CN107056875A - 一种鹰嘴豆三萜皂苷对照品的制备方法 - Google Patents

一种鹰嘴豆三萜皂苷对照品的制备方法 Download PDF

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CN107056875A CN201710064538.2A CN201710064538A CN107056875A CN 107056875 A CN107056875 A CN 107056875A CN 201710064538 A CN201710064538 A CN 201710064538A CN 107056875 A CN107056875 A CN 107056875A
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Abstract

本发明提供了一种鹰嘴豆三萜皂苷对照品的制备方法，包括如下步骤：（1）鹰嘴豆的提取；（2）碱修饰；（3）大孔吸附树脂柱色谱分离；（4）制备高效液相色谱分离得3β‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→2)‑β‑D‑吡喃半乳糖基‑22β,24‑二羟基‑齐墩果‑12‑烯对照品。高效液相色谱‑蒸发光检测器纯度检查，不同流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变流动相测定均未出现异常峰；以HPLC‑ELSD峰面积归一化法和不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数大于98%，符合含量测定用中药化学对照品的要求。而且本发明方法提取完全，产率高；有机溶剂用量少，成本低。

Description

一种鹰嘴豆三萜皂苷对照品的制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种鹰嘴豆三萜皂苷对照品的制备方法。
背景技术
鹰嘴豆是野豌豆族(Vicieae)鹰嘴豆属(Cicer)，学名Cicer arietinum Linn.的一年生草本植物，因其籽粒形状酷似脱毛后的鹰头或鸡头而得名，中文的别名有桃豆、鸡头豆、鸡碗豆、羊头豆、脑豆子等，新疆俗称诺胡提。起源于西亚、地中海沿岸和埃塞俄比亚，世界各洲均有种植，是世界上栽培面积较大的食用豆类之一，在豆科植物中居第三位，其中亚洲栽培面积最大，其次是非洲[肖克来提·木尼拉.中国民族医药杂志.2003，6(11)：20.]。据《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔分册》记载，鹰嘴豆具有清除异常体液，开通体液闭阻，调补机体之功能，用于身体瘦弱，性欲低下，食欲不振，皮肤瘙痒及糖尿病，但未收载含量测定项。3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯(结构式见下)是鹰嘴豆中主要三萜皂苷类化学成分，但是目前无法从国内外市场购得3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯对照品。经对现有技术文件检索，未见3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯对照品制备方法和检测方法的文献报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种鹰嘴豆三萜皂苷3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯对照品的制备方法。
本案发明人通过对鹰嘴豆三萜皂苷类化学成分进行细致深入的研究，发明了鹰嘴豆回流提取，提取物碱修饰，经大孔吸附柱色谱和高效液相柱色谱制备3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯，经纯度检测大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求，因而完成了本发明。
本发明提供一种鹰嘴豆三萜皂苷3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯对照品的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)鹰嘴豆粗粉中加50％-90％乙醇回流提取三次，每次用量为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的8倍以升计体积量，每次2小时，分次滤过，滤液合并，减压回收乙醇得鹰嘴豆提取物；
b)将步骤a)获得的提取物加0.5％～2％氢氧化钾75％乙醇溶液使溶解，用量为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的0.5倍以升计体积量，室温放置2小时～48小时，加稀盐酸调节pH值至7，加水调节醇浓度，用量为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的10倍以升计体积量，混匀得鹰嘴豆提取物碱修饰液；
c)将步骤b)获得的鹰嘴豆提取物碱修饰液加于大孔吸附树脂D101柱色谱，填充大孔吸附树脂体积为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的0.5倍以升计体积量，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得鹰嘴豆三萜皂苷提取物；
d)将步骤c)获得的鹰嘴豆三萜皂苷提取物经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相为65％体积甲醇、34.8％体积水和0.2％体积冰乙酸，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经减压浓缩，干燥后得3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯。
所述的鹰嘴豆粗粉回流提取溶剂优选的浓度为50％～90％乙醇，最佳浓度为70％乙醇。
本发明制备的一种鹰嘴豆三萜皂苷对照品经ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC和NOESY质谱和波谱数据鉴定为3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯；经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法和不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数均大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。而且本发明方法提取完全，产率高；有机溶剂用量少，成本低。
附图说明
图1为本发明制备的三萜皂苷3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯的高效液相色谱条件A纯度检查图
图2为本发明制备的三萜皂苷3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯的高效液相色谱条件B纯度检查图
