CN115716858B - 一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β‑谷甾醇的方法，属于生物技术领域，包括以下步骤：1）将牡丹籽粕经过干燥、粉碎加入丙酮超声萃取，得到提取液；2）将过滤后的提取液进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏；3）取少量的甲醇多次溶解牡丹籽粕粗提物的浸膏，置于硅胶层析柱中，流动相为正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5，V／V），分段收集后，合并点板比移值Rf=0.33部位的组分；4）将合并后的组分减压浓缩，冷冻干燥后得到β‑谷甾醇。使用本发明方法获得活性化合物β‑谷甾醇，提取率高，纯度在90%以上。方法简单，易于产业化，且成本低廉，为牡丹籽粕的废物深加工和高值化开发利用提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及牡丹籽粕的综合利用技术，具体涉及一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法。
背景技术
牡丹籽油是由牡丹籽提取的富含不饱和脂肪酸的植物油，其营养成分主要包括油酸、α-亚麻酸、亚油酸、角鲨烯、维生素E等。因其营养丰富而独特，被称为“世界上最好的油，”是植物油中的珍品。牡丹籽粕是油用牡丹籽通过压榨法或CO2超临界萃取法获取牡丹籽油后留下的固体残存物，目前牡丹产业化主要集中在牡丹籽油的生产工艺和用途功效的研究方面，对牡丹籽油生产过程中产生的籽粕的深加工的报道较少。因此针对以上的情况，需要对牡丹籽粕进行精细化处理，实现牡丹籽粕的综合利用，将牡丹籽粕中的活性化合物β-谷甾醇提取利用，最大化的实现其经济价值。
β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，广泛存在于各种植物油、果蔬、植物种子中，尤其在植物油中含量相对较高，其化学结构如附图1所示，属于四环三萜类化合物。此外，我国保健食品中较常见的40余种中草药，如杜仲、天冬、地黄、玄参等均有较高含量的植物甾醇，总量高达2.0 g/kg，其中β-谷甾醇是其主要的植物甾醇单体，占50%以上。目前，β-谷甾醇单体主要通过化学、物理方法提纯得到，具有较强的生理活性、极高的营养价值，广泛应用于医药、保健品、化妆品等领域。研究发现，β-谷甾醇在抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、中枢神经系统等方面表现出良好的药理作用。随着对其生理活性研究的不断深入，β-谷甾醇的分离纯化及其潜在的药理活性研究成为热点。
现阶段，β-谷甾醇主要从植物油精炼的脱臭馏出物中提取混合植物甾醇，进而分离纯化，获得纯品。牡丹籽粕作为生产牡丹籽油后的加工副产物，在实际生产中，往往作为动物饲料或植物肥料等粗放的加以利用。目前，关于从牡丹籽粕中分离纯化β-谷甾醇的相关研究鲜有报道。因此，本发明提供一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，无论从社会经济价值、药用价值还是科研价值来看，都具有重要的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，所述方法通过对各项操作步骤和参数进行调整和优化，从油用牡丹籽粕中有效提取到活性化合物β-谷甾醇，且步骤简单，提取产量高、纯度好。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）取牡丹籽经过机械压榨制取牡丹籽油后残留的籽粕，首先放置在鼓风干燥箱中60-80℃，干燥处理2-3小时；并经过200目的粉碎机粉碎后，置于超声提取器内，加入丙酮进行超声萃取至少三次，收集合并的丙酮萃取液，减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏；
（2）采用甲醇溶解牡丹籽粕粗提物的浸膏，置于硅胶层析柱中进行常压洗脱，硅胶柱的规格选用200～300目的正相硅胶；流动相为正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5，V／V），流速为10～20ml/min，分段收集后，合并在薄层板层析中点板比移值Rf=0.33的部位；将合并后部位在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，冷冻干燥后得到化合物β-谷甾醇。
优选地，步骤（1）中，所述牡丹籽采用油用牡丹品种“凤丹”或“紫斑”。
