CN102000067A - 一种蛇床子素在制备防治肺纤维化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛇床子素在制备防治肺纤维化药物中的应用,通过气管内滴注博莱霉素(Bleomycin,BLM)复制大鼠肺纤维化动物模型,首次选用蛇床子素作为治疗药物,研究蛇床子素对肺纤维化大鼠肺组织及血清相关生化指标及病理学改变的影响,观察蛇床子素对肺纤维化大鼠模型的治疗作用,从而为蛇床子素防治肺纤维化提供实验依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛇床子素在制备防治肺纤维化药物中的应用,属于医药技术领域
背景技术
肺(间质)纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是一种原因不明的弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱,从而导致肺泡、肺间质纤维化,最终引起呼吸衰竭的疾病,也是多种原因引起的急、慢性肺部疾病的共同结局,是一种严重危害人类健康的肺阻塞性疾病。在肺纤维化的临床研究中主要集中在特发性肺间质纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)方面,该病以肺泡上皮细胞的异常性损伤、成纤维细胞增殖和细胞外基质重塑为主要病理学改变,可使肺组织功能丧失,最终引起呼吸衰竭而导致死亡的致命性的肺间质疾病。近年来,IPF的发病率有呈逐年增高的趋势,诊断后肺纤维化患者5年内死亡率高达60-70%。迄今为止,该进行性肺部疾病仍然病因不明、发病机制不清、尚无有效的治疗药物能够逆转或阻断该病的进展。西医目前以糖皮质激素为首选药物治疗IPF,但有效率仅为20%,细胞毒性药物和免疫抑制剂也被用于IPF患者的治疗。应用更加安全有效的中药防治该病已经引起了医药学界越来越多的关注。
蛇床子素(Osthole),是从伞形科植物蛇床(Cnidium monnieri(L.)cuss)成熟果实蛇床子中提取的香豆素类化合物,其化学名称为7一甲氧基I8一异戊烯基香豆素。研究表明蛇床子素具有解痉、降血压、抗心律失常、抗氧化、增强免疫功能及广谱抗菌作用。目前,临床主要用于抗炎和抗菌,至今尚未见其作为防治肺纤维化药物的报道。
发明内容
本发明目的是:提供一种蛇床子素在制备防治肺纤维化药物中的应用。
本发明技术方案中,所述的药物包括治疗有效量的蛇床子素,与药理学上可接受的载体。
本发明技术方案中,所述药物中蛇床子素选用蛇床子素的含量为≥95%的蛇床子提取物。
本发明的技术方案是:通过气管内滴注博莱霉素(Bleomycin,BLM)复制大鼠肺纤维化动物模型,首次选用蛇床子素作为治疗药物,研究蛇床子素对肺纤维化动物肺组织及血清相关生化指标及病理学改变,观察蛇床子素对肺纤维化动物模型的防治作用,从而为蛇床子素防治肺纤维化提供实验依据。
本发明人在研究中发现,传统中药蛇床子提取物——蛇床子素给博莱霉素致肺纤维化大鼠灌服28天后,给药组小、中、大剂量组大鼠肺泡炎程度减轻或显著减轻(P<0.05,P<0.01),肺纤维化程度也减轻、显著减轻或极显著减轻(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(实施例1);蛇床子素还可以使肺纤维化大鼠体重显著或极显著增加(P<0.01,P<0.001),使肺系数降低或显著降低(P<0.05,P<0.01)(实施例2);间接反映肺组织中胶原含量的羟脯氨酸(HYP)含量减少或者显著减少(P<0.05,P<0.01)(实施例3)。蛇床子素可增强肺纤维化大鼠肺组织的总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05),增加肺组织中衡量机体抗氧化能力的谷胱甘肽(GSH)含量(P<0.05),且可以减少肺组织氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量(P<0.05)(实施例4)。蛇床子素还可以减少、显著减少或极显著减少肺纤维化大鼠血清中丙二醛含量(P<0.05,P<0.01,P<0.001),可增加或显著增加血清中谷胱甘肽含量(P<0.05,P<0.01),并可以增强血清总抗氧化能力(P<0.05)(实施例5)。上述实验结果表明,蛇床子提取物——蛇床子素具有显著抗肺纤维化的作用,该作用机理与蛇床子素的抗炎作用、抗脂质过氧化作用、抑制细胞间质胶原合成和沉积及成纤维细胞增生等有关。鉴于此,按本发明所采用的蛇床子提取物——蛇床子素有可能成为治疗肺纤维化的候选药物,特别是肺纤维化的预防和治疗。因此,本发明的目的是提供一种传统中药蛇床子提取物——蛇床子素用于预防肺纤维化疾病的药物中的应用。