图3为本发明制备的三萜皂苷3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯的高效液相色谱条件C纯度检查图
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。
具体实施方式
实施例1
(1)提取：鹰嘴豆粗粉10Kg，加70％乙醇回流提取三次，每次加70％乙醇80L，每次2小时，分次滤过，滤液合并，减压回收乙醇得鹰嘴豆提取物；
(2)碱修饰：鹰嘴豆提取物加1％氢氧化钾75％乙醇溶液5L使溶解，室温放置2小时，加稀盐酸调节pH值至7，加水100L，混匀得鹰嘴豆提取物碱修饰液；
(3)大孔吸附树脂柱色谱分离：鹰嘴豆提取物碱修饰液经大孔吸附树脂D101柱色谱，填充大孔吸附树脂体积为5L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得鹰嘴豆三萜皂苷提取物；
(4)制备高效液相色谱分离：鹰嘴豆三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相为65％体积甲醇、34.8％体积水和0.2％体积冰乙酸，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经减压浓缩，干燥后得3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯(产率0.147％)。
化合物结构鉴定：
白色粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阳性，1H-NMR谱和13C-NMR谱显示三萜皂苷类化合物特征，推测化合物为三萜皂苷类化合物。
HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 789.6038[M+Na]+，结合13C-NMR谱和HSQC谱数据推测分子式为C42H70O12。1H-NMR谱显示7个角甲基质子信号δ0.75(3H，s)，0.80(3H，s)，0.84(3H，s)，0.88(3H，s)，0.97(3H，s)，1.05(3H，s)和1.13(3H，s)，2个与氧相连的次甲基质子信号δ3.23(1H，m)和3.23(1H，m)，与氧相连的亚甲基质子信号δ3.07(1H，t，J＝10.8Hz)和3.91(1H，m)，烯氢质子信号δ5.16(1H，br s)。13C-NMR谱显示42个碳信号，其中30个为三萜皂苷元的碳信号。烯碳信号δ121.46和144.01，与氧相连的碳信号δ62.28，73.97和89.99，为3,22,24-三羟基-齐墩果-12-烯型五环三萜皂苷苷元的特征信号。以上数据与苷元3,22,24-三羟基-齐墩果-12-烯文献[Baxter RL，et al.J Nat Prod，1990：53：298.]比较，3位碳信号向低场位移，推测化合物为3位连糖的3,22,24-三羟基-齐墩果-12-烯型皂苷。
1H-NMR谱显示2个糖端基质子信号δ4.74(1H，d，J＝7.0Hz)和4.95(1H，br s)，1个鼠李糖特征甲基质子信号δ1.09(3H，d，J＝6.0Hz)；13C-NMR谱显示2个糖端基碳信号δ99.96和100.20，1个鼠李糖特征碳信号δ17.81。化合物经酸水解后HPLC法鉴定结构中存在D-半乳糖和L-鼠李糖。1H-NMR谱显示葡萄糖端基质子偶合常数为J＝7.0Hz，推测葡萄糖为β构型；13C-NMR谱显示鼠李糖5位碳信号分别为δ67.93，推测鼠李糖均为α构型。HMBC谱显示半乳糖端基质子δ4.74与苷元3位碳δ89.99，鼠李糖端基质子δ4.95与半乳糖2位碳δ75.57远程相关信号，推测结构中存在3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基。综合分析数据，鉴定化合物结构为3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯。
化合物结构鉴定数据：
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.16(1H，br s，H-12)，4.95(1H，br s，H-1”)，4.74(1H，d，J＝7.0Hz，H-1')，3.94(1H，m，H-4')，3.91(1H，m，H-24a)，3.89(1H，m，H-5”)，3.65(1H，br s，H-2”)，3.53(1H，m，H-3”)，3.51(1H，m，H-6'a)，3.47(1H，m，H-6'b)，3.41(1H，m，H-2')，3.38(1H，m，H-5')，3.35(1H，m，H-3')，3.23(1H，m，H-3)，3.23(1H，m，H-22)，3.14(1H，t，J＝9.3Hz，H-4”)，3.07(1H，t，J＝10.8Hz，H-24b)，1.99(1H，br d，J＝13.2Hz，H-18)，1.79(1H，m，H-2a)，1.79(1H，m，H-11a)，1.78(1H，m，H-11b)，1.70(1H，m，H-2b)，1.67(1H，m，H-15a)，1.67(1H，m，H-19a)，1.65(1H，m，H-16a)，1.51(1H，m，H-1a)，1.51(1H，m，H-6a)，1.47(1H，m，H-9)，1.45(1H，m，H-7a)，1.30(1H，m，H-7b)，1.30(1H，m，H-21a)，1.28(1H，m，H-6b)，1.28(1H，m，H-21b)，1.13(1H，m，H-16b)，1.13(3H，s，H-23)，1.09(3H，d，J＝6.0Hz，H-6”)，1.05(3H，s，H-27)，0.97(3H，s，H-30)，0.93(1H，m，H-15b)，0.90(1H，m，H-1b)，0.88(1H，m，H-19b)，0.88(3H，s，H-26)，0.84(1H，m，H-5)，0.84(3H，s，H-29)，0.80(3H，s，H-25)，0.75(3H，s，H-28)；13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)δ144.01(C-13)，121.46(C-12)，100.20(C-1”)，99.96(C-1')，89.99(C-3)，75.57(C-2')，74.59(C-3')，74.50(C-5')，73.97(C-22)，72.35(C-4”)，70.55(C-4'，2”)，69.21(C-3”)，67.93(C-5”)，62.28(C-24)，59.75(C-6')，55.10(C-5)，46.80(C-9)，45.96(C-19)，44.51(C-18)，42.98(C-4)，41.60(C-14)，41.16(C-21)，40.00(C-8)，38.03(C-1)，36.88(C-17)，35.78(C-10)，32.58(C-7，29)，30.12(C-20)，28.21(C-30)，27.82(C-16)，25.64(C-2)，25.41(C-15)，24.89(C-27)，23.14(C-11)，22.16(C-23)，20.26(C-28)，17.81(C-6，6”)，16.50(C-26)，15.33(C-25)；HR ESI-MS m/z 789.6038[M+Na]+(计算值C42H70O12Na相对分子质量789.4765)。
