CN102000138A

CN102000138A - 一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法

Info

Publication number: CN102000138A
Application number: CN 201010523065
Authority: CN
Inventors: 阿吉艾克拜尔·艾萨; 程珍; 阿布力米提·伊力; 吕俏莹; 高彦华; 窦君
Original assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2030-10-28
Also published as: CN102000138B

Abstract

本发明涉及一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法是挑选优质鹰嘴豆，经发芽，采摘豆芽，晾干，粉碎，加入乙醇，加热回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，得提取液，再用聚酰胺-大孔树脂进行纯化，乙醇溶液洗脱，减压浓缩，真干燥，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，结果表明有很好的活性。采用本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮质量含量达到52％，重现性好，树脂可重复使用。

Description

一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法

技术领域：

本发明涉及一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，具体涉及鹰嘴豆豆芽总皂苷、总异黄酮的纯化方法。

背景技术：

鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)起源于西亚、地中海沿岸，现全球播种面积已有1.5亿亩，是目前世界上第二大食用豆类作物，维吾尔族名为诺胡提，在新疆有2500年的生长历史，是维吾尔医常用药材，已收载在中华人民共和国卫生部《药品标准》维吾尔药分册和《维吾尔药志》，具有清除异常体液，开通体液闭阻，调节机体等作用。用于身体瘦弱，性欲低下，食欲不振，皮肤瘙痒及糖尿病等疾病。

鹰嘴豆豆芽中富含皂苷类成分，主要是三萜类大豆皂苷。我们测定鹰嘴豆豆芽中含有5％左右的皂苷。皂苷具有多种药理作用，如抗癌、防治心血管疾病、抗病毒、保肝以及抗血栓等作用，研究发现，B类和DDMP类大豆皂苷具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且表现为非竞争性抑制作用。鹰嘴豆皂苷被认为与降血脂作用有关。可能因与食物中的胆固醇结合(Gestener et al.1972)阻止吸收，也可能与胆汁酸结合干扰肝肠循环，增加粪排(Sidhu & Oakenful，1986)。而且胆汁酸的粪排增加就会引起肝内补偿性胆汁酸合成，消耗胆固醇，从而降低血浆胆固醇。鹰嘴豆抗癌作用的有效成分可能是三萜皂苷。

鹰嘴豆豆芽中富含异黄酮，是原豆中的300倍左右。异黄酮由于结构上类似于β雌二醇，因此近年来，异黄酮已广泛用于与年龄和激素有关的疾病的预防和治疗，如糖尿病、高血压、肿瘤等。因为植物雌激素可通过选择性的激活雌激素受体α和抑制雌激素受体β，从而提高胰岛素效应组织葡萄糖运载体4的表达和葡萄糖的吸收。因此对鹰嘴豆豆芽总皂苷、总异黄酮进行纯化研究，使其在保健和医药行业中得到应用。

传统的皂苷、异黄酮分离精制方法有化学溶剂沉淀法和柱色谱分离法。化学溶剂沉淀法需使用大量的化学试剂，不适用于工业化生产，且皂苷、异黄酮纯度较低。目前常用柱色谱分离法有硅胶柱，葡聚糖凝胶柱，聚酰胺柱和大孔树脂法。硅胶柱、葡聚糖凝胶柱等方法可纯化出纯度很高的皂苷和异黄酮，但其操作复杂，费用高，也不适用于工业化生产。利用聚酰胺、大孔树脂纯化皂苷、异黄酮，该法具有耗费溶剂量少，回收率较高的特点，且这两种吸附材料价格便宜，可反复使用，适用于生产化需求。鉴于鹰嘴豆豆芽提取物水溶性差的特性，不易于直接采用大孔树脂分离，而采用单一聚酰胺进行精制，纯化物纯度较低，因此，本研究采用聚酰胺-大孔树脂联用技术纯化鹰嘴豆豆芽提取物，可以提高皂苷、异黄酮活性成分纯度，使其在保健和医药行业中得到应用。

发明内容：

本发明目的在于，提供一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法是由挑选优质鹰嘴豆，经发芽，采摘豆芽，晾干，粉碎，加入乙醇，加热回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，得提取液，再用聚酰胺-大孔树脂进行纯化，乙醇溶液洗脱，减压浓缩，真干燥，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，结果表明有很好的活性。采用本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮质量含量达到52％，重现性好，树脂可重复使用。

本发明所述的一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，按下列步骤进行：

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，水温为25-35℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过80-100目筛，以质量体积比5-15倍量的30％-80％乙醇，加热回流提取1-3h，提取1-4次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，减压浓缩、干燥，大孔树脂进行纯化，树脂径高比为1∶1-8，以1-7倍体积的20％-40％乙醇洗除杂，再以50-80％乙醇洗脱，收集1-7倍体积洗脱液；

d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45℃真干燥，真空度20Pa，加热温度30-45℃，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分。