本发明的另一个目的是:提供本发明所采用的蛇床子提取物——蛇床子素及一种或多种原药上可接受的载体和/或赋形剂的药物。本发明的药物除含有本发明制备的蛇床子素外,还可含有一种或多种具有相同或相似作用的其他天然或化学合成的活性成分。
可以按照制剂制备中已知的方法将本发明制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、栓剂、膏剂及溶液剂或悬浮剂。其中优选的是适用于胃肠道给药的胶囊剂、片剂、颗粒剂等。在制备适用于口服给药的胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂和粉末剂时,可以使用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纤维素、羟甲基纤维素等作为载体或赋形剂。
此外,也可以用制药工业中已知的方法或辅助成分将本发明的药物制成溶液剂或悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂,可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液,或者低浓度(如:1-100mm)磷酸盐缓冲液(PBS)作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂,例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂,使用苯甲酸钠作为防腐剂。在这些剂型中还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂、表面活性剂。
一般说来,本发明药物组合物的口服给药剂量为0.1-100mg/kg/d,较好为0.1-50mg/kg/d,最好为1-10mg/kg/d。然而确切的用药剂量是根据待治疗的疾病或病例状况的性质、严重程度,病人性别、年龄、体重,待治疗病人所用的药物的敏感性及给药方式等因素由临床医生决定。
本发明基于中药蛇床子提取物蛇床子素组成的药物有效成分单一、疗效确切、使用方便,可以广泛应用于制备防治肺纤维化及相关疾病的药物中。
本发明的优点是:
1.蛇床子素可显著减轻肺纤维化大鼠肺部的炎症反应、显著减轻肺纤维化程度,提示蛇床子素具有抗炎、抗纤维化的作用。
2.蛇床子素可显著增加肺纤维化大鼠的体重、降低大鼠肺纤维化模型的肺系数,提示蛇床子素具有增加体质、抗纤维化的作用。
3.蛇床子素可明显降低肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量,提示蛇床子素可明显减少肺纤维化的大鼠肺组织胶原生成;蛇床子素可提高肺纤维化大鼠肺组织和血清中总抗氧化(T-AOC)能力、谷胱甘肽(GSH)含量、显著降低肺纤维化大鼠肺组织和血清中丙二醛(MDA)含量,提示蛇床子素可明显提高肺纤维化大鼠机体总抗氧化能力。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图1、正常对照组正常大鼠肺组织的观察结果(E×100);肺组织结构清晰,肺泡壁完整,肺泡间隔未见增厚,肺泡腔透亮,腔内未见炎性渗出。
图2、模型组博莱霉素致大鼠肺纤维化影响的病理观察结果(E×100);肺组织结构紊乱,肺泡间隔显著增厚,肺泡腔变窄或消失,成纤维细胞大量增生,炎性细胞浸润,胶原纤维沉积,肺间质纤维化形成。
图3、蛇床子素大剂量20mg/kg组对博莱霉素致大鼠肺纤维化影响的病理观察结果(E×100);肺组织结构清晰,肺泡壁尚完整,肺泡间隔成纤维细胞轻度增生,少量炎性细胞浸润,胶原沉积显著减少。