高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检测：
溶液的制备
精密称取3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯适量，加甲醇制成1.032mg·mL-1的溶液。
色谱条件
色谱条件A 色谱柱：YMC-Pack ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇:乙腈:2％冰乙酸溶液＝40:25:35；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：雾化温度：80℃,蒸发温度：110℃，载气流速量：1.4L·min-1。
色谱条件B 色谱柱：YMC-Pack ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇:乙腈:2％冰乙酸溶液＝40:35:25；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：雾化温度：80℃,蒸发温度：110℃，载气流速量：1.4L·min-1。
色谱条件C 色谱柱：YMC-Pack ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇:乙腈:2％冰乙酸溶液＝30:35:35；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：雾化温度：80℃,蒸发温度：110℃，载气流速量：1.4L·min-1。
方法与结果
精密吸取2μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰，色谱峰保留时间分别为：23.176min、8.032min和13.992min，色谱图见附图1～附图3。
HPLC-ELSD峰面积归一化法纯度检测：
溶液的制备
精密称取3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯适量，加甲醇制成3.176mg·mL-1的溶液。
色谱条件
色谱柱：YMC-Pack ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇: 乙腈:2％冰乙酸溶液＝30:35:35；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：雾化温度：80℃,蒸发温度：110℃，载气流速量：1.4L·min-1。
方法与结果
精密吸取溶液20μL，注入液相色谱仪，记录时间比主色谱峰保留时间延长1倍的色谱图。测定各杂质峰面积和色谱图总色谱峰面积，计算各杂质峰面积之和占总色谱峰面积的百分数。结果表明，3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯的质量分数为98.935％。
HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法纯度检测
溶液的制备
精密称取3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯适量，加甲醇制成3.176mg·mL-1的溶液。
自身对照溶液的制备
精密吸取上述溶液0.5mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
色谱条件
色谱柱：YMC-Pack ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇:乙腈:2％冰乙酸溶液＝30:35:35；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：雾化温度：80℃,蒸发温度：110℃，载气流速量：1.4L·min-1。
方法与结果
精密吸取自身对照溶液20μL，注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主色谱峰的峰高达满量程的10％以上，精密吸取溶液和自身对照溶液20μL，注入液相色谱仪，记录时间比主色谱峰保留时间延长1倍的色谱图。测定溶液各杂质峰面积和自身对照溶液主色谱峰面积，各杂质峰面积之和与主色谱峰面积比较计算杂质含量。结果表明，3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯的质量分数为98.715％。
实施例2
(1)提取：鹰嘴豆粗粉10Kg，加50％乙醇回流提取三次，每次加50％乙醇80L，每次2小时，分次滤过，滤液合并，减压回收乙醇得鹰嘴豆提取物；
(2)碱修饰：鹰嘴豆提取物加0.5％氢氧化钾75％乙醇溶液5L使溶解，室温放置48小时，加稀盐酸调节pH值至7，加水100L，混匀得鹰嘴豆提取物碱修饰液；
(3)大孔吸附树脂柱色谱分离：鹰嘴豆提取物碱修饰液经大孔吸附树脂D101柱色谱，填充大孔吸附树脂体积为5L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得鹰嘴豆三萜皂苷提取物；
(4)制备高效液相色谱分离：鹰嘴豆三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相为65％体积甲醇、34.8％体积水和0.2％体积冰乙酸，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经减压浓缩，干燥后得3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯(产率0.122％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为98.214％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.413％。
实施例3
(1)提取：鹰嘴豆粗粉10Kg，加90％乙醇回流提取三次，每次加90％乙醇80L，每次2小时，分次滤过，滤液合并，减压回收乙醇得鹰嘴豆提取物；
(2)碱修饰：鹰嘴豆提取物加2％氢氧化钾75％乙醇溶液5L使溶解，室温放置4小时，加稀盐酸调节pH值至7，加水100L，混匀得鹰嘴豆提取物碱修饰液；
(3)大孔吸附树脂柱色谱分离：鹰嘴豆提取物碱修饰液经大孔吸附树脂D101柱色谱，填充大孔吸附树脂体积为5L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得鹰嘴豆三萜皂苷提取物；
(4)制备高效液相色谱分离：鹰嘴豆三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相为65％体积甲醇、34.8％体积水和0.2％体积冰乙酸，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经减压浓缩，干燥后得3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯(产率0.135％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为98.733％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.595％。

