試驗測試樣品置換。
在96孔U形底聚丙烯培養盤(Greiner,650201)中之完全培養基中將經純化之IgG之測試溶液(一式兩份)稀釋至所要濃度。在與適當測試抗體混合之完全培養基中製備IL-33(Adipogen)，得到30ng/mL最終IL-33濃度。所有樣品在室溫下培育30分鐘，隨後將120μl IL-33/抗體混合物轉移至試驗培養盤。在18-24小時培育之後，藉由適於銪讀取之ELISA(R&D Systems,DY206)在細胞上清液中量測IL-6。黑色Fluro-Nunc Maxisorp培養盤(VWR,#437111)用50μL捕捉抗體塗佈，使用自動培養盤洗滌器(Biotek)用PBS-吐溫(0.01%)洗滌三次，且在室 溫下用250微升/孔PBS/1% BSA(Sigma,#A9576)阻斷1-2小時。培養盤如上所述洗滌，且在室溫下與50μL肥大細胞試驗上清液一起培育1-2小時。在用PBS-吐溫洗滌3次之後，根據製造商之說明書使培養盤與偵測抗體(50微升/孔)一起培育。ELISA培養盤在PBS-吐溫中洗滌三次，且在DELFIA®試驗緩衝劑(PerkinElmer,4002-0010)中以1：1000稀釋抗生蛋白鏈菌素-銪(PerkinElmer,1244-360)且在室溫下以50微升/孔添加持續45-60分鐘。培養盤隨後在DELFIA洗滌緩衝劑中洗滌7次，隨後添加50微升/孔增強溶液(PerkinElmer,4001-0010)且使用時差式螢光測定法(激發340nM，發射615nM)分析。使用Graphpad Prism軟體分析資料。藉由使用三參數或四參數對數方程式之曲線擬合確定IC50值。對於達成完整抑制曲線之彼等抗體，計算IC50值且概述於下表11中。與對照抗體相比，抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL330149及IL330180之經純化之IgG製劑(IgG1或IgG1-TM)抑制IL-6產生。例示性結合成員之效力基本上不受IgG1-TM Fc序列突變(L234F、L235E及P331S)之存在的影響，且所示之數據係組合兩種格式之資訊。圖7B展示IL330065及IL330101之最大IL-6釋放%(相比於人類ST2-Fc、抗IL33 pAb AF3625(R & D Systems)及對照mAb)，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比。
人類肥大細胞細胞因子釋放之抑制
使用細胞因子釋放試驗評估抗IL-33抗體對IL-33誘導之人類肥大細胞IL-6產生之抑制。除IL-6之外，使用替代duoset ELISA或Mesoscale Discovery多重分析量測細胞上清液中之其他細胞因子(IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF及TNFα)。
人類肥大細胞係藉由臍帶血CD133+祖細胞(Lonza,#2C-108)於活體外分化產生，基本上如Andersen等人(J Immunol Methods 336：166-174(2008))中所描述。祖細胞根據製造商之說明書解凍且在補充有 1%青黴素/鏈黴素(Invitrogen,15140-122)及生長因子：100ng/mL幹細胞因子(Peprotech,#AF-300-07)及50ng/mL IL-6(Peprotech,#AF-200-6)之不含血清之增殖培養基(StemSpan,#09650)中活體外培養8週。另外，在前三週期間在培養基中包括1ng/mL IL-3(R&D Systems,#203-IL)。細胞在期間維持<5×105個/毫升。
肥大細胞在分析培養基(StemSpan,#09650；1%青黴素/鏈黴素(Invitrogen,15140-122)及100ng/mL幹細胞因子(Peprotech,#AF-300-07))中培養隔夜，隨後在測試抗體存在或不存在下暴露於IL-33。
對於細胞因子釋放試驗，移出細胞，離心集結成粒(150g，10分鐘)且再懸浮於分析培養基(StemSpan,#09650；1%青黴素/鏈黴素(Invitrogen,15140-122)及100ng/mL幹細胞因子(Peprotech,#AF-300-07))中。使細胞返回至燒瓶且在試驗設置之前培養18-24小時。對於樣品評估，在96孔U形底聚丙烯培養盤(Greiner,650201)中之分析培養基中滴定IgG之測試溶液(一式兩份)至所要濃度範圍，且取50μL測試溶液轉移至96孔平底組織培養物處理培養盤(Costar,#3598)。取已在分析培養基中稀釋至90ng/mL之50μL重組人類IL-33(Adipogen,#522-098-3010)添加至適當測試抗體滴定液中，得到100微升/孔總體積。隨後添加50μl細胞懸浮液(1.5×105)至100μl IL-33或IL-33與抗體混合物中，得到每孔總試驗體積為150微升及每孔總細胞數為5×104個。在該試驗中使用30ng/mL IL-33最終試驗濃度，選擇該濃度作為提供大約50-80%最大細胞因子反應之劑量。培養盤在37℃及5% CO2下培育18-24小時。
藉由適於銪讀取之ELISA(R&D Systems,DY206)在細胞上清液中量測IL-6。黑色Fluro-Nunc Maxisorp培養盤(VWR,#437111)用50μL捕捉抗體塗佈，使用自動培養盤洗滌器(Biotek)用PBS-吐溫(0.01%)洗滌三次，且在室溫下用250微升/孔PBS/1% BSA(Sigma,#A9576)阻斷1-2 小時。培養盤如上所述洗滌，且在室溫下與50μL肥大細胞試驗上清液一起培育1-2小時。在用PBS-吐溫洗滌3次之後，根據製造商之說明書使培養盤與偵測抗體(50微升/孔)一起培育。ELISA培養盤在PBS-吐溫中洗滌三次，且在DELFIA試驗緩衝劑(PerkinElmer,4002-0010)中以1：1000稀釋抗生蛋白鏈菌素-銪(PerkinElmer,1244-360)且在室溫下以50微升/孔添加持續45-60分鐘。培養盤隨後在DELFIA洗滌緩衝劑中洗滌7次，隨後添加50微升/孔增強溶液(PerkinElmer,4001-0010)且使用時差式螢光測定法(激發340nM，發射615nM)分析。使用Graphpad Prism軟體分析資料。藉由使用三參數或四參數對數方程式之曲線擬合確定IC50值。
圖8A展示藉由增加抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180之濃度使IL-6產生減少，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應%。與對照抗體相比，測試抗體之經純化之IgG製劑能夠抑制IL-6活性。例示性結合成員之效力基本上不受IgG1-TM Fc序列突變(L234F、L235E及P331S)之存在的影響，且資料組合兩種格式之資訊。TF-1增殖試驗、HUVEC IL-6產生及肥大細胞IL-6產生之IC50結果展示於表11中。
Figure 105110432-A0202-12-0186-953
根據製造商之說明書使用Meso-Scale Diagnostics Demonstration 10叢人類細胞因子試驗(#K15002B-1)偵測細胞上清液中之額外細胞因子(IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13及GM-CSF)。使用與上文所描述 之IL-6 ELISA相似的方案藉由適於銪讀取之ELISA在細胞上清液中量測細胞因子。
展示肥大細胞在用IL-33(Meso-Scale Diagnostics Demonstration 10叢人類細胞因子試驗#K15002B-1；R&D Systems,#DY213)刺激之後產生一系列細胞因子。圖8B-F分別展示IL-33驅動之GM-CSF、IL10、IL-8、IL-13及IL-5產生之抑制。此等結果展示抗體IL330065、IL330101、IL330107及IL330149能夠抑制IL-33驅動之所量測之所有細胞因子的產生。
天然全長IL-33之結合及中和
上文所描述之選擇及活性研究使用重組之內部或商業來源之成熟IL-33(胺基酸112-270)。全長IL-33亦可為活性的(Cayrol等人，Proc Natl Acad Sci U S A 106(22)：9021-6(2009)；Hayakawa等人，Biochem Biophys Res Commun 387(1)：218-22(2009)；Talabot-Ayer等人，J Biol Chem.284(29)：19420-6(2009))。為評估抗體與全長IL-33之結合，選殖全長IL-33且在HEK293-EBNA細胞中表現。如下文所描述，展示所選抗體結合於全長IL-33，如藉由西方墨點法所確定。
全長人類IL-33之選殖及表現
編碼人類全長(FL)IL-33之cDNA分子(Swiss Prot寄存編號O95760，胺基酸1-270)係藉由引子延伸PCR選殖合成，且選殖至pDONR221(Invitrogen,12536-017)中且根據製造商之說明書(Invitrogen,12538-120)使用LR閘道選殖酶II轉移至哺乳動物表現載體pDEST12.2(Invitrogen)。pDEST12.2載體已經修飾以含有pCEP4載體(Invitrogen)之oriP複製起點，在轉染至表現EBNA-1基因產物之細胞株(諸如HEK293-EBNA細胞)中之後允許游離型質體複製。HEK293-EBNA細胞經脂染胺2000(Invitrogen,11668-019)轉染。在蛋白酶抑制劑(Roche,05892791001)存在下使用音波處理使表現FL HuIL-33之細 胞(及模擬轉染對照)溶解。
表現全長人類IL-33之細胞溶解物之西方墨點分析
使來自細胞溶解物之蛋白質變性且用SDS樣品緩衝劑及DTT還原，隨後藉由SDS-PAGE電泳分離且轉移至硝化纖維膜。膜用5%脫脂奶粉/PBS-T阻斷1h，與一級抗體(0.5微克/毫升)一起培育1h，在PBS-T中洗滌三次，隨後與HRP結合二級抗體(1/10,000山羊抗人類IgG稀釋液(Sigma,A0170))一起培育1h且在PBS-T中洗滌三次。用Amersham ECL加偵測試劑(GE healthcare,RPN2132)偵測HRP。藉由比較遷移與Magic Mark XP(Invitrogen,LC5602)之遷移來估算尺寸。圖9藉由西方墨點法展示IL-33抗體(IL330065、IL330101、IL330107及IL330149)與全長人類IL-33之結合。
肥大細胞細胞因子之中和對全長IL-33細胞溶解物起反應
在經急性酶(PAA,#L11-007)轉染之後24小時收集表現全長(FL)HuIL-33之HEK293-EBNA細胞(及模擬轉染對照)。細胞用PBS稀釋至5×107個/毫升，且使用組織均質器均質化30秒。藉由離心移除細胞碎片。肥大細胞用不同濃度之細胞溶解物刺激。僅在全長IL-33轉染細胞溶解物而非模擬轉染細胞溶解物之情況下觀測到細胞因子產生刺激。選擇刺激次最大細胞因子釋放之溶解物濃度(大致EC50)用於抗體中和研究。
對於細胞因子釋放試驗，肥大細胞在分析培養基(StemSpan,#09650；1%青黴素/鏈黴素(Invitrogen,15140-122)及100ng/mL幹細胞因子(Peprotech,#AF-300-07))中培養隔夜，隨後在測試抗體存在或不存在下暴露於FL HuIL-33。在18-24小時之後藉由試驗上清液之ELISA偵測IL-6及IL-13產生。上文描述該方案之詳細描述(實例2-0007)。
圖10展示抗IL-33抗體IL330065及IL330101對由全長IL-33轉染細胞之細胞溶解物刺激之肥大細胞IL-6及IL-13產生之影響。經純化之 IgG製劑能夠抑制由全長IL-33細胞溶解物誘導之IL-6(圖10A)及IL-13(圖10B)產生。
IL-33抗體之非競爭作用模式 純化之IgG抑制IL-33與ST2結合
抗IL-33抗體抑制Flag®-His標記之IL-33結合於ST2受體之能力係在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗中評估，其完整方法描述於實例1中。
圖11A展示在增加抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180之濃度的情況下HTRF®受體-配位體競爭試驗之特異性結合結果。此等結果展示抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180不為IL-33：ST2相互作用之競爭抑制劑。
IgG抑制Huvec中之NFkB信號傳導
如實例1中所描述由藉由免疫螢光染色偵測之p65/RelA NFkB亞單位之核易位評估Huvec中回應於IL-33之NFκB信號傳導。
圖11B展示在增加抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107及IL330149之濃度的情況下之Huvec NFkB易位。此等結果展示IL330065、IL330099、IL330101、IL330107及IL330149在IL-33刺激之Huvecs中在刺激之後30分鐘不抑制p65/RelA NFkB之核易位。該等結果與抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180不能抑制IL-33結合於ST2一致。
在HTRF ® 抗原決定基競爭試驗中IL-33抗體之抗原決定基分組
在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)抗原決定基競爭試驗中評估抗體與mAb IL330101或mAb IL330180競爭結合於生物素標記人類IL-33之能力。
下文所描述之HTRF®抗原決定基競爭試驗用於量測IgG格式之前 導抗體與生物素標記IL-33之結合。辨識與前導抗體相似的抗原決定基之測試scFv樣品將與該前導抗體競爭結合於IL-33，導致試驗信號減少。
藉由添加5微升各抗體測試樣品稀釋液至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試經純化之抗IL-33 scFv抗體樣品對生物素標記人類IL-33結合前導抗體之抑制。接著，製備含有8nM IL330180 IgG1或12nM IL330101 IgG1及40nM抗人類Fc偵測劑(Cisbio International,61HFXLB)之溶液，且添加2.5微升至試驗培養盤中。此後添加含有4nM(對於IL330180抗原決定基競爭試驗)或18nM(對於IL330101抗原決定基競爭試驗)生物素標記人類IL-33(Axxora,AG-40B-0038；生物素標記)及4.65nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液。在由含有0.8M氟化鉀(BDH,103444T)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,Sigma A9576)的杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)組成之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育2小時隨後在4℃下培育16小時，隨後使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm及665nm發射波長下之時差式螢光。使用如先前所描述之方程式1至3分析資料。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記IL-33/抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物組合來定義陰性對照(非特異性結合)。
IL330101及IL330180抗原決定基競爭試驗之結果分別展示於圖8A及8B中。圖12A展示IL330101 scFv、IL330107 scFv、IL330149 scFv、IL330065 scFv、不相關scFv及IL330180 scFv與mAb IL330101結合於生物素標記人類IL-33之競爭性結合。此等結果展示IL330101 scFv、IL330107 scFv、IL330149 scFv競爭性地抑制IL330101結合於生物素標記人類IL-33。
圖12B展示在生物化學HTRF®中評估之IL330180、IL330101、 IL330149、IL330065及不相關scFv與mAb IL330180結合於生物素標記人類IL-33之競爭性結合。此等結果展示IL330101、IL330149及IL330065不競爭性地抑制IL330180結合於生物素標記人類IL-33。
使用此方法之抗原決定基分組展示三組包含IL330101、IL330107及IL330149(在第1組中)、IL330065(在第2組中)及IL330180(在第3組中)之抗體，如表12中詳述。
Figure 105110432-A0202-12-0191-954
實例3 優化抗-IL-33 Ab IL330101 親和力成熟
使用靶向突變誘發方法及基於親和力之噬菌體呈現選擇來優化IL330101。使用如所描述(Clackson,T.及Lowman,H.B.Phage Display-A Practical Approach,2004.Oxford University Press)之標準分子生物學技術藉由寡核苷酸導引之可變重鏈(VH)互補決定區2及3(CDR2及CDR3)及輕鏈(VL)CDR3突變誘發來形成來源於前導純系之大scFv噬菌體庫。對庫進行基於親和力之噬菌體呈現選擇使得選擇對人類及小鼠IL-33具有較高親和力之變異體。使用如實例1及2中所描述之試劑基本上如先前所描述(Thompson,J等人J Mol Biol,1996.256：第77-88頁)進行選擇。簡言之，使scFv噬菌體粒子與重組生物素標記人類IL-33溶液(Adipogen；如在實例1內之蛋白質修飾中所描述進行生物素標記)一起培育。隨後遵循製造商之建議在經抗生蛋白鏈菌素塗佈之順磁珠粒(Dynabeads® M-280)上捕捉與抗原結合之scFv噬菌體。所選scFv噬菌體粒子隨後如先前所描述(Osbourn,J.K.等人， Immunotechnology,1996.2(3)：第181-96頁)獲救，且在四輪選擇內在通常500nM至500pM之交替及降低濃度之人類或小鼠生物素標記IL-33存在下重複選擇過程。
未純化scFv抑制IL-33與mAb結合
使來自選擇輸出之代表性數目的個別純系在96孔培養盤中生長。ScFv在細菌周質中表現(Kipriyanov等人，J Immunol Methods 200(1-2)：69-77(1997))，且在基於均相FRET(螢光共振能量轉移)HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)之IL-33：mAb結合試驗中針對其抑制活性進行篩選。在此試驗中，樣品與IL330101 IgG競爭結合於生物素標記人類IL-33或小鼠IL-33 FLAG®His。此類抗原決定基競爭試驗係基於如下原理：辨識與抗IL-33 IgG相似的抗原決定基之測試抗體樣品將與IgG競爭結合於生物素標記IL-33，導致試驗信號減少。
藉由添加5微升樣品至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試未純化抗IL-33 scFv樣品對生物素標記人類或小鼠IL-33 FLAG®His結合於IL330101之抑制。接著，製備含有12nM IL330101以及40nM抗人類Fc XL665偵測劑(Cisbio International,61HFCXLB)之溶液用於人類IL-33試驗，且製備含有2nM IL330101以及40nM抗人類Fc XL665偵測劑(Cisbio International,61HFCXLB)之溶液用於小鼠試驗。添加2.5微升至試驗培養盤中。此後添加含有18nM生物素標記人類IL-33(Adipogen,AG-40B-0038)以及4.6nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於人類試驗，或含有2nM生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His以及4.6nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於獼猴試驗。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA, K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育4小時隨後在4攝氏度下培育16小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm及665nm發射波長下之時差式螢光。藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值分析資料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干擾。隨後使用方程式2計算各樣品之△F%。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記IL-33與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合%。
在抗原決定基競爭試驗達到其靈敏度極限時，用使用中間優化之mAb IL330259之試驗來測試未純化scFv樣品。藉由添加5微升各樣品至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試未純化抗IL-33抗體樣品對生物素標記人類IL-33或生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His結合DyLight標記IL330259之抑制。接著，製備含有20nM DyLight標記IL330259之溶液用於人類IL-33試驗且製備含有4nM DyLight標記IL330259之溶液用於小鼠試驗，且添加2.5微升至試驗培養盤(按照製造商之說明書使用套組(Thermo Scientific,53051)標記之IgG)中。此後添加含有20nM生物素標記人類IL-33(Adipogen,AG-40B-0038)或1.6nM生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His以及6nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA,K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育4小時隨後在4攝氏度下培育16小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm及665nm發射波長下之時差式螢光。藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值分析資料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干 擾。隨後使用方程式2計算各樣品之△F%。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記IL-33與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合%。
純化之scFv抑制IL-33與mAb結合
對展示作為未純化周質提取物對IL-33：mAb相互作用之抑制效果相比於IL330101更大之單鏈Fv純系進行DNA測序(Osbourn等人，Immunotechnology 2(3)：181-96(1996)；Vaughan等人，Nat Biotechnol 14(3)：309-14(1996))。獨特scFv再次在細菌中表現且藉由親和層析純化(如WO01/66754中所描述)。此等樣品之效力係藉由經純化製劑之稀釋系列與IL330101 IgG競爭結合於如上文所描述之生物素標記人類IL-33、生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His或生物素標記獼猴IL-33 FLAG®His，但在添加生物素標記獼猴IL-33 FLAG®His試驗(以12nM濃度添加生物素標記獼猴IL-33 FLAG®His)之情況下確定。
圖13：展示在增加IL-33 scFv抗體IL330101、IL330259之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33結合於IL330101所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
選擇能夠比IL330101在更大程度上抑制IL-33：mAb相互作用之經純化之scFv製劑用於轉化為IgG格式。IgG表現及純化之方法描述於實例1中。
在抗原決定基競爭試驗達到其靈敏度極限時，用使用中間優化之mAb(IL330259)之試驗來測試經純化之scFv樣品。藉由添加生物素標記獼猴IL-33 FLAG®His試驗(以12nM濃度添加生物素標記獼猴IL-33 FLAG®His)來測試經純化之抗IL-33抗體樣品對如上文所描述之生物素標記人類IL-33、生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His或生物素標記獼猴FLAG®His IL-33結合IL330259之抑制。
基於序列及抗原決定基競爭資料，藉由標準分子生物學技術使所選VH及VL輸出再組合形成純系含有隨機配對VH及VL序列之庫(例如，VH CDR2/VL CDR3及VH CDR3/VL CDR3庫)。或者，使VH CDR3及VL CDR3序列隨機配對且與選自改良變異體之集合的特定VH CDR2序列再組合，產生所有三個CDR均為非親本之庫。通常在所有重組庫上進行五輪使用10nM至10pM之降低及交替濃度之人類及小鼠生物素標記IL-33的親和力選擇以識別具有改良動力學之scFv序列。或者，在四輪選擇內在1000×未生物素標記IL-33存在下使用固定濃度之生物素標記IL-33(例如，1nM、100pM或300pM)選擇重組庫持續增加之時間量(例如30分鐘、1小時、2小時或4小時)，該過程在此項技術中已知為『解離速率』或『競爭』選擇，使得識別具有改良動力學之scFv。
再次在HTRF®抗原決定基競爭試驗中如先前所描述針對抑制標記huIL-33與IL330101親本抗體或VH CDR2優化抗體IL330259之結合的能力來篩選樣品。對與IL330101相比展示顯著改良之抑制效果的scFv進行DNA測序，且產生獨特變異體作為經純化之scFv用於進一步表徵。如實例1中所描述，將抑制性scFv轉化為完整免疫球蛋白G1(IgG1)抗體格式。
或者，個別獨特VH CDR2、VH CDR3及VL CDR3序列特定且合理地直接再組合及產生作為IgG。在此實例中，在無任何額外親和力選擇之情況下測試IgG之改良動力學。
根據所有策略識別具有改良動力學之抗體，且由IL330259、IL330377、IL330388、IL330396、IL330398及H338L293例示。
將IL330101親本及優化抗IL-33抗體之VH及VL域之胺基酸序列與IMGT資料庫(Lefranc,M.P.等人Nucl.Acids Res.2009.37(Database issue)：D1006-D1012)中之已知人類生殖系序列進行比對，且藉由序 列相似性識別最接近生殖系。對於IL330101抗體譜系之VH域，此為IGHV3-21/IGHJ2。對於VL域，其為IGIV3-25/IGLJ3。不考慮保持不變之維尼爾殘基(Foote,J.等人，J Mol Biol,1992.224：第487頁)，在VH域之構架中不需要變化且在VL構架中需要4個變化(V3E、T5M、A45V及V104L；Kabat編號)。此等位置如所指示使用標準定點突變誘發技術用適當突變誘發引子改變。以此方式生殖系化之抗體以『fgl』後綴出現在序列表中。對應於抗體IL330259、H338L293、IL330377、IL330388、IL330396及IL330398之不同區域的SEQ ID NO展示於表13中。
Figure 105110432-A0202-12-0196-955
Figure 105110432-A0202-12-0197-956
純化之IgG抑制IL-33與mAb結合
在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗中評估抗IL-33抗體抑制生物素標記人類IL-33、生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His或獼猴IL-33 FLAG®His結合於DyLight標記之IL330101 IgG的能力。
藉由添加5微升各濃度之樣品至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試經純化之抗IL-33抗體樣品對生物素標記人類IL-33、生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His或生物素標記獼猴FLAG®His IL-33結合DyLight標記IL330101之抑制。接著，製備含有40nM DyLight標記IL330101之溶液且添加2.5微升至試驗培養盤(按照製造商之說明書使用套組(Thermo Scientific,53051)標記)中。此後添加含有40nM生物素標記人類IL-33(Adipogen,AG-40B-0038)、2.5nM生物素標記小鼠IL-33 FLAG® His或12nM生物素標記獼猴IL-33 FLAG® His以及4.6nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA,K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育4小時隨後在4攝氏度下培育16小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm及665nm發射波長下之時差式螢光。藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值分析資料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干擾。隨後使用方程式2計算各樣品之 △F%。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記IL-33與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合%。
圖14A：展示在增加IL-33 IgG1抗體IL330101、IL330259之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33結合於IL330101所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
在抗原決定基競爭試驗達到其靈敏度極限時，用使用中間優化之mAb IL330259之試驗來測試經純化之IgG樣品。此如對於測試經純化之scFv所描述。
在IL330259抗原決定基競爭試驗達到其靈敏度極限時，用使用優化之mAb(H338L293)之第三試驗來測試經純化之IgG樣品。藉由添加5微升各樣品至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試經純化之抗IL-33抗體樣品對生物素標記人類IL-33、生物素標記獼猴IL-33 FLAG®His或生物素標記小鼠IL-33 FLAG®His結合DyLight標記H338L293之抑制。接著，製備含有20nM DyLight標記H338L293之溶液且添加2.5微升至試驗培養盤(按照製造商之說明書使用套組(Thermo Scientific,53051)標記)中。此後添加含有4nM生物素標記人類IL-33(Adipogen,AG-40B-0038)、0.8nM生物素標記小鼠IL-33 FLAG® His或1.6nM生物素標記獼猴IL-33 FLAG® His以及4.6nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA,K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育4小時隨後在4℃下培育16小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm 及665nm發射波長下之時差式螢光。藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值分析資料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干擾。隨後使用方程式2計算各樣品之△F%。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記IL-33與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合%。
圖14B：展示在增加IgG1抗體H338L293、IL330396及IL330388之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33結合於H338L293所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
IL-33抗體抑制Huvec IL-6產生
如實例2中所描述，評估抗體抑制IL-33刺激之Huvec IL-6產生之能力。
圖15A展示藉由增加抗體(IL330101、IL330377、H338L293、IL330388、IL330396、IL330398)之濃度使IL-6產生減少，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應%。抗體之經純化之IgG製劑抑制了最大約70% IL-6活性，相比之下，商業多株抗體抑制100%。
IL-33抗體抑制肥大細胞IL-6產生
如實例2中所描述，評估抗體抑制IL-33刺激之源自人類臍帶血之肥大細胞的IL-6產生之能力。
圖15B展示藉由增加抗體(IL330101、H338L293、IL330388、IL330396)之濃度使IL-6產生減少，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應%。與陰性對照抗體相比，抗體之經純化之IgG製劑抑制了100% IL-6活性。
HUVEC IL-6產生及肥大細胞IL-6產生之IC50結果展示於表14 中。
Figure 105110432-A0202-12-0200-957
抗體藥理學
使用實例2中所描述之方法藉由增加IL-33(Adipogen)之濃度誘導源自臍帶血之肥大細胞之IL-6產生。此劑量反應係在濃度增加之H338L293或IL330388存在下進行，產生IL-33劑量反應曲線向右移。使用GraphPad PRISM軟體(La Jolla,CA,USA)計算在抗體不存在及存在下之IL-33 EC50值，且計算劑量比(DR)。資料標繪為log[抗體]M(x軸)與log[DR-1](y軸)。此清楚地展示非競爭性特徵(曲線圖)，異位調節劑特徵。為研究此，使各實驗之資料標準化且合併成單一資料集。使用Prism Graphpad軟體擬合異位模型，且確定Kb及α值。所檢查之兩個前導的α值相似，指示α值為約0.02(亦即在結合抗體時IL-33親和力/效力之最大減少為約50倍)。可估算H338L293(約4.2nM)及IL330388約1.7nM)之功能性親和力(Kb)。
圖16展示在肥大細胞IL-6產生試驗中對IL330388及H338L293之Schild分析。兩個抗體均顯示異位調節劑之特徵。
使用BIAcore計算IL-33抗體之結合親和力
使用BIAcore 2000(GE healthcare)藉由溶液親和力確定例示性結合成員之經純化之IgG樣品與人類、獼猴或小鼠IL-33之結合親和力。使生物素標記IL33表面固定於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之感測器晶片(GE healthcare目錄號BR-1000-32)上。使抗IL33抗體與不同濃度之未 經標記IL33在25℃下一起培育且平衡48小時。藉由使樣品流經IL33晶片且量測相比於標準抗體曲線之反應來確定游離抗體之量。使用在BIA評估軟體中擬合之溶液親和力確定親和力。抗體IL330101、H338L293、IL330388、IL330396結合於人類、獼猴或小鼠IL 33之親和力展示於表15中。
Figure 105110432-A0202-12-0201-958
實例4 IL-33之氧化還原調節 試劑
編碼人類IL-33(胺基酸112-270)、寄存編號(Swiss-Prot)O95760之成熟組分之cDNA係藉由引子延伸PCR合成，且選殖至pJexpress404(DNA 2.0)中。編碼序列經修飾以在蛋白質之N端含有10xhis、Avitag及Xa因子蛋白酶裂解位點(MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR)。藉由轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞產生N端標記His10/Avitag IL33-01(WT,SEQ ID 632)。在自體誘導培養基(隔夜ExpressTM自體誘導系統1，Merck Millipore,71300-4)中在37℃下培養經轉化細胞18小時，隨後藉由離心收集細胞且儲存在-20℃下。使細胞再懸浮於含有完全蛋白酶抑制劑混合物錠劑(Roche,11697498001)、2.5μ/ml全能核酸酶(merck Millipore,70746-3)及1mg/ml重組溶菌酶之BugBuster(Merck Millipore,70921-5)中。藉由在4℃下在75,000×g下離心2小時使細胞溶解物澄清。藉由在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪 唑中之尼克爾(Nickel)親和層析，在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、250mM咪唑中溶離，自上清液純化IL-33蛋白質。藉由在磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)中使用Superdex 75 10/300 GL管柱進行尺寸排阻層析進一步純化IL-33。藉由SDS PAGE分析峰溶離份。將含有純IL-33之溶離份合併，且藉由Nanodrop A280量測來量測濃度。藉由SDS PAGE分析最終樣品。
為產生去標記IL-33(BK349)，使N端標記His10/Avitag IL33-01與每毫克蛋白質10個單位Xa因子(GE healthcare 27-0849-01)在2倍DPBS緩衝劑中在RT下一起培育1小時。在2倍DPBS中在S75管柱(GE healthcare 28-9893-33)上使用SEC層析以1ml/min流動速率純化未標記IL33。
表16中所概述之其他試劑係如實例1中所描述產生。
Figure 105110432-A0202-12-0202-959
蛋白質修飾
如實例1中所描述使用EZ連接磺基-NHS-LC-生物素(Thermo/Pierce,21335)經由游離胺對本文所用之IgG及經修飾之受體蛋白進行生物素標記。使用EZ連接生物素-BMCC(Perbio/Pierce，產品編號21900)經由游離半胱胺酸對本文所用之IL-33蛋白質進行生物素標記。
IL-33在活體外快速失去活性
在HUVEC信號傳導試驗(30分鐘)及IL-6產生試驗(18-24小時)中量 測IL-33活性，其方法分別描述於實例1及2中。
圖17展示在HUVEC信號傳導試驗(30分鐘)及IL-6產生試驗(18-24小時)中所量測之人類IL-33、半胱胺酸生物素標記IL-33或細胞培養基預處理IL-33之活性。圖17A展示如藉由NFkB或IL-6試驗所量測之人類IL-33活性(Adipogen)之比較，其中x軸為以莫耳濃度計之人類IL-33濃度且y軸為最大反應%。相比於短(30分鐘)試驗，IL-33在隔夜試驗下不太顯著有效。經由半胱胺酸殘基生物素標記之人類IL-33 Flag®His在短(30分鐘)試驗與較長(隔夜)試驗之間不失去活性(圖17B)。為研究此現象，使IL-33(BK349)在細胞培養基(EBM-2(Lonza,#CC-3156)與EGM-2 SingleQuot Kit Suppl.& Growth Factors(Lonza,#CC-4176))中預處理18小時，且隨後與未處理IL-33比較誘導NFkB信號傳導之能力。已用培養基預處理之IL-33顯示顯著活性損失(圖17C)。
IL-33之SDS-PAGE分析
為研究IL-33蛋白質之潛在變化，藉由SDS PAGE電泳在還原或非還原條件下分析PBS/0.1%牛血清白蛋白(BSA)或經伊斯科夫改良型杜爾貝科氏培養基(IMDM)處理之人類IL-33(BK349或人類IL-33 Flag®His)及小鼠IL-33 Flag®His。在1倍NuPAGE凝膠裝載緩衝劑(Invitrogen)中製造樣品，且在90℃下變性3min。還原型樣品含有2% β-巰基乙醇。根據製造商之說明書使用MOPS操作緩衝劑(Invitrogen)在NuPAGE Novex 12% Bis-Tris微型凝膠(Invitrogen)上操作樣品。還原及非還原型樣品在單獨凝膠上操作。每個泳道裝載500ng IL-33。使凝膠在震盪平台上在ddH20中洗滌3×5min，且隨後使用EzBlue(基於考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)G-250之凝膠染色試劑，Sigma G1041)染色1小時。使凝膠在dH2O中脫色且使用Epsom掃描儀掃描。
圖18展示在用伊斯科夫改良型杜爾貝科氏培養基(IMDM)處理之前及之後在還原或非還原條件下人類或小鼠IL-33之SDS-PAGE。僅在非還原條件下觀測到在用IMDM處理後IL-33之表觀分子量差異，意味著人類及小鼠IL-33之氧化還原相關修飾的存在。圖18A展示僅在非還原條件下觀測到的在用IMDM處理後人類IL-33(BK349)之表觀分子量差異。圖18B展示在非還原條件下非生物素標記與生物素標記之人類IL-33 Flag®His。觀測到在IMDM處理之後IL-33 Flag®His而非半胱胺酸生物素標記IL-33 Flag®His之表觀分子量差異。圖18C展示僅在非還原條件下觀測到的在用IMDM處理後小鼠IL-33 Flag®His之表觀分子量差異。
質譜分析及二硫鍵映射
經培養基處理之人類IL-33型式經純化用於進一步分析。使人類IL-33(BK349)與60% IMDM培養基一起或在PBS中以300μg/ml最終蛋白質濃度在37℃下培育18小時。18小時後，使用AKTAxpress FPLC系統(GE healthcare)在2倍DPBS中在S75 16：600 Superdex管柱(GE healthcare 28-9893-33)上使用尺寸排阻層析(SEC)自培養基組分純化經培養基處理之IL33。藉由SDS PAGE分析峰溶離份，且合併非聚集純溶離份且藉由LC-MS分析。
圖19展示藉由SEC純化經IMDM處理之人類IL-33。收集單體溶離份用於進一步分析。
LC-MS
使用與Synapt G1四極桿飛行時間(QToF)質譜儀(Waters,Milford,US)耦合之Acquity UPLC進行逆相(RP)LC-MS分析。將在10mM Tris HCl(pH 8)中以1mg/ml稀釋之1μg經純化蛋白質注射至保持在65℃下之50mm×2.1mm、1.7μm粒度BEH300 C4分析管柱(Waters,Milford,US)上。使用5分鐘二元梯度以0.15mL/min恆定流動速率溶離蛋白 質；溶劑B在1分鐘內最初由5%增加至95%，在2分鐘內減少至20%且在另外2分鐘內返回至5%。清潔管柱，隨後藉由在高(95%)與低(5%)溶劑B之間振盪5分鐘進行後續注射。溶劑A(水)及B(乙腈)以0.01%(v/v)三氟乙酸及0.1%(v/v)甲酸補充。在500m/z與4500m/z之間採集光譜。關鍵儀器參數包括正電離模式，源電壓：3.4kV，樣品錐電壓：50V，源溫度：140℃，去溶劑化溫度：400℃。使用BioPharmaLynx(Waters,Milford,US)使電荷包膜解卷積。
圖20展示藉由LC-MS確定之PBS與IMDM處理之IL-33的完整質量。經IMDM處理之IL-33與經PBS處理之IL-33相比顯示4Da損失，與兩個二硫鍵之形成相容。
二硫鍵映射
