CN101028341B - 木兰科植物提取物、制备方法以及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有吉马烷型倍半萜内酯的植物提取物,其制备方法和在食品、医药中的应用。本发明所述的木兰科植物提取物是由木兰科玉兰属植物和含笑属植物经冷浸或温浸或回流方式提取,再以液液萃取,柱层析方式纯化制备而得,其中含有重量百分比为2%~95%吉马烷型倍半萜内酯。该提取物可以制成各种口服以及注射制剂,用于血管神经性头痛的预防、治疗和辅助治疗,心脑血管疾病的预防、治疗和辅助治疗、实体性恶性肿瘤和白血病的预防、治疗和辅助治疗等。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有吉马烷型倍半萜内酯的植物提取物,其制备方法和在食品、医药中的应用。
背景技术
在世界上50多万种植物中,蕴藏着丰富的药用植物资源与天然活性产物。人类很早就知道,许多植物及其所含有的天然活性有效部位和有效成分可以预防、治疗疾病。100多年来,尤其是近半个多世纪以来,人们在寻找药用植物资源及其天然活性产物方面,获得了很大成功。直到现在,高等植物仍然是发现新药的重要途径。随着人们生活水平的提高和健康理念的改变,对天然药物的需求也日益增长。尽管数千年来,人类已经发现了数以千计的植物可以用于治疗疾病,但就整体而言,已作为药物开发使用的,仅仅只是全部植物中很少部分,还有大量的植物及其所含有的天然活性有效部位和有效成分需要进一步地发掘。
木兰科Magnoliaceae是双子叶植物中最古老的科之一,在我国共有73个种,广泛分布于东南部至西南部地区,多数作为观赏性植物而种植,其中也有少部分种,如厚朴、辛夷(望春花)等在我国作为传统中药使用。在民间,木兰科的一些植物也作为草药用于治疗疾病。除厚朴、辛夷等少数种在我国作为传统中药使用外,木兰科植物中的多数种均未进行药用开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有功能性的、含有吉马烷型倍半萜内酯的植物提取物。
本发明的另一目的在于提供这种植物提取物的制备方法。
本发明的再一目的是提供这种植物提取物的用途。
本发明所述的木兰科植物提取物是由木兰科玉兰属植物和含笑属植物经冷 浸或温浸或回流方式提取,再以液液萃取,柱层析方式纯化制备而得,其中含有重量百分比为2%~95%吉马烷型倍半萜内酯。更佳的范围为:吉马烷型倍半萜内酯含量为重量百分比50~95%。
所述的玉兰属植物为玉兰Magnolia denudate、荷花玉兰Magnolia grandiflora等;所述的含笑属植物为云南含笑Michelia yunnanensis、壮丽含笑Michelia lacei等。
本发明所述的木兰科植物提取物的制备方法由以下步骤组成:
一、以上述植物的叶、根皮或/和茎皮为原料,用5~10倍重量、介电常数值为1.5~45的有机溶剂,在绝对压力0.03~4MPa、温度15~85℃条件下提取,得提取液;
二、上述提取液在绝对压力0.03~0.11MPa、35~80℃条件下浓缩至无有机溶剂,得干浸膏;
三、上述干浸膏以介电常数值为1.5~45、在水中溶解度小于0.08ml/ml的有机溶剂-水体系,在室温常压下萃取,有机溶剂∶水的体积比为1∶0.2~4,取有机溶剂层,浓缩至膏状物;
四、取上述膏状物与200~400目硅胶拌和后装入层析柱,用介电常数值为1.5~45、且互溶的二元或三元有机溶剂系,在室温、绝对压力0.1~3.5MPa压力下进行洗脱;再用薄层层析色谱,展开剂为石油醚-丙酮(4∶0.8~2),以吉马烷型倍半萜内酯为对照物质进行流份的检测,收集含吉马烷型倍半萜内酯的流份,在0.03~0.11MPa、35~80℃条件下浓缩至干,即可得提取物。