步骤a浸泡时加入0.02-2.00mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，100-500mg/L(NH4)2SO4和先用5mL乙醇溶解的0.02-2.00mg/L2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆。

步骤c鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为1-10∶1，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为1-7∶1。

步骤c大孔树脂为HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、D141、D101、SA-3或FL-3型。

所述的方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分为总皂苷、总异黄酮，其质量含量为52-55％。

本发明提供的鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法具有以下优点：

通过鹰嘴豆发芽这一简单的生物反应，可显著提高鹰嘴豆降血糖功能因子皂苷和异黄酮的含量，利于其进一步纯化。

以乙醇为溶剂和洗脱剂，价廉、无毒。

采用的聚酰胺和FL-3大孔树脂进行纯化，这两种树脂价格较低，且安全性较高，FL-3大孔树脂符合国家关于食品工业用大孔树脂的国家标准，是目前国内药品行业常用的纯化填料。

获得的鹰嘴豆豆芽提取物中的有效成分总皂苷、总异黄酮质量含量52-55％。

本发明所述的一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法对不同型号大孔树脂对纯化物总皂苷、总异黄酮含量的影响；药材与聚酰胺用量分析；药材与大孔树脂用量比分析；树脂解吸剂对纯化物总皂苷、总异黄酮含量的影响；70％乙醇的动态解吸和色谱柱径高比分析的测试：

大孔树脂型号筛选：

取等量不同型号的大孔树脂，预处理后装柱(5mL注射器)，供试液8等份分别拌入相同量的聚酰胺粉末，减压干燥后等量水洗脱，将水洗脱后的聚酰胺分别置于大孔树脂上部，再以70％乙醇洗脱，收集洗脱液5BV，测定洗脱液中总皂苷和总异黄酮含量及固体量，计算纯度和回收率。结果见图1：

利用大孔树脂吸附和分子筛双重作用，经聚酰胺初步精致的供试液进入大孔树脂柱后将得到进一步分离纯化。由图1可以看出，8种大孔树脂中，FL-3大孔树脂在富集物总异黄酮和总皂苷纯度及回收率方面效果较好。

鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺用量比分析：

称取等量的已处理好的聚酰胺，分别伴以供试液，使供试液所对应鹰嘴豆豆芽粉-聚酰胺用量比分别为1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、10∶1，相同量水洗后，以70％乙醇洗脱，收集7BV洗脱液，测定洗脱液中相应指标，计算其纯度和回收率。结果见图2：

由图2可知，随着鹰嘴豆豆芽粉-聚酰胺用量比增大，洗脱液中的总异黄酮和皂苷增加，而收率明显降低，到鹰嘴豆豆芽粉-聚酰胺比达到10∶1时，纯度和收率都最低，这可能是由于聚酰胺相对供试液用量减少后，对异黄酮和皂苷杂质的吸附和截留同时减少，是在水洗脱除杂过程中，大量的异黄酮和皂苷流失。

鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂用量比分析：

称取等量的已处理好的FL-3大孔树脂各10g，湿法装柱，分别量取供试液，以鹰嘴豆豆芽粉-聚酰胺用量比5∶1伴以聚酰胺，等量水洗后，以供试液所对应的鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂用量比分别为1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1，置于树脂上部，以70％乙醇洗脱，收集洗脱液7BV，测定洗脱液中相应指标，计算其纯度和回收率。结果见图3：

由图3可以看出，随着鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂用量比增加，总异黄酮的收率随之增高，总皂苷收率在3∶1时最高，再增大时开始降低，在3∶1时，总异黄酮和总皂苷的纯度都最高。

聚酰胺-大孔树脂联用洗脱剂的选择：

取上柱供试液750mL，拌入6g干燥的聚酰胺粉末，减压干燥后置于10gFL-3大孔树脂上，用水、20％、40％、60％、80％乙醇依次以2BV/h流速洗脱，分别收集5BV洗脱液，测定洗脱物中总皂苷和总异黄酮量。计算收率(％)＝[洗脱液中总皂苷(异黄酮量)/上柱前药液所含总皂苷/(异黄酮量)]×100％。结果见图4：