對於各樣品，在100mM磷酸鈉、1mM N-乙基順丁烯二醯亞胺pH 7.0緩衝劑中以3mg/ml製備50μg蛋白質，且在室溫下培育20分鐘。使乾燥樣品再懸浮於7M鹽酸胍、100mM NaCl、10mM磷酸鈉中，且在37℃下培育30分鐘。將變性蛋白質稀釋至0.3mg/ml且用Glu-C以1：50 E：S比率在2M胍、100mM磷酸鈉、0.1mM EDTA(pH 7.0)中在37℃下消化。2小時後，添加第二相等Lys-C等分試樣。在另外2小時之後，使消化物分裂；對於還原分析，使消化物與50mM二硫蘇糖醇一起在室溫下培育15min。使用與Synapt G2 QToF質譜儀(Waters,Milford,US)耦合之Acquity UPLC藉由RP LC-MS分析還原及非還原型樣品。對於各樣品，將5μg Lys-C消化物注射至保持在55℃下之150mm×2.1mm、1.7μm粒度BEH300 C18分析管柱(Waters,Milford,US)上。使用75分鐘二元梯度以0.2mL/min恆定流動速率溶離肽；溶劑B自0%增加至35%。清潔管柱，隨後藉由在高(95%)與低(5%)溶劑B之間振盪5分鐘進行後續注射。溶劑A(水)及B(乙腈)以0.02%(v/v)三氟乙酸補充。使用資料獨立採集模式在50m/z與2000m/z之間採集光 譜。使用BioPharmaLynx(Waters,Milford,US)處理低及高能量光譜。
圖21展示經IMDM處理之人類IL-33之二硫鍵映射。圖21A展示來自DSB IL-33之非還原及還原型Lys-C肽圖分析之組合解卷積質譜。圖21B展示含半胱胺酸肽之分離光譜。獨特的還原及非還原型樣品之肽分別以綠色及藍色突出顯示。資料與兩個二硫橋鍵之形成一致。所識別之一個物種分別在半胱胺酸C208與C249之間及C227與C232之間具有橋鍵。然而，未解析主要峰且可能存在其他物種。圖21C展示藉由二硫鍵鍵結之IL-33之非還原及還原型Lys-C肽圖分析所識別之二硫鍵鍵結肽之序列。二硫鍵由兩個連字符(--)表示。Lys-C錯裂解由方形括號表示。
二硫鍵鍵結之IL-33之NMR分析
基於所報導之IL-33結構(Lingel,A.等人Structure 17,1398-1410(2009)；Liu,X.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,14918-14923(2013))，半胱胺酸殘基之接近度不足以在無顯著構形變化之情況下發生二硫鍵鍵結。為研究此，進行NMR異核多量子相干(HMQC)分析。
15 N-IL-33蛋白質之生產
使用編碼具有N端6His標籤及TEV蛋白酶裂解位點之野生型IL-33(SEQ ID.633)之DNA轉化大腸桿菌BL21 Gold細胞。經轉化細胞在補充有5g/L 15N-IsoGroTM粉末之M9基本培養基中在37℃下培養直至其達到0.6至0.8之OD600nm，此時藉由添加100mM IPTG誘導蛋白質表現。在18℃下繼續培養另外20小時，隨後藉由離心收集細胞且儲存在-80℃下。使細胞再懸浮於含有完全蛋白酶抑制劑錠劑(Roche,11697498001)、2.5U/ml全能核酸酶(merck Millipore,70746-3)及1mg/ml重組溶菌酶之50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中。再懸浮細胞使用Constant Systems細胞瓦解劑在25kpsi下溶解，且藉由在4℃下在75,000×g下離心2小時澄清。藉 由在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中之尼克爾親和層析，在50mM磷酸鈉(pH8.0)、300mM NaCl、250mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中溶離，自上清液純化IL-33。在4℃下使溶離之蛋白質與TEV蛋白酶一起培育且透析至50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中。藉由在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中之尼克爾親和層析自未裂解IL-33分離去標記蛋白質。藉由使用AKTAxpress FPLC系統(GE healthcare)在20mM磷酸鈉(pH 6.5)、100mM NaCl、5mM β-巰基乙醇中使用HiLoad 16/60 Superdex 75管柱(GE healthcare)進行尺寸排阻層析進一步純化IL-33。藉由SDS PAGE分析峰溶離份。
將含有純IL-33之溶離份合併，且藉由Nanodrop A280量測來量測濃度。使用Amicon 10,000分子量截斷旋轉濃縮器將蛋白質濃縮至9.5mg/ml最終濃度以用於NMR分析。
使含經純化之15N標記蛋白之PBS(pH 7.4)與60%IMDM培養基一起以0.28mg/ml最終蛋白質濃度在37℃下培育18小時。18小時後，使用Amicon 10,000分子量截斷旋轉濃縮器將蛋白質濃縮至0.8mg/ml濃度。隨後藉由在PBS(pH 7.4)中使用HiLoad 16/60 Superdex 75進行尺寸排阻層析來純化蛋白質。藉由SDS PAGE分析峰溶離份，且合併非聚集純溶離份。最後，使用Amicon 10,000分子量截斷旋轉濃縮器將蛋白質濃縮至1.8mg/ml(100μM)濃度以用於NMR分析。
NMR分析
在配備有含Z軸梯度之5mm TCI低溫探針之Bruker Avance 600MHz光譜儀操作Topspin 2.3上在298K下記錄NMR光譜。如所描述藉由添加5%氧化氘製備15N標記之IL33 WT樣品以使樣品鎖定。使用sofast HMQC脈衝序列(Schanda,P；Brutscher,B；Very fast two- dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds,J.Am.Chem.Soc.(2005)127,8014-5)以(F2×F1)1024×64複點(狀態-TPPI模式)、9615×1460Hz吹掃寬度、53.4ms×43.8ms採集時間採集例示性1H-15N相關光譜。
圖22A展示對經IMDM處理之WT IL33之SDS PAGE分析。SDS PAGE展示在濃縮用於NMR之前及之後還原及非還原型經IMDM處理之WT IL33。
圖22B展示WT IL33之NMR分析。在IMDM培養基處理之前及之後0.1mM經15N標記之IL33 WT之1H-15N HMQC光譜的覆蓋分別以黑色及紅色標繪。兩個光譜之比較指示在IMDM處理之後完全不同且不太有序之結構。
圓二色性(CD)光譜學
為確認構形變化及進一步研究，進行圓二色性(CD)光譜學分析。
在Jasco-815儀器(Easton,Maryland)上進行遠UV及近UV CD分析。對於遠UV CD，在10mM磷酸鹽緩衝溶液(pH=6.9)中在20℃下分別在redIL-33及DSB IL-33之0.14mg/mL及0.12mg/mL之樣品濃度下在1mm路徑長度光析槽中在180nm至260nm波長範圍內記錄光譜。對於近UV CD，在DPBS緩衝溶液中在20℃下分別在redIL-33及DSB IL-33之1.38mg/mL及0.89mg/mL之樣品濃度下在10mm路徑長度光析槽中在260nm至350nm波長範圍內記錄光譜。記錄緩衝溶液之CD光譜且自所有樣品光譜減去以校正儀器、光析槽及基線效果。CD Pro軟體用於使光譜解卷積成二級結構元素。
圖22C：近UV圓二色性(CD)光譜學。在260nm至350nm波長範圍內記錄光譜。最終光譜為4次掃描之平均值。芳族胺基酸及二硫化物吸收帶係改編自Kelly(Kelly S.M.等人How to study proteins by Circular Dichroism.Biochimica et Biophysica Acta,1751,119-139(2005))。所觀測到的Trp吸收周圍橢圓率差異與單獨色胺酸(W193)之環境變化一致，展現在此區域中還原型IL-33與DSB IL-33之間的三級結構變化。在大約260nm強度內之差異與自二硫鍵形成引入額外發色團一致。
圖22D：IL-33之關鍵特徵。Trp193、半胱胺酸及ST2結合位點(Liu,X.等人Structural insights into the interaction of IL-33 with its receptors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,14918-14923(2013))指示於經解析之IL-33結構中(Lingel 2009)。
圖22E：遠UV圓二色性(CD)光譜學。在190nm至260nm波長範圍內記錄光譜。最終光譜為8次掃描之平均值。遠UV光譜與如先前此蛋白質家族所見之顯著β-摺疊二級結構一致。(Chang B.S.等人，Formation of an active dimer during storage of interleukin-1 receptor antagonist in aqueous solution.Biophysical Journal.71,3399-3406(1996)；Craig S.等人Conformation,Stability and folding of Interleukin1β.Biochemistry.26,3570-3576(1987)；HaileyK.L.等人Pro-interleukin(IL)-1β shares a core region of stability as compared with mature IL-1β while maintaining a distinctly different configurational landscape.J.Biol.Chem.284.26137-26148(2009)；Hazudat D.等人Purification and characterisation of Human Recombinant Precursor Interleukin 1β.J.Biol.Chem.264,1689-1693(1989)；Meyers C.A.等人，Purification and characterization of Human recombinant interleukin-1β.J.Biol.Chem.262,11176-11181(1987))光譜顯著不同，展現DSB IL-33相對於還原型IL-33之二級結構變化。
CD光譜指示IL-33型式之間的顯著構形變化。redIL-33光譜與所公佈之資料一致。DSB-IL-33光譜與不同於還原型式之結構化蛋白一 致。為映射可在還原型IL-33與DSB-IL-33之間大部分改變之區域，吾人進行氫/氘交換質譜。
氫/氘交換質譜(HDX-MS)
使蛋白質在磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)中稀釋至3.5μM。此儲備液用於藉由用氘化(10mM磷酸鈉，pD 6.6)水性溶劑稀釋10倍來引發標記實驗。進行初始映射實驗以將質譜種類分配給IL33胃蛋白酶肽序列。此主要如所描述進行21。簡言之，質子化稀釋蛋白與淬滅溶液(100mM磷酸鉀(pH 2.55)、0.1M TCEP，1℃)以1：1混合，使得最終混合物pH為2.55。將淬滅蛋白注射至具有固定胃蛋白酶管柱(2.0×30mm；Poroszyme,Life Technologies)、C18捕獲管柱(VanGuard ACQUITY BEH 2.1×5mm；Waters)及分析C18管柱(1.0×100mm ACQUITY BEH；Waters)之Waters HDX Manager中。移動相為在H2O(A)中0.1%甲酸及在ACN(B)中0.1%甲酸，使得其pH為2.55。將蛋白質應用於胃蛋白酶且以100μL/min緩衝劑A捕獲管柱，且以3-40% 40μL/min B線性梯度自分析管柱溶離。肽序列係藉由Protein Lynx Global Server(Waters)3.0.2及DynamX 3.0(Waters)自MSE片段資料分配。關於測序，除僅將質譜儀設置為MS掃描之外，採集標記資料。在DynamX及MatLab(Mathworks)中分析肽含量資料。
圖23展示還原型IL-33及DSB IL-33之氫交換質譜(HX-MS)分析。圖23A比較還原型IL-33(左圖)及DSB IL-33(右圖)中之部分氫交換(氘)。出於比較目的，在兩種情況下將資料映射至所公佈之IL-33結構上(lingel 2009)。不可獲得資料(HX-MS資料)之序列覆蓋間隙以灰藍色突出顯示。半胱胺酸殘基之側鏈顯示為棒。圖23B展示與ST2結合位點重疊之差示HX-MS資料之結構模型(紅色及洋紅色)。(Liu 2013)暗藍色指示DSB IL-33中之氫交換相對於還原型IL-33增加之區域。ST2結合位點1位於具有最大H/D交換差異之區域且有可能結構已改變。 還原型IL-33對比DSB IL-33與ST2之結合(BIAcore)
二硫鍵鍵結之IL-33有可能為極其不同於還原ST2-結合IL-33型式之結構(圖22、23)，且向二硫鍵鍵結型式之轉化與功能性活性之損失相關(圖17C)。為研究此，藉由BIAcore分析測試二硫鍵鍵結之IL-33型式結合ST2之能力。使用BIAcore 2000(GE healthcare)藉由表面電漿子共振確定IL-33與ST2胞外域之直接結合。在CM5感測器晶片(GE healthcare BR-1003-99)上使用抗人類Fc捕捉(GE healthcare BR-1003-39)經由Fc標籤固定ST2，得到大約150 RU穩定表面。使IL-33以30μl/min流經表面三分鐘以確定結合速率。藉由使緩衝劑以30μl/min流動15分鐘來量測解離。使用BIA評估軟體解譯感測器圖譜，且使用1：1(朗格繆爾)結合模型使用雙參考減去感測器圖譜確定動力學。
圖24A展示結合於ST2之redIL-33。展示7.8nM至0.24nM之感測器圖譜，給出0.2nM KD。
圖24B展示結合於ST2之二硫鍵鍵結之IL-33(IL33-DSB)。展示500nM至0.24nM之感測器圖譜未觀測到明顯結合。
ST2結合及活性之損失使吾人假設氧化可為終止IL-33活性及限制活體內ST2依賴性免疫反應之持續時間的機制。
IL-33型式之偵測
為確定二硫鍵鍵結IL-33型式確實存在於活體內，吾人使用三種不同商業IL-33偵測試驗(2種人類IL-33及一種小鼠IL-33)。將人類及小鼠IL-33 Duoset ELISA(RnD Systems)轉化為MSD格式(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)。捕捉抗體之塗佈濃度為如下：抗小鼠IL-33pAb 37.5μg/ml；抗人類IL-33pAb 18μg/mL。在PBS中用0.03%曲拉通X-100稀釋捕捉抗體，且將5μl點塗至標準結合培養盤(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)上之各孔中心中且在室溫下保持乾燥隔夜。培養盤在PBS-吐溫中洗滌3次，且藉由密封培養盤用25μl試驗 稀釋劑阻斷且在震盪(450rpm)下在室溫下培育30分鐘。將25μl樣品或在試驗稀釋劑中稀釋之校準劑轉移至經阻斷之分析培養盤，在震盪(450rpm)下在室溫下培育2小時。培養盤在PBS-吐溫及25μl偵測試劑(偵測抗體加抗生蛋白鏈菌素SulfoTag，均在抗體稀釋劑中稀釋至1μg/ml)中洗滌3次。將培養盤密封且在震盪下在RT下培育1小時。培養盤在PBS-吐溫中洗滌3次。添加在蒸餾水中2倍稀釋之150μl讀取緩衝劑T。在15分鐘內讀取培養盤(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)。
根據製造商之說明書進行Millipore人類IL-33試驗(目錄號HTH17MAG-14K批號2159117)。簡言之，IL-33標準品及樣品在試驗緩衝劑中稀釋且在震盪(500rpm)、避光下在室溫下與珠粒一起培育1小時。移出孔內含物且用200μL洗滌緩衝劑洗滌2次。每孔添加25μL偵測抗體，且在室溫下培育培養盤1小時。添加25μL抗生蛋白鏈菌素-PE(不洗滌)，且在震盪(850rpm)且避光下培育培養盤另外30分鐘。移出孔內含物且用200μL洗滌緩衝劑洗滌2次。使樣品再懸浮於125μL試驗緩衝劑中，覆蓋且在850rpm下震盪30秒。在Bio-Plex 200(BioRad)上分析樣品。在低RP1下讀取培養盤，計數50個珠粒/區域(區域44)，雙重偵測閘設置為5000(低)及25000(高)。
圖25展示對偵測還原及二硫鍵鍵結之IL-33型式之三種商業IL-33 ELISA試驗的分析。亦展示ST2對還原及二硫鍵鍵結型式之試驗信號的干擾之影響。圖25A及B展示兩種商業人類IL-33試驗顯著偵測到二硫鍵鍵結之IL-33型式(IL33-DSB)，表明此為迄今為止其他人在人類離體樣品中已量測之主要種類。『還原型』而非氧化型/二硫鍵鍵結之IL-33試驗信號可藉由添加sST2消除。圖25C展示小鼠IL-33試驗，其偵測到還原及氧化型式之小鼠IL-33。『還原型』而非氧化型IL-33試驗信號可藉由添加sST2消除。
由於吾人不能識別對人類IL-33之還原ST2活性型式具有特異性之 商業試驗，吾人研發吾人之自身新穎試驗。使用IL330425 mAb(SEQ ID NO.62及67)或IL330004 mAb(SEQ ID NO.12及17)作為捕捉抗體。分別用生物素標記sST2.Fc(R&D systems)或生物素標記IL330425(SEQ ID NO.62及67)偵測所捕捉之IL-33。在PBS中用0.03%曲拉通X-100將捕捉抗體稀釋至150μg/mL，且將5μl點塗至標準結合培養盤(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)上之各孔中心中且在室溫下保持乾燥隔夜。培養盤在PBS-吐溫中洗滌3次，且藉由密封培養盤用25μl試驗稀釋劑阻斷且在震盪(450rpm)下在室溫下培育30分鐘。將25μl樣品或在試驗稀釋劑中稀釋之校準劑轉移至經阻斷之分析培養盤，在震盪(450rpm)下在室溫下培育2小時。培養盤在PBS-吐溫及25μl偵測試劑(偵測抗體加抗生蛋白鏈菌素SulfoTag，均在抗體稀釋劑中稀釋至1μg/ml)中洗滌3次。將培養盤密封且在震盪下在RT下培育1小時。培養盤在PBS-吐溫中洗滌3次。添加在蒸餾水中2倍稀釋之150μl讀取緩衝劑T。在15分鐘內讀取培養盤(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)。
圖26A、B展示對偵測還原型IL-33具有特異性之ELISA試驗。未觀測到二硫鍵鍵結型式之偵測。
轉化為二硫鍵鍵結之IL-33型式之時間過程
使用如上文所描述偵測不同IL-33型式之試驗來監測自redIL-33轉化為其二硫鍵鍵結型式之時間過程。在100%人類血清、PBS/1% BSA或IMDM/1% BSA中在37℃下培育10μg/mL去標記redIL-33。在時間點t=0、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時及24小時，移出10μl等分試樣且添加至90μl PBS/1% BSA(1/10稀釋至1μg/ml)中，將此分為3×30μl等分試樣且在-80℃下儲存前快速冷凍於乾冰上。亦在ELISA分析之前立即新鮮製備t=0樣品作為冷凍/解凍循環之對照。使用上文所描述之人類MSD(R&D Systems)及 IL33004/IL330425-生物素試驗分析樣品以分別量測二硫鍵鍵結及還原型IL-33。總之，此等試驗允許監測還原型IL-33向二硫鍵鍵結之IL-33型式的轉化。
為確認ELISA之結果，藉由西方墨點法分析時間過程樣品中之IL-33。在還原或非還原條件下對樣品進行SDS-PAGE。在1倍NuPAGE凝膠裝載緩衝劑(Invitrogen)中製造樣品，且在90℃下變性3分鐘。還原型樣品含有2% β-巰基乙醇。根據製造商之說明書使用MOPS操作緩衝劑(Invitrogen)在NuPAGE Novex 12% Bis-Tris微型凝膠(Invitrogen)上操作樣品。還原及非還原型樣品在單獨凝膠上操作。每個泳道裝載100pg IL-33。將蛋白質轉移至硝化纖維膜(Invitrogen目錄號IB3010-02)，且用抗IL-33 pAb(R&D systems)藉由西方墨點法偵測。
圖27展示在IMDM或人類血清中培育之人類IL-33之時間過程。圖27A：使用IL-33 ELISA(IL33004/IL330425-生物素及人類R&D systems MSD試驗)分別偵測還原型及二硫鍵鍵結IL-33。圖27B：使用西方墨點分析偵測還原型及二硫鍵鍵結IL-33型式。快速發生向二硫鍵鍵結IL-33型式之轉化，在1-2小時內有50%轉化。在ELISA及西方墨點分析中，還原型IL-33之消失與氧化型IL-33之出現密切相關。
人類化IL-33轉殖基因小鼠之產生
為研究內源性IL-33之行為及生命週期，吾人使用小鼠IL-33基因經人類IL-33基因置換之轉殖基因小鼠。如下文所描述產生人類化IL-33轉殖基因小鼠。簡言之，使小鼠基因組片段(獲自C57BL/6J RPCIB-731 BAC庫)、人類基因組片段(獲自人類RPCIB-753 BAC庫)及所選特徵(諸如重組位點及選擇標記)組合形成靶向載體(資料未展示)。
靶向載體經BstBI線性化且電穿孔至TaconicArtemis Balb/cJ ES細胞株(Balb/c.2)中，且用嘌呤黴素(陽性選擇)及更昔洛韋(Gancyclovir)(陰性選擇)選擇ES細胞純系。隨後藉由PCR與南方分析之組合來篩選 所得耐嘌呤黴素ES細胞純系以識別正確靶向ES純系。使此等純系擴展且冷凍於液氮中。
在投與激素之後，使超排卵C57BL/6雌性與C57BL/6雄性配對。在dpc 3.5下自子宮分離囊胚。對於顯微注射，將囊胚置於一滴DMEM(在礦物油下含15% FCS)中。使用內徑為12-15微米之平頭壓電致動顯微注射吸管將10-15個靶向BALB/c ES細胞注射至各囊胚中。在回收之後，將8個經注射囊胚轉移至交配後2.5天假孕NMRI雌性之各子宮角。藉由ES細胞與C57BL/6宿主之毛色比重(白色/黑色)在嵌合體(G0)中量測嵌合。使高度嵌合小鼠育種菌株BALB/cJBomTac雌性突變體以用於呈現Flp重組酶基因(Flp-Deleter菌株)。藉由白色菌株BALB/c後代(G1)之呈現來識別藉由毛色之生殖系傳播。實際生殖系傳播係使用對靶向對偶基因(資料未展示)具有特異性之引子藉由PCR基因分型確認。
活體內氧化還原IL-33型式之存在
先前已描述小鼠中互隔交鏈孢黴菌(Alternaria alternata)誘導之氣管炎症的模型(Kouzaki等人J.Immunol.2011,186：4375-4387；Bartemes等人J Immunol,2012,188：1503-1513)。雄性或雌性野生型或人類化IL-33小鼠(6-10週)用異氟醚簡單麻醉，且經鼻內投與總體積為50μl之25μg互隔交鏈孢黴菌(ALT)提取物(Greer,Lenoir,NC)或媒劑。在ALT攻擊之後多個時間點，小鼠用戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)最終麻醉，隨後進行支氣管肺泡灌洗術(BAL)。經由氣管套管藉由灌洗(0.3ml、0.3ml及0.4ml)收集支氣管肺泡灌洗術流體(BALF)。使BALF離心，且使用上文所描述之試驗分析上清液之氧化還原IL-33型式之存在。所有工作均在適當項目許可證授權下根據英國內政部(UK Home Office)道德與管理標準進行。
圖28展示使用多個ELISA試驗之組合對在ALT鼻內攻擊之後在不 同時間點收集之人類化IL-33小鼠之BALF的分析。使用(A)Millipore、(B)R&D systems及(C)IL330425/sST2-生物素試驗在sST2存在或不存在下量測IL-33(左邊圖)。將在sST2存在下之信號(來自所消除之還原型IL-33溶離份之信號)與二硫鍵鍵結之IL-33標準進行比較以定量二硫鍵鍵結之IL-33的含量。還原型IL-33信號被計算為相對於還原型IL-33標準所定量之在ST2存在及不存在下在IL-33量測之間的信號差值。還原型IL-33之估值展示於右邊圖上。所有試驗展示所釋放之IL-33顯著呈其還原型式，在5min與30min之間達到最大，隨後快速下降，截至120分鐘變得不可偵測。反之，IL-33-DSB自時間0逐漸增加，在30-120分鐘達到峰值且截至24小時消失。此等資料與IL-33以還原型式釋放且隨後在活體內快速氧化成IL33-DSB之模型一致。
圖29展示對在ALT鼻內攻擊之後在不同時間點收集之野生型BALB/c小鼠之BALF的分析。圖29A在sST2存在或不存在下使用小鼠IL-33 ELISA(R&D systems)量測IL-33(經培養基處理之小鼠IL-33用作標準曲線)。圖29B將在sST2存在下之信號(來自所消除之還原型IL-33溶離份之信號)與經培養基處理之小鼠IL-33標準進行比較以定量氧化型IL-33的含量。還原型IL-33信號被計算為相對於還原型小鼠IL-33標準所定量之在ST2存在及不存在下在IL-33量測之間的信號差值。資料展示所釋放之IL-33顯著呈其還原型式，在15分鐘達到峰值，隨後快速下降，截至120分鐘變得不可偵測。反之，IL-33-DSB自時間0逐漸增加，在45-60分鐘達到峰值且截至24小時消失。此等資料與IL-33以還原型式釋放且隨後在活體內快速氧化成IL33-DSB之模型一致。
實例5 抗IL-33抗體之表徵 H338L293引起構形變化
單株抗體H338L293(SEQ ID NO 182及187)(其產生描述於實例2及3中)為IL-33之異位調節劑。IL-33可使構形顯著改變為二硫鍵鍵結型式(如實例4中所描述)。以下實驗展現H338L293 mAb似乎使IL-33分子不穩定，促進其展開且加速轉化為二硫鍵鍵結型式。本文所用之試劑及蛋白質修飾如先前實例中所描述。
寶石橙試驗(Sypro orange assay)
寶石橙非特異性結合於疏水性表面，且水強烈淬滅寶石橙之螢光。在蛋白質展開時，暴露之疏水性表面結合染料，導致螢光增加。使5μM抗體與20μM redIL-33在25℃下在由5000×儲備液(Life technologies S-6650)在1×DPBS中稀釋之8×寶石橙染料存在下一起培育。使用Chromo4即時偵測器(Bio-rad)每隔一分鐘量測螢光(激發490nm及發射575nm)。吾人觀測到培育redIL-33與H338L293抗體而非單獨redIL-33或抗體，螢光信號增加，指示蛋白質展開。
圖30A展示在8×寶石橙染料存在下在25℃下使5μM抗體與20μM redIL33培育之後100分鐘之相對螢光單位。在redIL-33 H338L293而非IL330004或對照mAb存在下，螢光信號增加指示蛋白質展開。
圖30B展示在8×寶石橙染料存在下在25℃下使不同濃度之H338L293與20μM redIL33培育之後隨時間推移之相對螢光單位。螢光信號隨著抗體濃度增加而增加。
SDS-PAGE電泳
為判定H338L293是否可能影響二硫鍵鍵結之IL-33，藉由比較還原與非還原型SDS-PAGE分析在H338L293存在下監測IL-33。在含有1.5mg/ml H338L293 mAb、NIP228 mAb或未添加mAb之PBS/0.1% BSA中培育100μg/ml重組人類IL-33112-270(BK349)。在標準組織培養恆溫箱中在37℃下培育樣品20h。在還原及非還原條件下在Novex 12% Bis-Tris微型NuPAGE凝膠(Invitrogen)上藉由SDS-PAGE分析含有 1μg IL-33之樣品。隨後SDS-PAGE凝膠在ddH20中洗滌3×5min，在EzBlue(Sigma G1041，基於考馬斯亮藍G-250之蛋白質染色)中培育1h，且在ddH20中脫色直至凝膠之背景清晰。所有凝膠染色步驟均在擺動平台上在室溫下進行。使用Epsom數位掃描儀可視凝膠。
圖30C展示IL-33之SDS-PAGE分析。預培育IL-33與H338L293(而非對照mAb或無mAb)，在非還原條件下增加較快遷移之二硫鍵鍵結IL-33型式之存在。
IgG抑制Huvec中之NFkB信號傳導
如實例1中所描述由藉由免疫螢光染色偵測之p65/RelA NFkB亞單位之核易位評估人類臍靜脈內皮細胞中回應於IL-33之NFkB信號傳導。在多個濃度之測試抗體H338L293存在下用不同IL-33濃度刺激細胞30分鐘或6小時。
圖31展示H338L293對HUVEC上經IL-33刺激之NFkB易位的影響。此等結果展示如先前所見在刺激30分鐘之後H338L293不抑制經IL-33刺激之Huvec中p65/RelA NFkB之核易位。然而，6小時後可見抑制。結果與H338L293不能直接抑制IL-33結合於ST2但能夠在幾小時內使IL-33轉化為非ST2結合型式一致。
純化之IgG抑制IL-33與ST2結合
如實例1中所描述在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗中評估H338L293抑制FLAG®His標記之IL-33結合於ST2受體之能力。測試兩個條件。首先，完全如同實例1，同時添加抗體及IL-33至試驗中。如先前，經純化之IgG製劑在所測試濃度下不能抑制IL-33：ST2相互作用。其次，使H338L293與IL-33FLAG®His一起預培育18小時，隨後添加至試驗中。在此情況下，觀測到IL-33：ST2結合之濃度依賴性抑制。綜合而言，此等資料與隨時間推移H338L293使IL-33轉化為非ST2結合型式一致。
圖32展示在增加H338L293濃度之情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。此等結果展示H338L293僅在與配位體長期預培育之後抑制IL-33結合於ST2。
抗原決定基定位
嘗試H338L293 IgG之抗原決定基定位使得說明結合於此IgG之IL-33的模式。進行尺寸排阻層析(SEC)實驗使得觀測IL-33：IgG複合物之形成。在Agilent HP1100 HPLC上以0.5mL min-1用杜爾貝科氏PBS平衡BioSep-SES-S 2000管柱(300×7.4mm,s/n 550331-4)。使用來自二極體陣列偵測器(DAD)之280nm信號偵測峰。此等研究確認抗體-抗原複合物形成相當緩慢，耗費至少幾個小時。在允許足夠時間用於完整複合物形成之後，添加胰蛋白酶至預形成之IL-33：IgG複合物中，隨後進行SEC分析。36min胰蛋白酶消化導致主峰之保留時間增加至14.1分鐘(在未處理複合物峰溶離時間(13.6min)與完整H338L292 IgG溶離(14.4min)之間的中間)。隨後使用質譜法識別最小H338L293 IgG抗原決定基。Shimadzu MALDI-TOF MS觀測到的來自所捕捉之14.1min峰的質量為3,209Da及4,485.3Da。ABI4800 MALDI-TOF MS觀測到的質量為3,208.9Da高強度峰，亦存在次級4,486.4Da峰。所觀測到的3206-3208Da前驅體離子質量及對3,206Da前驅體離子之ABI4800 MS/MS片段化分析符合所預測的胰蛋白酶IL-33片段MLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHK。此位於如下文所展示r人類IL-33-Flag His10之總一級序列(SEQ ID NO.627)內：-
Figure 105110432-A0202-12-0219-960
所識別之肽與截斷(LSPTKDFWLHANNKEHSVELHK)及兩者之 加擾變異體一起隨後以化學方式合成且用於驗證T100 Biacore(GE Healthcare)結合研究。根據製造商之說明書使用標準胺偶合試劑使蛋白G'(Sigma Aldrich,P4689)與CM5感測器晶片(GE Healthcare)之表面共價偶合。蛋白G'表面用於經由Fc域捕捉H338L293或ST2-Fc，提供每個週期大約290 RU表面密度。使在HBS-EP+緩衝劑中製備之一系列濃度的IL33肽通過感測器晶片表面。在每次抗體注射之間使用pH 1.7及pH 1.5之兩個10mM甘胺酸洗液使表面再生。所得感測器圖譜係使用Biacore T100評估軟體2.0.3(GE Healthcare)評估且擬合為1：1朗格繆爾結合模型，提供相對結合資料。
全長合成抗原決定基肽強烈結合於H338L293 IgG而非IL-33受體(ST2-Fc)。全長及截斷合成肽均強烈結合於H338L293，但加擾全長及截斷型式並非如此。此強烈證明藉由肽切除所識別之IL-33片段不為人工產物，且表示H338L293抗原決定基之核心。使0.625-20nM截斷肽流經H338L293 IgG以估計親和力。獲得良好品質1：1擬合，給出2.36nM之KD值。
圖33展示H338L293之抗原決定基定位。頂部圖展示在H338L293用胰蛋白酶消化之前及之後的情況下對IL33：IgG複合物之SEC分析。下部圖展示由Lingel等人2009描述經確定強烈結合於IL-33結構內之顏色為黑色的H338L293之截斷肽。
實例6 Cys→Ser IL-33突變
為理解人類IL-33之四個游離半胱胺酸在其轉化為二硫鍵鍵結型式中之作用，吾人生成所有可能的Cys向Ser突變之完整圖。大部分此等突變IL-33分子與野生型IL-33相比展示相似的通過ST2之初始活性。在培養基中培育之後，突變體不顯示較快凝膠遷移，與缺乏形成2個二硫鍵之能力一致。然而，在培養基處理之後的效力損失在突變體之間變化。
生成IL-33半胱胺酸向絲胺酸突變之圖
編碼人類IL-33(112-270)、寄存編號(Swiss-Prot)O95760之成熟組分之cDNA分子及在所有組合(總計15個)中具有1、2、3或4個半胱胺酸殘基突變為絲胺酸之一系列變異體係藉由引子延伸PCR合成，且選殖至pJexpress404(DNA 2.0)中。野生型(WT)及突變IL-33編碼序列經修飾以在蛋白質之N端含有10xhis、Avitag及Xa因子蛋白酶裂解位點(MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR)。
使用編碼IL-33突變體之DNA轉化大腸桿菌BL21 Gold細胞。經轉化細胞在37℃下培養直至其達到0.3至0.5之OD600nm。培養物隨後在18℃下生長直至其達到0.6至0.8之OD600nm，此時藉由添加100mM IPTG誘導蛋白質表現。在18℃下繼續培養另外20小時，隨後藉由離心收集細胞且儲存在-80℃下。
使細胞再懸浮於含有完全蛋白酶抑制劑錠劑(Roche,11697498001)、2.5μ/ml全能核酸酶(merck Millipore,70746-3)及1mg/ml重組溶菌酶之50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中。再懸浮細胞使用Constant Systems細胞瓦解劑在25kpsi下溶解，且藉由在4℃下在75,000×g下離心2小時澄清。藉由在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中之尼克爾親和層析，在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、250mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中溶離，自上清液純化IL33。藉由在磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)中使用Superdex 75 10/300 GL管柱(GE Healthcare)進行尺寸排阻層析進一步純化IL33。藉由SDS PAGE分析峰溶離份。將含有純IL33之溶離份合併，且藉由Nanodrop A280量測來量測濃度。藉由SDS PAGE及完整質譜分析最終樣品。使蛋白質在液氮中快速冷凍。
表17. IL-33突變序列
Figure 105110432-A0202-12-0222-961
IL-33 Cys→Ser突變之活性
為檢查蛋白質完整性，在ST2依賴性信號傳導試驗中量測未處理之野生型IL-33(IL33-01)及IL-33突變體之活性。如實例1中所描述由藉由免疫螢光染色偵測之p65/RelA NFkB亞單位之核易位評估人類臍靜脈內皮細胞(Huvec)中回應於IL-33之NFκB信號傳導。為研究在細胞培養基處理之後的活性損失，使IL-33蛋白質01-16在伊斯科夫改良型杜爾貝科氏培養基(IMDM)中培育隔夜且相比於未處理蛋白質進行評估。
Figure 105110432-A0202-12-0223-962
圖34展示在用IMDM處理18小時之前及之後IL-33突變體之活性。已用培養基預處理之野生型IL-33(IL33-01)完全損失可偵測活性。所有突變體顯示效力損失比WT少。一些突變體完全免受效力損失。
人類肥大細胞之細胞因子釋放
為看見突變體在活體外較長時間點在刺激下游反應時是否更有效，使用隔夜肥大細胞IL-6產生試驗量測人類IL-33野生型及所選突變 體之活性。試驗方法描述於實例2中。資料由IL33-11例示。
圖35A展示IL33-11在刺激人類肥大細胞IL-6產生時的效力比IL-33 WT更大。使用無先前處理之IL33-01(WT)及IL33-11來刺激源自人類臍帶血之肥大細胞之不同濃度的IL-6產生，其中x軸為以莫耳濃度計之IL-33濃度且y軸為在18小時之後在上清液中偵測之IL-6含量。
活體內突變體IL-33效力
用異氟醚使雌性BALB/c小鼠(6-8週)簡單麻醉，且經鼻內投與總體積為50μl之0.1-10μg野生型人類IL-33(IL33-01,SEQ ID NO：632)、IL33-11(SEQ ID NO：643)或媒劑。在攻擊之後24小時，用戊巴比妥鈉使小鼠最終麻醉，隨後進行支氣管肺泡灌洗術(BAL)。收集BALF且如實例4中所描述進行分析。
圖35B展示鼻內投與IL33-11雙突變體相比於天然IL-33僅需要多達十分之一蛋白質用於等效ST2依賴性IL-5反應。此與小鼠肺環境中相比於野生型IL-33之更快速不活化之長期突變體活性一致。
IL33-11之NMR分析
為研究IL33-11與野生型人類IL-33蛋白質(IL33-01)之間的構形差異，進行NMR分析。
15 N-IL-33蛋白質之生產
使用編碼具有N端6His標籤及TEV蛋白酶裂解位點之野生型IL-33(SEQ ID.633)之DNA轉化大腸桿菌BL21 Gold細胞。經轉化細胞在補充有5g/L 15N-IsoGroTM粉末之M9基本培養基中在37℃下培養直至其達到0.6至0.8之OD600nm，此時藉由添加100mM IPTG誘導蛋白質表現。在18℃下繼續培養另外20小時，隨後藉由離心收集細胞且儲存在-80℃下。使細胞再懸浮於含有完全蛋白酶抑制劑錠劑(Roche,11697498001)、2.5U/ml全能核酸酶(merck Millipore,70746-3)及1mg/ml重組溶菌酶之50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪 唑、5mM β-巰基乙醇中。再懸浮細胞使用Constant Systems細胞瓦解劑在25kpsi下溶解，且藉由在4℃下在75,000×g下離心2小時澄清。藉由在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中之尼克爾親和層析，在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、250mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中溶離，自上清液純化IL-33。在4℃下使溶離之蛋白質與TEV蛋白酶一起培育且透析至50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中。藉由在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM β-巰基乙醇中之尼克爾親和層析自未裂解IL-33分離去標記蛋白質。藉由使用AKTAxpress FPLC系統(GE healthcare)在20mM磷酸鈉(pH 6.5)、100mM NaCl、5mM β-巰基乙醇中使用HiLoad 16/60 Superdex 75管柱(GE healthcare)進行尺寸排阻層析進一步純化IL-33。藉由SDS PAGE分析峰溶離份。將含有純IL-33之溶離份合併，且藉由Nanodrop A280量測來量測濃度。使用Amicon 10,000分子量截斷旋轉濃縮器將蛋白質濃縮至1.8mg/ml(100μM)最終濃度以用於NMR分析。
NMR分析
在配備有含Z軸梯度之5mm TCI低溫探針之Bruker Avance 600MHz光譜儀操作Topspin 2.3上在298K下記錄NMR光譜。如所描述藉由添加5%氧化氘製備15N標記之IL33 WT樣品以使樣品鎖定。使用sofast HMQC脈衝序列(Schanda,P；Brutscher,B；Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds,J.Am.Chem.Soc.(2005)127,8014-5)在(F2×F1)1024×64複點(狀態-TPPI模式)、9615×1460Hz吹掃寬度、53.4ms×43.8ms採集時間下採集例示性1H-15N相關光譜。
圖36展示0.1mM經15N標記之IL33-01及IL33-11之1H-15N HMQC 光譜覆蓋分別以黑色及紅色標繪。指示相關殘基之分配。資料展示峰正如預期在C208及C259周圍移位。然而，T185至A196存在比預期更多的峰移位，可能指示構形變化。
實例7 使用IL33-11分離及識別抗IL-33抗體
Cys→Ser突變IL-33蛋白質使IL-33以其還原型式穩定，且具有不同於野生型之構形(如實例6中所描述)。突變蛋白可提供不同抗體抗原決定基之可用性或抗原決定基之更大長壽/穩定性，且可因此適用於分離中和IL-33抗體，尤其還原IL-33型式。此實例使用抗氧化突變IL33-11蛋白分離噬菌體呈現之IL-33抗體。
重組蛋白
藉由轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞產生N端標記His10/Avitag IL33-01(WT,SEQ ID NO.632)、N端標記His10/Avitag IL33-11(C208S、C259S，SEQ ID 643)及N端標記His10/Avitag獼猴IL-33(SEQ ID 649)。在自體誘導培養基(隔夜ExpressTM自體誘導系統1，Merck Millipore,71300-4)中在37℃下培養經轉化細胞18小時，隨後藉由離心收集細胞且儲存在-20℃下。使細胞再懸浮於含有完全蛋白酶抑制劑混合物錠劑(Roche,11697498001)、2.5μ/ml全能核酸酶(merck Millipore,70746-3)及1mg/ml重組溶菌酶之BugBuster(Merck Millipore,70921-5)中。藉由在4℃下在75,000×g下離心2小時使細胞溶解物澄清。藉由在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、20mM咪唑中之尼克爾親和層析，在50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl、250mM咪唑中溶離，自上清液純化IL-33蛋白質。藉由在磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)中使用Superdex 75 10/300 GL管柱進行尺寸排阻層析進一步純化IL-33。藉由SDS PAGE分析峰溶離份。將含有純IL-33之溶離份合併，且藉由Nanodrop A280量測來量測濃度。藉由SDS PAGE分析最終樣品。
實例1中所描述之人類ST2載體經修飾以含有具有C端Flag-His標籤之人類ST2 ECD(SEQ ID NO 650)。
Figure 105110432-A0202-12-0227-963
蛋白質修飾
遵循製造商之方案使用生物素連接酶(BirA)(Avidty,Bulk BirA)對含有Avitag序列基元(GLNDIFEAQKIEWHE)之蛋白質進行生物素標記。如實例1中所描述使用EZ連接磺基-NHS-LC-生物素(Thermo/Pierce,21335)經由游離胺對本文所用之所有IgG及經修飾之無Avitag蛋白質進行生物素標記。
選擇
基本上如實例1中所描述進行選擇但使用IL33-11 C208S、C259S突變蛋白。簡言之，使scFv-噬菌體粒子與生物素標記重組IL-33-11溶液一起培育(經由Avi標籤進行生物素標記)。粒子與100nM生物素標記重組IL33-11一起培育2小時。隨後遵循製造商之建議在經抗生蛋白鏈菌素塗佈之順磁珠粒(Dynabeads®,M-280)上捕捉與抗原結合之scFv。在一系列洗滌週期中使用PBS-吐溫洗掉未結合噬菌體。將保留在抗原上之噬菌體粒子溶離，感染細菌且獲救使得用於下一輪選擇。在濃度降低之生物素標記IL33-11(50nM及25nM)存在下再進行兩輪選擇。
未純化scFv抑制IL-33與ST2結合