优选地，步骤（1）中，每100g籽粕，经干燥、粉碎后，加入150mL丙酮进行超声萃取，萃取三次，合并萃取液，在40℃旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏。
有益效果：本发明综合β-谷甾醇和油用牡丹籽粕的性质，采用常规的薄层层析方法，通过对各项操作步骤和工艺参数进行调整和优化，从牡丹油用牡丹籽粕中有效提取到活性化合物β-谷甾醇，大大增加了油用牡丹的综合利用价值。采用本发明方法提取活性化合物β-谷甾醇，提取率为1.2%，经过气相质谱联用（GC-MS）分析鉴定，其纯度在90%以上。本发明方法简单，易于产业化，且成本低廉，为牡丹籽粕的废物深加工和高值化开发利用提供技术支撑。
附图说明
图1 活性化合物β-谷甾醇的化学结构式；
图2 本方法制取β-谷甾醇的流程图；
图3 标准品β-谷甾醇的薄层层析的结果；
图4 牡丹籽粕粗提物通过薄层层析的结果；其中，A为牡丹籽粕粗提物通过薄层层析板在紫外356nm下的显色情况； B为牡丹籽粕粗提物通过薄层层析板在碘蒸汽中的显色情况；
图5 牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的总离子流图；
图6 牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的质谱图。
具体实施方式
一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，包括以下步骤：
1、油用牡丹籽粕的前处理。
取油用牡丹品种“凤丹”或“紫斑”的牡丹籽，经过机械压榨制取牡丹籽油后残留的籽粕100g，首先放置在鼓风干燥箱中60-80℃，干燥处理2-3小时；并经过200目的粉碎机粉碎后，置于超声提取器内，加入150mL丙酮进行超声萃取三次后，收集合并的丙酮萃取液，在40℃旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏5.6g。
2、β-谷甾醇的分离纯化。
取少量的甲醇多次溶解牡丹籽粕的粗体物浸膏，置于硅胶层析柱中进行常压洗脱，硅胶柱的规格选用，正相硅胶的规格为200～300目；流动相为正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5，V／V），流速为为10～20ml/min，分段收集后，合并在薄层板层析中点板比移值Rf=0.33的部位，薄层板选用的规格为青岛海洋化工GF254；将合并后部位在在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，冷冻干燥后得到化合物β-谷甾醇1.2g。如图3薄层层析板点板粗提物的结果。
3、β-谷甾醇的分析检测。
取少量冷冻干燥后获得的提纯化合物β-谷甾醇，溶于色谱级的正己烷中，置于气相质谱（GC-MS）进行成分分析和鉴定。仪器型号为安捷伦7890B-5977B：色谱条件:HP-5MS色谱柱(30mx0.25mmx0.25μm，美国安捷伦公司)，初始柱温120℃，以12℃/min程序升温至300℃，保持20min。进样口温度300℃，载气为高纯氦气(99.999%)，柱流量100mL/min，不分流，设置进样量为1.0uL。
质谱条件:电离方式为电子轰击离子源(El离子源)，电子能量70eV，质量扫描范围35~500u，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC-MS接口温度300℃，扫描方式为Scan，标准质谱图库NIST17。使用本发明的方法获得活性化合物β-谷甾醇，经过GC-MS分析鉴定，其纯度在90%以上。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：β-谷甾醇粗体物的获得
取油用牡丹品种“凤丹”或“紫斑”的牡丹籽，经过机械压榨制取牡丹籽油后残留的籽粕100g，首先放置在鼓风干燥箱中60-80℃。考察干燥处理时间与水分的关系。设置干燥时间分别为1h、2h、3h、4h、5h。通过水分测定仪测定分析，考察不同干燥时间处理与牡丹籽粕的水分含量关系，结果如下表1所示。综合能耗成本和处理效率，最终确定干燥时间为2-3小时；并经过200目的粉碎机粉碎后，置于超声提取器内，加入150mL丙酮，进行超声萃取三次后，收集合并的丙酮萃取液，在40℃旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏5.6g。
表1. 不同干燥时间处理与牡丹籽粕的水分含量情况。
实施例2：β-谷甾醇的分离纯化
