CN101991635B - 一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，该方法是将鹰嘴豆粉碎，过筛，加溶剂油，加热回流脱脂，加热回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，真空干燥，即可得到鹰嘴豆总皂苷的质量含量达到22-25％的纯化产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆总皂苷产品经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，结果表明有很好的活性。同时，本发明所述方法重现性好，树脂可重复使用。

Description

一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法。

背景技术：

鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)起源于西亚、地中海沿岸，现全球播种面积已有1.5亿亩，是目前世界上第二大食用豆类作物，维吾尔族名为诺胡提，在新疆有2500年的生长历史，是维吾尔医常用药材，已收载在中华人民共和国卫生部《药品标准》维吾尔药分册和《维吾尔药志》，具有清除异常体液，开通体液闭阻，调节机体等作用。用于身体瘦弱，性欲低下，食欲不振，皮肤瘙痒及糖尿病等疾病。

鹰嘴豆中富含皂苷类成分，P.A.Ireland等研究表明鹰嘴豆中含有0.23-6％的总皂苷。鹰嘴豆中皂苷类主要是三萜类大豆皂苷。皂苷具有多种药理作用，如抗癌、防治心血管疾病、抗病毒、保肝以及抗血栓等作用，研究发现，B类和DDMP类大豆皂苷具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且表现为非竞争性抑制作用。鹰嘴豆皂苷被认为与降血脂作用有关。可能因与食物中的胆固醇结合(Gestener et al.1972)阻止吸收，也可能与胆汁酸结合干扰肝肠循环，增加粪排(Sidhu & Oakenful，1986).而且胆汁酸的粪排增加就会引起肝内补偿性胆汁酸合成，消耗胆固醇，从而降低血浆胆固醇。鹰嘴豆抗癌作用的有效成分可能是三萜皂苷。因此对鹰嘴豆总皂苷进行纯化研究，使其在保健和医药行业中得到应用。

传统的皂苷分离精制方法有分段沉淀法、铅盐沉淀法、胆甾醇沉淀法、吉拉尔试剂法和色谱分离法。分段沉淀法、铅盐沉淀法、胆甾醇沉淀法和吉拉尔试剂法纯化皂苷，均需使用大量的化学试剂，不适用于工业化生产，且皂苷纯度较低。目前常用色谱分离法有吸附色谱法、分配色谱法、高效液相色谱法、液滴逆流色谱法(DCCC)和大孔树脂法。吸附色谱法、分配色谱法、高效液相色谱法、液滴逆流色谱法(DCCC)等方法可纯化出纯度很高的皂苷和单一化合物，但其操作复杂，费用高，也不适用于工业化生产。利用大孔树脂纯化皂苷，该法具有耗费溶剂量少，回收率较高的特点，且大孔树脂价格便宜，可反复使用，适用于生产化需求。因此，本研究采用大孔树脂纯化鹰嘴豆提取物，可以提高皂苷活性成分纯度，使其在保健和医药行业中得到应用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，该方法是将鹰嘴豆粉碎，过筛，加溶剂油，加热回流脱脂，加热回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，真空干燥，即可得到鹰嘴豆总皂苷的质量含量达到22-25％的纯化产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆总皂苷产品经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，结果表明有很好的活性。同时，本发明所述方法重现性好，树脂可重复使用。

本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，按下列步骤进行：

a、将鹰嘴豆粉碎，过40-50目筛，取粉碎的鹰嘴豆，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度40-70℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比5-15倍量的30％-80％乙醇采用电热套加热回流提取1-4次，时间1-3h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，上样时间为1-6h，水洗脱体积为1-3BV，水洗流速为1-4BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为50％-80％，乙醇洗脱量为1-4BV，乙醇洗脱速度为1-4BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度30-45℃，即可得到鹰嘴豆总皂苷质量含量22-25％产品。

步骤b中的大孔树脂为HPD100、HPD300、SA-1、SA-3、DM131、D101、XAD-2或ADS-7型。

本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，该方法经过对不同型号大孔树脂对纯化物总皂苷含量的影响；大孔树脂不同上样浓度对纯化物总皂苷含量的影响；大孔树脂柱径高比对纯化物总皂苷含量的影响；大孔树脂不同吸附速度对纯化物总皂苷含量的影响；大孔树脂解吸剂对纯化物总皂苷含量的影响；80％乙醇的动态解吸；水洗脱用量和吸附泄露的测试如下：