图4、蛇床子素中剂量10mg/kg组对博莱霉素致大鼠肺纤维化影响的病理观察结果(E×100);肺组织结构轻度破坏,部分区域肺泡间隔稍增厚,成纤维细胞轻度增生,少量炎性细胞浸润,胶原沉积量减少。
图5、蛇床子素小剂量5mg/kg组对博莱霉素致大鼠肺纤维化影响的病理观察结果(E×100);部分肺泡结构破坏,肺泡壁轻度增厚,有轻度纤维化病灶,病灶处炎性细胞浸润。
图6、阳性对照药醋酸泼尼松(3.33mg/kg)组对博莱霉素致大鼠肺纤维化影响的病理观察结果(E×100);部分肺泡结构破坏,肺泡间隔轻度增宽,成纤维细胞增生和胶原纤维沉积程度减轻。
具体实施方式
一、材料
1.实验动物
SD大鼠,48只,雄性,体重180-220克,清洁级,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证号SCXK(沪)2007-0005。试验期间饲养室温度20±3.2℃,相对湿度为55±10%。
2.药品与试剂
2.1药品
蛇床子素,白色、粉末状,含量为95%,由西安旭煌生物技术有限公司提供,4℃冰箱保存。临用时加5%羧甲基纤维素钠(CMC Na)制成混悬液,现用现配;博莱霉素A5(BLM A5),白色冻干粉末,15mg/支,日本化药株式会社生产,批号:640110,药品进口注册证号:H20040205;注射用青霉素钠,华北制药股份有限公司生产,国药准字:H13020657;4%水合氯醛;醋酸泼尼松片,5mg/片,江苏徐州平光制药有限责任公司,批号:32022681。
2.2试剂
羟脯氨酸(HYP),总抗氧化能力(T-AOC),丙二醛(MDA),谷胱甘肽(GSH)等各指标检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;
3.仪器
电子天平,EL104型,上海越平科学仪器有限公司生产;H1650型台式高速离心机,湖南湘仪实验仪器开发有限公司生产;光学显微镜OLYMPUS CX21,为日本生产;紫外可见分光光度计,T6新世纪型,为北京普析通用仪器有限责任公司生产,仪器编号:18-1650-01-016;低温冷冻离心机,KDC-2044型,科大创新股份有限公司中佳分公司生产;电热恒温水槽,HH-S26S型,金坛市大地自动化仪器厂生产。
二、方法
1.造模及给药
SD大鼠48只,雄性,称重,编号,按体重随机分为6组,即正常对照组、模型组、蛇床子素大(20mg/kg)、中(10mg/kg)及小(5mg/kg)剂量组和阳性对照药醋酸泼尼松(3.33mg/kg)组,每组8只。模型组与各治疗组大鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下:实验时,大鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉,仰卧手术台,固定头部及四肢,常规消毒,无菌条件下行颈正中切口,钝性分离暴露气管,1ml注射器刺入模型组、蛇床子素各治疗组及醋酸泼尼松组大鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLM A5(4.5mg/kg),正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将大鼠直立,沿身体纵轴左右旋转3-5min,使药液均匀分布于两侧肺内,然后缝合皮肤、消毒,待大鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前1日及术后3日所有大鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.5ml/只)。各组动物于造模第二天开始按照相应的体重灌胃给药,正常组及模型组给予等体积5%羧甲基纤维素钠(CMC Na),每隔一天大鼠称重一次,连续给药28天。
2.标本采集
各组大鼠处死前12小时禁食,不禁水,处理当日称重,麻醉后腹主动脉取血处死各组实验动物。无菌条件下开胸分离出气管和两侧肺脏,称重。右侧肺下叶置于4%多聚甲醛中固定,常规石蜡包埋切片,HE染色;取右肺中叶约30克置于带刻度的10ml玻璃离心管中,-80℃冰箱保存,以备测定各实验组大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量;