使來自在上文所描述之兩輪或三輪選擇之後的選擇輸出之代表 性數目的個別純系在96孔培養盤中生長。ScFv在細菌周質中表現(Kipriyanov等人，J Immunol Methods 200(1-2)：69-77(1997))，且在基於均相FRET(螢光共振能量轉移)HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)之IL-33：ST2結合試驗中針對其抑制活性進行篩選。基本上，方法類似於實例1中所描述之彼等方法。在此試驗中，樣品與FLAG®His標記之人類ST2競爭結合於生物素標記人類IL33-01(IL33-01,SEQ ID No.632)(野生型)或生物素標記人類IL33-11(IL33-11,SEQ ID No.643)。
藉由添加5微升各抗體測試樣品稀釋液至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試未純化抗IL-33抗體樣品對生物素標記IL-33結合FLAG®His標記ST2之抑制。接著，製備含有4nM人類FLAG®His標記ST2及5nM抗FLAG® XL665偵測劑(Cisbio International,61FG2XLB)之溶液，且添加2.5微升混合物至試驗培養盤中。此後添加含有2.4nM生物素標記人類IL33-01或IL33-11以及1.5nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA,K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育1小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)在620nm及665nm發射波長下讀取時差式螢光。培養盤在4攝氏度下培育另外16小時(隔夜)，且再次讀取時差式螢光。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記人類IL33-01或IL33-11與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。如實例1中所描述分析資料。
純化之scFv抑制IL-33與ST2結合
對展示作為未純化周質提取物在兩個時間點對IL-33：ST2相互作用之抑制效果之單鏈Fv純系進行DNA測序(Osbourn等人， Immunotechnology 2(3)：181-96(1996)；Vaughan等人，Nat Biotechnol 14(3)：309-14(1996))。獨特scFv再次在細菌中表現且藉由親和層析純化(如WO01/66754中所描述)。此等樣品之效力係藉由經純化製劑之稀釋系列與FLAG®His標記之人類ST2競爭結合於如上文所描述之生物素標記IL33-01或生物素標記IL33-11來確定。試驗培養盤在室溫下培育1小時(1小時培育)，或試驗培養盤在室溫下培育1小時隨後在4攝氏度下培育16小時(隔夜培育)。選擇能夠在兩個時間點抑制IL-33：ST2相互作用之經純化之scFv製劑用於轉化為IgG格式。
圖37A：展示在1小時培育之後在增加IL-33 scFv抗體33v20064濃度之情況下對由人類IL-33-01結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
圖37B：展示在1小時培育之後在增加IL-33 scFv抗體33v20064濃度之情況下對由IL33-11結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
圖37C：展示在隔夜培育之後在增加IL-33 scFv抗體33v20064濃度之情況下對由人類IL-33-01結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
圖37D：展示在隔夜培育之後在增加IL-33 scFv抗體33v20064濃度之情況下對由IL33-11結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
scFv重新格式化為IgG1
如實例1中所描述將能夠抑制IL-33：ST2相互作用之經純化之scFv製劑轉化為完整免疫球蛋白G1(IgG1)抗體格式。抑制程度類似於或大於IL330004之抗體(實例1，SEQ ID No.12及17)直接用於進一步分析。該等抗體由33v20064例示。對應於抗體33v20064之不同區域的SEQ ID NO.展示於表20中。
Figure 105110432-A0202-12-0230-964
純化之IgG抑制IL-33與ST2結合
在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗(其原理描述於上文中)中評估抗IL-33抗體抑制生物素標記IL-33-01結合於FLAG®-His標記之ST2受體之能力。藉由經純化IgG之稀釋系列與人類FLAG®-His標記之ST2競爭結合於人類生物素標記人類IL-33-01(SEQ ID No.632)來確定經純化之IgG製劑的活性。
圖38A：展示在1小時培育之後在增加33v20064 IgG1抗體濃度之情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
圖38B：展示在隔夜培育之後在增加33v20064 IgG1抗體濃度之情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
IgG抑制Huvec中之IL-6產生
評估33v20064對HUVEC中IL-33刺激之IL-6產生的抑制，其方法描述於實例2中。使用His-Avi人類IL-33野生型(IL33-01,SEQ ID No.632)(30ng/mL)或His-Avi突變IL-33(IL33-11,SEQ ID No.643)(30ng/mL)在不同濃度之測試抗體存在下刺激HUVEC。
圖39A：展示抗體33v20064相比於IL330004及抗NIP IgG1陰性對照抗體NIP228對IL33-01(WT)刺激之HUVEC IL-6產生之抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應%。33v20064展示在高抗體濃度下對WT IL-33反應之部分抑制，而IL330004展示無效果。
圖39B：展示抗體33v20064相比於IL330004及抗NIP IgG1陰性對 照抗體NIP228對IL33-11刺激之HUVEC IL-6產生之抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應%。33v20064相比於IL330004展示對IL33-11突變體刺激之IL-6產生之更完全抑制。
抗IL-33抗體之交叉反應性
使用基於均相FRET(螢光共振能量轉移)HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)之IL-33：mAb結合試驗來確定抗IL-33抗體33v20064之交叉反應性。在此試驗中，樣品與生物素標記人類IL-33-01(SEQ ID No.632)競爭結合於DyLight標記之33v20064 IgG。
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藉由添加5微升各IL-33樣品稀釋液至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試人類、獼猴及小鼠IL-33 FLAG®His(實例1中所描述)對人類IL-33結合於DyLight標記之33v20064之抑制。接著，製備含有20nM DyLight標記之33v20064的溶液，且添加2.5微升至試驗培養盤(按照製造商之說明書使用套組(Innova Biosciences,326-0010)標記)中。此後添加含有1.2nM生物素標記人類IL-33-01以及1.5nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA,K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育1小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)在620nm及665nm發射波長下讀取時差式螢光。藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值分析資 料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干擾。隨後使用方程式2計算各樣品之△F%。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記人類IL-33與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合%。藉由使用四參數對數方程式(方程式4)之曲線擬合使用GraphPad Prism軟體測定IC50值。此等結果展現33v20064與獼猴IL-33交叉反應。而33v20064不展示與小鼠IL-33競爭。
圖40A：展示在增加測試蛋白之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33-01結合於DyLight標記之33v20064所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之測試樣品濃度且y軸為特異性結合%。在人類及獼猴而非小鼠IL-33之情況下觀測到FRET信號之抑制。
抗IL-33抗體之選擇性
使用基於均相FRET(螢光共振能量轉移)HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)之IL-33：mAb結合試驗來確定抗IL-33抗體33v20064之選擇性。在此試驗中，樣品與生物素標記His-Avi人類IL-33(IL33-01,SEQ ID No.632)競爭結合於野生型DyLight標記之33v20064 IgG。如上文所描述測試人類IL-1 α及人類IL-1 β對生物素標記IL-33-01結合DyLight標記之33v20064的抑制。此等結果展現33v20064不展示與人類IL-1 α或IL-1 β競爭。
圖40B：展示在增加測試蛋白之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33-01結合於DyLight標記之33v20064所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之測試樣品濃度且y軸為特異性結合%。在人類IL-1 α或IL-1 β之情況下未觀測到FRET信號之抑制。
實例8 抗IL-33 Ab 33v20064之優化 33v20064之生殖系化構架區
將親本抗體33v20064之VH及VL域之胺基酸序列與IMGT資料庫 (Lefranc,M.P.等人Nucl.Acids Res.2009.37(Database issue)：D1006-D1012)中之已知人類生殖系序列進行比對，且藉由序列相似性識別最接近生殖系。對於33v20064抗體譜系之VH域，此為IGHV3-23*01。對於VL域，其為IGLV3-1。在33v20064上進行生殖系化，隨後進行親和力成熟過程。不考慮保持不變之維尼爾殘基(Foote 1992)，在不同於生殖系之33v20064 VL域之構架中存在6個殘基，用適當突變誘發引子使用Kunkel突變誘發方法(Clackson,T.及Lowman,H.B.Phage Display-A Practical Approach,2004.Oxford University Press)使其中5個恢復至最接近生殖系序列。此生殖系化之產物為33_640001。序列ID號描述於表22中。
Figure 105110432-A0202-12-0233-966
純化之scFv抑制IL-33與ST2結合
將33_640001之活性與其非生殖系化親本33v20064進行比較。如實例7中所描述在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗中評估scFv抗體抑制生物素標記His Avi人類IL-33(IL33-01,SEQ ID No.632)結合於FLAG®-His標記之ST2受體的能力。
圖41A：展示在1小時培育之後在增加scFv抗體濃度之情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。33_640001具有等效於其非生殖系化親本之活性。
圖41B：展示在隔夜培育之後在增加scFv抗體濃度之情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫 耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。33_640001具有等效於其非生殖系化親本之活性。
親和力成熟
使用靶向突變誘發方法及基於親和力之噬菌體呈現選擇來優化33v20064。使用如所描述(Clackson 2004)之標準分子生物學技術藉由寡核苷酸導引之可變重鏈(VH)互補決定區3(CDR3)及輕鏈(VL)CDR3突變誘發來形成來源於生殖系化親本(33_640001)之大scFv噬菌體庫。對於VH CDR3，亦包括在Kabat定義之CDR之前的兩個維尼爾位置(亦即VH位置93及94)以用於在靶向突變誘發方法中之潛在優化。對庫進行基於親和力之噬菌體呈現選擇使得選擇對人類IL-33具有較高親和力之變異體。此等選擇係藉由使生物素標記His-Avi人類IL-33野生型(IL33-01,SEQ ID NO.632)及生物素標記His Avi突變IL-33(IL33-11,SEQ ID NO.643)抗原在依序輪回中交替或僅生物素標記IL33-11抗原在所有輪回中交替來進行。基本上如先前所描述(Thompson 1996)進行選擇。簡言之，使seFv噬菌體粒子與重組生物素標記抗原溶液一起培育。隨後遵循製造商之建議在經抗生蛋白鏈菌素塗佈之順磁珠粒(Dynabeads® M-280)上捕捉與抗原結合之scFv噬菌體。隨後如先前所描述(Osbourn,J.K.等人，Immunotechnology,1996.2(3)：第181-96頁)使所選scFv噬菌體粒子獲救，且在濃度降低之生物素標記抗原(通常50nM至10pM)存在下在五輪選擇內重複選擇過程。
亦基本上如Hanes等人所描述使用核糖體呈現技術優化33v20064(Hanes,J.等人，Methods in Enzymology，2000.328：第404-30頁)。使用親本scFv純系33v20064作為用於庫構築及轉化為核糖體呈現格式之模板使得後續選擇。在DNA層面，在5'端添加T7啟動子用於有效轉錄至mRNA。在mRNA層面，構築體含有原核核糖體結合位點(夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno sequence))。在單鏈之3'端，移除 終止密碼子且添加一部分M13噬菌體gIII(基因III)以充當新生scFv多肽與核糖體之間的間隔物(Hanes 2000)。
遵循製造商之建議使用DiversifyTM PCR(聚合酶鏈反應)隨機突變誘發套組(BD Biosciences)藉由隨機突變誘發形成來源於親本(33v20064)scFv構築體之核糖體呈現庫。選擇此易錯PCR(EP)之條件以引入平均每1000個鹼基對8.1個核苷酸變化(根據製造商)。所得EP庫隨後用於基於親和力之核糖體呈現選擇(Hanes 2000)。遵循製造商之方案使用RiboMAXTM大規模RNA生產系統(T7)(Promega)及基於大腸桿菌之無原核細胞轉譯系統在活體外表現scFv。藉由使生物素標記IL33-01及生物素標記IL33-11抗原在依序輪回中交替或僅生物素標記IL-33-11抗原在所有輪回中交替，使所產生之scFv抗體-核糖體-mRNA(ARM)複合物以溶液形式與生物素標記人類IL-33抗原一起培育。遵循製造商之建議(Dynal)在經抗生蛋白鏈菌素塗佈之順磁珠粒(Dynabeads® M-280)上捕捉特異性結合之三級複合物(IL-33：ARM)，而未結合ARM被洗掉。隨後藉由逆轉錄-PCR(RT-PCR)回收編碼結合scFv之mRNA。在濃度降低之生物素標記人類IL-33(100nM至100pM，在5輪內)之情況下對所得群體重複選擇過程以進行更多輪選擇，使得增濃且因此選擇對IL-33具有較高親和力之純系。將第3輪、第4輪及第5輪選擇之輸出次選殖至pCantab6(McCaffeerty,J.等人，Appl Biochem Biotechnol,1994.47(2-3)：第157頁)中，且如下文所描述識別改良之純系。
未純化scFv抑制IL-33與mAb結合
使來自選擇輸出之代表性數目的個別純系在96孔培養盤中生長。ScFv在細菌周質中表現(Kipriyanov等人，J Immunol Methods 200(1-2)：69-77(1997))，且在基於均相FRET(螢光共振能量轉移)HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)之IL-33：mAb結合試驗 中針對其抑制活性進行篩選。在此試驗中，樣品與DyLight標記之33v20064 IgG競爭結合於生物素標記His Avi IL-33-01(SEQ ID NO.632)或生物素標記His Avi獼猴IL-33(SEQ ID NO.649)。此類抗原決定基競爭試驗係基於如下原理：辨識與經標記之抗IL-33 IgG相似的抗原決定基之測試抗體樣品將與經標記之IgG競爭結合於生物素標記IL-33，導致試驗信號減少。
藉由添加5微升樣品至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試未純化抗IL-33抗體樣品對生物素標記His Avi IL33-01(人類)或生物素標記His Avi獼猴IL-33結合DyLight標記之33v20064之抑制。接著，製備含有2.4nM經DyLight標記之33v20064用於人類IL-33試驗且製備6nM經DyLight標記之33v20064用於獼猴試驗，且添加2.5微升至試驗培養盤(按照製造商之說明書使用套組(Innova Biosciences,326-0010標記)中。此後添加含有0.8nM生物素標記人類IL-33-01以及0.75nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於人類試驗，或含有4nM生物素標記獼猴IL-33以及1.5nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於獼猴試驗。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA,K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育1小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)在620nm及665nm發射波長下讀取時差式螢光。藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值分析資料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干擾。隨後使用方程式2計算各樣品之△F%。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記IL-33與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合 %。
在抗原決定基競爭試驗達到其靈敏度極限時，用使用中間優化之mAb 33_640027之試驗來測試未純化scFv樣品。該試驗基本上如對於33v20064競爭試驗所描述，具有以下修改：製備20nM經DyLight標記之33_640027且添加2.5微升至試驗培養盤中。此後添加含有0.32nM生物素標記人類IL-33-01以及0.75nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於人類試驗，或含有0.8nM生物素標記獼猴IL-33以及1.5nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於獼猴試驗。
純化之scFv抑制IL-33與mAb結合
對展示作為未純化周質提取物對IL-33：mAb相互作用之抑制效果之單鏈Fv純系進行DNA測序(Osbourn等人，Immunotechnology 2(3)：181-96(1996)；Vaughan等人，Nat Biotechnol 14(3)：309-14(1996))。獨特scFv再次在細菌中表現且藉由親和層析純化(如WO01/66754中所描述)。藉由經純化製劑之稀釋系列與DyLight標記之33v20064 IgG或DyLight標記之33_640027 IgG競爭結合於生物素標記His Avi IL33-01、生物素標記His Avi IL33-11或生物素標記His Avi獼猴IL-33來測試經純化之抗IL-33抗體樣品的抑制效力。方法如前述部分中所描述。
Figure 105110432-A0202-12-0237-967
scFv重新格式化為IgG1
如實例1中所描述將來自IL-33：mAb結合試驗之具有理想特性的單鏈Fv純系轉化為完整免疫球蛋白G1(IgG1)抗體格式。此等包括抗體33_640027(來源於EP庫選擇)及33_640047、33_640050(來源於VH CDR3區塊突變誘發庫選擇)，對應於此等抗體之不同區域之SEQ ID NO展示於表24中
Figure 105110432-A0202-12-0238-968
純化之IgG抑制IL-33與mAb結合
如所描述在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗中評估抗IL-33抗體抑制生物素標記His Avi IL33-01、生物素標記His Avi IL33-11或生物素標記His Avi獼猴IL-33結合於DyLight標記之33v20064 IgG或DyLight標記之33_640027 IgG之能力。選擇來自IL-33：mAb結合試驗之具有理想特性的IgG用於進一步分析。
IgG抑制Huvec中之IL-8產生
使用細胞因子釋放試驗評估抗IL-33抗體對IL-33誘導之人類臍靜脈內皮細胞(Huvec)IL-8產生之抑制。在測試抗體或基本上如實例2中所描述之具有輕微修改的ST2.Fc(R&D systems)存在或不存在下使細胞暴露於IL-33。在完全培養基中將經純化IgG之測試溶液(一式兩份)稀釋至所要濃度。在與適當測試抗體混合之完全培養基中製備N端His Avi IL-33(IL33-01,SEQ ID NO 632)，得到2ng/mL最終IL-33濃度。所有樣品在室溫下培育30分鐘，隨後將IL-33/抗體混合物轉移至試驗培養盤。在18-24小時培育之後，如實例2中所描述藉由適於銪讀取之ELISA(R&D Systems,DY208)在細胞上清液中量測IL-8。使用Graphpad Prism軟體分析資料。藉由使用四參數對數方程式之曲線擬合確定IC50值。計算IC50值且概述於下表25中。
圖42A展示在33v20064、33_640050、人類ST2-Fc或對照mAb存在下經IL33-01刺激之HUVEC，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比(IL-8產生)。
哺乳動物全長IL-33之中和
全長IL-33亦為活性的(Cayrol等人，Proc Natl Acad Sci U S A 106(22)：9021-6(2009)；Hayakawa等人，Biochem Biophys Res Commun 387(1)：218-22(2009)；Talabot-Ayer等人，J Biol Chem.284(29)：19420-6(2009))。
為評估抗體中和全長IL-33之能力，在經急性酶(PAA,#L11-007)轉染之後24小時收集表現全長(FL)HuIL-33之HEK293-EBNA細胞(及模擬轉染對照)。細胞用PBS稀釋至1×108個/毫升，且使用組織均質器均質化30秒。藉由離心移除細胞碎片。用不同濃度之細胞溶解物刺激HUVEC。僅在全長IL-33轉染細胞溶解物而非模擬轉染細胞溶解物之情況下觀測到細胞因子產生刺激。選擇刺激次最大細胞因子釋放之1：1000溶解物濃度(大致EC50)用於抗體中和研究。如上文所描述進行實驗。計算IC50值且概述於下表25中。
圖42B展示在33v20064、33_640050、人類ST2-Fc或對照mAb存在下經全長IL-33細胞溶解物刺激之HUVEC，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比(IL-8產生)。
表25. Huvec IL-8試驗中之IC50值
Figure 105110432-A0202-12-0240-969
IgG防止二硫鍵鍵結之IL-33型式
使IL-33-01(0.14nM或3ng/mL)在含有1% BSA之IMDM或PBS中在抗體(25μg/mL)或人類ST2-Fc(105μg/mL)存在或不存在下在37℃、5% CO2下培育0-24小時。在不同時間點移出等分試樣且添加至含有PBS或sST2之預冷卻培養盤中(最終濃度10.5μg/mL)。在收集時將sST2摻人對照mAb及未處理樣品中以使繼續進行之IL-33氧化反應停止。將樣品等分至預冷凍96孔培養盤中且儲存在-80℃下。在DELFIA偵測系統(Perkin Elmer)替代抗生蛋白鏈菌素-HRP之取代的情況下根據製造商之說明書(R&D Systems，目錄編號DY3625，批號1362797)進行人類IL-33 ELISA且繼續。簡言之，黑色96孔Maxisorp培養盤在室溫下用50微升/孔捕捉抗體塗佈隔夜。培養盤在PBS中用300μL 0.05%吐溫-20洗滌3次且在室溫下用150μL 1% BSA/PBS阻斷1小時。培養盤洗滌3次，且在震盪(400rpm)下在室溫下添加50微升/孔樣品或標準品至培養盤中持續2小時。培養盤洗滌3次，且在震盪(400rpm)下在室溫下添加50微升/孔偵測抗體至培養盤中持續2小時。如先前所述洗滌培養盤，且在室溫、避光下在震盪(400rpm)下將在DELFIA試驗緩衝劑中以1/1000稀釋之50微升/孔抗生蛋白鏈菌素-銪添加至培養盤中持續40分鐘。用300微升/孔DELFIA洗滌緩衝劑洗滌培養盤7次。添加50微升/孔DELFIA增強溶液(預溫熱至室溫)至培養盤中。在室溫、避光下培育10分鐘之後，使用EnVision盤式讀取器(PerkinElmer)量測螢光。在Microsoft Excel中進行標準及資料插值，在GraphPad Prism軟體中進行後續分析。
如實例4圖24A中所論述，此ELISA偵測在此實驗中所量測之IL-33濃度範圍內的顯著二硫鍵鍵結IL-33(IL33-DSB)。ELISA在本文中用於監測在測試抗體存在下IL-33向其二硫鍵鍵結型式之轉化。
圖43展示在測試抗體存在或不存在下在IMDM(圖43A)或PBS(圖43B)中培育期間IL33-01向其二硫鍵鍵結型式(IL33-DSB)之轉化，其中x軸為以小時計之時間且y軸為IL-33-DSB濃度。IL330004及33v20064使IL-33轉化為IL33-DSB之速率減慢。33_640050及ST2.Fc在所測試之時間過程內防止向IL-33-DSB轉化。
有益突變重組及進一步優化
出於產生進一步親和力改良之目的，使自前述選擇及篩選級聯識別之有益突變以多種不同方式藉由簡單加成方法或經由在進一步選擇下之重組庫方法重組。
序列分析表明存在兩個單點突變『熱點』，其在許多前導抗體序列中為普遍的；在VH CDR3中之I98M及在VL CDR2中之Q50R(Kabat編號)。使用標準分子生物學技術將此兩個突變移植至33_640001構築體上，產生新抗體33_640036。在進一步重組中，使33_640047之VH與33_640036之VL配對，產生抗體33_640117。此等為使用加成方法之序列重組的實例。SEQ ID NO展示於表26中。
Figure 105110432-A0202-12-0241-970
另外，來自覆蓋VH CDR3及VL CDR3區之區塊突變誘發庫的選擇輸出已展示親和力改良及良好序列多樣性，且因此使用群體選殖方法重組。第3輪選擇輸出被重組形成庫，其中純系含有隨機配對之單獨 隨機VH CDR3及VL CDR3序列。此等重組VH CDR3/VL CDR3庫隨後用於核糖體呈現選擇，藉由使生物素標記His Avi人類IL-33野生型(IL33-01,SEQ ID NO.632)及生物素標記His Avi突變IL-33(IL33-11,SEQ ID NO.643)抗原在依序輪回中交替或僅生物素標記His Avi IL33-11抗原在所有輪回中交替來進行。在濃度降低之生物素標記抗原(50nM至30pM)存在下在五輪選擇內基本上如對於個別CDR3庫所描述進行選擇。
由來自重組VH CDR3/VL CDR3庫之選擇輸出的代表性數目之個別scFv製備粗的含scFv周質提取物。如所描述在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗中評估抗IL-33抗體抑制生物素標記His Avi IL33-01或生物素標記His Avi獼猴IL-33結合於DyLight標記之33v20064 IgG或DyLight標記之33_640027 IgG之能力。對與親本scFv及相比展示顯著改良之抑制效果的ScFv變異體及產生預重組之前導進行DNA測序，且產生獨特重組變異體作為經純化之scFv且如前述部分中所描述進行測試。
獲自此等重組庫之優化抗體係由33_640076、33_640081、33_640082、33_640084、33_640086及33_640087例示。此等抗體之SEQ ID NO展示於表27中。
Figure 105110432-A0202-12-0242-971
Figure 105110432-A0202-12-0243-972
在核糖體呈現選擇程序期間由於重複幾輪之PCR擴增而將額外自發突變引入此等scFv格式抗體之可變區中。此等事件增加輸出之序列多樣性，但在其發生於構架區中時通常為不希望的。因此，使用標準分子生物學技術使在33_640076、33_640081、33_640082、33_640084、33_640086及33_640087之構架區中發生之自發突變恢復至如實例3中所描述之IgG構築體上的生殖系。此類發生於任一CDR或與CDR相鄰之維尼爾殘基(例如，藉由Kabat編號之VH位置27、28、29、30、93及94)中之自發突變保持不變。作為增加親和力之額外策略，同時亦將先前識別之『熱點』(在VL CDR2中之Q50R突變)移植至構築體上。由此等生殖系化及熱點移植修飾產生之抗體被命名為33_640076-1、33_640081-A、33_640082-2、33_640084-2、33_640086-2及33_640087-2，分別對應於其親本抗體33_640076、33_640081、33_640082、33_640084、33_640086及33_640087。此等抗體之SEQ ID NO.展示於表28中。
Figure 105110432-A0202-12-0243-973
Figure 105110432-A0202-12-0244-974
額外CDR之優化
作為增加親和力之另一策略，優化額外CDR。使用如所描述(Clackson 2004)之標準分子生物學技術藉由寡核苷酸導引之可變重鏈(VH)CDR1及CDR2及輕鏈(VL)CDR1及CDR2之突變誘發來形成來源於生殖系化親本(33_640001)之大scFv噬菌體庫。如對於VHVL CDR3庫所描述進行選擇及篩選。改良最多之抗體變異體係獲自VH CDR2庫。此等抗體變異體由33_640166、33_640169、33_640170例示。此等抗體之SEQ ID NO.展示於表29中。
Figure 105110432-A0202-12-0244-975
作為達成進一步親和力改良之附加策略，使用標準分子生物學方法將33_640166、33_640169及33_640170之VH CDR2序列移植至33_640076-1、33_640082-2、33_640086-2及33_640087-2之IgG構築體上。由此等重組產生之抗體係由33_640076-4、33_640082-4、33_640082-6、33_640082-7、33_640086-6及33_640087-7例示。序列來源及SEQ ID NO展示於表30中。
表30. IL33抗體之序列來源及SEQ ID編號
Figure 105110432-A0202-12-0245-976
亦使用群體選殖及選擇方法進行有益VH CDR3/VL CDR3及VH CDR2序列之重組。使用標準分子生物學技術使來自覆蓋VH CDR2區之區塊突變誘發庫的第3輪選擇輸出與在群體選殖方法中重組VH CDR3/VL CDR3庫之第3輪選擇輸出重組。使包含大量scFv變異體之選擇輸出重組形成庫，其中純系含有來源於VH CDR3/VL CDR3及VH CDR2選擇之隨機配對序列。在濃度降低之生物素標記抗原(通常3nM至3pM)存在下在五輪選擇內如對於VHVL CDR3庫所描述進行選擇。如對於VHVL CDR3庫所描述在生物化學HTRF®試驗中篩選來自選擇輸出之代表性數目的個別scFv之粗的含scFv周質提取物。對與親本scFv相比展示顯著改良之抑制效果的ScFv變異體及產生預重組之前導進行DNA測序。
在利用33_640027之抗原決定基競爭試驗達到其靈敏度極限時，用使用33_640117之試驗來測試經純化之scFv樣品。該試驗基本上如對於33v20064競爭試驗所描述，具有以下修改：製備2.5nM經DyLight標記之33_640117且添加2.5微升至試驗培養盤中。此後添加含有0.12nM生物素標記人類IL-33-01以及0.75nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於人類試驗，或含有0.24nM生物素標記獼猴IL-33以及1.5nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液用於獼猴試驗。在一小時及隔夜培育之後讀取螢光。直接取用在兩個時間點最有效力樣品以重新格式化為IgG。
獨特重組變異體被評估為經純化之scFv，且隨後選擇活性最強scFv且如實例1中所描述轉化為IgG1格式。獲自此等重組庫之抗體係由33_640201及33_640237例示。使在核糖體呈現選擇期間引入33_640201及33_640237之構架區中的自發突變恢復至如先前在此部分中所描述之生殖系序列，且其生殖系化對應物被分別命名為33_640201-2及33_640237-2。此等抗體之SEQ ID展示於表31中。
Figure 105110432-A0202-12-0246-977
VH CDR3/VL CDR3及VH CDR2之藉由合理重組或群體方法優化 之抗體資料係由33_640082-6、33_640087-7、33_640201及33_640237例示於圖44及45中。
純化之IgG抑制IL-33與mAb結合
如上文所描述在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗中評估抗IL-33抗體抑制生物素標記His Avi人類IL-33或獼猴His Avi IL-33結合於DyLight標記之33_640117 IgG之能力。
圖44A展示在1小時培育之後在增加抗體33v20064、33_640050、33_640082-6、33_640087-7、33_640201及33_640237之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33(IL33-01)結合於DyLight標記之33_640117 IgG所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
圖44B展示在隔夜培育之後在增加抗體33v20064、33_640050、33_640082-6、33_640087-7、33_640201及33_640237之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33(IL33-01)結合於DyLight標記之33_640117IgG所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
圖44C展示在1小時培育之後在增加抗體33v20064、33_640050、33_640082-6、33_640087-7、33_640201及33_640237之濃度的情況下對由生物素標記獼猴His Avi IL-33結合於DyLight標記之33_640117 IgG所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
Figure 105110432-A0202-12-0247-978
Figure 105110432-A0202-12-0248-979
IgG抑制Huvec中之IL-8產生
在Huvec IL-8產生試驗中測試IgG。如先前所描述在測試抗體存在或不存在下使細胞暴露於N端His Avi IL-33(IL33-01,SEQ ID NO 632)或哺乳動物全長IL-33細胞溶解物(FL-IL33溶解物)。計算IC50值且概述於下表33中。
圖45A展示在測試抗體33_640050、33_640082-6、33_640087-7、33_640201及33_640237存在下經IL33-01刺激之HUVEC，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比(IL-8產生)。
圖45B展示在測試抗體33_640050、33_640082-6、33_640087-7、33_640201及33_640237存在下經全長IL-33細胞溶解物刺激之HUVEC，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比(IL-8產生)。
Figure 105110432-A0202-12-0248-980
生殖系化IGLJ序列
將抗體33_640076-4、33_640081-A、33_640082-6、33_640082- 7、33_640084-2、33_640086-6、33_640087-7、33_640201-2及33_640237-2之VL構架區之胺基酸序列與IMGT資料庫(Lefranc,M.P.等人Nucl.Acids Res.2009.37(Database issue)：D1006-D1012)中之已知人類IGLJ生殖系序列進行比對，且藉由序列相似性識別最接近生殖系。對於所有此等抗體，此為IGLJ2，其與VL區之位置104(Kabat編號)處的抗體具有單個胺基酸差異。使用標準分子生物學方法使此殘基恢復至如實例3中所描述之生殖系。所得抗體被命名為33_640076-4B、33_640081-AB、33_640082-6B、33_640082-7B、33_640084-2B、33_640086-6B、33_640087-7B、33_640201-2B及33_640237-2B，分別對應於其親本譜系33_640076-4、33_640081-A、33_640082-6、33_640082-7、33_640084-2、33_640086-6、33_640087-7、33_640201-2及33_640237-2。此等抗體之VH及VL區之SEQ ID展示於表34中。
Figure 105110432-A0202-12-0249-981
實例9 活體內氣管炎症模型 選殖、表現及純化IL-33細胞因子捕獲物
自Swiss Prot獲得小鼠IL-1RAcP及小鼠ST2之蛋白質序列(寄存編號分別為Q61730及P14719)。小鼠IL-33細胞因子捕獲物係基於Economides等人2003設計，且由與人類IgG1之Fc部分融合之胺基酸1-359 Q61730及胺基酸27-332 P14719組成。蛋白質序列進行密碼子優 化(Geneart)且選殖至pDEST12.2中，OriP蛋白利用IL-1RAcP之天然信號肽自細胞分泌至培養基中。為在CHO細胞中表現，藉由重疊引子PCR移除閘道連接子。使捕獲物表現載體轉染至CHO短暫哺乳動物細胞中。使小鼠IL-33捕獲物表現且分泌至培養基中。合併收集物且過濾，隨後使用蛋白A層析純化。將培養上清液裝載至5ml Hitrap蛋白A管柱(GE Healthcare)上且用1×DPBS洗滌，使用0.1M檸檬酸鈉(pH 3.0)使結合捕獲物自管柱溶離且藉由添加Tris-HCl(pH 9.0)中和。藉由使用S200 16：600 Superdex管柱(GE healthcare)在1×DPBS中進行SEC進一步純化所溶離之物質，且基於胺基酸序列使用消光係數以分光光度法確定濃度(Mach等人，Anal.Biochem.200(1)：74-80(1992))。
人類化IL-33小鼠
先前已在實例4中描述產生人類化IL-33小鼠之方法。在氣管及/或過敏性炎症之模型中使用人類化小鼠評估抗人類IL-33抗體之效果。
活體內氣管炎症模型
先前已描述小鼠中互隔交鏈孢黴菌(ALT)誘導之氣管炎症的模型(Kouzaki等人J.Immunol.2011,186：4375-4387；Bartemes等人J Immunol,2012,188：1503-1513)。內源性IL-33在ALT暴露之後快速釋放且驅動IL-33依賴性IL-5產生及肺嗜伊紅血球增多。雄性或雌性野生型或人類化IL-33小鼠(6-10週)用異氟醚簡單麻醉，且經鼻內投與總體積為50μl之25μg ALT提取物(Greer,Lenoir,NC)或媒劑。小鼠經腹膜內或經鼻內用以下測試物質治療：IL330004 IgG(SEQ ID No.12及17)、H338L293 IgG(SEQ ID No.182及187)、小鼠IL-33捕獲物33_640050(SEQ ID No.302及307)、同型對照IgG(NIP228)或媒劑(PBS,10ml/kg)，在24小時後(對於腹膜內治療)或2小時後(對於鼻內治療)用ALT鼻內攻擊。在攻擊之後24小時，小鼠用戊巴比妥鈉最終 麻醉，隨後放血且進行支氣管肺泡灌洗術(BAL)。經由氣管套管藉由灌洗(0.3ml、0.3ml及0.4ml)收集支氣管肺泡灌洗術流體(BALF)。使BALF離心，計數細胞(藉由FACS(FacsCALIBER,BD)之總細胞)且藉由ELISA(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)分析細胞因子之上清液。對經Diff-Quik(Fisher Scientific,UK)染色之細胞離心塗片製劑進行分化細胞計數(200個細胞/載片)。所有工作均在適當項目許可證授權下根據英國內政部道德與管理標準進行。
圖46展示H338L293以劑量依賴性方式抑制野生型BALB/c小鼠中ALT誘導之BAL IL-5及嗜伊紅血球增多。在用25μg ALT攻擊之前2小時經鼻內給與測試物質(10、30或100mg/kg，如括號中所指示)。在ALT攻擊之後24小時收集BALF且分析IL-5(圖46A)及嗜伊紅血球(圖46B)之存在。藉由邦弗倫尼多重比較測試使用單因子ANOVA確定測試物質之顯著效果。相比於對照mAb，***p<0.001，~~p<0.01(n=4-8)。使用小鼠IL-33捕獲物作為陽性對照。
圖47展示H338L293(30mg/kg)及小鼠IL-33捕獲物(10mg/kg)而非IL330004(30mg/kg)抑制人類化IL-33小鼠中ALT誘導之BAL IL-5。在用25μg ALT攻擊之前2小時經鼻內給與測試物質。在ALT攻擊之後24小時收集BALF且分析IL-5之存在。藉由邦弗倫尼多重比較測試使用單因子ANOVA確定測試物質之顯著效果。***p<0.001，**p<0.01(n=4)。
圖48展示33_640050以劑量依賴性方式抑制人類化IL-33小鼠中交鏈孢屬誘導之BAL IL-5。在用25μg交鏈孢屬攻擊之前24小時經腹膜內給與測試物質(0.3、3或30mg/kg，如括號中所指示)。在ALT攻擊之後24小時收集BALF且分析IL-5之存在。藉由邦弗倫尼多重比較測試使用單因子ANOVA確定測試物質之顯著效果。***p<0.001，**p<0.01(n=4-5)。
實例10抗IL-33抗體之表徵 純化之IgG抑制IL-33與ST2結合
在生物化學HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)競爭試驗(其原理描述於上文中)中評估抗IL-33抗體抑制生物素標記IL33-01結合於FLAG®-His標記之ST2受體之能力。藉由經純化IgG之稀釋系列與人類FLAG®-His標記之ST2競爭結合於人類生物素標記人類IL33-01(SEQ ID No.632)來確定經純化之IgG製劑的活性。
圖49A：展示在隔夜培育之後在增加抗體33v20064、33_640087-7、33_640087-7B、33_640050及33_640237-2B之濃度的情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為特異性結合%。
IgG抑制Huvec中之IL-8產生