八种大孔树脂对鹰嘴豆总皂苷的静态吸附与解析试验

取不同型号的抽干树脂各1g，分别装入30mL一定质量浓度的提取液中，恒温震荡(37℃，250r/min)13.5h，测上清液的平衡皂苷质量浓度ρ_e(mg/mL)，滤去提取液后树脂经50mL纯水清洗，再放入50mL80％乙醇中，于相同条件下解吸，测定解析液的皂苷质量浓度ρ_d(mg/mL)，分别按下式计算吸附量、解析量、解析率，从中筛选出性能最好的树脂进行后续实验，结果见图1；

吸附量(mg/g干树脂)＝(ρ₀-ρ_e)×V0/m

解析量(mg/g干树脂)＝ρ_d×V_d/m

解析率＝解析量×100/吸附量

其中：ρ₀-提取液中皂苷质量浓度(mg/mL)，V₀-提取液体积(mL)，V_d-解析液体积(mL)，m-树脂质量(g)。

结果显示(图1)，8种大孔树脂中，吸附量和解析量都较高的是XAD-2，但XAD-2大孔树脂价格昂贵，不适于生产用，HPD100大孔树脂解析量较XAD-2次之，解析率最高，但吸附量较少，SA-3大孔树脂吸附量较HPD100大孔树脂高，但解吸量次之，HPD100大孔树脂皂苷纯度(22％)比SA-3大孔树脂(19％)高，比较后选择HPD100型号大孔树脂。

上样溶液的浓度筛选试验：

取20mL树脂，湿法装柱(柱长径比8∶1)，将质量浓度为0.29、0.58、0.87、1.16和1.74g生药/mL的提取物溶液以3.0BV/h的流速分别过柱，分别吸附4、6、8、12、24倍柱体积后，用60mL纯水洗树脂至流出液无色，再用80mL体积分数70％的乙醇溶液以2BV/h洗柱，收集解吸液，测定其P_d。结果见图2：

如结果显示(图2)，不同浓度，上样量相同的情况下，上样液浓度为0.87g生药/mL的解析量最大，浓度继续减小其解析率开始降低，这可能是因为上样液浓度太低，上样体积加大，吸附时间过长，导致先吸附的皂苷被洗脱下来，所以，选择浓度0.87g生药/mL为最佳上样浓度。

树脂柱径高比例的考察试验：

分别装树脂床径高比为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8的大孔树脂(柱长径比8∶1)，以3BV/h流速上样(总皂苷浓度为0.199mg/mL)，吸附后用5BV水快速洗脱，以2BV/h流速4BV70％乙醇洗脱，收集解吸液，测定其P_d。结果见图3：

从图3可以看出，径高比在1∶4时解析量最多，径高比从1∶6开始解析量开始下降，这是因为树脂柱过高，随之吸附时间过长，导致先吸附的皂苷被洗脱下来。因此，径高比选择为1∶4。

吸附速率的筛选：

装填树脂床径高比为1∶4的大孔树脂，湿法装柱(柱长径比8∶1)，以1.0BV/h、2.0BV/h、3.0BV/h和4BV/h的流速上样(总皂苷浓度为0.199mg/mL)，12倍柱体积吸附后，用5BV纯水洗树脂，再用体积分数70％的乙醇溶液以2BV/h洗柱4BV，收集解吸液，测定其P_d。结果见图4：

结果显示(图4)，吸附速率为1BV/h时，总皂苷解析量最大，2BV/h和3BV/h解析量无太大差异，当吸附速率为4BV/h，树脂解吸量明显减少，考虑到工作效率，因此，选择吸附率为3BV/h。

解吸剂的筛选试验：

取20mL大孔树脂，湿法装柱(柱长径比8∶1)，将一定浓度的提取物溶液(总皂苷浓度为0.199mg/mL)，以3.0BV/h流速过柱，饱和吸附后，用100mL纯水洗树脂至流出液无色，再依次用体积分数20％、40％、60％、80％和100％的乙醇溶液以2BV/h洗柱，收集解吸液，测定其Pd。结果如图5：