在步骤一中所使用的介电常数值为1.5~45的有机溶剂主要是乙腈(介电常数值36.6)、甲醇(33)、乙醇(24.3)、丙醇(20.1)、异丙醇(17.9)、丙酮(20.7)、正丁醇(17.8)、乙酸(6.15)、乙酸乙酯(6.02)、氯仿(4.81)、二氯甲烷(9.08)、二氧六环(2.25)、环己烷(2.02)、石油醚(1.8)等,可以是一种或一种以上混合使用,提取次数可以是多次,每次2~24小时;步骤三中所述的介电常数值为1.5~45、在水中溶解度小于0.08ml/ml的有机溶剂主要是氯仿、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯等,萃取次数可为多次;步骤四中所述介 电常数值为1.5~45、且互溶的二元或三元有机溶剂系主要为氯仿-甲醇(体积比8∶0.6~3),氯仿-甲醇-水(体积比9∶0.3~3∶0.3~1),丙酮-石油醚(体积比4∶0.5~3),丙酮-石油醚-水(体积比8∶0.5~4∶0.3~2),醋酸乙酯-甲醇(体积比9∶0.4~3),醋酸乙酯-石油醚-甲醇(体积比8∶0.5~4∶0.3~2),二氯甲烷-石油醚(体积比8∶0.6~3)等。
上述步骤一至三所得膏状物为粗提物,此粗提物中吉马烷型倍半萜内酯含量约为重量百分比2~12%;步骤一至四所得提取物为精提物,其中吉马烷型倍半萜内酯含量为重量百分比12~95%。
经研究发现木兰科木兰属和含笑属中部分植物含有较为丰富的天然倍半萜化合物。倍半萜是由3分子异戊二烯聚合而成,分子中含有15个C原子的一类天然萜类化合物,是挥发油的主要组成成分之一,沸点较高,其含氧衍生物,如醇、醛、酮、羧酸、酯(内酯)类以及苷等,大多有较强的香气。其中在部分木兰科植物如玉兰属植物玉兰Magnolia denudate、荷花玉兰Magnoliagrandiflora或含笑属植物云南含笑Michelia yunnanensis、壮丽含笑Michelia lacei中所含有的吉马烷型倍半萜内酯,具有多方面生物活性。我们的研究证明,上述植物中含有在γ2内酯环C11~C13上具双键的吉马烷型倍半萜的提取物、有效部位和有效成分者,活性均较强,可用于血管神经性头痛的预防、治疗和辅助治疗,心脑血管疾病的预防、治疗和辅助治疗、实体性恶性肿瘤和白血病的预防、治疗和辅助治疗等。
本发明提取物可以依常规的方法加入适当辅料制成药物制剂或功能性食品,如散剂、颗粒剂、胶囊剂、缓释和控释胶囊剂、素片和包衣片、缓释和控释片、分散片、口含片、口服液、软胶囊、滴丸等,吉马烷型倍半萜内酯含量为重量百分比80%以上时也可以制备为注射剂、注射用粉针、含药输液剂等。
本发明所述的天然药物和功能性食品可用于神经血管性头痛疾病的预防、治疗和辅助治疗,心脑血管疾病的预防、治疗和辅助治疗、实体性恶性肿瘤(肺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、卵巢癌、神经胶质瘤等)和白血病的预防、治疗和辅助治疗等。
本发明涉及所述提取物在制备治疗和辅助治疗神经血管性头痛疾病的药物中的应用。
本发明涉及所述提取物在制备治疗和辅助治疗神经血管性头痛疾病的药物中的应用。
本发明涉及所述提取物在制备治疗和辅助治疗实体性恶性肿瘤的药物中的应用。
本发明涉及所述提取物在制备治疗和辅助治疗白血病的药物中的应用。
本发明涉及所述提取物在制备预防和辅助降血压的功能性食品中的应用。
本发明涉及所述提取物在制备预防和辅助保护辐射危害的功能性食品中的应用。
以下提供本发明所述提取物的药效学及功能性实验资料:
实验一 MPA体外抗血小板聚集活性
试验材料
实验动物