在Huvec IL-8產生試驗中測試IgG。如先前所描述在測試抗體存在或不存在下使細胞暴露於N端His Avi IL-33(IL33-01,SEQ ID NO 632)。計算IC50值且概述於下表35中。資料展示IGLJ序列之生殖系化對抗體效力無任何影響。
圖49B展示在測試抗體33_640087-7、33_640087-7B、33_640237-2及33_640237-2B存在下經IL33-01刺激之HUVEC，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比(IL-8產生)。
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抗IL-33抗體之選擇性及交叉反應性
使用基於均相FRET(螢光共振能量轉移)HTRF®(均相時差式螢光，Cisbio International)之IL-33：mAb結合試驗確定生殖系化抗IL-33 抗體之選擇性及交叉反應性。在此試驗中，樣品與生物素標記人類IL-33-01(SEQ ID No.632)競爭結合於DyLight標記之33_640087-7B IgG(SEQ ID No.618及618)或33_640237-2B IgG(SEQ ID No.624及626)。
藉由添加5微升各樣品稀釋液至384孔小體積試驗培養盤(Costar,3673)中來測試人類、獼猴及小鼠IL-33 FLAG®His(描述於實例1及表21中)、人類IL-1 α及IL-1 β(R&D Systems)(表21)或大鼠IL-33(GenScript)對人類IL-33結合於DyLight650標記之33_640087-7B或DyLight650標記之33_640237-2B之抑制。接著，製備含有1.2nM經DyLight650標記之33_640087-7B或33_640237-2B之溶液，且添加2.5微升至試驗培養盤(按照製造商之說明書使用套組(Innova Biosciences,326-0010)標記)中。此後添加含有0.12nM生物素標記人類IL-33-01以及0.75nM抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑(Cisbio International,610SAKLB)之2.5微升溶液。在杜爾貝科氏PBS(Invitrogen,14190185)中含有0.8M氟化鉀(VWR,26820.236)及0.1%牛血清白蛋白(BSA,PAA,K05-013)之試驗緩衝劑中進行所有稀釋。試驗培養盤在室溫下培育4小時隨後在4攝氏度下培育18小時，且使用EnVision盤式讀取器(Perkin Elmer)讀取在620nm及665nm發射波長下之時差式螢光。藉由計算665/620nm比率隨後各樣品之△F%值分析資料。665/620nm比率用於使用方程式1校正樣品干擾。隨後使用方程式2計算各樣品之△F%。藉由僅用抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑置換生物素標記人類IL-33與抗生蛋白鏈菌素穴狀化合物偵測劑之組合來定義陰性對照(非特異性結合)。△F%值隨後用於計算如方程式3中所描述之特異性結合%。藉由使用四參數對數方程式(方程式4)之曲線擬合使用GraphPad Prism軟體測定IC50值。此等結果展現33_640087-7B及33_640237-2B與獼猴IL-33而非小鼠IL-33、大鼠IL-33、人類IL-1 α或 人類IL-1 β交叉反應。
圖50A：展示在增加測試蛋白之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33-01結合於DyLight標記之33_640087-7B(SEQ ID No.618及618)所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之測試樣品濃度且y軸為特異性結合%。在人類及獼猴而非小鼠或大鼠IL-33、人類IL-1 α或人類IL-1 β之情況下觀測到FRET信號之抑制。
圖50B：展示在增加測試蛋白之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33-01結合於DyLight標記之33_640237-2B(SEQ ID No.624及626)所產生之FRET信號的抑制，其中x軸為以莫耳濃度計之測試樣品濃度且y軸為特異性結合%。在人類及獼猴而非小鼠或大鼠IL-33、人類IL-1 α或人類IL-1 β之情況下觀測到FRET信號之抑制。
在HUVEC IL-8試驗中內源性IL-33之中和
為判定抗體是否能夠中和內源性IL-33，使用人類肺組織提供內源性IL-33蛋白質來源。該研究經NRES東英格蘭(Cambridge East)研究倫理委員會(參考號08/H0304/56þ5)批准，且在患者知情同意下捐贈組織。帕普沃斯醫院(Papworth Hospital)NHS信託研究組織銀行(Trust Research Tissue Bank)供應來自肺癌患者及肺移植手術之非癌相鄰組織於冰上Aqix RS-I培養基(Aqix Ltd)中。組織在PBS中以400mg/mL稀釋且使用組織均質器均質化30秒。藉由離心移除細胞碎片。用不同濃度之肺溶解物刺激HUVEC。選擇刺激IL-8釋放之溶解物EC50濃度用於抗體中和研究。如先前所描述在測試抗體存在或不存在下使細胞暴露於肺溶解物。sST2抑制IL-8反應達到最大大約70%，表明大多數而非所有IL-8產生係由內源性IL-33在肺溶解物內驅動。33_640050及33_640087-7B IgG對IL-8反應之抑制程度類似於sST2，展現其結合及中和內源性IL-33之能力。33_640050 IgG中和IC50為0.032nM之肺溶解物。33_640087-7B中和IC50為0.013nM之肺溶解物。sST2中和IC50 為0.019nM之肺溶解物。
圖51展示相比於sST2在測試抗體33_640050及33_640087-7B存在下經人類肺溶解物刺激之HUVEC，其中x軸為以莫耳濃度計之抗體濃度且y軸為最大反應百分比(IL-8產生)。sST2抑制IL-8反應達到最大大約70%，表明大多數而非所有IL-8產生係由內源性IL-33在肺溶解物內驅動。兩個抗體對IL-8反應之抑制程度均類似於sST2，展現其結合及中和內源性IL-33之能力。
活體內氣管炎症模型
先前已在實例4中描述產生人類化IL-33小鼠之方法。在如實例9中所描述之互隔交鏈孢黴菌(ALT)誘導之氣管炎症的模型中使用人類化小鼠評估33_640087-7B之效果。雄性或雌性野生型或人類化IL-33小鼠(6-10週)用異氟醚簡單麻醉，且經鼻內投與總體積為50μl之25μg ALT提取物(Greer,Lenoir,NC)或媒劑。小鼠經腹膜內用以下測試物質治療：33_640087-7B IgG(SEQ ID No,618及618)、同型對照IgG(NIP228)或媒劑(PBS,10ml/kg)，在24小時後用ALT鼻內攻擊。在攻擊之後24小時，小鼠用戊巴比妥鈉最終麻醉，隨後放血且進行支氣管肺泡灌洗術(BAL)。經由氣管套管藉由灌洗(0.3ml、0.3ml及0.4ml)收集支氣管肺泡灌洗術流體(BALF)。使BALF離心，且藉由ELISA(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)分析細胞因子之上清液。所有工作均在適當項目許可證授權下根據英國內政部道德與管理標準進行。
圖52展示33_640087-7B以劑量依賴性方式抑制人類化IL-33小鼠中交鏈孢屬誘導之BAL IL-5。在用25μg交鏈孢屬攻擊之前24小時經腹膜內給與測試物質(0.1、1、3或10mg/kg，如括號中所指示)。在ALT攻擊之後24小時收集BALF且分析IL-5之存在。藉由邦弗倫尼多重比較測試使用單因子ANOVA確定測試物質之顯著效果。 ***p<0.001，**p<0.01(n=5-6)。
實例11抗IL-33抗體之親和力
使用藉由BIACORETM之即時相互作用監測及對於33_640087-7B在平衡時使用KinExATM確定抗IL-33抗體片段(Fab)對重組人類IL33之親和力。對於兩種方法，藉由SEC-HPLC純化人類IL33蛋白以確保抗原以及Fab之品質以用於biacore分析。
Biacore親和力分析
藉由番木瓜蛋白酶裂解自全長IgG1產生Fab片段，且藉由SEC純化。在25℃下使用Biacorc T100量測抗體片段(Fab)之親和力。使用標準胺偶合技術使在10mM乙酸鈉(pH 4.5)中呈4μg/ml濃度之抗生蛋白鏈菌素共價固定於C1晶片表面上。達成115至170RU範圍內之典型的最終抗生蛋白鏈菌素表面密度。將在HBS-EP+緩衝劑中呈4μg/ml之重組酶促生物素標記人類IL-33(自製)滴定至抗生蛋白鏈菌素晶片表面上，能夠在飽和下實現約30 RU Fab結合(Rmax)。此分析物低結合水準確保最小質量輸送效果。
IL-33 Fab在HBS-EP+緩衝劑中自5nM連續稀釋至78pM且以50μl/min流經晶片，具有3分鐘締合及長達30分鐘解離。在同一條件下進行多次僅緩衝劑注射以允許雙參考減去最終感測器圖譜集，使用BiaEval軟體(2.0.1版本)分析。晶片表面藉由3M MgCl2之脈衝完全再生。
使用上文所描述之同一方法藉由BIACORETM確定在人類IL-33之HEK-EBNA細胞中表現之ST2-Flag-His10(SEQ.ID no.650)的親和力。
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Figure 105110432-A0202-12-0257-66
KinExA親和力分析
為確認在SPR試驗下所見之高親和力，吾人轉向動力學排除試驗(KinExA)。愈來愈發現KinExA有利於解析較高親和力蛋白質間相互作用，尤其pM至子pM範圍內之彼等蛋白質，其中基於表面之生物感測器技術達到其實際極限(Rathanaswami P,Roalstad S,Roskos L,Qiaojuan JS,Lackie S,Babcook J.Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8.Biochemical and Biophysical Research Communications.2005；334：1004-1013)。
藉由在KinExA 3200上進行之動力學排除試驗量測抗體33_640087-7B之親和力。藉由在2.5ml之50mM碳酸氫鈉(pH 8.4)中在室溫下在不斷攪拌下使200mg乾燥UltraLink Biosupport吖內酯珠粒與110μg IL-33(如先前所提及)混合2小時來製備取樣珠粒。沖洗珠粒，且用10mg/ml BSA/1M Tris(pH 8.7)阻斷。在使用前，使珠粒再懸浮於D-PBS、0.02%疊氮化鈉中。在由1mg/ml BSA、0.02%疊氮化鈉/DPBS(杜爾貝科氏PBS)組成之樣品緩衝劑中製備33_640087-7B/IL-33平衡混合物。在不同IL-33濃度下使用兩種不同IgG濃度，在自125pM連續稀釋至61fM之IL-33的情況下用5pM 33_640087-7B，且在自62.5pM連續稀釋至15fM之IL-33的情況下用500fM 33_640087-7B，兩者均在零IL-33對照之情況下進行。螢光二級偵測試劑為在1mg/ml BSA、0.02%疊氮化鈉、0.1%吐溫20/DPBS中稀釋之Alexa Fluor 647山羊抗人類Fc。樣品在KinExA上操作同時容納於設置在25℃下之溫度受控櫃中。使用KinExA Pro軟體4.1.11版本分析資料。
KinExA試驗指示33_640087-7B對於人類IL-33之KD為<142fM(飛 莫耳濃度)(表37)。
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實例12氧化型IL-33之活性 活體內初步研究探索氧化型IL-33之活性
在實例4(亦參見Cohen,E.S.等人Oxidation of the alarmin IL-33 regulates ST2-dependent inflammation.Nat.Commun.6：8327 doi：10.1038/ncomms9327(2015))中，吾人描述氧化型、二硫鍵鍵結型式IL-33(DSB IL-33)之探索且展示此型式不結合ST2。為在氧化型IL-33具有獨立於ST2之替代活性之情況下研究，缺乏ST2之小鼠經腹膜內或經鼻內用重複劑量之人類IL-33治療2、4或6週。在多個組織上進行組織學分析。
如先前所描述產生缺乏ST2之小鼠(Townsend,M.J.,Fallon,P.G.,Matthews,D.J.,Jolin,H.E.及McKenzie,A.N.J.(2000).T1/ST2-deficient mice demonstrate the importance of T1/ST2 in developing primary T helper cell type 2 responses.J.Exp.Med.191,1069-1076)。缺乏ST2之雌性小鼠(12週)用異氟醚簡單麻醉，且經鼻內投與總體積為50μl之10μg N端His Avi IL-33(IL33-01,SEQ ID NO 632；批號CCH168，內毒素含量0.03EU/mg)或媒劑(PBS)。或者，藉由腹膜內注射投與IL-33或媒劑。此過程每週重複3次持續總計18次治療。接受僅2週或4週用IL-33治療之小鼠被投與PBS持續給藥前4週或2週，隨後接受IL-33。
在最後一次治療之後24小時，小鼠用戊巴比妥鈉最終麻醉，隨後放血且進行支氣管肺泡灌洗術(BAL)。使用EDTA沖洗注射器藉由心臟出血收集血液。使用Sysmex XTVet血液學分析儀完成血液學。使剩餘血液離心且提取血漿。經由氣管套管藉由灌洗(0.3ml、0.3ml及 0.4ml)收集支氣管肺泡灌洗術流體(BALF)。計數BAL細胞(藉由流式細胞儀(MACSquant,Miltenye Biotec)之BAL總細胞，且使BALF離心以分離上清液，藉由ELISA(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)分析細胞因子之上清液。對經Diff-Quik(Fisher Scientific,UK)染色之細胞離心塗片製劑進行分化細胞計數(200個細胞/載片)。在PBS灌洗之後，經由氣管輸注用10%中性緩衝福馬林(formalin)(NBF)充氣肺以維持肺架構且浸沒固定於NBF中24-48小時。隨後將固定之肺樣品橫向切成4個相等橫截面，隨後經由一系列醇、二甲苯加工且進入石蠟中。最後，使肺橫截面隨後嵌入石蠟塊中。切割4μm組織學切片且用蘇木精及曙紅(H&E)染色用於分析及炎症評分評估。
所有工作均在適當項目許可證授權下根據英國內政部道德與管理標準進行。
為研究經由腹膜內或鼻內途徑之IL-33暴露，使用如實例4中所描述之Millipore人類IL-33試驗(目錄號HTH17MAG-14K批號2159117)在BALF及血漿中量測人類IL-33。使用sST2-Fc減少試驗信號之能力確定ST2結合(還原型)與非ST2結合(氧化型)IL-33之存在。在鼻內投與之後，在2、4及6週端點在BALF及血漿中一致地偵測到IL-33。大多數所偵測到的IL-33為氧化型。在單次腹膜內投與之後，在給藥後5小時在血漿中短暫偵測到IL-33，但截至24小時不可偵測。在重複IL-33投與之後，在2、4或6週端點在BALF或血漿中未一致地偵測到人類IL-33。此等資料指示氧化型IL-33之最佳全身暴露係經由鼻內給藥達成。
圖53A.活體內初步研究之實驗設計。缺乏ST2之小鼠藉由經腹膜內或經鼻內重複投與人類IL-33或媒劑(PBS)6週(每組n=3-4)來治療。在最終IL-33投與之後24小時收集組織、BALF及血清。
圖53B.在向BALB/c小鼠重複投與人類IL-33之後對BAL流體中人 類IL-33暴露之分析。在來自如圖53A中所描述之經治療小鼠的BALF中量測人類IL-33，其中x軸展示治療組且y軸展示以任意單位計之人類IL-33試驗信號。在鼻內給藥之後僅在BALF中偵測到IL-33。發現所偵測到的IL-33顯著氧化(非ST2結合)。
圖53C在單次腹膜內投與人類IL-33(10μg)之後對血漿中IL-33暴露之分析。在投與之後2、5、24及48小時在血漿中量測人類IL-33，其中x軸展示分析之時間點且y軸展示以任意單位計之人類IL-33試驗信號。在給藥後5小時在血漿中短暫偵測到IL-33，但截至24-48小時不可偵測。
圖53D在向BALB/c小鼠重複投與人類IL-33之後對血漿中IL-33暴露之分析。在來自如圖53A中所描述之經治療小鼠的血漿中量測人類IL-33，其中x軸展示治療組且y軸展示以任意單位計之人類IL-33試驗信號。在鼻內給藥之後僅在血漿中偵測到IL-33。發現所偵測到的IL-33顯著氧化(非ST2結合)。
在多個組織上進行組織學分析。與肝、腦、脾、皮膚、胃、淋巴結或心臟中之對照相比，經人類IL-33治療之小鼠中無相關異常。在肺中，與僅在鼻內組中且僅在6週治療之後的對照相比，經IL-33治療之小鼠中存在增加之淋巴細胞性血管周炎症。此與最高暴露於氧化型IL-33(圖53)一致。總之，用IL-33治療ST2 KO小鼠相比於對照增加經IL-33治療之小鼠的肺中之血管周淋巴細胞性浸潤之存在。此病理學可經由氧化型IL-33介導。
圖54A展示來自經鼻內投與PBS 6週之小鼠(n=3)的肺組織之代表性H&E染色石蠟切片。
圖54B展示來自經鼻內投與IL-33 6週之小鼠(n=4)的肺組織之代表性H&E染色石蠟切片。
對經IL-33治療之小鼠肺的路徑分析
為獲得對小鼠肺中導致所觀測到的發炎性反應之藉由氧化型IL-33調節之路徑的理解，對經PBS治療6週與經IL-33治療6週之動物的肺組織進行微陣列分析。
收集7隻ST2KO小鼠(如上文所描述3隻給與PBS且4隻給與IL33-01)之肺組織，且直接置於350μL RLT緩衝劑(Qiagen #79216)中。隨後根據製造商之方案使用Qiagen組織研磨機(Qiagen #85300)使組織破碎，且使用RNeasy纖維組織套組(Qiagen #74704)純化RNA。隨後根據製造商之方案使用RNeasy微型管柱(Qiagen #74004)濃縮此套組之經純化RNA。隨後使用Affymetrix基因晶片WT加試劑套組(Affymetrix #902513)使RNA擴增至單鏈DNA，且雜交至小鼠轉錄組1.0(MTA1.0)基因晶片(Affymetrix #900720)上，在Affymetrix流體學裝置中且在Affymetrix基因晶片掃描儀3000 7G上掃描。隨後在Affymetrix表現控制台中處理資料。在Microsoft Excel中分析資料且對基因進行排序，其中至少2/4經IL33治療之小鼠之信號變化比對照組平均值大±1.2倍。使用生物資料庫網路(BioDBnet v2.1)將排序後的基因清單轉化為KEGG ID，且在KEGG路徑分析(www.kegg.jp；KEGG Mapper v2.5)中分析。亦使用生物反應路徑分析(Ingenuity Pathway Analysis，IPA)(Qiagen)分析在KEGG路徑中分析之同一基因。IPA分析表明與細胞週期相關之路徑似乎被調節。例示性基因列於表38中。
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Huvec中之DSB IL-33信號傳導
為查明是否可在人類細胞上觀測到對氧化型(DSB)人類IL-33之反 應，探索活體外人類細胞刺激。小鼠微陣列分析指示與細胞週期相關之路徑活化且因此研究p38 MAP激酶及JAK-STAT信號傳導。根據製造商之說明書培養人類臍靜脈內皮細胞(Huvec)且用還原型或DSB IL-33刺激。藉由免疫螢光染色偵測p-p38 MAPK或p-STAT5之核易位。在ArrayScan VTi HCS讀取器(Cellomics)上進行核染色強度之成像及定量。該試驗基本上與對於NFkB p65/RelA核易位所描述相同，但具有以下修改。
對於p-p38 MAPK試驗，Huvec在培養基[EBM-2(Lonza,#CC-3156)與EGM-2 SingleQuot Kit Suppl.& Growth Factors(Lonza,#CC-4176)]中以1×104個/75微升/孔接種至96孔黑色壁、透明平底之經膠原蛋白I塗佈之培養盤(Greiner # 655956)中，且在37℃、5% CO2下培育18-24小時。在96孔U形底聚丙烯培養盤(Greiner,650201)中之完全培養基中將還原型或DSB IL-33之測試樣品(一式兩份)稀釋至所要濃度，且添加75μL至Huvec培養盤中以引發刺激。在37℃下之15或30分鐘試驗培育之後，使細胞在3.7%甲醛溶液中固定15分鐘(藉由添加已預溫熱至37℃之50μL 16%溶液)。抽吸固定劑且用100微升/孔PBS洗滌細胞兩次。染色細胞，用於p-p38與磷酸基-p38抗體(Cell signalling #9211S)以1：250稀釋。簡言之，用體積為50μL之一級抗體溶液使細胞在室溫下滲透15分鐘，阻斷15分鐘且染色1小時。培養盤在阻斷緩衝液中洗滌2次，且在室溫下用二級抗體溶液(DyLight 488標記之山羊抗兔IgG；ThermoFisher Scientific #35552，以1：400稀釋度)及赫斯特核染色(ThermoFisher Scientific #62249，以1：10000稀釋度)染色1小時。培養盤在PBS中洗滌2次。將細胞儲存於最終體積為150微升/孔之PBS中且用黑色遮光密封件(Perkin Elmer,#6005189)覆蓋，隨後在ArrayScan VTi HCS讀取器上讀取。使用適合算法計算核染色強度。使用Graphpad Prism軟體分析資料。
對於pSTAT5試驗，Huvec在培養基[EBM-2(Lonza,#CC-3156)與EGM-2 SingleQuot Kit Suppl.& Growth Factors(Lonza,#CC-4176)]中以1×104個/75微升/孔接種至96孔黑色壁、透明平底之經膠原蛋白I塗佈之培養盤(Greiner,#655956)中，且在37℃、5% CO2下培育18-24小時。在抽吸此完全培養基之後，細胞在100μL PBS/孔中洗滌2次，抽吸PBS且添加75μL饑餓培養基[EBM-2(Lonza,#CC-3156)與青黴素/鏈黴素]至各孔中。隨後在37℃、5% CO2下培育細胞18小時。在96孔U形底聚丙烯培養盤(Greiner,650201)中之饑餓培養基中將還原型或DSB IL-33之測試樣品(一式兩份)稀釋至所要濃度，且添加75μL至Huvec培養盤中以引發刺激。在37℃下之15或30分鐘試驗培育之後，使細胞在3.7%甲醛溶液中固定15分鐘(藉由添加已預溫熱至37℃之50μL 16%溶液)。抽吸固定劑且用100微升/孔PBS洗滌細胞兩次。染色細胞，用於p-STAT5與磷酸基-STAT5兔抗體C71E5(Cell Signalling #9314S)以1：250稀釋，如上文所描述偵測。
還原型IL-33觸發p-p38 MAPK信號傳導，在氧化為DSB型式之後喪失信號傳導(圖55A)，類似於先前對於NFkB信號傳導所描述(實例4至6)。然而，DSB IL-33而非還原型IL-33觸發p-STAT5信號傳導(圖55B)。因此，在人類IL-33自還原型轉化為DSB型式之後觀測到信號傳導路徑活化之清楚切換，表明DSB IL-33可具有不同於已知IL-33路徑之活性。
為確認核易位試驗之結果，藉由西方墨點分析確定IL-33信號傳導。如上所述用還原型或DSB IL-33(3ng/mL)刺激Huvec 15分鐘。細胞隨後在冰冷PBS中洗滌兩次，且用含有HALT蛋白酶抑制劑(Pierce #78430)之250μL RIPA緩衝劑(Pierce #89901)溶解。在還原條件下對樣品進行SDS-PAGE。樣品與4×NuPAGE凝膠裝載緩衝劑(Invitrogen)以3：1混合，且在90℃下變性3分鐘。還原型樣品含有2% β-巰基乙 醇。根據製造商之說明書使用MOPS操作緩衝劑(Invitrogen)在NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris微型凝膠(Invitrogen)上操作樣品。將蛋白質轉移至硝化纖維膜(Invitrogen目錄號IB3010-02)，且用兔磷酸基-p38 MAPK抗體(Cell signalling #9211S)、兔磷酸基-STAT5抗體C71E5(Cell Signalling #9314S)或兔p-JAK2抗體(Cell Signalling #3771S)藉由西方墨點法偵測。一級抗體用抗兔HRP(Cell Signalling #7074)偵測且使用ECL試劑(Thermo Scientific #34096)可視。
圖55A展示Huvec中回應於還原型IL-33或DSB IL-33(經IMDM培養基預處理之IL33-01)之p-p38 MAPK核易位活性，其中x軸展示IL-33濃度且y軸展示以任意單位計之核易位信號。觀測到還原型而非氧化型IL-33之濃度依賴性信號。
圖55B展示Huvec中回應於還原型IL-33或DSB IL-33(經IMDM培養基預處理之IL33-01)之p-STAT5核易位，其中x軸展示IL-33濃度且y軸展示以任意單位計之核易位信號。觀測到DSB而非還原型IL-33之濃度依賴性信號。
圖55C.對在經還原型IL-33或DSB IL-33(經IMDM培養基預處理之IL33-01)刺激15分鐘之Huvec中的p-p38 MAPK、p-JAK2及p-STAT5之西方墨點分析。在經還原型而非DSB IL-33刺激之後偵測到p-p38 MAPK活化。在經DSB IL-33而非還原型IL-33刺激之後偵測到p-JAK2及p-STAT5活化。
經由晚期糖基化終點產物受體(RAGE)介導DSB IL-33之信號傳導
為獲得對在Huvec中藉由DSB IL-33調節之路徑的理解，如先前所描述培養Huvec，以1×106個細胞/孔接種於6孔組織培養物處理培養盤(Nunc 140675)中。在隔夜培育之後，細胞用DSB IL-33刺激2或6小時。將細胞收集於350μL RLT緩衝劑(Qiagen #79216)中。根據製造商之方案使用RNeasy微型套組(Qiagen #74004)純化RNA。隨後使用 Affymetrix基因晶片WT加試劑套組(Affymetrix #902513)使RNA擴增至單鏈DNA，且雜交至人類基因組U133A 2.0(U133A 2.0)基因晶片(Affymetrix #900469)上，在Affymetrix流體學裝置中洗滌且在Affymetrix基因晶片掃描儀3000 7G上掃描。隨後在Affymetrix表現控制台中處理資料，且對信號變化比未處理對照大±1.8倍之基因進行排序。觀測到少數基因表現變化(表39)。然而，使用生物反應路徑分析(IPA)(Qiagen)分析有限基因面板，表明在2小時之EIF2信號傳導路徑及在6小時之AGER信號傳導。此等可能表明清除/晚期糖基化終點產物受體(RAGE)路徑活化。
Figure 105110432-A0202-12-0265-69
晚期糖基化終點產物受體(RAGE)為多配位體受體，其屬於免疫球蛋白超家族，且辨識多種配位體，包括高遷移率族蛋白1(HMGB-1)、S100蛋白家族、晚期糖基化終點產物(AGE)及β-摺疊纖維狀物質。認為其參與氧化應激且與多種疾病之發病機制有關。
為評估DSB是否與RAGE直接相互作用，使用ELISA格式探索結合於還原型IL-33與DSB IL-33之RAGE(圖56A)。如實例7中所描述對還原型或DSB N端His Avi IL-33(IL33-01,SEQ ID NO 632)進行生物素標記。用50μg/ml生物素標記抗原/PBS塗佈抗生蛋白鏈菌素培養盤(Thermo Scientific,AB-1226)，且在室溫下培育1小時。培養盤用PBS-T(PBS+1%(v/v)吐溫-20)洗滌3次且用300微升/孔阻斷緩衝液(PBS與1% BSA(Sigma,A9576))阻斷1小時。培養盤用PBS-T洗滌3次。在阻斷緩衝液中稀釋RAGE-Fc(R&D Systems #1145-RG)，添加至經IL-33塗佈之孔或對照(無IL-33)孔中且在室溫下培育1小時。在室溫下用在 50微升/孔阻斷緩衝液中以1：5000稀釋之抗人類IgG HRP(Sigma,A0170)偵測RAGE-Fc持續1小時。培養盤用PBS-T洗滌3次且用50微升/孔TMB(Sigma,T0440)顯影。用50微升/孔0.1M H2SO4淬滅反應物，隨後在EnVisionTM盤式讀取器或相似設備上在450nm下讀取。
為進一步確認DSB IL-33與RAGE之相互作用，評估RAGE-Fc或抗RAGE抗體抑制Huvec中ST2非依賴性pSTAT5信號傳導之能力。為此目的，根據上文所描述之方案在RAGE-Fc(R&D Systems #1145-RG)、ST2-Fc(R&D Systems #523-ST)、抗RAGE mAb(來自WO 2008137552)或對照試劑存在或不存在下使用不同濃度之DSB IL-33(經IMDM處理之IL33-01)刺激Huvec。用RAGE-Fc中和DSB IL-33(圖56B)或用抗RAGE mAb中和受體(圖56C)能夠完全抑制pSTAT5信號。
圖56A.藉由ELISA之RAGE-Fc與還原型IL-33或DSB培養盤表面之結合，其中x軸展示RAGE-Fc濃度且y軸展示在450nM下之吸光度。資料展示相比於還原型IL-33，RAGE與DSB IL-33之結合增加。
圖56B展示在RAGE-Fc(50μg/mL)、ST2-Fc(50μg/mL)或抗NIP IgG1陰性對照抗體NIP228(50μg/mL)存在下在Huvec中pSTAT5對DSB IL-33反應。pSTAT5信號傳導完全受RAGE-Fc而非ST2-Fc或NIP228抑制。
圖56C展示在抗RAGE mAb,m4F4(10μg/mL)或小鼠IgG1陰性對照抗體(10μg/mL)存在下在Huvec中pSTAT5對DSB IL-33反應。pSTAT5信號傳導完全受m4F4而非對照mAb抑制。
抗IL-33抗體防止DSB IL-33活性
如實例8中所描述，結合IL-33之抗體可防止IL-33氧化成DSB型式(圖43A)。評估IL-33抗體防止Huvec中之pSTAT5信號傳導之能力。
在IMDM中製備固定濃度之33_640087-7B(SEQ ID No 616及618)、抗ST2(來自WO 2013/173761 Ab2；SEQ ID 85及SEQ ID 19)及 同型對照mAb，且隨後與WT IL-33滴定(亦在IMDM中製備)在96孔U形底培養盤中組合(100μL與100μL)培養盤在37℃及5% CO2下培育隔夜。將來自此等『預培育處理』培養盤之各孔的75μL添加至如上文對於pSTAT5試驗所描述製備之『饑餓』細胞中，且在37℃下培育15分鐘。細胞隨後在冰冷PBS中洗滌兩次，且將eBioscience磷酸基-STAT5A/B Instant One ELISA(eBioscience # 85-86112-11)之100μL溶解緩衝劑添加至各孔中。隨後根據製造商之說明書量測細胞溶解物中之pSTAT5活性。
圖57展示在33_640087-7B(10μg/mL)或抗ST2 mAb,Ab2(10μg/mL)存在下在Huvec中pSTAT5對經IMDM處理之IL-33反應，其中x軸為IL-33濃度且y軸為pSTAT5信號。pSTAT5信號傳導完全受33_640087-7B而非抗ST2抑制，確認此反應為ST2非依賴性。
抗IL-33抗體抑制上皮細胞中之RAGE依賴性反應
RAGE在肺上皮細胞中高度表現。評估肺上皮細胞株之DSB IL-33依賴性反應。為此目的，在補充有1%青黴素/鏈黴素及10% FBS之F12K培養基(Gibco #21127022)中培養A549細胞。用0.5%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,#15400-054)收集細胞，洗滌且在96孔培養盤中以1×105個細胞/孔接種於培養基中。隨後在37℃、5% CO2下培育細胞24小時。第二天，移出完全培養基，細胞在PBS中洗滌兩次，且用『饑餓』培養基(含1%青黴素/鏈黴素之F12K培養基)置換培養基，且培養盤在37℃及5% CO2下培育24小時。
在IMDM中製備固定濃度之33_640087-7B(SEQ ID No 616及618)、抗ST2(WO 2013/173761 Ab2(SEQ ID 85及SEQ ID 19))、抗RAGE m4F4(來自WO 2008137552)及同型對照mAb，且隨後與WT IL-33(亦在IMDM中製備)在96孔U形底培養盤中組合(100μL與100μL)。細胞及處理培養盤均在37℃及5% CO2下培育隔夜。將來自此等『預 培育處理』培養盤之各孔的75μL添加至如上文所描述製備之『饑餓』細胞中，且培養盤在37℃及5% CO2下培育24小時。隨後藉由添加96孔傳斯維爾(transwell)培養盤至低結合96孔接收培養盤來設置96孔傳斯維爾系統(Corning # CLS3422-48EA)。將235μL完全培養基(補充有10% FBS及1%青黴素/鏈黴素之F12K培養基)添加至傳斯維爾系統之底部室中。隨後在PBS中洗滌96孔各孔之經處理A549細胞，胰蛋白酶消化分離，在1000rpm下離心5min，再懸浮於75μL『饑餓』培養基中且添加至傳斯維爾系統之頂部室中。傳斯維爾培養盤隨後在37℃、5% CO2下培育16小時。隨後自頂部及底部室移出培養基且使用235μL胰蛋白酶自底部室移出細胞。隨後添加100μL胰蛋白酶/細胞懸浮液至100μL Cell Titer Glo(Promega #G7571)中。在胰蛋白酶中製備新鮮A549細胞之滴定，且添加50：50至Cell Titer Glo中，形成標準細胞數曲線。隨後根據製造商之說明書培育及讀取培養盤。
圖58A展示A549細胞在用在33_640087-7B(10μg/mL)、抗ST2 mAb,Ab2(10μg/mL)或抗RAGE mAb 4F4存在下培育之IL33-01處理後之遷移，其中x軸展示細胞預處理條件且y軸為遷移細胞數。資料展現用DSB IL-33預處理A549細胞使後續細胞遷移減少。此遷移抑制由抗RAGE mAb及33_640087-7B而非抗ST2逆轉。
圖58B展示A549細胞在用在33_640087-7B(10μg/mL)或抗ST2 mAb,Ab2(10μg/mL)存在下培育之DSB IL33-01處理後之遷移，其中x軸展示細胞預處理條件且y軸為遷移細胞數。資料展現用DSB IL-33預處理A549細胞使後續細胞遷移減少。此遷移抑制未由33_640087-7B或抗ST2逆轉。
總之，此等資料確認33_640087-7B藉由防止還原型IL-33轉化為DSB IL-33而非直接中和DSB IL-33來抑制DSB-IL_33活性，與其僅結合還原型ST2活性型式之IL-33的能力一致。
圖1展示在未純化scFv周質製劑存在下對人類IL33-ST2結合之HTRF試驗。突出顯示含有抗體IL330004之孔。
圖2A及2B展示在IL33-ST2 HTRF試驗中人類及獼猴IL33藉由純化scFv製劑中和。
圖3A及3B展示在IL33-ST2 HTRF試驗中人類及獼猴IL33藉由純化IgG製劑中和。
圖4A及4B展示在NFkB信號傳導試驗中人類IL33藉由純化IgG製劑中和。
圖5展示IL-33抗體IL330004(右圖)相比於CAT-002陰性對照(左圖)，藉由免疫螢光染色偵測支氣管平滑肌細胞中之內源性IL-33。
圖6展示針對人類IL-33、獼猴IL-33及胰島素篩選之單個培養盤之結合資料。一個特定人類/獼猴交叉反應IL-33結合子展示於孔C4中，且孔A12及B12含有對照IL-33結合純系。
圖7A展示在TF-1增殖試驗中抗體之中和活性。
圖7B展示在HUVEC IL-6產生試驗中抗體之中和活性。
圖8A至8F展示在肥大細胞細胞因子產生試驗中抗體之中和活性。
圖9藉由西方墨點法展示IL-33抗體(IL330065、IL330101、IL330107及IL330149)與全長人類IL-33之結合。
圖10A及10B展示抗IL-33抗體IL330065及IL330101對肥大細胞IL-6之中和活性及由全長IL-33細胞溶解物刺激之IL-13產生。
圖11A展示在抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107、IL33149及IL330180存在下之HTRF®受體-配位體競爭試驗。
圖11B展示在抗體IL330065、IL330099、IL330101、IL330107及IL330149存在下之Huvec NFkB(p65/RelA)易位試驗。
圖12A展示純化scFv製劑與mAb IL330101對於結合於生物素標記人類IL-33之競爭性結合。
圖12B展示純化scFv製劑與mAb IL330180對於結合於生物素標記人類IL-33之競爭性結合。
圖13展示IL330259 scFv與mAb IL330101對於結合於生物素標記人類IL-33之競爭性結合。
圖14A展示IL330259 IgG與mAb IL330101對於結合於生物素標記人類IL-33之競爭性結合。
圖14B展示抗體與mAb H338L293對於結合於生物素標記人類IL-33之競爭性結合。
圖15A及15B展示在HUVEC或肥大細胞IL-6產生試驗中抗體之中和活性。
圖16展示在肥大細胞IL-6產生試驗中對IL330388及H338L293之Schild分析。
圖17A至17C展示在HUVEC信號傳導試驗(30分鐘)及IL-6產生試驗(18-24小時)中所量測之人類IL-33、半胱胺酸生物素標記IL-33或細胞培養基預處理之IL-33之活性。
圖18A至18C展示在用伊斯科夫改良型杜爾貝科氏培養基(Iscoves Modified Dulbeccos Medium，IMDM)處理之前或之後，在還原或非還原條件下人類生物素標記之人類或小鼠IL-33之SDS-PAGE。
圖19展示經細胞培養基處理之人類IL-33藉由SEC之純化。
圖20展示經PBS與培養基處理之IL-33藉由LC-MS確定之完整質量。經IMDM處理之IL-33與經PBS處理相比顯示4Da損失，與兩個二硫鍵之形成相容。
圖21A至21C展示經培養基處理之人類IL-33之二硫鍵映射。資料與兩個二硫橋鍵之形成一致。
圖22A展示用於NMR分析之高濃度redIL-33及DSB IL-33之SDS-PAGE分析。
圖22B展示redIL-33及DSB IL-33在經15N標記之人類IL-33之1H-15N HMQC光譜覆蓋之情況下的NMR異核多量子相干(HMQC)分析。
圖22C近UV圓二色性(CD)光譜。
圖22D展示在所解析之IL-33結構內指示之IL-33關鍵特徵(Trp193、半胱胺酸及ST2結合位點)。
圖22E展示遠UV圓二色性(CD)光譜。
圖23A及23B展示redIL-33及DSB IL-33之氫-氘交換分析。氘併入之差異映射至所公佈之IL-33結構上。
圖24A及24B展示redIL-33或DSB IL-33結合於ST2。
圖25A至25C展示對三個商業IL-33 ELISA試驗偵測redIL-33及DSB IL-33型式之分析。
圖26A及26B展示特異於redIL-33偵測之ELISA試驗。
圖27A及27B展示人類IL-33在細胞培養基(IMDM)或人類血清中之培育時間過程。redIL-33或DSB IL-33型式藉由ELISA或西方墨點法量測。
圖28展示使用多個ELISA試驗之組合對在交鏈孢屬(Alternaria)鼻內攻擊之後在不同時間點收集之人類化IL-33小鼠之BALF的分析。使用(A)Millipore、(B)R&D systems及(C)IL330425/sST2-生物素試驗在 sST2存在或不存在下量測IL-33(左邊圖)。將在sST2存在下之信號(來自所消除之還原型IL-33溶離份之信號)與二硫鍵鍵結之IL-33標準進行比較以定量二硫鍵鍵結之IL-33的含量。還原型IL-33信號被計算為相對於還原型IL-33標準所定量之在ST2存在及不存在下在IL-33量測之間的信號差值。還原型IL-33之估值展示於右邊圖上。
圖29A及29B展示對在交鏈孢屬鼻內攻擊之後在不同時間點收集之野生型BALB/c小鼠之BALF的分析。在sST2存在或不存在下使用小鼠IL-33 ELISA(R&D systems)量測IL-33(經培養基處理之小鼠IL-33用作標準曲線)。將在sST2存在下之信號(來自所消除之還原型IL-33溶離份之信號)與經培養基處理之小鼠IL-33標準進行比較以定量氧化型IL-33的含量。還原型IL-33信號被計算為相對於還原型小鼠IL-33標準所定量之在ST2存在及不存在下在IL-33量測之間的信號差值。
圖30A展示在8×寶石橙(SYPRO orange)染料存在下在25℃下使5μM抗體與20μM IL33培育之後100分鐘之相對螢光單位。在IL-33 H338L293而非IL330004或對照mAb存在下，螢光信號增加指示蛋白質展開。
圖30B展示在8×寶石橙染料存在下在25℃下使不同濃度之H338L293與20μM IL33培育之後隨時間推移之相對螢光單位。螢光信號隨著抗體濃度增加而增加。
圖30C展示IL-33之SDS-PAGE分析。預培育IL-33與H338L293(而非對照mAb或無mAb)，在非還原條件下增加較快遷移之二硫鍵鍵結IL-33型式之存在。
圖31展示用mAb H338L293中和HUVEC中之IL-33刺激之NFkB信號傳導之時間過程。
圖32展示在直接競爭條件下或在與IL-33預培育之後增加H338L293濃度之情況下對由人類IL-33結合於人類ST2所產生之FRET 信號的抑制。
圖33a及33b展示H338L293之抗原決定基定位。頂部圖展示在H338L293用胰蛋白酶消化之前及之後的情況下對IL33：IgG複合物之SEC分析。下部圖展示由Lingel等人2009描述經確定強烈結合於IL-33結構內之顏色為黑色的H338L293之截斷肽。
圖34展示在用IMDM細胞培養基處理18小時之前及之後，野生型IL-33(IL33-01)及IL-33半胱胺酸至絲胺酸突變體之NFkB信號傳導活性。
圖35A及35B展示在活體外及活體內IL33-11比IL33-01(WT)具有更大效力。
圖36展示0.1mM經15N標記之IL33-01及IL33-11之1H-15N HMQC光譜覆蓋分別以黑色及紅色標繪。指示相關殘基之分配。資料展示峰正如預期在C208及C259周圍移位。然而，T185至A196存在比預期更多的峰移位，可能指示構形變化。
圖37A至37D展示在IL33-ST2 HTRF結合試驗中33v20064 scFv之IL-33中和活性之時間過程。
圖38A及38B展示在IL33-ST2 HTRF結合試驗中33v20064 IgG之IL-33中和活性之時間過程。
圖39A及39B展示在HUVEC中由野生型或突變IL-33刺激之IL-6產生之抗體中和。
圖40A及40B展示在增加測試蛋白之濃度的情況下對由生物素標記人類IL-33-01結合於DyLight標記33v20064所產生之FRET信號的抑制。信號之抑制與33v20064與測試蛋白之相對結合親和力一致。
圖41A及41B展示與親本33v20064 scFv相比生殖系變異體33_640001之IL33-ST2 HTRF結合試驗中之IL-33中和活性之時間過程。
圖42A及42B展示在HUVEC中由截斷(112-270)或全長(1-270)IL-33刺激之IL-8產生之抗體中和。
圖43A及43B展示IL-33結合蛋白對redIL-33向DSB IL-33轉化之影響。
圖44展示在增加測試蛋白之濃度的情況下對在不同時間點由結合於33_640117 mAb之生物素標記人類或獼猴IL-33產生之FRET信號的抑制。信號之抑制與33v20064與測試蛋白之相對結合親和力一致。
圖45A及45B展示在HUVEC中由截斷(112-270)或全長(1-270)IL-33刺激之IL-8產生之抗體中和。
圖46展示H338L293以劑量依賴性方式抑制野生型BALB/c小鼠中交鏈孢屬(ALT)誘導之BAL IL-5及嗜伊紅血球增多。在用25μg ALT攻擊之前2小時經鼻內給與測試物質(10、30或100mg/kg，如括號中所指示)。在ALT攻擊之後24小時收集BALF且分析IL-5(圖46A)及嗜伊紅血球(圖46B)之存在。藉由邦弗倫尼多重比較測試(Bonferroni's multiple comparisons test)使用單因子ANOVA確定測試物質之顯著效果。與對照mAb相比，***p<0.001，~~p<0.01(n=4-8)。使用小鼠IL-33捕獲物作為陽性對照。
圖47展示H338L293(30mg/kg)及小鼠IL-33捕獲物(10mg/kg)而非IL330004(30mg/kg)抑制人類化IL-33小鼠中ALT誘導之BAL IL-5。在用25μg ALT攻擊之前2小時經鼻內給與測試物質。在ALT攻擊之後24小時收集BALF且分析IL-5之存在。藉由邦弗倫尼多重比較測試使用單因子ANOVA確定測試物質之顯著效果。***p<0.001，**p<0.01(n=4)。
圖48展示33_640050以劑量依賴性方式抑制人類化IL-33小鼠中交鏈孢屬誘導之BAL IL-5。在用25μg交鏈孢屬攻擊之前24小時經腹膜內給與測試物質(0.3、3或30mg/kg，如括號中所指示)。在ALT攻擊 之後24小時收集BALF且分析IL-5之存在。藉由邦弗倫尼多重比較測試使用單因子ANOVA確定測試物質之顯著效果。***p<0.001，**p<0.01(n=4-5)。