从图5结果可以看出，皂苷洗脱主要集中在20％-60％乙醇之间，再分别用20％、50％、60％、70％、80％乙醇洗脱饱和吸附提取液的大孔树脂，测各洗脱液中皂苷纯度，80％洗脱液中皂苷纯度最高，因此，洗脱剂选择80％乙醇。

解吸剂用量体积的筛选试验：

以一定质量浓度的提取液上样，30mL树脂柱达饱和吸附后，以体积分数80％的乙醇溶液洗脱，每10mL解析液收集一次，3倍体积后每30mL收集一次，其动态解吸曲线见图6：

结果显示，体积分数80％的乙醇溶液洗脱液中皂苷纯度最高，且洗脱峰窄且集中，无拖尾，被解吸的皂苷主要集中于0.7-1.8BV段，解吸剂用量为3BV时，皂苷的洗脱率达到平衡，故此解吸剂具有洗脱效率高、用量少和安全性高的特点其作为适宜的解吸剂。

水洗脱用量体积的考察试验：

将吸附饱和的树脂用纯净水快速洗脱树脂，洗去树脂间未吸附的提取液和蛋白、糖等杂质，测定皂苷含量。结果见图7：

从图7可以看出，当水洗至3BV时，将树脂未吸附的提取液都被洗脱下来，而流出液接近无色，因此，水洗量选择为3BV。

提取液上样量考察试验：

取鹰嘴豆提取液(总皂苷质量浓度为0.53mg/mL，即0.87g生药/mL)，上30mLHPD100大孔树脂上，以3BV/h流速进行吸附后，收集流出液，测定中皂苷含量，结果见图8：

从图8泄露曲线来看，上样量从14BV开始，泄露趋于稳定，即9-16BV之间达到一个动态平衡，从17BV开始，泄露曲线由直线上升，因此，确定上样量为16BV时，树脂柱达到吸附饱和。

本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，鹰嘴豆脱脂用的6#溶剂油，是目前市场上生产食用油所用的萃取溶剂，提取物使用食用乙醇提取，无毒，真空干燥，对活性成分损害小。本发明得到的总皂苷产品经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，结果表明有很好的活性。

本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，具有以下优点：所述方法中以乙醇为溶剂和洗脱剂，价廉、无毒；脱脂采用的溶剂为目前市场上生产食用油用的萃取剂6#溶剂油，安全、价廉；采用的大孔树脂价格较低，且安全性较高，是目前国内药品行业常用的大孔树脂。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆总皂苷的质量含量可达22-25％。

附图说明：

图1为本发明不同型号大孔树脂对纯化物总皂苷含量的影响，其中□为吸附率，

为解析率。

图2为本发明大孔树脂不同上样浓度对纯化物总皂苷含量的影响图。

图3为本发明大孔树脂柱径高比对纯化物总皂苷含量的影响图。

图4为本发明大孔树脂不同吸附速度对纯化物总皂苷含量的影响图。

图5为本发明大孔树脂解吸剂对纯化物总皂苷含量的影响图。

图6为本发明80％乙醇的动态解吸曲线图。

图7为本发明水洗脱用量图。

图8为本发明吸附泄露曲线图。

具体实施方式：

本发明将结合具体实施例作进一步说明，但不限于本实施例范围。

实施例1

a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度40℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比5倍量的30％乙醇采用电热套加热回流提取1次，时间1h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用HPD100大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为1h，控制流出液流速为3BV/h，静置2h，让其充分吸收，用1BV纯净水洗树脂床，水洗流速为1BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用3BV的浓度80％乙醇洗脱，流速为1BV/h；

c、收集乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，真空度20Pa，加热温度为30℃，即得干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量为22％。

实施例2

a、将鹰嘴豆粉碎，过50目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度55℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比10倍量的50％乙醇采用电热套加热回流提取3次，时间2-3h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用HPD300大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为3h，控制流出液流速为1BV/h，静置2h，让其充分吸收，用3BV纯净水洗树脂床，水洗流速为3BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用1BV的浓度50％乙醇洗脱，流速为3BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度40℃，即可得到干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量23％。

实施例3

a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度70℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比15倍量的80％乙醇采用电热套加热回流提取4次，时间3h，提取温度95℃，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用SA-3大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为6h，控制流出液流速为4BV/h，静置2h，让其充分吸收，用3BV纯净水洗树脂床，水洗流速为4BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用4BV的浓度80％乙醇洗脱，流速为4BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度45℃，即可得到干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量25％产品。