取少量的甲醇多次溶解牡丹籽粕的粗体物浸膏，置于硅胶层析柱中进行常压洗脱，硅胶柱的规格选用，正相硅胶的规格为200～300目；配制不同比例组分的洗脱溶剂作为流动相进行实验，各种洗脱溶剂对β-谷甾醇的分离结果如表 2 所示，拖尾严重的现象说明此种流动相分离效果欠佳，Rf值在 0.30~0.60 之间比较合适。最终确定最佳的流动相为正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5，V／V），流速固定为10～20ml/min，分段收集后，合并在薄层板层析中点板比移值Rf=0.33的部位，薄层板选用的规格为青岛海洋化工GF254；将合并后部位在在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，冷冻干燥后得到化合物β-谷甾醇1.2g。如图3为标准品β-谷甾醇的薄层层析的结果；如图4为牡丹籽粕粗提物通过薄层层析的结果。
表2. 不同洗脱溶剂和比例作为流动相对β-谷甾醇分离的影响。
| 编号 | 流动相（体积比） | 拖尾 | 比移值Rf |
| 1 | 乙酸乙酯：甲醇（2：1） | + | 1 |
| 2 | 乙酸乙酯：甲醇（6：1） | + | 1 |
| 3 | 乙酸乙酯：甲醇（9：1） | + | 1 |
| 4 | 正己烷：乙酸乙酯（2：1） | - | 0.72 |
| 5 | 正己烷：乙酸乙酯（6.5：1.5） | - | 0.33 |
| 6 | 正己烷：乙酸乙酯（9.5：1.5） | + | 0.15 |
| 7 | 二氯甲烷：乙酸乙酯（1：1） | + | 0.26 |
| 8 | 二氯甲烷：乙酸乙酯（3：1） | - | 0.18 |
| 9 | 二氯甲烷：乙酸乙酯（8：1） | + | 0 |
注：+表示拖尾且斑点可分辨；-表示不拖尾且斑点圆整清晰。
实施例3：β-谷甾醇纯度的验证
取少量冷冻干燥后获得的提纯化合物β-谷甾醇，溶于色谱级的正己烷中，置于气相质谱（GC-MS）进行成分分析和鉴定。仪器型号为安捷伦7890B-5977B：色谱条件:HP-5MS色谱柱(30mx0.25mmx0.25μm，美国安捷伦公司)，初始柱温120℃，以12℃/min程序升温至300℃，保持20min。进样口温度300℃，载气为高纯氦气(99.999%)，柱流量100mL/min，不分流，设置进样量为1.0uL。质谱条件:电离方式为电子轰击离子源(El离子源)，电子能量70eV，质量扫描范围35~500u，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC-MS接口温度300℃，扫描方式为Scan，标准质谱图库NIST17。使用本发明的方法获得活性化合物β-谷甾醇，经过GC-MS分析鉴定，其纯度在90%以上。如图5为牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的总离子流图；图6为牡丹籽粕中提取物β-谷甾醇经GC-MS分析的质谱图。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种从油用牡丹籽粕中提取活性化合物β-谷甾醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取牡丹籽经过机械压榨制取牡丹籽油后残留的籽粕，首先放置在鼓风干燥箱中60-80℃，干燥处理2-3小时；并经过200目的粉碎机粉碎后，置于超声提取器内，加入丙酮进行超声萃取至少三次，收集合并的丙酮萃取液，减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏；
（2）采用甲醇溶解牡丹籽粕粗提物的浸膏，置于硅胶层析柱中进行常压洗脱，硅胶柱的规格选用200～300目的正相硅胶；流动相为体积比为6.5：1.5的正己烷：乙酸乙酯，流速为10～20ml/min，分段收集后，合并在薄层板层析中点板比移值Rf=0.33的部位；将合并后部位在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，冷冻干燥后得到化合物β-谷甾醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述牡丹籽采用油用牡丹品种“凤丹”或“紫斑”。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，每100g籽粕，经干燥、粉碎后，加入150mL丙酮进行超声萃取，萃取三次，合并萃取液，在40℃旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到牡丹籽粕粗提物的浸膏。
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