圖49A展示在IL33-ST2 FRET結合試驗中抗體之效果。
圖49B展示抗體對IL-33刺激之自Huvec之IL-8釋放的影響。
圖50展示使用基於(A)IL33/33_640087-7B或(B)33_640237-2B之FRET試驗之不同物種IL-33或其他IL-1家族成員之mAb特異性。
圖51展示抗體對由人類肺溶解物刺激之自Huvec之IL-8釋放的影響。
圖52展示33_640087-7B以劑量依賴性方式抑制人類化IL-33小鼠中交鏈孢屬誘導之BAL IL-5。
圖53A研究與ST2無關之IL-33潛在活性之初步活體內研究之實驗設計。
圖53B在向BALB/c小鼠重複投與人類IL-33之後對BAL流體中人類IL-33暴露之分析。
圖53C在單次腹膜內投與人類IL-33(10μg)之後對血漿中IL-33暴露之分析。
圖53D在向BALB/c小鼠重複投與人類IL-33之後對血漿中IL-33暴露之分析。
圖54展示經鼻內投與(A)PBS或(B)IL-33 6週之小鼠之肺組織之代表性H&E染色石蠟切片。
圖55展示Huvec中回應於還原型IL-33或DSB IL-33之(A)p-p38 MAPK或(B)p-STAT5核易位活性。
圖55C在Huvec中用還原型IL-33或DSB IL-33刺激15分鐘之p-p38 MAPK、p-JAK2及p-STAT5西方墨點分析。
圖56A藉由ELISA展示RAGE-Fc與還原型或DSB IL-33之結合。
圖56B展示用RAGE-Fc或抗RAGE mAb抑制Huvec pSTAT5對DSB IL-33反應。
圖56C展示用抗RAGE mAb抑制Huvec pSTAT5對DSB IL-33反應。
圖57展示抗IL-33與抗ST2對Huvec pSTAT5反應之影響。
圖58展示抗IL-33、抗ST2或抗RAGE mAb與(A)還原型IL-33、(B)DSB IL-33對IL-33誘導之A549細胞遷移抑制的影響。
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<400> 2
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Figure 105110432-A0305-02-0273-3
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0273-4
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330002 VH CDR2 PRT
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Figure 105110432-A0305-02-0273-5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0273-6
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<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0274-7
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<212> PRT
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Figure 105110432-A0305-02-0274-8
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0275-11
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Figure 105110432-A0305-02-0275-12
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 15
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<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0278-21
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<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0278-22
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Figure 105110432-A0305-02-0278-24
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0279-28
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Figure 105110432-A0305-02-0280-31
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0280-32
Figure 105110432-A0305-02-0281-33
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<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0281-34
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<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0281-35
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0281-36
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0282-38
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0283-41
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<211> 321
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0283-42
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0283-43
Figure 105110432-A0305-02-0284-44
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Figure 105110432-A0305-02-0288-60
Figure 105110432-A0305-02-0289-61
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 智人IL330126 VH CDR1 PRT
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Figure 105110432-A0305-02-0289-62
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0289-63
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330126 VH CDR3 PRT
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Figure 105110432-A0305-02-0289-64
<210> 56
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 56
Figure 105110432-A0305-02-0290-65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 105110432-A0305-02-0290-66
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330126 VL CDR1 PRT
<400> 58
Figure 105110432-A0305-02-0291-67
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330126 VL CDR2 PRT
<400> 59
Figure 105110432-A0305-02-0291-68
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330126 VL CDR3 PRT
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Figure 105110432-A0305-02-0291-69
<210> 61
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 61
Figure 105110432-A0305-02-0291-71
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VH PRT
<400> 62
Figure 105110432-A0305-02-0291-72
Figure 105110432-A0305-02-0292-73
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VH CDR1 PRT
<400> 63
Figure 105110432-A0305-02-0292-74
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VH CDR2 PRT
<400> 64
Figure 105110432-A0305-02-0292-75
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VH CDR3 PRT
<400> 65
Figure 105110432-A0305-02-0293-76
<210> 66
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VL DNA
<400> 66
Figure 105110432-A0305-02-0293-77
<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VL PRT
<400> 67
Figure 105110432-A0305-02-0293-78
Figure 105110432-A0305-02-0294-79
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VL CDR1 PRT
<400> 68
Figure 105110432-A0305-02-0294-80
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VL CDR2 PRT
<400> 69
Figure 105110432-A0305-02-0294-81
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330425 VL CDR3 PRT
<400> 70
Figure 105110432-A0305-02-0294-82
<210> 71
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VH DNA
<400> 71
Figure 105110432-A0305-02-0294-83
<210> 72
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VH PRT
<400> 72
Figure 105110432-A0305-02-0295-84
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VH CDR1 PRT
<400> 73
Figure 105110432-A0305-02-0295-85
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VH CDR2 PRT
<400> 74
Figure 105110432-A0305-02-0296-86
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VH CDR3 PRT
<400> 75
Figure 105110432-A0305-02-0296-87
<210> 76
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VL DNA
<400> 76
Figure 105110432-A0305-02-0296-88
<210> 77
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VL PRT
<400> 77
Figure 105110432-A0305-02-0296-89
Figure 105110432-A0305-02-0297-90
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VL CDR1 PRT
<400> 78
Figure 105110432-A0305-02-0297-91
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VL CDR2 PRT
<400> 79
Figure 105110432-A0305-02-0297-92
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330428 VL CDR3 PRT
<400> 80
Figure 105110432-A0305-02-0297-93
<210> 81
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VH DNA
<400> 81
Figure 105110432-A0305-02-0298-94
<210> 82
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VH PRT
<400> 82
Figure 105110432-A0305-02-0298-95
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VH CDR1 PRT
<400> 83
Figure 105110432-A0305-02-0298-96
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VH CDR2 PRT
<400> 84
Figure 105110432-A0305-02-0299-97
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VH CDR3 PRT
<400> 85
Figure 105110432-A0305-02-0299-98
<210> 86
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VL DNA
<400> 86
Figure 105110432-A0305-02-0299-99
<210> 87
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VL PRT
<400> 87
Figure 105110432-A0305-02-0299-100
Figure 105110432-A0305-02-0300-101
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VL CDR1 PRT
<400> 88
Figure 105110432-A0305-02-0300-102
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VL CDR2 PRT
<400> 89
Figure 105110432-A0305-02-0300-103
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330065 VL CDR3 PRT
<400> 90
Figure 105110432-A0305-02-0300-104
<210> 91
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VH DNA
<400> 91
Figure 105110432-A0305-02-0301-105
<210> 92
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VH PRT
<400> 92
Figure 105110432-A0305-02-0301-106
Figure 105110432-A0305-02-0302-107
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VH CDR1 PRT
<400> 93
Figure 105110432-A0305-02-0302-108
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VH CDR2 PRT
<400> 94
Figure 105110432-A0305-02-0302-109
<210> 95
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VH CDR3 PRT
<400> 95
Figure 105110432-A0305-02-0302-110
<210> 96
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VL DNA
<400> 96
Figure 105110432-A0305-02-0302-111
Figure 105110432-A0305-02-0303-112
<210> 97
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VL PRT
<400> 97
Figure 105110432-A0305-02-0303-113
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VL CDR1 PRT
<400> 98
Figure 105110432-A0305-02-0303-114
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VL CDR2 PRT
<400> 99
Figure 105110432-A0305-02-0304-115
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330099 VL CDR3 PRT
<400> 100
Figure 105110432-A0305-02-0304-116
<210> 101
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VH DNA
<400> 101
Figure 105110432-A0305-02-0304-117
<210> 102
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VH PRT
<400> 102
Figure 105110432-A0305-02-0304-118
Figure 105110432-A0305-02-0305-119
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VH CDR1 PRT
<400> 103
Figure 105110432-A0305-02-0305-120
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VH CDR2 PRT
<400> 104
Figure 105110432-A0305-02-0305-121
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VH CDR3 PRT
<400> 105
Figure 105110432-A0305-02-0305-122
<210> 106
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VL DNA
<400> 106
Figure 105110432-A0305-02-0306-123
<210> 107
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VL PRT
<400> 107
Figure 105110432-A0305-02-0306-124
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VL CDR1 PRT
<400> 108
Figure 105110432-A0305-02-0307-125
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VL CDR2 PRT
<400> 109
Figure 105110432-A0305-02-0307-126
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101 VL CDR3 PRT
<400> 110
Figure 105110432-A0305-02-0307-127
<210> 111
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VH DNA
<400> 111
Figure 105110432-A0305-02-0307-128
<210> 112
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VH PRT
<400> 112
Figure 105110432-A0305-02-0307-129
Figure 105110432-A0305-02-0308-130
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VH CDR1 PRT
<400> 113
Figure 105110432-A0305-02-0308-131
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VH CDR2 PRT
<400> 114
Figure 105110432-A0305-02-0308-132
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VH CDR3 PRT
<400> 115
Figure 105110432-A0305-02-0309-133
<210> 116
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VL DNA
<400> 116
Figure 105110432-A0305-02-0309-134
<210> 117
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VL PRT
<400> 117
Figure 105110432-A0305-02-0309-135
Figure 105110432-A0305-02-0310-136
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VL CDR1 PRT
<400> 118
Figure 105110432-A0305-02-0310-137
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VL CDR2 PRT
<400> 119
Figure 105110432-A0305-02-0310-138
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330101_fgl VL CDR3 PRT
<400> 120
Figure 105110432-A0305-02-0310-139
<210> 121
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VH DNA
<400> 121
Figure 105110432-A0305-02-0310-140
<210> 122
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VH PRT
<400> 122
Figure 105110432-A0305-02-0311-141
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VH CDR1 PRT
<400> 123
Figure 105110432-A0305-02-0311-142
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VH CDR2 PRT
<400> 124
Figure 105110432-A0305-02-0311-143
Figure 105110432-A0305-02-0312-144
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VH CDR3 PRT
<400> 125
Figure 105110432-A0305-02-0312-145
<210> 126
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VL DNA
<400> 126
Figure 105110432-A0305-02-0312-146
<210> 127
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VL PRT
<400> 127
Figure 105110432-A0305-02-0312-147
Figure 105110432-A0305-02-0313-148
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VL CDR1 PRT
<400> 128
Figure 105110432-A0305-02-0313-149
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VL CDR2 PRT
<400> 129
Figure 105110432-A0305-02-0313-150
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330107 VL CDR3 PRT
<400> 130
Figure 105110432-A0305-02-0313-151
<210> 131
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VH DNA
<400> 131
Figure 105110432-A0305-02-0313-152
Figure 105110432-A0305-02-0314-153
<210> 132
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VH PRT
<400> 132
Figure 105110432-A0305-02-0314-154
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VH CDR1 PRT
<400> 133
Figure 105110432-A0305-02-0314-155
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VH CDR2 PRT
<400> 134
Figure 105110432-A0305-02-0315-156
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VH CDR3 PRT
<400> 135
Figure 105110432-A0305-02-0315-157
<210> 136
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VL DNA
<400> 136
Figure 105110432-A0305-02-0315-158
<210> 137
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VL PRT
<400> 137
Figure 105110432-A0305-02-0315-159
Figure 105110432-A0305-02-0316-160
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VL CDR1 PRT
<400> 138
Figure 105110432-A0305-02-0316-161
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VL CDR2 PRT
<400> 139
Figure 105110432-A0305-02-0316-162
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330149 VL CDR3 PRT
<400> 140
Figure 105110432-A0305-02-0316-163
<210> 141
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VH DNA
<400> 141
Figure 105110432-A0305-02-0317-164
<210> 142
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VH PRT
<400> 142
Figure 105110432-A0305-02-0317-166
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VH CDR1 PRT
<400> 143
Figure 105110432-A0305-02-0318-167
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VH CDR2 PRT
<400> 144
Figure 105110432-A0305-02-0318-168
<210> 145
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VH CDR3 PRT
<400> 145
Figure 105110432-A0305-02-0318-169
<210> 146
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VL DNA
<400> 146
Figure 105110432-A0305-02-0318-170
<210> 147
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VL PRT
<400> 147
Figure 105110432-A0305-02-0319-171
<210> 148
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VL CDR1 PRT
<400> 148
Figure 105110432-A0305-02-0319-172
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VL CDR2 PRT
<400> 149
Figure 105110432-A0305-02-0319-173
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330180 VL CDR3 PRT
<400> 150
Figure 105110432-A0305-02-0320-174
<210> 151
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VH DNA
<400> 151
Figure 105110432-A0305-02-0320-175
<210> 152
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VH PRT
<400> 152
Figure 105110432-A0305-02-0320-176
Figure 105110432-A0305-02-0321-177
<210> 153
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VH CDR1 PRT
<400> 153
Figure 105110432-A0305-02-0321-178
<210> 154
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VH CDR2 PRT
<400> 154
Figure 105110432-A0305-02-0321-179
<210> 155
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VH CDR3 PRT
<400> 155
Figure 105110432-A0305-02-0321-180
<210> 156
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VL DNA
<400> 156
Figure 105110432-A0305-02-0321-181
Figure 105110432-A0305-02-0322-182
<210> 157
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VL PRT
<400> 157
Figure 105110432-A0305-02-0322-183
<210> 158
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VL CDR1 PRT
<400> 158
Figure 105110432-A0305-02-0322-184
<210> 159
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VL CDR2 PRT
<400> 159
Figure 105110432-A0305-02-0323-185
<210> 160
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259 VL CDR3 PRT
<400> 160
Figure 105110432-A0305-02-0323-186
<210> 161
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VH DNA
<400> 161
Figure 105110432-A0305-02-0323-187
<210> 162
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VH PRT
<400> 162
Figure 105110432-A0305-02-0323-188
Figure 105110432-A0305-02-0324-189
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VH CDR1 PRT
<400> 163
Figure 105110432-A0305-02-0324-190
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VH CDR2 PRT
<400> 164
Figure 105110432-A0305-02-0324-191
<210> 165
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VH CDR3 PRT
<400> 165
Figure 105110432-A0305-02-0324-192
<210> 166
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VL DNA
<400> 166
Figure 105110432-A0305-02-0325-193
<210> 167
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VL PRT
<400> 167
Figure 105110432-A0305-02-0325-194
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VL CDR1 PRT
<400> 168
Figure 105110432-A0305-02-0326-195
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VL CDR2 PRT
<400> 169
Figure 105110432-A0305-02-0326-196
<210> 170
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330259_fgl VL CDR3 PRT
<400> 170
Figure 105110432-A0305-02-0326-197
<210> 171
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VH DNA
<400> 171
Figure 105110432-A0305-02-0326-198
<210> 172
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VH PRT
<400> 172
Figure 105110432-A0305-02-0327-199
<210> 173
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VH CDR1 PRT
<400> 173
Figure 105110432-A0305-02-0327-200
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VH CDR2 PRT
<400> 174
Figure 105110432-A0305-02-0327-201
<210> 175
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VH CDR3 PRT
<400> 175
Figure 105110432-A0305-02-0328-202
<210> 176
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VL DNA
<400> 176
Figure 105110432-A0305-02-0328-204
<210> 177
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VL PRT
<400> 177
Figure 105110432-A0305-02-0328-205
Figure 105110432-A0305-02-0329-206
<210> 178
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VL CDR1 PRT
<400> 178
Figure 105110432-A0305-02-0329-207
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VL CDR2 PRT
<400> 179
Figure 105110432-A0305-02-0329-208
<210> 180
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293 VL CDR3 PRT
<400> 180
Figure 105110432-A0305-02-0329-209
<210> 181
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VH DNA
<400> 181
Figure 105110432-A0305-02-0329-211
<210> 182
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VH PRT
<400> 182
Figure 105110432-A0305-02-0330-212
<210> 183
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VH CDR1 PRT
<400> 183
Figure 105110432-A0305-02-0330-213
<210> 184
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VH CDR2 PRT
<400> 184
Figure 105110432-A0305-02-0331-214
<210> 185
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VH CDR3 PRT
<400> 185
Figure 105110432-A0305-02-0331-215
<210> 186
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VL DNA
<400> 186
Figure 105110432-A0305-02-0331-216
<210> 187
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VL PRT
<400> 187
Figure 105110432-A0305-02-0331-217
Figure 105110432-A0305-02-0332-218
<210> 188
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VL CDR1 PRT
<400> 188
Figure 105110432-A0305-02-0332-219
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VL CDR2 PRT
<400> 189
Figure 105110432-A0305-02-0332-220
<210> 190
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人H338L293_fgl VL CDR3 PRT
<400> 190
Figure 105110432-A0305-02-0332-221
<210> 191
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VH DNA
<400> 191
Figure 105110432-A0305-02-0332-223
Figure 105110432-A0305-02-0333-224
<210> 192
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VH PRT
<400> 192
Figure 105110432-A0305-02-0333-225
<210> 193
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VH CDR1 PRT
<400> 193
Figure 105110432-A0305-02-0333-226
<210> 194