Claims (2)

1.一种鹰嘴豆三萜皂苷3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯对照品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a）鹰嘴豆粗粉中加50%-90%乙醇回流提取三次，每次用量为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的8倍以升计体积量，每次2小时，分次滤过，滤液合并，减压回收乙醇得鹰嘴豆提取物；
b）将步骤a）获得的提取物加0.5%~2%氢氧化钾75%乙醇溶液使溶解，用量为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的0.5倍以升计体积量，室温放置2小时~48小时，加稀盐酸调节pH值至7，加水调节醇浓度，用量为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的10倍以升计体积量，混匀得鹰嘴豆提取物碱修饰液；
c）将步骤b）获得的鹰嘴豆提取物碱修饰液加于大孔吸附树脂D101柱色谱，填充大孔吸附树脂体积为以公斤计鹰嘴豆粗粉重量的0.5倍以升计体积量，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得鹰嘴豆三萜皂苷提取物；
d）将步骤c）获得的鹰嘴豆三萜皂苷提取物经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相为65%体积甲醇、34.8%体积水和0.2%体积冰乙酸，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经减压浓缩，干燥后得3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯，上述成分是由下述式表示的化合物，
。
2.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆三萜皂苷3β-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-22β,24-二羟基-齐墩果-12-烯对照品的制备方法，其特征在于所述的回流提取溶剂浓度为70%乙醇。
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