雄性日本大耳白兔,体重2.0~2.2kg。
药品及试剂
供试样品:实施例4所得提取物(MPA-3),以20%聚乙二醇配制成适宜浓度备用,pH值为6.5左右。
花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和小牛血清蛋白(bovine serumalbumin,BSA)系Sigma公司产品.前者溶于含0.25%小牛血清蛋白的Tris-NaCl缓冲液中,PH7.6;后者溶于无水乙醇中,用前以1% Na2CO3稀释成0.25%的工作液。二磷酸腺苷(adenosin diphosphate,ADP)系AMRESCO进口分装,溶于生理盐水中。
试验方法:
富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)和贫血小板血浆(platelet poorplasma,PPP)的制备:自清醒兔颈总动脉取血,以3.8%枸橼酸钠9∶1(v∶v)抗凝收集于塑料离心管中,900rpm离心8min,取上层液即为PRP,剩余 血液再以3000rpm离心5min,取上层液即为PPP,PRP中的血小板数控制在约5×1011cell/L。
按Born氏比浊法原理,采用LBY-NJ2型血小板多道凝集仪(北京普利生公司产品)进行。溶媒或药物与PRP孵育10min后,加入诱导剂(PAF:4.5nmol/L,AA:100μmol/L,ADP:5μmol/L)诱导聚集,测试5min并记录最大聚集百分率,以[(对照管聚集%-样品管聚集%)/对照管聚集%]×100计算血小板聚集抑制率。
结果:
结果表明:供试样品MPA-3体外对AA诱导的兔血小板聚集有明显抑制作用,终浓度10μg/ml时,抑制率达99.94±0.12%,其IC50为2.15±0.99μg/ml。
与抗AA诱导的血小板聚集作用类似,MPA-3对ADP和PAF诱导的血小板聚集也有明显抑制作用,但对PAF诱导聚集的抑制作用较强,终浓度10μg/ml时,抑制率均达100.00±0.00%,其IC50分别为2.17±0.67和1.22±0.31μg/ml。
**P<0.01,与对照相比(t-test)。
结论:
所送样品MPA-3体外对AA、ADP和PAF和诱导的兔血小板聚集都有明显的抑制作用,并呈浓度-效应相关性,对PAF诱导聚集的抑制作用较强, IC50分别为2.15±0.99、2.17±0.67和1.22±0.31μg/ml。提示MPA抗血小板聚集作用谱广。
实验二MPA对离体血管及回肠平滑肌活性的影响
一、材料和方法
1、动物
日本大耳白兔,体重2.0±0.2kg,雄性。杂种狗,体重10.0-12.0kg,雌雄兼用。豚鼠,体重300-400g,雌雄兼用。
2、供试品
实施例5所得提取物(MPA-4)。取10mg MPA-4加20%聚乙二醇-4000.5ml加热溶解后加生理盐水至10ml,则原液浓度为1mg/ml。取原液2ml稀释至10ml得浓度为2×10-1mg/ml液,取此液1ml稀释至10ml得2×10-2mg/ml。以此类推得经稀释后分别得2×10-3,2×10-4,2×10-5,2×10-6mg/ml。
3、试剂
去甲肾上腺素注射液,天津市和平制药厂,规格2mg/ml,取含量为2mg/ml的去甲肾上腺素注射液1ml稀释至10ml,则稀释后的浓度为0.2mg/ml。五羟色胺,瑞士进口分装,批号65-92-28,取五羟色胺8.5mg配至10ml,再稀释10倍,则五羟色胺的浓度为0.85mg/ml。组胺,中科院上海生化所东风生化技术公司,批号1703,取组胺15mg配至10ml,再稀释10倍,则组胺的浓度为0.15mg/ml。
4、营养液配方
1)血管营养液配方