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VH CDR2 PRT
<400> 194
Figure 105110432-A0305-02-0334-227
<210> 195
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VH CDR3 PRT
<400> 195
Figure 105110432-A0305-02-0334-228
<210> 196
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VL DNA
<400> 196
Figure 105110432-A0305-02-0334-229
<210> 197
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VL PRT
<400> 197
Figure 105110432-A0305-02-0334-230
Figure 105110432-A0305-02-0335-231
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VL CDR1 PRT
<400> 198
Figure 105110432-A0305-02-0335-232
<210> 199
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VL CDR2 PRT
<400> 199
Figure 105110432-A0305-02-0335-233
<210> 200
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377 VL CDR3 PRT
<400> 200
Figure 105110432-A0305-02-0335-234
<210> 201
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VH DNA
<400> 201
Figure 105110432-A0305-02-0336-235
<210> 202
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VH PRT
<400> 202
Figure 105110432-A0305-02-0336-236
<210> 203
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VH CDR1 PRT
<400> 203
Figure 105110432-A0305-02-0337-237
<210> 204
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VH CDR2 PRT
<400> 204
Figure 105110432-A0305-02-0337-238
<210> 205
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VH CDR3 PRT
<400> 205
Figure 105110432-A0305-02-0337-239
<210> 206
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VL DNA
<400> 206
Figure 105110432-A0305-02-0337-240
<210> 207
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VL PRT
<400> 207
Figure 105110432-A0305-02-0338-241
<210> 208
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VL CDR1 PRT
<400> 208
Figure 105110432-A0305-02-0338-242
<210> 209
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VL CDR2 PRT
<400> 209
Figure 105110432-A0305-02-0338-243
<210> 210
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330377_fgl VL CDR3 PRT
<400> 210
Figure 105110432-A0305-02-0339-245
<210> 211
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VH DNA
<400> 211
Figure 105110432-A0305-02-0339-246
<210> 212
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VH PRT
<400> 212
Figure 105110432-A0305-02-0339-247
Figure 105110432-A0305-02-0340-248
<210> 213
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VH CDR1 PRT
<400> 213
Figure 105110432-A0305-02-0340-249
<210> 214
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VH CDR2 PRT
<400> 214
Figure 105110432-A0305-02-0340-250
<210> 215
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VH CDR3 PRT
<400> 215
Figure 105110432-A0305-02-0340-251
<210> 216
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VL DNA
<400> 216
Figure 105110432-A0305-02-0340-252
Figure 105110432-A0305-02-0341-253
<210> 217
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VL PRT
<400> 217
Figure 105110432-A0305-02-0341-254
<210> 218
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VL CDR1 PRT
<400> 218
Figure 105110432-A0305-02-0341-255
<210> 219
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VL CDR2 PRT
<400> 219
Figure 105110432-A0305-02-0342-256
<210> 220
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388 VL CDR3 PRT
<400> 220
Figure 105110432-A0305-02-0342-257
<210> 221
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VH DNA
<400> 221
Figure 105110432-A0305-02-0342-258
<210> 222
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VH PRT
<400> 222
Figure 105110432-A0305-02-0342-259
Figure 105110432-A0305-02-0343-260
<210> 223
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VH CDR1 PRT
<400> 223
Figure 105110432-A0305-02-0343-261
<210> 224
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VH CDR2 PRT
<400> 224
Figure 105110432-A0305-02-0343-262
<210> 225
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VH CDR3 PRT
<400> 225
Figure 105110432-A0305-02-0343-263
<210> 226
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VL DNA
<400> 226
Figure 105110432-A0305-02-0344-264
<210> 227
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VL PRT
<400> 227
Figure 105110432-A0305-02-0344-265
<210> 228
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VL CDR1 PRT
<400> 228
Figure 105110432-A0305-02-0345-266
<210> 229
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VL CDR2 PRT
<400> 229
Figure 105110432-A0305-02-0345-267
<210> 230
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330388_fgl VL CDR3 PRT
<400> 230
Figure 105110432-A0305-02-0345-268
<210> 231
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VH DNA
<400> 231
Figure 105110432-A0305-02-0345-271
<210> 232
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VH PRT
<400> 232
Figure 105110432-A0305-02-0345-270
Figure 105110432-A0305-02-0346-272
<210> 233
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VH CDR1 PRT
<400> 233
Figure 105110432-A0305-02-0346-273
<210> 234
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VH CDR2 PRT
<400> 234
Figure 105110432-A0305-02-0346-274
<210> 235
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VH CDR3 PRT
<400> 235
Figure 105110432-A0305-02-0347-275
<210> 236
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VL DNA
<400> 236
Figure 105110432-A0305-02-0347-276
<210> 237
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VL PRT
<400> 237
Figure 105110432-A0305-02-0347-277
Figure 105110432-A0305-02-0348-278
<210> 238
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VL CDR1 PRT
<400> 238
Figure 105110432-A0305-02-0348-279
<210> 239
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VL CDR2 PRT
<400> 239
Figure 105110432-A0305-02-0348-280
<210> 240
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396 VL CDR3 PRT
<400> 240
Figure 105110432-A0305-02-0348-281
<210> 241
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VH DNA
<400> 241
Figure 105110432-A0305-02-0348-282
<210> 242
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VH PRT
<400> 242
Figure 105110432-A0305-02-0349-284
<210> 243
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VH CDR1 PRT
<400> 243
Figure 105110432-A0305-02-0349-285
<210> 244
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VH CDR2 PRT
<400> 244
Figure 105110432-A0305-02-0349-286
Figure 105110432-A0305-02-0350-287
<210> 245
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VH CDR3 PRT
<400> 245
Figure 105110432-A0305-02-0350-288
<210> 246
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VL DNA
<400> 246
Figure 105110432-A0305-02-0350-289
<210> 247
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VL PRT
<400> 247
Figure 105110432-A0305-02-0350-290
Figure 105110432-A0305-02-0351-291
<210> 248
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VL CDR1 PRT
<400> 248
Figure 105110432-A0305-02-0351-292
<210> 249
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VL CDR2 PRT
<400> 249
Figure 105110432-A0305-02-0351-293
<210> 250
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330396_fgl VL CDR3 PRT
<400> 250
Figure 105110432-A0305-02-0351-294
<210> 251
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VH DNA
<400> 251
Figure 105110432-A0305-02-0351-295
Figure 105110432-A0305-02-0352-296
<210> 252
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VH PRT
<400> 252
Figure 105110432-A0305-02-0352-297
<210> 253
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VH CDR1 PRT
<400> 253
Figure 105110432-A0305-02-0352-298
<210> 254
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VH CDR2 PRT
<400> 254
Figure 105110432-A0305-02-0353-299
<210> 255
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VH CDR3 PRT
<400> 255
Figure 105110432-A0305-02-0353-300
<210> 256
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VL DNA
<400> 256
Figure 105110432-A0305-02-0353-302
<210> 257
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VL PRT
<400> 257
Figure 105110432-A0305-02-0353-303
Figure 105110432-A0305-02-0354-304
<210> 258
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VL CDR1 PRT
<400> 258
Figure 105110432-A0305-02-0354-305
<210> 259
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VL CDR2 PRT
<400> 259
Figure 105110432-A0305-02-0354-306
<210> 260
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398 VL CDR3 PRT
<400> 260
Figure 105110432-A0305-02-0354-307
<210> 261
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VH DNA
<400> 261
Figure 105110432-A0305-02-0355-310
<210> 262
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VH PRT
<400> 262
Figure 105110432-A0305-02-0355-311
<210> 263
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VH CDR1 PRT
<400> 263
Figure 105110432-A0305-02-0356-312
<210> 264
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VH CDR2 PRT
<400> 264
Figure 105110432-A0305-02-0356-313
<210> 265
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VH CDR3 PRT
<400> 265
Figure 105110432-A0305-02-0356-314
<210> 266
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VL DNA
<400> 266
Figure 105110432-A0305-02-0356-315
<210> 267
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VL PRT
<400> 267
Figure 105110432-A0305-02-0357-316
<210> 268
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VL CDRI PRT
<400> 268
Figure 105110432-A0305-02-0357-317
<210> 269
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VL CDR2 PRT
<400> 269
Figure 105110432-A0305-02-0357-318
<210> 270
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人IL330398_fgl VL CDR3 PRT
<400> 270
Figure 105110432-A0305-02-0358-319
<210> 271
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VH DNA
<400> 271
Figure 105110432-A0305-02-0358-322
<210> 272
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VH PRT
<400> 272
Figure 105110432-A0305-02-0358-321
Figure 105110432-A0305-02-0359-323
<210> 273
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VH CDR1 PRT
<400> 273
Figure 105110432-A0305-02-0359-324
<210> 274
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VH CDR2 PRT
<400> 274
Figure 105110432-A0305-02-0359-325
<210> 275
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VH CDR3 PRT
<400> 275
Figure 105110432-A0305-02-0359-326
<210> 276
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VL DNA
<400> 276
Figure 105110432-A0305-02-0360-327
<210> 277
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VL PRT
<400> 277
Figure 105110432-A0305-02-0360-328
<210> 278
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VL CDR1 PRT
<400> 278
Figure 105110432-A0305-02-0360-329
<210> 279
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VL CDR2 PRT
<400> 279
Figure 105110432-A0305-02-0361-330
<210> 280
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33v20064 VL CDR3 PRT
<400> 280
Figure 105110432-A0305-02-0361-331
<210> 281
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VH DNA
<400> 281
Figure 105110432-A0305-02-0361-334
<210> 282
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VH PRT
<400> 282
Figure 105110432-A0305-02-0361-333
Figure 105110432-A0305-02-0362-335
<210> 283
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VH CDR1 PRT
<400> 283
Figure 105110432-A0305-02-0362-336
<210> 284
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VH CDR2 PRT
<400> 284
Figure 105110432-A0305-02-0362-337
<210> 285
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VH CDR3 PRT
<400> 285
Figure 105110432-A0305-02-0363-338
<210> 286
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VL DNA
<400> 286
Figure 105110432-A0305-02-0363-339
<210> 287
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VL PRT
<400> 287
Figure 105110432-A0305-02-0363-340
Figure 105110432-A0305-02-0364-341
<210> 288
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VL CDR1 PRT
<400> 288
Figure 105110432-A0305-02-0364-342
<210> 289
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VL CDR2 PRT
<400> 289
Figure 105110432-A0305-02-0364-343
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640001 VL CDR3 PRT
<400> 290
Figure 105110432-A0305-02-0364-344
<210> 291
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VH DNA
<400> 291
Figure 105110432-A0305-02-0364-345
<210> 292
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VH PRT
<400> 292
Figure 105110432-A0305-02-0365-346
<210> 293
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VH CDR1 PRT
<400> 293
Figure 105110432-A0305-02-0365-347
<210> 294
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VH CDR2 PRT
<400> 294
Figure 105110432-A0305-02-0366-348
<210> 295
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VH CDR3 PRT
<400> 295
Figure 105110432-A0305-02-0366-349
<210> 296
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VL DNA
<400> 296
Figure 105110432-A0305-02-0366-350
<210> 297
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VL PRT
<400> 297
Figure 105110432-A0305-02-0366-351
Figure 105110432-A0305-02-0367-352
<210> 298
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VL CDR1 PRT
<400> 298
Figure 105110432-A0305-02-0367-353
<210> 299
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VL CDR2 PRT
<400> 299
Figure 105110432-A0305-02-0367-354
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640027 VL CDR3 PRT
<400> 300
Figure 105110432-A0305-02-0367-355
<210> 301
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VH DNA
<400> 301
Figure 105110432-A0305-02-0368-356
<210> 302
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VH PRT
<400> 302
Figure 105110432-A0305-02-0368-357
<210> 303
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VH CDR1 PRT
<400> 303
Figure 105110432-A0305-02-0369-358
<210> 304
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VH CDR2 PRT
<400> 304
Figure 105110432-A0305-02-0369-359
<210> 305
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VH CDR3 PRT
<400> 305
Figure 105110432-A0305-02-0369-361
<210> 306
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VL DNA
<400> 306
Figure 105110432-A0305-02-0369-362
<210> 307
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VL PRT
<400> 307
Figure 105110432-A0305-02-0370-363
<210> 308
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VL CDR1 PRT
<400> 308
Figure 105110432-A0305-02-0370-364
<210> 309
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VL CDR2 PRT
<400> 309
Figure 105110432-A0305-02-0370-365
<210> 310
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640050 VL CDR3 PRT
<400> 310
Figure 105110432-A0305-02-0371-366
<210> 311
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VH DNA
<400> 311
Figure 105110432-A0305-02-0371-367
<210> 312
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VH PRT
<400> 312
Figure 105110432-A0305-02-0371-368
Figure 105110432-A0305-02-0372-369
<210> 313
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VH CDR1 PRT
<400> 313
Figure 105110432-A0305-02-0372-370
<210> 314
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VH CDR2 PRT
<400> 314
Figure 105110432-A0305-02-0372-371
<210> 315
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VH CDR3 PRT
<400> 315
Figure 105110432-A0305-02-0372-372
<210> 316
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VL DNA
<400> 316
Figure 105110432-A0305-02-0373-373
<210> 317
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VL PRT
<400> 317
Figure 105110432-A0305-02-0373-374
<210> 318
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VL CDR1 PRT
<400> 318
Figure 105110432-A0305-02-0373-375
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VL CDR2 PRT
<400> 319
Figure 105110432-A0305-02-0374-376
<210> 320
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640047 VL CDR3 PRT
<400> 320
Figure 105110432-A0305-02-0374-377
<210> 321
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VH DNA
<400> 321
Figure 105110432-A0305-02-0374-378
<210> 322
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VH PRT
<400> 322
Figure 105110432-A0305-02-0374-379
Figure 105110432-A0305-02-0375-380
<210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VH CDR1 PRT
<400> 323
Figure 105110432-A0305-02-0375-381
<210> 324
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VH CDR2 PRT
<400> 324
Figure 105110432-A0305-02-0375-382
<210> 325
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VH CDR3 PRT
<400> 325
Figure 105110432-A0305-02-0376-383
<210> 326
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VL DNA
<400> 326
Figure 105110432-A0305-02-0376-384
<210> 327
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VL PRT
<400> 327
Figure 105110432-A0305-02-0376-385
Figure 105110432-A0305-02-0377-386
<210> 328
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VL CDR1 PRT
<400> 328
Figure 105110432-A0305-02-0377-387
<210> 329
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VL CDR2 PRT
<400> 329
Figure 105110432-A0305-02-0377-388
<210> 330
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640166 VL CDR3 PRT
<400> 330
Figure 105110432-A0305-02-0377-389
<210> 331
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VH DNA
<400> 331
Figure 105110432-A0305-02-0377-390
Figure 105110432-A0305-02-0378-391
<210> 332
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VH PRT
<400> 332
Figure 105110432-A0305-02-0378-392
<210> 333
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VH CDR1 PRT
<400> 333
Figure 105110432-A0305-02-0378-393
<210> 334
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VH CDR2 PRT
<400> 334
Figure 105110432-A0305-02-0379-394
<210> 335
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VH CDR3 PRT
<400> 335
Figure 105110432-A0305-02-0379-395
<210> 336
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VL DNA
<400> 336
Figure 105110432-A0305-02-0379-397
<210> 337
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VL PRT
<400> 337
Figure 105110432-A0305-02-0379-398
Figure 105110432-A0305-02-0380-399
<210> 338
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VL CDR1 PRT
<400> 338
Figure 105110432-A0305-02-0380-400
<210> 339
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VL CDR2 PRT
<400> 339
Figure 105110432-A0305-02-0380-401
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640169 VL CDR3 PRT
<400> 340
Figure 105110432-A0305-02-0380-402
<210> 341
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VH DNA
<400> 341
Figure 105110432-A0305-02-0381-403
<210> 342
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VH PRT
<400> 342
Figure 105110432-A0305-02-0381-404
<210> 343
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VH CDR1 PRT
<400> 343
Figure 105110432-A0305-02-0382-405
<210> 344
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VH CDR2 PRT
<400> 344
Figure 105110432-A0305-02-0382-406
<210> 345
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VH CDR3 PRT
<400> 345
Figure 105110432-A0305-02-0382-407
<210> 346
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VL DNA
<400> 346
Figure 105110432-A0305-02-0382-408
<210> 347
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VL PRT
<400> 347
Figure 105110432-A0305-02-0383-409
<210> 348
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VL CDR1 PRT
<400> 348
Figure 105110432-A0305-02-0383-410
<210> 349
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VL CDR2 PRT
<400> 349
Figure 105110432-A0305-02-0383-411
<210> 350
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640170 VL CDR3 PRT
<400> 350
Figure 105110432-A0305-02-0384-412
<210> 351
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VH DNA
<400> 351
Figure 105110432-A0305-02-0384-414
<210> 352
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VH PRT
<400> 352
Figure 105110432-A0305-02-0384-413
Figure 105110432-A0305-02-0385-415
<210> 353
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VH CDR1 PRT
<400> 353
Figure 105110432-A0305-02-0385-416
<210> 354
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VH CDR2 PRT
<400> 354
Figure 105110432-A0305-02-0385-417
<210> 355
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VH CDR3 PRT