肺组织匀浆的制备:其余肺组织称重,加入9倍肺组织重量的冰生理盐水,内切式组织匀浆器制成10%的肺组织匀浆,-80℃冰箱保存,以测T-AOC,MDA,GSH各项生化指标。
血清的制备:各组大鼠腹主动脉取全血后3500r/min离心10min,小心取上清置于1.5ml离心管内,转移后的上清再次3500r/min离心10min。制备好的血清液-80℃冰箱保存,以测定血清中T-AOC,MDA和GSH生化指标。
3.肺系数
按以下公式计算肺系数,肺系数=肺重(mg)/体重(g)。因为大鼠肺纤维化早期炎症细胞大量渗出,晚期成纤维细胞大量增生,胶原过度沉积均可导致肺系数增加,所以肺系数这一指标可间接反应肺纤维化大鼠炎症和纤维化的程度。
4.组织病理学观察
右下肺组织用4%甲醛液固定,经逐级酒精脱水,二甲苯透明、浸蜡,石蜡包埋,常规切片4μm,后行HE染色。参照Szapiel方法光学显微镜下观察确定肺组织的肺泡炎和肺纤维化的程度。两种病变程度均分四级:0级无明显改变;1级轻度改变,病变范围小于全肺的20%;2级中度改变,病变范围占全肺的20%-50%;3级重度改变,病变范围占全肺的50%以上。
5.肺组织和血清中生化指标测定
将0.5ml水解液准确加入冷冻保存小块肺组织的刻度玻璃试管内,混匀,加盖后沸水浴水解20分钟,其间10分钟混匀一次。之后将试管内液体PH值调至6.5左右,加适量活性炭,混匀,转移至1.5ml离心管中,3500r/min离心10min,取上清0.5ml,依次加入试剂一、试剂二、试剂三,混匀,60℃水浴15min,冷却后3500r/min离心10min,取上清于显微分光光度计550nm,1cm光径下测定各管的吸光度,按说明书公式计算肺组织中HYP含量。肺组织匀浆及血清内T-AOC,GSH和MDA等各项指标均采用化学比色法测定。
6.统计方法
三、实施结果
实施例1蛇床子素对肺纤维化大鼠肺组织形态学的影响
实验大鼠肺组织经石蜡切片并行HE染色,光镜下观察结果显示:正常组肺组织结构清晰,肺泡腔透亮,肺泡壁完整,肺泡间隔未见增厚、未见炎细胞浸润。模型组肺组织结构紊乱,炎症细胞浸润广泛,肺泡腔变窄或消失,肺泡间隔显著增厚,肺间质大量成纤维细胞增生和胶原纤维沉积,肺泡炎显著(P<0.01),肺纤维化显著(P<0.01),提示肺间质纤维化形成。与模型组大鼠肺组织相比,蛇床子素大剂量组大鼠肺组织肺泡炎症程度显著减轻(P<0.01)、肺纤维化病变程度减轻极显著(P<0.001);蛇床子素中剂量组大鼠肺泡炎和肺纤维化病变程度显著减轻(P<0.01);蛇床子素小剂量组大鼠肺泡炎和肺纤维化病变程度减轻(P<0.05);醋酸泼尼松组大鼠与模型组大鼠相比肺泡炎症程度减轻(P<0.05)。肺纤维化程度显著减轻(P<0.01)。见表1、图1~6。
##P<0.01vs control;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs model.
实施例2蛇床子素对肺纤维化大鼠体重及肺系数的影响
动物造模后,模型组大鼠体重较正常组降低极显著(P<0.001),泼尼松组、蛇床子素大剂量组大鼠与模型组相比体重显著增加(P<0.01),蛇床子素中、小剂量组大鼠与模型组相比体重增加极显著(P<0.001);模型组大鼠肺系数极显著高于正常对照组大鼠(P<0.001);与模型组大鼠肺系数相比,蛇床子素大、中剂量组大鼠及醋酸泼尼松组大鼠的肺系数均降低(P<0.05),蛇床子素小剂量组大鼠的肺系数显著降低(P<0.01)。见表2。
实施例3蛇床子素对肺纤维化大鼠肺组织HYP含量的影响
与正常组大鼠相比,模型组大鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量增加极显著(P<0.001)。与模型组大鼠HYP含量相比,蛇床子素中、小剂量组,醋酸泼尼松组大鼠肺组织HYP含量显著减少(P<0.01),蛇床子素大剂量组大鼠肺组织HYP含量减少(P<0.05),见表2。
##P<0.01,###P<0.001vs control;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs model.