1000ml g/L(mM)
Nacl 7.5(128) CaCl2(单独稀释100倍)0.24
Kcl 0.35(4.7) NaHCO3 1.0
Mgcl2 0.025(0.4) Glucose 1.0
NaH2PO4 0.1(0.8) 通O2两次共1h
b)回肠平滑肌营养液配方
1000ml g/L(mM)
Nacl 7.5(128) CaCl2(单独稀释100倍) 0.18
Kcl 0.35(4.7) NaHCO3 1.5
Mgcl2 0.05(0.6) Glucose 1.0
NaH2PO4 0.1(0.8) 通O2两次共1h
5、仪器
Shimadzu平衡自动记录仪 型号3771
SSY型离体器官恒温浴槽 型号253
张力传感器
6、方法
1)离体血管
取兔子降主动脉、门静脉及狗颈动脉,分离周围脂肪,将其置于盛有营养液的培养皿中,剪取4mm血管环,用一对不锈钢丝悬挂并置于离体器官恒温浴槽内,通O2,2g负荷,平衡1h后在盛兔主动脉、门静脉及盛狗颈动脉的装置中分别加入激动剂0.1ml去甲肾上腺素注射液及0.1ml五羟色胺,绘制去甲肾上腺素对照曲线及五羟色胺对照曲线,冲洗三次。
分别加入0.1ml去甲肾上腺素注射液及五羟色胺在兔主动脉、门静脉及狗颈动脉中,当其升高到最高点时,走纸,顺序加入D.C.B.A液,求EC50。
加1500ml药原液,走纸约10min,再加去甲肾上腺素注射液及五羟色胺0.1ml,走纸10min,冲洗。
2)离体平滑肌
与离体血管方法相似,取豚鼠回肠将其内容物冲洗干净,剪取2cm回肠段两端穿线,置于离体器官恒温水浴槽内(37℃±0.5℃),连接于张力换能器和自动平衡记录仪,通O2、1g负荷,平衡0.5h,用激动剂组胺(1ug/ml)产生收缩反应。作用至少10min,然后用营养液冲洗2-3遍,平衡15min后采用单次剂量法依次加入MPA的系列浓度D.C.B.A.观察该药对肌条收缩反应的影响,求抑制率。
二、实验结果
1、药物对兔离体主动脉、门静脉的影响
该药物对去甲肾上腺素抑制作用较强,兔主动脉1×10-7g/L,门静脉仅1×10-9g/l就能抑制去甲肾上腺素的收缩。而且药物剂量加大,抑制作用随之增强(见表一),兔主动脉、兔门静脉抑制率的EC50值分别为7.74×10-6g/l.和1.44×10-8g/L。且效应与剂量呈良好的正相关。此外,若先给1500ulMPA,再给去甲肾上腺素,则可明显观察到药物对去甲肾上腺素的抑制作用,主动脉的抑制率为23.01±29.88%,门静脉的抑制率为36.50±15.66%。
2、药物对离体狗颈动脉的影响
该药能较好的抑制五羟色胺,其抑制率EC50为1.13×10-6g/l,且效应与剂量也呈良好的正相关。
3、药物对豚鼠回肠的影响
该药物对组胺(1ug/ml)有一定抑制作用,即仅当药物浓度为2×10-1mg/ml及1mg/ml时有抑制作用,其抑制率分别为16.33±28.79%和65.30±12.38%。且抑制作用随浓度增强而增强(见表2)。
三、讨论
一般认为去甲肾上腺素激动血管的α1-R,使血管收缩,主要是使小动脉和小静脉收缩,给药后由于MPA抑制了去甲肾上腺素对血管平滑肌的直接收缩效应,使得血管舒张。
五羟色胺使血管收缩是因为它引起电位敏感性钙离子通道的开放及Ca2+内流所致,MPA对五羟色胺有拮抗作用,可能是因为MPA作用于受体及钙通道所致,MPA影响五羟色胺的分泌,拮抗了五羟色胺的作用,阻滞Ca2+内流,能明显舒张血管。
组胺是广泛存在于人体组织的自身活性物质,具强烈的舒血管作用,引起血压下降甚至休克,兴奋平滑肌,引起支气管痉挛。一定浓度的MPA对阻胺有抑制作用,可产生抗外周组胺H1-R效应,从而使胃、肠、气管、支气管平滑肌收缩,又释放血管内皮松弛因子(EDRF)和PGI2,使小血管扩张,通透性增加。