<400> 355
Figure 105110432-A0305-02-0385-418
<210> 356
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VL DNA
<400> 356
Figure 105110432-A0305-02-0386-419
<210> 357
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VL PRT
<400> 357
Figure 105110432-A0305-02-0386-420
<210> 358
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VL CDR1 PRT
<400> 358
Figure 105110432-A0305-02-0386-421
<210> 359
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VL CDR2 PRT
<400> 359
Figure 105110432-A0305-02-0387-422
<210> 360
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640036 VL CDR3 PRT
<400> 360
Figure 105110432-A0305-02-0387-423
<210> 361
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VH DNA
<400> 361
Figure 105110432-A0305-02-0387-425
<210> 362
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VH PRT
<400> 362
Figure 105110432-A0305-02-0387-424
Figure 105110432-A0305-02-0388-426
<210> 363
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VH CDR1 PRT
<400> 363
Figure 105110432-A0305-02-0388-427
<210> 364
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VH CDR2 PRT
<400> 364
Figure 105110432-A0305-02-0388-428
<210> 365
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VH CDR3 PRT
<400> 365
Figure 105110432-A0305-02-0389-429
<210> 366
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VL DNA
<400> 366
Figure 105110432-A0305-02-0389-431
<210> 367
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VL PRT
<400> 367
Figure 105110432-A0305-02-0389-430
Figure 105110432-A0305-02-0390-432
<210> 368
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VL CDR1 PRT
<400> 368
Figure 105110432-A0305-02-0390-433
<210> 369
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VL CDR2 PRT
<400> 369
Figure 105110432-A0305-02-0390-434
<210> 370
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640117 VL CDR3 PRT
<400> 370
Figure 105110432-A0305-02-0390-435
<210> 371
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VH DNA
<400> 371
Figure 105110432-A0305-02-0390-436
Figure 105110432-A0305-02-0391-437
<210> 372
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VH PRT
<400> 372
Figure 105110432-A0305-02-0391-438
<210> 373
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VH CDR1 PRT
<400> 373
Figure 105110432-A0305-02-0391-439
<210> 374
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VH CDR2 PRT
<400> 374
Figure 105110432-A0305-02-0392-440
<210> 375
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VH CDR3 PRT
<400> 375
Figure 105110432-A0305-02-0392-441
<210> 376
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VL DNA
<400> 376
Figure 105110432-A0305-02-0392-443
<210> 377
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VL PRT
<400> 377
Figure 105110432-A0305-02-0392-442
Figure 105110432-A0305-02-0393-444
<210> 378
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VL CDR1 PRT
<400> 378
Figure 105110432-A0305-02-0393-445
<210> 379
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VL CDR2 PRT
<400> 379
Figure 105110432-A0305-02-0393-446
<210> 380
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076 VL CDR3 PRT
<400> 380
Figure 105110432-A0305-02-0393-447
<210> 381
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VH DNA
<400> 381
Figure 105110432-A0305-02-0394-448
<210> 382
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VH PRT
<400> 382
Figure 105110432-A0305-02-0394-449
<210> 383
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VH CDR1 PRT
<400> 383
Figure 105110432-A0305-02-0395-450
<210> 384
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VH CDR2 PRT
<400> 384
Figure 105110432-A0305-02-0395-451
<210> 385
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VH CDR3 PRT
<400> 385
Figure 105110432-A0305-02-0395-452
<210> 386
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VL DNA
<400> 386
Figure 105110432-A0305-02-0395-454
<210> 387
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VL PRT
<400> 387
Figure 105110432-A0305-02-0396-455
<210> 388
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VL CDR1 PRT
<400> 388
Figure 105110432-A0305-02-0396-456
<210> 389
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VL CDR2 PRT
<400> 389
Figure 105110432-A0305-02-0396-457
<210> 390
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081 VL CDR3 PRT
<400> 390
Figure 105110432-A0305-02-0397-458
<210> 391
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VH DNA
<400> 391
Figure 105110432-A0305-02-0397-461
<210> 392
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VH PRT
<400> 392
Figure 105110432-A0305-02-0397-459
Figure 105110432-A0305-02-0398-463
<210> 393
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VH CDR1 PRT
<400> 393
Figure 105110432-A0305-02-0398-464
<210> 394
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VH CDR2 PRT
<400> 394
Figure 105110432-A0305-02-0398-465
<210> 395
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VH CDR3 PRT
<400> 395
Figure 105110432-A0305-02-0398-466
<210> 396
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VL DNA
<400> 396
Figure 105110432-A0305-02-0399-467
<210> 397
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VL PRT
<400> 397
Figure 105110432-A0305-02-0399-468
<210> 398
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VL CDR1 PRT
<400> 398
Figure 105110432-A0305-02-0399-469
Figure 105110432-A0305-02-0400-470
<210> 399
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VL CDR2 PRT
<400> 399
Figure 105110432-A0305-02-0400-471
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082 VL CDR3 PRT
<400> 400
Figure 105110432-A0305-02-0400-472
<210> 401
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VH DNA
<400> 401
Figure 105110432-A0305-02-0400-474
<210> 402
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VH PRT
<400> 402
Figure 105110432-A0305-02-0400-473
Figure 105110432-A0305-02-0401-475
<210> 403
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VH CDR1 PRT
<400> 403
Figure 105110432-A0305-02-0401-477
<210> 404
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VH CDR2 PRT
<400> 404
Figure 105110432-A0305-02-0401-476
<210> 405
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VH CDR3 PRT
<400> 405
Figure 105110432-A0305-02-0402-478
<210> 406
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VL DNA
<400> 406
Figure 105110432-A0305-02-0402-480
<210> 407
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VL PRT
<400> 407
Figure 105110432-A0305-02-0402-481
Figure 105110432-A0305-02-0403-482
<210> 408
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VL CDR1 PRT
<400> 408
Figure 105110432-A0305-02-0403-483
<210> 409
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VL CDR2 PRT
<400> 409
Figure 105110432-A0305-02-0403-484
<210> 410
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084 VL CDR3 PRT
<400> 410
Figure 105110432-A0305-02-0403-485
<210> 411
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VH DNA
<400> 411
Figure 105110432-A0305-02-0403-487
Figure 105110432-A0305-02-0404-488
<210> 412
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VH PRT
<400> 412
Figure 105110432-A0305-02-0404-489
<210> 413
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VH CDR1 PRT
<400> 413
Figure 105110432-A0305-02-0404-490
<210> 414
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VH CDR2 PRT
<400> 414
Figure 105110432-A0305-02-0405-492
<210> 415
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VH CDR3 PRT
<400> 415
Figure 105110432-A0305-02-0405-493
<210> 416
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VL DNA
<400> 416
Figure 105110432-A0305-02-0405-495
<210> 417
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VL PRT
<400> 417
Figure 105110432-A0305-02-0405-494
Figure 105110432-A0305-02-0406-496
<210> 418
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VL CDR1 PRT
<400> 418
Figure 105110432-A0305-02-0406-497
<210> 419
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VL CDR2 PRT
<400> 419
Figure 105110432-A0305-02-0406-498
<210> 420
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086 VL CDR3 PRT
<400> 420
Figure 105110432-A0305-02-0406-499
<210> 421
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VH DNA
<400> 421
Figure 105110432-A0305-02-0407-500
<210> 422
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VH PRT
<400> 422
Figure 105110432-A0305-02-0407-501
<210> 423
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VH CDR1 PRT
<400> 423
Figure 105110432-A0305-02-0408-502
<210> 424
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VH CDR2 PRT
<400> 424
Figure 105110432-A0305-02-0408-504
<210> 425
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VH CDR3 PRT
<400> 425
Figure 105110432-A0305-02-0408-505
<210> 426
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VL DNA
<400> 426
Figure 105110432-A0305-02-0408-507
<210> 427
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VL PRT
<400> 427
Figure 105110432-A0305-02-0409-508
<210> 428
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VL CDR1 PRT
<400> 428
Figure 105110432-A0305-02-0409-509
<210> 429
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VL CDR2 PRT
<400> 429
Figure 105110432-A0305-02-0409-510
<210> 430
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087 VL CDR3 PRT
<400> 430
Figure 105110432-A0305-02-0410-511
<210> 431
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VH DNA
<400> 431
Figure 105110432-A0305-02-0410-513
<210> 432
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VH PRT
<400> 432
Figure 105110432-A0305-02-0410-512
Figure 105110432-A0305-02-0411-514
<210> 433
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VH CDR1 PRT
<400> 433
Figure 105110432-A0305-02-0411-515
<210> 434
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VH CDR2 PRT
<400> 434
Figure 105110432-A0305-02-0411-516
<210> 435
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VH CDR3 PRT
<400> 435
Figure 105110432-A0305-02-0411-517
<210> 436
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VL DNA
<400> 436
Figure 105110432-A0305-02-0412-519
<210> 437
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VL PRT
<400> 437
Figure 105110432-A0305-02-0412-520
<210> 438
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VL CDR1 PRT
<400> 438
Figure 105110432-A0305-02-0413-521
<210> 439
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VL CDR2 PRT
<400> 439
Figure 105110432-A0305-02-0413-522
<210> 440
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-1 VL CDR3 PRT
<400> 440
Figure 105110432-A0305-02-0413-523
<210> 441
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VH DNA
<400> 441
Figure 105110432-A0305-02-0413-525
<210> 442
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VH PRT
<400> 442
Figure 105110432-A0305-02-0413-524
Figure 105110432-A0305-02-0414-526
<210> 443
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VH CDR1 PRT
<400> 443
Figure 105110432-A0305-02-0414-527
<210> 444
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VH CDR2 PRT
<400> 444
Figure 105110432-A0305-02-0414-528
<210> 445
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VH CDR3 PRT
<400> 445
Figure 105110432-A0305-02-0415-529
<210> 446
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VL DNA
<400> 446
Figure 105110432-A0305-02-0415-531
<210> 447
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VL PRT
<400> 447
Figure 105110432-A0305-02-0415-532
Figure 105110432-A0305-02-0416-533
<210> 448
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VL CDR1 PRT
<400> 448
Figure 105110432-A0305-02-0416-534
<210> 449
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VL CDR2 PRT
<400> 449
Figure 105110432-A0305-02-0416-535
<210> 450
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-A VL CDR3 PRT
<400> 450
Figure 105110432-A0305-02-0416-536
<210> 451
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VH DNA
<400> 451
Figure 105110432-A0305-02-0416-537
Figure 105110432-A0305-02-0417-538
<210> 452
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VH PRT
<400> 452
Figure 105110432-A0305-02-0417-539
<210> 453
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VH CDR1 PRT
<400> 453
Figure 105110432-A0305-02-0417-540
<210> 454
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VH CDR2 PRT
<400> 454
Figure 105110432-A0305-02-0418-541
<210> 455
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VH CDR3 PRT
<400> 455
Figure 105110432-A0305-02-0418-542
<210> 456
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VL DNA
<400> 456
Figure 105110432-A0305-02-0418-544
<210> 457
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VL PRT
<400> 457
Figure 105110432-A0305-02-0418-543
Figure 105110432-A0305-02-0419-545
<210> 458
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VL CDR1 PRT
<400> 458
Figure 105110432-A0305-02-0419-546
<210> 459
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VL CDR2 PRT
<400> 459
Figure 105110432-A0305-02-0419-547
<210> 460
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-2 VL CDR3 PRT
<400> 460
Figure 105110432-A0305-02-0419-548
<210> 461
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VH DNA
<400> 461
Figure 105110432-A0305-02-0420-549
<210> 462
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VH PRT
<400> 462
Figure 105110432-A0305-02-0420-550
<210> 463
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VH CDR1 PRT
<400> 463
Figure 105110432-A0305-02-0421-551
<210> 464
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VH CDR2 PRT
<400> 464
Figure 105110432-A0305-02-0421-552
<210> 465
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VH CDR3 PRT
<400> 465
Figure 105110432-A0305-02-0421-553
<210> 466
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VL DNA
<400> 466
Figure 105110432-A0305-02-0421-554
Figure 105110432-A0305-02-0422-555
<210> 467
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VL PRT
<400> 467
Figure 105110432-A0305-02-0422-556
<210> 468
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VL CDR1 PRT
<400> 468
Figure 105110432-A0305-02-0422-557
<210> 469
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VL CDR2 PRT
<400> 469
Figure 105110432-A0305-02-0422-558
<210> 470
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2 VL CDR3 PRT
<400> 470
Figure 105110432-A0305-02-0423-559
<210> 471
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VH DNA
<400> 471
Figure 105110432-A0305-02-0423-560
<210> 472
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VH PRT
<400> 472
Figure 105110432-A0305-02-0423-561
Figure 105110432-A0305-02-0424-562
<210> 473
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VH CDR1 PRT
<400> 473
Figure 105110432-A0305-02-0424-563
<210> 474
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VH CDR2 PRT
<400> 474
Figure 105110432-A0305-02-0424-564
<210> 475
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VH CDR3 PRT
<400> 475
Figure 105110432-A0305-02-0424-565
<210> 476
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VL DNA
<400> 476
Figure 105110432-A0305-02-0425-566
<210> 477
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VL PRT
<400> 477
Figure 105110432-A0305-02-0425-567
<210> 478
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VL CDR1 PRT
<400> 478
Figure 105110432-A0305-02-0426-568
<210> 479
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VL CDR2 PRT
<400> 479
Figure 105110432-A0305-02-0426-569
<210> 480
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-2 VL CDR3 PRT
<400> 480
Figure 105110432-A0305-02-0426-570
<210> 481
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VH DNA
<400> 481
Figure 105110432-A0305-02-0426-573
<210> 482
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VH PRT
<400> 482
Figure 105110432-A0305-02-0427-574
<210> 483
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VH CDR1 PRT
<400> 483
Figure 105110432-A0305-02-0427-575
<210> 484
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VH CDR2 PRT
<400> 484
Figure 105110432-A0305-02-0427-576
<210> 485
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VH CDR3 PRT
<400> 485
Figure 105110432-A0305-02-0428-577
<210> 486
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VL DNA
<400> 486
Figure 105110432-A0305-02-0428-578
<210> 487
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VL PRT
<400> 487
Figure 105110432-A0305-02-0428-579
Figure 105110432-A0305-02-0429-580
<210> 488
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VL CDR1 PRT
<400> 488
Figure 105110432-A0305-02-0429-581
<210> 489
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VL CDR2 PRT
<400> 489
Figure 105110432-A0305-02-0429-582
<210> 490
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-2 VL CDR3 PRT
<400> 490
Figure 105110432-A0305-02-0429-583
<210> 491
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VH DNA
<400> 491
Figure 105110432-A0305-02-0429-584
Figure 105110432-A0305-02-0430-585
<210> 492
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VH PRT
<400> 492
Figure 105110432-A0305-02-0430-586
<210> 493
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VH CDR1 PRT
<400> 493
Figure 105110432-A0305-02-0430-587
<210> 494
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VH CDR2 PRT
<400> 494
Figure 105110432-A0305-02-0431-588
<210> 495
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VH CDR3 PRT
<400> 495
Figure 105110432-A0305-02-0431-590
<210> 496
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VL DNA
<400> 496
Figure 105110432-A0305-02-0431-591
<210> 497
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VL PRT
<400> 497
Figure 105110432-A0305-02-0431-592
Figure 105110432-A0305-02-0432-593
<210> 498
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VL CDR1 PRT
<400> 498
Figure 105110432-A0305-02-0432-594
<210> 499
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VL CDR2 PRT
<400> 499
Figure 105110432-A0305-02-0432-595
<210> 500
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4 VL CDR3 PRT
<400> 500
Figure 105110432-A0305-02-0432-596
<210> 501
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VH DNA
<400> 501
Figure 105110432-A0305-02-0433-598
<210> 502
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VH PRT
<400> 502
Figure 105110432-A0305-02-0433-599
<210> 503
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VH CDR1 PRT
<400> 503
Figure 105110432-A0305-02-0434-600
<210> 504
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VH CDR2 PRT
<400> 504
Figure 105110432-A0305-02-0434-601
<210> 505
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VH CDR2 PRT
<400> 505
Figure 105110432-A0305-02-0434-602
<210> 506
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VL DNA
<400> 506
Figure 105110432-A0305-02-0434-603
Figure 105110432-A0305-02-0435-604
<210> 507
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VL PRT
<400> 507
Figure 105110432-A0305-02-0435-605
<210> 508
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VL CDR1 PRT
<400> 508
Figure 105110432-A0305-02-0435-606
<210> 509
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VL CDR2 PRT
<400> 509
Figure 105110432-A0305-02-0435-607
Figure 105110432-A0305-02-0436-609
<210> 510
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-4 VL CDR3 PRT
<400> 510
Figure 105110432-A0305-02-0436-610
<210> 511
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VH DNA
<400> 511
Figure 105110432-A0305-02-0436-611
<210> 512
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VH PRT
<400> 512
Figure 105110432-A0305-02-0436-612
Figure 105110432-A0305-02-0437-613
<210> 513
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VH CDR1 PRT
<400> 513
Figure 105110432-A0305-02-0437-614
<210> 514
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VH CDR2 PRT
<400> 514
Figure 105110432-A0305-02-0437-615
<210> 515
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VH CDR3 PRT
<400> 515
Figure 105110432-A0305-02-0437-616