从图4中看出，异黄酮和皂苷主要集中在40％乙醇到80％乙醇洗脱剂之间，进一步筛选结果表明，异黄酮、皂苷纯度70％＞60％＞80％，选择70％作为其洗脱剂。

洗脱剂用量的考察：

取上柱供试液750mL，拌入6g干燥的聚酰胺粉末，减压干燥后置于10gFL-3大孔树脂上，2根平行柱，分别用水、40％乙醇依次以2BV/h流速洗脱，分别收集5BV洗脱液，再以70％乙醇洗脱5BV，收集洗脱液，测定洗脱物中总皂苷和总异黄酮量。测定各洗脱部位蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性，结果见表2：

表2 聚酰胺-大孔树脂联用富集各部位皂苷和异黄酮纯度及PTP1B抑制活性

结合以上实验结果，选择40％乙醇洗脱除杂。以药材-聚酰胺用量比5∶1伴以聚酰胺，称取一定量的已处理好的FL-3大孔树脂，以色谱柱径高比为1∶6装柱，以40％乙醇洗脱4BV除杂，再以70％乙醇洗脱，每1BV洗脱液收集一次，测定其总异黄酮和总皂苷量，确定70％乙醇洗脱体积，结果见图5：

由图5看出，70％乙醇洗脱至6BV时，异黄酮和皂苷类成分的洗脱效率达到平衡，进而又分析了洗脱剂洗脱5BV和6BV总异黄酮和总皂苷的纯度，结果见表3：

表3 洗脱液中总异黄酮和总皂苷纯度

结合以上结果，选择4BV40％乙醇洗脱除杂，再以5BV 70％乙醇洗脱，收集洗脱液。

色谱柱径高比分析：

以鹰嘴豆豆芽粉-聚酰胺用量比5∶1伴以聚酰胺，称取一定量的已处理好的FL-3大孔树脂，以色谱柱径高比为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8分别装柱，以40％乙醇洗脱4BV，再以70％乙醇洗脱，收集洗脱液7BV，测定洗脱液中相应指标，计算其纯度和回收率。结果见图5：

色谱柱径高比达到1∶8时，洗脱液无法流动，原因可能由于柱太高，柱压大，色谱填料被压缩太紧，导致洗脱液不流动，因此无法适于生产需要。

由图4看出，径高比达到1∶6时，有效成分纯度和回收率最高，得到较好富集。

附图说明：

图1为本发明不同型号大孔树脂对纯化物总皂苷、总异黄酮含量的影响图，其中

是皂苷纯度，

是皂苷回收率，

是异黄酮纯度，是异黄酮回收率。

图2为本发明鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺用量分析图，其中a是总异黄酮，b是总皂苷，

是回收率，是纯度。

图3为本发明鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂用量比分析图，其中a是总异黄酮，b是总皂苷，是回收率，

是纯度。

图4为本发明树脂解吸剂对纯化物总皂苷、总异黄酮含量的影响图，其中

是异黄酮，

是皂苷。

图5为本发明70％乙醇的动态解吸曲线图，其中

是异黄酮，

是皂苷。

图6为本发明色谱柱径高比分析图，其中a是总异黄酮，b是总皂苷，

是回收率，是纯度。

具体实施方式：

本发明将结合具体实施例作进一步说明，但不限于此实施例范围。

实施例1

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入0.02mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，100mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的0.02mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为25℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过80目筛，取500g豆芽粉以质量体积比5倍量的浓度为30％乙醇，加热回流提取1h，提取1次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺质量比为1∶1减压浓缩、干燥，用HPD100大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为1∶1，树脂径高比为1∶1，以1倍体积的浓度为20％乙醇洗除杂，再以浓度为50％乙醇洗脱，收集1倍体积洗脱液；

d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45℃真干燥，真空度20Pa，加热温度30℃，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，其质量含量为52％。

实施例2

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入0.10mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，150mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的0.10mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为28℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过90目筛，取500g豆芽粉以质量体积比8倍量的浓度为45％乙醇，加热回流提取2h，提取2次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为2∶1，减压浓缩、干燥，用HPD300大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为2∶1，树脂径高比为1∶2，以2倍体积的浓度为25％乙醇洗除杂，再以浓度为60％乙醇洗脱，收集2倍体积洗脱液；

d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45℃真干燥，真空度20Pa，加热温度35℃，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，其质量含量为53％。

实施例3

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入0.50mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，200mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的0.50mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为30℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过100目筛，取500g豆芽粉以质量体积比15倍量的浓度为75％乙醇，加热回流提取3h，提取4次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为4∶1，减压浓缩、干燥，用HPD450大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为3∶1，树脂径高比为1∶4，以4倍体积的浓度为35％乙醇洗除杂，再以浓度为60％乙醇洗脱，收集4倍体积洗脱液；

d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45℃真干燥，真空度20Pa，加热温度45℃，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，其质量含量为54％。