实施例4蛇床子素对肺纤维化大鼠肺组织T-AOC、GSH和MDA含量的影响
与正常组大鼠相比,模型组大鼠肺组织总抗氧化能力(T-AOC)降低(P<0.05),谷胱甘肽(GSH)含量降低极显著(P<0.001),氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.01)。与模型组大鼠相比,蛇床子素各剂量组大鼠肺组织T-AOC均增加(P<0.05),醋酸泼尼松组大鼠肺组织T-AOC有增加趋势但无统计学意义(P>0.05);与模型组大鼠肺组织相比,蛇床子素各剂量组大鼠肺组织GSH含量均增加(P<0.05),醋酸泼尼松组大鼠肺组织GSH含量显著增加(P<0.01);与模型组大鼠肺组织MDA含量相比,蛇床子素各剂量组大鼠肺组织MDA含量降低(P<0.05),醋酸泼尼松组MDA含量有降低趋势但无统计学意义(P>0.05)见表3。
##P<0.01,###P<0.001vs control;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs model.
实施例5蛇床子素对肺纤维化大鼠血清中T-AOC、GSH和MDA含量的影响
与正常组大鼠相比,模型组大鼠血清中T-AOC、GSH含量均降低(P<0.001),MDA含量增加极显著(P<0.001)。与模型组相比,蛇床子素大剂量组、醋酸泼尼松组大鼠MDA含量显著降低(P<0.01),蛇床子素中剂量组MDA含量极显著降低(P<0.001),小剂量组MDA含量降低(P<0.05);与模型组GSH含量相比,蛇床子素大剂量组、醋酸泼尼松组GSH含量显著升高(P<0.01),蛇床子素中、小剂量组GSH含量升高(P<0.05);与模型组小鼠相比,蛇床子素各剂量组大鼠血清中T-AOC增强(P<0.05),醋酸泼尼松组T-AOC有增强趋势但无统计学意义(P>0.05),见表4。
表4蛇床子素对肺纤维化大鼠血清中MDA、GSH和T-AOC含量的影响
##P<0.01,###P<0.001vs control;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs model.
实施结果小结
1.病理组织学观察结果显示,肺纤维化大鼠给予蛇床子素治疗28天后,与模型组大鼠相比,肺组织的肺泡炎和纤维化程度明显减轻。
2.连续给药28天后,蛇床子素可增加肺纤维化大鼠的体重,并显著地降低肺系数。
上述两项结果表明,蛇床子素具有一定的防治肺纤维化的作用。
3.给予实验大鼠蛇床子素灌服治疗28天后,肺纤维化大鼠肺组织内的羟脯氨酸(HYP)含量明显降低,提示其抗纤维化作用可能与抑制肺组织内胶原的生成有关。
4.给予蛇床子素灌服28天后,肺组织匀浆和血清内总抗氧化能力(T-AOC)明显增强、谷胱甘肽(GSH)含量明显升高,而氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量则显著性地降低。上述结果显示,蛇床子素还可能通过抗氧化作用实现其对肺纤维化大鼠肺组织的防治作用。
综上所述,蛇床子素对博莱霉素致大鼠肺纤维化具有一定的防治作用,该作用与其增加机体的抗炎、抗氧化能力及抑制肺组织内胶原生成有关。
Claims (3)
1.一种蛇床子素在制备防治肺纤维化药物中的应用。
2.权利要求1所述的一种蛇床子素在制备防治肺纤维化药物中的应用,其特征在于所述的药物包括治疗有效量的蛇床子素与药理学上可接受的载体。
3.权利要求1所述一种蛇床子素在制备防治肺纤维化药物中的应用,其特征在于所述药物中蛇床子素选用蛇床子素的含量≥95%的蛇床子提取物。
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