<210> 516
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VL DNA
<400> 516
Figure 105110432-A0305-02-0438-617
<210> 517
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VL PRT
<400> 517
Figure 105110432-A0305-02-0438-618
<210> 518
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VL CDR1 PRT
<400> 518
Figure 105110432-A0305-02-0439-619
<210> 519
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VL CDR2 PRT
<400> 519
Figure 105110432-A0305-02-0439-622
<210> 520
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6 VL CDR3 PRT
<400> 520
Figure 105110432-A0305-02-0439-621
<210> 521
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VH DNA
<400> 521
Figure 105110432-A0305-02-0439-624
<210> 522
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VH PRT
<400> 522
Figure 105110432-A0305-02-0440-625
<210> 523
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VH CDR1 PRT
<400> 523
Figure 105110432-A0305-02-0440-629
<210> 524
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VH CDR2 PRT
<400> 524
Figure 105110432-A0305-02-0440-628
<210> 525
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VH CDR3 PRT
<400> 525
Figure 105110432-A0305-02-0441-630
<210> 526
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VL DNA
<400> 526
Figure 105110432-A0305-02-0441-631
<210> 527
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VL PRT
<400> 527
Figure 105110432-A0305-02-0441-632
Figure 105110432-A0305-02-0442-633
<210> 528
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VL CDR1 PRT
<400> 528
Figure 105110432-A0305-02-0442-634
<210> 529
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VL CDR2 PRT
<400> 529
Figure 105110432-A0305-02-0442-635
<210> 530
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7 VL CDR3 PRT
<400> 530
Figure 105110432-A0305-02-0442-636
<210> 531
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VH DNA
<400> 531
Figure 105110432-A0305-02-0442-638
Figure 105110432-A0305-02-0443-639
<210> 532
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VH PRT
<400> 532
Figure 105110432-A0305-02-0443-640
<210> 533
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VH CDR1 PRT
<400> 533
Figure 105110432-A0305-02-0443-641
<210> 534
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VH CDR2 PRT
<400> 534
Figure 105110432-A0305-02-0444-642
<210> 535
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VH CDR3 PRT
<400> 535
Figure 105110432-A0305-02-0444-644
<210> 536
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VL DNA
<400> 536
Figure 105110432-A0305-02-0444-646
<210> 537
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VL PRT
<400> 537
Figure 105110432-A0305-02-0444-645
Figure 105110432-A0305-02-0445-647
<210> 538
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VL CDR1 PRT
<400> 538
Figure 105110432-A0305-02-0445-648
<210> 539
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VL CDR2 PRT
<400> 539
Figure 105110432-A0305-02-0445-649
<210> 540
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6 VL CDR3 PRT
<400> 540
Figure 105110432-A0305-02-0445-650
<210> 541
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VH DNA
<400> 541
Figure 105110432-A0305-02-0446-651
<210> 542
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VH PRT
<400> 542
Figure 105110432-A0305-02-0446-652
<210> 543
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VH CDR1 PRT
<400> 543
Figure 105110432-A0305-02-0447-653
<210> 544
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VH CDR2 PRT
<400> 544
Figure 105110432-A0305-02-0447-654
<210> 545
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VH CDR3 PRT
<400> 545
Figure 105110432-A0305-02-0447-655
<210> 546
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VL DNA
<400> 546
Figure 105110432-A0305-02-0447-657
Figure 105110432-A0305-02-0448-658
<210> 547
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VL PRT
<400> 547
Figure 105110432-A0305-02-0448-659
<210> 548
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VL CDR1 PRT
<400> 548
Figure 105110432-A0305-02-0448-660
<210> 549
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VL CDR2 PRT
<400> 549
Figure 105110432-A0305-02-0449-661
<210> 550
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7 VL CDR3 PRT
<400> 550
Figure 105110432-A0305-02-0449-662
<210> 551
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VH DNA
<400> 551
Figure 105110432-A0305-02-0449-664
<210> 552
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VH PRT
<400> 552
Figure 105110432-A0305-02-0449-663
Figure 105110432-A0305-02-0450-665
<210> 553
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VH CDR1 PRT
<400> 553
Figure 105110432-A0305-02-0450-666
<210> 554
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VH CDR2 PRT
<400> 554
Figure 105110432-A0305-02-0450-667
<210> 555
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VH CDR3 PRT
<400> 555
Figure 105110432-A0305-02-0450-668
<210> 556
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VL DNA
<400> 556
Figure 105110432-A0305-02-0451-669
<210> 557
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VL PRT
<400> 557
Figure 105110432-A0305-02-0451-670
<210> 558
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VL CDR1 PRT
<400> 558
Figure 105110432-A0305-02-0452-671
<210> 559
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VL CDR2 PRT
<400> 559
Figure 105110432-A0305-02-0452-672
<210> 560
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201 VL CDR3 PRT
<400> 560
Figure 105110432-A0305-02-0452-673
<210> 561
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VH DNA
<400> 561
Figure 105110432-A0305-02-0452-674
<210> 562
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VH PRT
<400> 562
Figure 105110432-A0305-02-0453-676
<210> 563
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VH CDR1 PRT
<400> 563
Figure 105110432-A0305-02-0453-677
<210> 564
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VH CDR2 PRT
<400> 564
Figure 105110432-A0305-02-0453-678
<210> 565
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VH CDR3 PRT
<400> 565
Figure 105110432-A0305-02-0454-679
<210> 566
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VL DNA
<400> 566
Figure 105110432-A0305-02-0454-681
<210> 567
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VL PRT
<400> 567
Figure 105110432-A0305-02-0454-680
Figure 105110432-A0305-02-0455-682
<210> 568
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VL CDR1 PRT
<400> 568
Figure 105110432-A0305-02-0455-683
<210> 569
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VL CDR2 PRT
<400> 569
Figure 105110432-A0305-02-0455-684
<210> 570
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237 VL CDR3 PRT
<400> 570
Figure 105110432-A0305-02-0455-685
<210> 571
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VH DNA
<400> 571
Figure 105110432-A0305-02-0455-686
Figure 105110432-A0305-02-0456-687
<210> 572
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VH PRT
<400> 572
Figure 105110432-A0305-02-0456-688
<210> 573
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VH CDR1 PRT
<400> 573
Figure 105110432-A0305-02-0456-689
<210> 574
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VH CDR2 PRT
<400> 574
Figure 105110432-A0305-02-0457-690
<210> 575
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VH CDR3 PRT
<400> 575
Figure 105110432-A0305-02-0457-691
<210> 576
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VL DNA
<400> 576
Figure 105110432-A0305-02-0457-693
<210> 577
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VL PRT
<400> 577
Figure 105110432-A0305-02-0457-692
Figure 105110432-A0305-02-0458-694
<210> 578
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VL CDR1 PRT
<400> 578
Figure 105110432-A0305-02-0458-695
<210> 579
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VL CDR2 PRT
<400> 579
Figure 105110432-A0305-02-0458-696
<210> 580
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2 VL CDR3 PRT
<400> 580
Figure 105110432-A0305-02-0458-697
<210> 581
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VH DNA
<400> 581
Figure 105110432-A0305-02-0459-698
<210> 582
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VH PRT
<400> 582
Figure 105110432-A0305-02-0459-700
<210> 583
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VH CDR1 PRT
<400> 583
Figure 105110432-A0305-02-0460-701
<210> 584
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VH CDR2 PRT
<400> 584
Figure 105110432-A0305-02-0460-702
<210> 585
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VH CDR3 PRT
<400> 585
Figure 105110432-A0305-02-0460-703
<210> 586
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VL DNA
<400> 586
Figure 105110432-A0305-02-0460-704
Figure 105110432-A0305-02-0461-705
<210> 587
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VL PRT
<400> 587
Figure 105110432-A0305-02-0461-706
<210> 588
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VL CDR1 PRT
<400> 588
Figure 105110432-A0305-02-0461-707
<210> 589
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<323> 智人33_640237-2 VL CDR2 PRT
<400> 589
Figure 105110432-A0305-02-0462-708
<210> 590
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2 VL CDR3 PRT
<400> 590
Figure 105110432-A0305-02-0462-709
<210> 591
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4B VH DNA
<400> 591
Figure 105110432-A0305-02-0462-710
<210> 592
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4B VH PRT
<400> 592
Figure 105110432-A0305-02-0462-711
Figure 105110432-A0305-02-0463-712
<210> 593
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4B VL DNA
<400> 593
Figure 105110432-A0305-02-0463-713
<210> 594
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640076-4B VL PRT
<400> 594
Figure 105110432-A0305-02-0463-714
Figure 105110432-A0305-02-0464-715
<210> 595
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-AB VH DNA
<400> 595
Figure 105110432-A0305-02-0464-717
<210> 596
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-AB VH PRT
<400> 596
Figure 105110432-A0305-02-0464-718
Figure 105110432-A0305-02-0465-719
<210> 597
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-AB VL DNA
<400> 597
Figure 105110432-A0305-02-0465-720
<210> 598
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640081-AB VL PRT
<400> 598
Figure 105110432-A0305-02-0465-721
Figure 105110432-A0305-02-0466-722
<210> 599
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6B VH DNA
<400> 599
Figure 105110432-A0305-02-0466-724
<210> 600
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6B VH PRT
<400> 600
Figure 105110432-A0305-02-0466-723
<210> 601
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6B VL DNA
<400> 601
Figure 105110432-A0305-02-0467-725
<210> 602
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-6B VL PRT
<400> 602
Figure 105110432-A0305-02-0467-726
<210> 603
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7B VH DNA
<400> 603
Figure 105110432-A0305-02-0468-727
<210> 604
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7B VH PRT
<400> 604
Figure 105110432-A0305-02-0468-728
<210> 605
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640082-7B VL DNA
<400> 605
Figure 105110432-A0305-02-0469-729
<210> 606
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<323> 智人33_640082-7B VL PRT
<400> 606
Figure 105110432-A0305-02-0469-730
<210> 607
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2B VH DNA
<400> 607
Figure 105110432-A0305-02-0469-731
Figure 105110432-A0305-02-0470-732
<210> 608
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2B VH PRT
<400> 608
Figure 105110432-A0305-02-0470-733
<210> 609
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2B VL DNA
<400> 609
Figure 105110432-A0305-02-0470-734
Figure 105110432-A0305-02-0471-735
<210> 610
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640084-2B VL PRT
<400> 610
Figure 105110432-A0305-02-0471-739
<210> 611
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6B VH DNA
<400> 611
Figure 105110432-A0305-02-0471-743
Figure 105110432-A0305-02-0472-740
<210> 612
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6B VH PRT
<400> 612
Figure 105110432-A0305-02-0472-741
<210> 613
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6B VL DNA
<400> 613
Figure 105110432-A0305-02-0472-742
<210> 614
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640086-6B VL PRT
<400> 614
Figure 105110432-A0305-02-0473-744
<210> 615
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7B VH DNA
<400> 615
Figure 105110432-A0305-02-0473-745
<210> 616
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7B VH PRT
<400> 616
Figure 105110432-A0305-02-0474-746
<210> 617
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7B VL DNA
<400> 617
Figure 105110432-A0305-02-0474-753
<210> 618
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640087-7B VL PRT
<400> 618
Figure 105110432-A0305-02-0475-749
<210> 619
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2B VH DNA
<400> 619
Figure 105110432-A0305-02-0475-751
<210> 620
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2B VH PRT
<400> 620
Figure 105110432-A0305-02-0475-752
Figure 105110432-A0305-02-0476-754
<210> 621
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2B VL DNA
<400> 621
Figure 105110432-A0305-02-0476-755
<210> 622
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640201-2B VL PRT
<400> 622
Figure 105110432-A0305-02-0476-756
Figure 105110432-A0305-02-0477-757
<210> 623
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2B VH DNA
<400> 623
Figure 105110432-A0305-02-0477-759
<210> 624
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2B VH PRT
<400> 624
Figure 105110432-A0305-02-0477-758
Figure 105110432-A0305-02-0478-760
<210> 625
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2B VL DNA
<400> 625
Figure 105110432-A0305-02-0478-763
<210> 626
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人33_640237-2B VL PRT
<400> 626
Figure 105110432-A0305-02-0478-761
Figure 105110432-A0305-02-0479-764
<210> 627
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟人類IL-33 aa 112-270 c端FLAG 10His
<400> 627
Figure 105110432-A0305-02-0479-765
Figure 105110432-A0305-02-0480-766
<210> 628
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟小鼠IL-33 aa 109-266 c端FLAG 10His
<400> 628
Figure 105110432-A0305-02-0480-767
<210> 629
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟獼猴IL-33 aa 112-270 c端FLAG 10His
<400> 629
Figure 105110432-A0305-02-0481-768
<210> 630
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類ST2 ECD-Fc/His6
<400> 630
Figure 105110432-A0305-02-0481-769
Figure 105110432-A0305-02-0482-770
Figure 105110432-A0305-02-0483-771
Figure 105110432-A0305-02-0484-772
<210> 631
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ST2 ECD-Fc/His
<400> 631
Figure 105110432-A0305-02-0484-774
Figure 105110432-A0305-02-0485-775
Figure 105110432-A0305-02-0486-776
<210> 632
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-01-具有N端10His、avitag、Xa因子蛋白酶裂解位點之人類IL33
<400> 632
Figure 105110432-A0305-02-0486-777
Figure 105110432-A0305-02-0487-778
<210> 633
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端6His標記及TEV蛋白酶裂解位點之人類IL33
<400> 633
Figure 105110432-A0305-02-0487-779
Figure 105110432-A0305-02-0488-780
<210> 634
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-02
<400> 634
Figure 105110432-A0305-02-0488-781
Figure 105110432-A0305-02-0489-782
<210> 635
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-03
<400> 635
Figure 105110432-A0305-02-0489-783
Figure 105110432-A0305-02-0490-784
<210> 636
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-04
<400> 636
Figure 105110432-A0305-02-0490-785
Figure 105110432-A0305-02-0491-786
<210> 637
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-05
<400> 637
Figure 105110432-A0305-02-0491-787
<210> 638
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-06
<400> 638
Figure 105110432-A0305-02-0492-788
<210> 639
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-07
<400> 639
Figure 105110432-A0305-02-0493-789
<210> 640
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-08
<400> 640
Figure 105110432-A0305-02-0494-790
<210> 641
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-09
<400> 641
Figure 105110432-A0305-02-0494-791
Figure 105110432-A0305-02-0495-792
<210> 642
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-10
<400> 642
Figure 105110432-A0305-02-0495-793
Figure 105110432-A0305-02-0496-794
<210> 643
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-11
<400> 643
Figure 105110432-A0305-02-0496-795
Figure 105110432-A0305-02-0497-796
<210> 644
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-12
<400> 644
Figure 105110432-A0305-02-0497-797
Figure 105110432-A0305-02-0498-798
<210> 645
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-13
<400> 645
Figure 105110432-A0305-02-0498-799
Figure 105110432-A0305-02-0499-800
<210> 646
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-14
<400> 646
Figure 105110432-A0305-02-0499-801
Figure 105110432-A0305-02-0500-802
<210> 647
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-15
<400> 647
Figure 105110432-A0305-02-0500-803
Figure 105110432-A0305-02-0501-804
<210> 648
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33-16
<400> 648
Figure 105110432-A0305-02-0501-805
Figure 105110432-A0305-02-0502-806
<210> 649
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 獼猴HisAvi_IL-33
<400> 649
Figure 105110432-A0305-02-0502-807
Figure 105110432-A0305-02-0503-808
<210> 650
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類ST2 ECD-Flag-his10
<400> 650
Figure 105110432-A0305-02-0503-809
Figure 105110432-A0305-02-0504-810

Claims (26)

  1. 一種結合還原型式之IL-33(redIL-33)的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO：543之序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO：544之序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO：545之序列的VHCDR3、具有SEQ ID NO：548之序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO：549之序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO：550之序列的VLCDR3。
  2. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段之VH及VL分別包含與SEQ ID NO：542及SEQ ID NO：547至少95%、90%或85%一致之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO：542之序列的VH及具有SEQ ID NO：547之序列的VL。
  4. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO：616之序列的VH及具有SEQ ID NO：618之序列的VL。
  5. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其選自由以下組成之群：人類抗體、嵌合抗體及人類化抗體。
  6. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其選自由以下組成之群：天然存在之抗體、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及單鏈抗體。
  7. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其為單株抗體。
  8. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  9. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段之VH。
  10. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段之VL。
  11. 一種載體，其包含如請求項8至10中任一項之聚核苷酸。
  12. 一種組合物，其包含如請求項8至10中任一項之聚核苷酸或如請求項11之載體。
  13. 一種宿主細胞，其包含如請求項8至10中任一項之聚核苷酸或如請求項11之載體。
  14. 一種包含至少第一及第二載體之宿主細胞，其中該第一載體與該第二載體不相同，其中該第一載體包含編碼免疫球蛋白重鏈可變區之如請求項9之聚核苷酸，且其中該第二載體包含編碼免疫球蛋白輕鏈可變區之如請求項10之聚核苷酸。
  15. 一種產生抗IL33抗體或其抗原結合片段之方法，其包含培養如請求項13或14之宿主細胞及回收該抗體或其抗原結合片段。
  16. 一種抗IL33抗體或其抗原結合片段，其藉由如請求項15之方法產生。
  17. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段及載劑。
  18. 一種組合產品，其包含如請求項1至7中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段及第二治療劑。
  19. 一種如請求項1至7中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段或如請求項17之醫藥組合物或如請求項18之組合產品的用途，其用於製造治療用藥物。
  20. 一種如請求項1至7中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段或如請求項17之組合物的用途，其用於製造用以治療患有發炎性病狀之個體的藥物。
  21. 如請求項20之用途，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段抑 制IL-33驅動之細胞因子產生。
  22. 如請求項20或21之用途，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段抑制RAGE介導之效應。
  23. 如請求項20或21之用途，其中該結合分子或其抗原結合片段抑制IL-33驅動之細胞因子產生及/或RAGE介導之效應。
  24. 如請求項20或21之用途，其中該發炎性病狀為過敏性病症。
  25. 如請求項20或21之用途，其中該發炎性病狀為哮喘或COPD。
  26. 如請求項20或21之用途，其中該發炎性病狀係在該個體之氣管中。
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