实施例4

a、将鹰嘴豆粉碎，过50目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度50℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比8倍量的40％乙醇采用电热套加热回流提取2次，时间1h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用SA-1大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为2h，控制流出液流速为1BV/h，静置2h，让其充分吸收，用3BV纯净水洗树脂床，水洗流速为3BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用4BV的浓度40％乙醇洗脱，流速为2BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度32℃，即可得到干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量23％产品。

实施例5

a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度60℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比12倍量的50％乙醇采用电热套加热回流提取3次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用DM131大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为5h，控制流出液流速为2BV/h，静置2h，让其充分吸收，用1BV纯净水洗树脂床，水洗流速为2BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用2BV的浓度60％乙醇洗脱，流速为2BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度30℃，即可得到干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量24％产品。

实施例6

a、将鹰嘴豆粉碎，过50目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度55℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比14倍量的65％乙醇采用电热套加热回流提取4次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用D101大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为4h，控制流出液流速为3BV/h，静置2h，让其充分吸收，用1BV纯净水洗树脂床，水洗流速为1BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用2BV的浓度70％乙醇洗脱，流速为4BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度38℃，即可得到干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量25％产品。

实施例7

a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度65℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比6倍量的70％乙醇采用电热套加热回流提取1次，时间3h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用XAD-2大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为5h，控制流出液流速为2BV/h，静置2h，让其充分吸收，用2BV纯净水洗树脂床，水洗流速为2BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用3BV的浓度75％乙醇洗脱，流速为3BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度40℃，即可得到干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量25％产品。

实施例8

a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度45℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比9倍量的75％乙醇采用电热套加热回流提取3次，时间3h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用ADS-7大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1∶4，上样时间为6h，控制流出液流速为1BV/h，静置2h，让其充分吸收，用4BV纯净水洗树脂床，水洗流速为3BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质，用4BV的浓度80％乙醇洗脱，流速为3BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度42℃，即可得到干燥的鹰嘴豆纯化产物209.4mg，总皂苷质量含量24％产品。

实施例9

鹰嘴豆总皂苷提取物降糖体外筛选—蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制实验

纯化的总皂苷提取物溶于DMSO，初始浓度为100mM×L^-1，DMSO稀释，分别配成浓度为10，1，0.1，0.01mm×L^-1的样品溶液，阳性对照药：NaVO₃，IC50：4μg×mL^-1。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性测定采用微量法。测试反应体系：样品溶液1μL，再加入179μL含0.09μmol×L^-1蛋白酪氨酸磷酸酶1B的缓冲液(20mmol×L^-1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸，150mmol×L^-1NaCl，和1mmol×L^-1乙二胺四乙酸，pH＝7.0)，室温孵育10min，然后加入20μL 35mmol×L^-1对硝基苯磷酸二钠盐，总体积为200μL，室温孵育30min后，用10μL 3mol×L^-1的NaOH溶液终止反应，在405nm处测定吸收值，以不含酶的溶液体系为空白。

按上述活性测试方法，化合物样品按不同剂量加入，405nm处测定吸收值，每个实验重复3次，抑制率＝(OD405空白-OD405样品)/OD405空白×100％。

表3 鹰嘴豆提取物和纯化物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性筛选

样品	IC50(μg/mL)
		鹰嘴豆提取物	347
树脂纯化物	16
		阳性对照(钒酸钠)	4

由表3中可以看出，树脂纯化后的总皂苷对蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制率明显高于纯化前的鹰嘴豆提取物的活性，表明该纯化方法确实可行。

Claims (2)

1.一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、将鹰嘴豆粉碎，过40-50目筛，取粉碎的鹰嘴豆，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度40-70℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比5-15倍量的30％-80％乙醇采用电热套加热回流提取1-4次，时间1-3h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，上样时间为1-6h，水洗脱体积为1-3BV，水洗流速为1-4BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为50％-80％，乙醇洗脱量为1-4BV，乙醇洗脱速度为1-4BV/h；

c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度30-45℃，即可得到鹰嘴豆总皂苷质量含量22-25％产品。

2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于步骤b中的大孔树脂为HPD100、HPD300、SA-1、SA-3、DM131、D101、XAD-2或ADS-7型。

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