实验三 对肿瘤细胞株生长的抑制试验
(一)材料和仪器
癌株:MCF-7人乳腺癌细胞株、V937人恶性淋巴瘤细胞株、SGC-7901人胃癌细胞株。
1、受试药物:实施例4所得提取物(MPA-3),实施例2所得提取物(MPA-17)。
阳性对照药物:5-氟尿嘧啶(5-FU)。
阴性对照:含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基。
0.4%台盼蓝溶液;
Hank’s平衡盐水(HBSS)。
二氧化碳培养箱;生物显微镜;超净工作台。
2、实验方法
取对数生长期的肿瘤细胞,用含10%新生牛血清的RPMI1-640配成浓度为4×104个/ml的肿瘤细胞悬液,分装于每个培养瓶中,接种细胞悬液4ml的第2天每瓶加入受试药物40μl(受试药物用时溶于少量DMSO和95%乙醇,用含5%新生牛血清的RPMI-1640培养基分别稀释成1,5,10μg/ml3个浓度,每个浓度3瓶,阴性对照组加等体积的含10%新生牛血清的RPMI1640,阳性对照组加等体积的5-氟尿嘧啶(浓度为4μg/ml),继续在37℃,5%CO2的培养箱中培养72h,摇匀组织培养瓶,取悬浮液0.2ml,加入0.4%台盼蓝溶液0.5ml及平衡盐水0.3ml,充分混合,在血球计数板上分别计数(200个以上)其中未染色的活细胞及染色的死细胞。计算出杀伤率(公式:杀伤率=染色细胞/总细胞×100%),并通过X2(2×2)统计法对数据进行统计。
3、实验结果
实验结果见表4、表5、表6。
表6 MPA对SGC-7901人胃癌细胞株的杀伤作用
4、结论
不同浓度(10,5,1μg/ml)的MPA(MPA-3,MPA-17)对体外培养的MCF-7人乳腺癌细胞株和V937人恶性淋巴瘤细胞株、SGC-7901人胃癌细胞株均有杀伤作用,并且杀伤作用呈剂量依赖性增强(P<0.05)。
具体实施方式
本发明以下引用实施例进一步说明,但所引用实施例并不对本发明涵盖范围形成限制。
实施例1:称取云南含笑Michelia yunnanensis根皮10kg,用10倍重量甲醇,在常压下,室温冷浸提取5次,每次提取时间为24小时。提取液在绝对压力0.06MPa,50℃条件下减压浓缩至无有机溶剂。所得干浸膏以石油醚-水(体积比4∶1),在室温常压下萃取3次。合并石油醚层,在绝对压力0.06MPa,45℃条件下减压浓缩至膏状物。
取所得膏状物40g研细,过100目筛,加入过100目筛的蔗糖粉600g,乳糖1200g,微晶纤维素150g,香兰素10g,混合均匀,用适量的10%淀粉浆制粒,干燥,分装为1000份,制成颗粒剂型药物或功能性食品。
实施例2:取实施例1所得膏状物与400目硅胶拌和后装入层析柱,以氯仿-甲醇系统(8∶1),在室温常压下进行洗脱。用薄层层析色谱,展开剂为石油醚-丙酮(4∶1),以吉马烷型倍半萜内酯为对照物质进行流份的检测。收集含吉马烷型倍半萜内酯的流份,合并,在绝对压力0.06MPa,60℃条件下减压浓缩至干,即得。
称取所得物10g,用20%注射用聚乙二醇-200分散,用4%氢氧化钠调节 pH7~7.5,加1%吐温-80,滤过,灌装,灭菌,制成注射剂。
实施例3:称取荷花玉兰Magnolia grandiflora叶20kg,置索氏提取器中用5倍重量80%乙醇加热回流提取,提取温度70℃,提取时间为28小时,合并提取液,用2%活性炭脱色,滤过。在绝对压力0.06MPa,70℃条件下减压浓缩至无有机溶剂。所得干浸膏以二氯甲烷-水(体积比3∶1),在室温常压下萃取3次。合并二氯甲烷层,在绝对压力0.03MPa,60℃条件下减压浓缩至膏状物。