实施例4

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入0.80mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，250mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的0.80mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为32℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过80目筛，取500g豆芽粉以质量体积比8倍量的浓度为80％乙醇，加热回流提取2.5h，提取2次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为5∶1，减压浓缩、干燥，用HPD600大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为5∶1，树脂径高比为1∶5，以6倍体积的浓度为40％乙醇洗除杂，再以80％乙醇洗脱，收集6倍体积洗脱液；

d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45℃真干燥，真空度20Pa，加热温度45℃，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，其质量含量为55％。

实施例5

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入1.0mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，300mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为35℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过100目筛，取500g豆芽粉以质量体积比15倍量的80％乙醇，加热回流提取3h，提取4次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为10∶1，减压浓缩、干燥，用D141大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为7∶1，树脂径高比为1∶8，以7倍体积的浓度为40％乙醇洗除杂，再以75％乙醇洗脱，收集7倍体积洗脱液；

实施例6

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入1.4mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，380mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的1.4mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为30℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过90目筛，取500g豆芽粉以质量体积比12倍量的浓度为45％乙醇，加热回流提取1.5h，提取2次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为6∶1，减压浓缩、干燥，用D101大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为6∶1，树脂径高比为1∶7，以5倍体积的浓度为25％乙醇洗除杂，再以浓度为55％乙醇洗脱，收集5倍体积洗脱液；

d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45℃真干燥，真空度20Pa，加热温度32℃，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，其质量含量为54％。

实施例7

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入1.8mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，450mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的1.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为29℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过80目筛，取500g豆芽粉以质量体积比9倍量的浓度为50％乙醇，加热回流提取1h，提取1次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为9∶1，减压浓缩、干燥，用SA-3大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为5∶1，树脂径高比为1∶5，以3倍体积的浓度为35％乙醇洗除杂，再以浓度为60％乙醇洗脱，收集3倍体积洗脱液；

d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45℃真干燥，真空度20Pa，加热温度40℃，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，其质量含量为52-55％。

实施例8

a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，浸泡时加入2.00mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，500mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的2.00mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆，水温为35℃，用水量为鹰嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27℃，每4h淋一次水，经6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；

b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过80目筛，取500g豆芽粉以质量体积比15倍量的80％乙醇，加热回流提取1h，提取4次，收集提取液，减压回收乙醇；

c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为7∶1，减压浓缩、干燥，用FL-3大孔树脂进行纯化，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为7∶1，树脂径高比为1∶6，以4倍体积的浓度为20％乙醇洗除杂，再以浓度为70％乙醇洗脱，收集4倍体积洗脱液；

实施例9

鹰嘴豆豆芽有效成分纯化物降糖体外筛选—蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制实验：

待测样品溶于DMSO，初始浓度为100mM×L^-1，DMSO稀释，分别配成浓度为10，1，0.1，0.01mm×L^-1的样品溶液。阳性对照药：NaVO₃。IC50：4μg×mL^-1。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性测定采用微量法，测试反应体系：样品溶液1μL，再加入179μL含0.09μmol×L^-1蛋白酪氨酸磷酸酶1B的缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸，150mmol×L^-1NaCl，和1mmol×L^-1乙二胺四乙酸，pH＝7.0)，室温孵育10min，然后加入20μL 35mmol×L^-1对硝基苯磷酸二钠盐，，总体积为200μL，室温孵育30min后，用10μL 3mol×L^-1的NaOH溶液终止反应，在405nm处测定吸收值，以不含酶的溶液体系为空白。

按上述活性测试方法，化合物样品按不同剂量加入，405nm处测定吸收值，每个实验重复3次，抑制率＝(OD405空白-OD405样品)/OD405空白×100％。

表鹰嘴豆豆芽提取物和纯化物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性筛选

样品	IC50(μg/mL)
		鹰嘴豆提取物	347.8
鹰嘴豆豆芽提取物	124.72
		树脂纯化物	11.99
阳性对照(钒酸钠)	4

由表中可以看出，鹰嘴豆豆芽提取物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制率明显高于鹰嘴豆提取物的活性，对鹰嘴豆豆芽提取物纯化研究是有必要的，为其在保健和医药行业中得到应用奠定理论基础。树脂纯化后的产品对蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制率明显高于纯化前的鹰嘴豆豆芽提取物的活性，表明该纯化方法确实可行。

Claims

1.一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，其特征在于按下列步骤进行：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a浸泡时加入0.02-2.00mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，100-500mg/L(NH₄)₂SO₄和先用5mL乙醇溶解的0.02-2.00mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为1-10∶1，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为1-7∶1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c大孔树脂为HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、D141、D101、SA-3或FL-3型。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于采用该方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分为总皂苷、总异黄酮，其质量含量为52-55％。