取该膏状物40g研细,过100目筛,加入过100目筛的淀粉100g,乳糖20g,微晶纤维素10g,硬脂酸镁10g,混合均匀,用适量的10%淀粉浆制粒,压制成1000片或充填成1000粒胶囊,制成片剂或胶囊剂。
实施例4:实施例3所得膏状物与400目硅胶拌和后装入层析柱,以丙酮-石油醚-水系统(8∶3∶1),在室温,0.3MPa压力下进行洗脱。用薄层层析色谱,展开剂为石油醚-丙酮(4∶1),以吉马烷型倍半萜内酯为对照物质进行流份的检测。收集含吉马烷型倍半萜内酯的流份,合并,在绝对压力0.06MPa,60℃条件下减压浓缩至干,即得。
称取该提取物10g,用少量乙醇溶解后,加入10%葡萄糖水溶液中,加8%甘露醇,1%吐温-80,混合均匀,无菌滤过,分装,冷冻干燥,制成注射用粉针。
实施例5:称取玉兰Magnolia denudate叶和茎皮混合物30kg,用7倍重量乙酸乙酯在2MPa压力,60℃温度下温浸提取3次,每次6小时。提取液在常压、78℃下浓缩至无有机溶剂。所得浸膏用氯仿-水系统(体积比2∶1),在常温常压下萃取3次,合并氯仿层,在绝对压力0.05MPa,55℃条件下减压浓缩至干膏状。
取该干膏100g,烘干后研细,过120目筛。900g PEG6000在油浴上加热至约110℃,加入药粉,不断搅拌使全部分散,趁热过滤,置贮液瓶中,110℃下保温,用管口内、外径分别为9.0mm、9.8mm的滴管滴制,滴速60滴/min,滴入含43%煤油的液体石蜡(外层为冰水浴)冷却液中,冷凝成丸,以液体石蜡洗丸,至无煤油味,吸去粘附的液体石蜡,制备为滴丸剂。
实施例6:称取壮丽含笑Michelia lacei叶、根皮、茎皮混合物30kg,用8倍重量丙酮,在绝对压力0.01MPa、55℃温度下,温浸提取3次,每次8小时。提取液在常压、78℃下浓缩至无有机溶剂。所得浸膏用石油醚-水系统(体积比4∶1),在常温常压下萃取3次,合并石油醚层,在绝对压力0.05MPa、55℃条件下减压浓缩至干膏状。
膏状物与400目硅胶拌和后装入层析柱,以氯仿-甲醇系统(9∶1,8∶1,7∶1),在室温,0.1MPa压力下进行梯度洗脱。用薄层层析色谱,展开剂为石油醚-丙酮(4∶1),以吉马烷型倍半萜内酯为对照物质进行流份的检测。收集含吉马烷型倍半萜内酯的流份,合并,在绝对压力0.06MPa,60℃条件下减压浓缩至略显浑浊,加入少量8∶1氯仿-甲醇混合溶剂,使之恢复澄清。冷却至室温,出现白色结晶,过滤,干燥即得。
称取该提取物10g,用20%注射用聚乙二醇-200分散在5%葡萄糖水溶液中,4%氢氧化钠调节pH7~7.5,加1%吐温-80,滤过,灌装,灭菌,制成含药输液剂。
Claims (1)
1.木兰科植物提取物在制备治疗和辅助治疗神经血管性头痛疾病的药物中的应用,所述的木兰科植物提取物是由玉兰叶和茎皮混合物30kg,用7倍重量乙酸乙酯在2MPa压力,60℃温度下温浸提取3次,每次6小时,提取液在常压、78℃下浓缩至无有机溶剂,所得浸膏用氯仿-水系统,体积比2∶1,在常温常压下萃取3次,合并氯仿层,在绝对压力0.05MPa,55℃条件下减压浓缩至干膏状。
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洪鑫等.云南含笑中的新倍半萜醇.云南植物研究20 4.1998,20(4),464-465. |
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荷花玉兰中的香豆素和倍半萜内酯.国外医学中医中药分册17 2.1995,17(2),47. |
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