CN101530493A - 治疗呼吸系统疾病的药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗呼吸系统疾病的药物组合物及其用途。制备所述药物组合物的有效成分的原料是：1)补中益气，健脾益肺药，其选自：党参、黄芪、人参、太子参、西洋参；2)滋阴补血，益肾精药，其选自：熟地、生地黄、当归；3)补益肝肾、固本定喘药，其选自：山萸肉、何首乌、五味子、紫河车、蛤蚧；4)解表散寒，宣肺平喘药，其选自：炙麻黄、白果；5)清热燥湿，泻火解毒药，其选自：黄芩、金荞麦、桑白皮；6)理气健脾，燥湿化痰药，其选自：陈皮、青皮、枳壳、橘红；7)润肺下气，消痰止咳药，其选自：紫菀、百部、款冬花；8)清热凉血，活血化瘀药，其选自：赤芍、丹参、郁金；和9)甘草。

Description

治疗呼吸系统疾病的药物组合物及其用途

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及治疗呼吸系统疾病的药物组合物及其用途。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD主要累及肺脏，但也可引起全身(或称肺外)的不良效应。由于其患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题。COPD目前居全球死亡原因的第4位，世界银行/世界卫生组织公布，至2020年COPD将位居世界疾病经济负担的第5位。在我国，COPD同样是严重危害人民身体健康的重要慢性呼吸系统疾病。近期对我国7个地区20245名成年人群进行调查，COPD患病率占40岁以上人群的8.2％，其患病率之高十分惊人。

由于COPD具有缓慢进展和进行性加重的病理特点，对患者本人的健康、生存质量造成严重威胁，同时也成为患者和社会的重要经济负担。因此对该病的治疗成为目前当务之急。COPD病程可分为急性加重期与稳定期。COPD急性加重期是指患者出现超越日常状况的持续恶化，并需改变基础COPD的常规用药者，通常在疾病过程中，患者短期内咳嗽、咳痰、气短和/或喘息加重，痰量增多，呈脓性或黏脓性，可伴发热等炎症明显加重的表现。稳定期则指患者咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或症状轻微。COPD稳定期治疗的目的在于：(1)减轻症状，阻止病情发展；(2)缓解或阻止肺功能下降；(3)改善活动能力，提高生活质量；(4)降低病死率。

支气管扩张(简称：支扩)是常见的慢性呼吸系统疾病，其临床表现主要为慢性咳嗽，咯痰和/或反复咯血，属于中医“咳嗽、肺痈、咯血”等范畴。其主要病因病机为肺虚为本，累及它脏，病程迁延不愈，肺脾肾三脏俱虚；痰、热、瘀为其主要病理改变，瘀血贯穿始终。其病程可分为急性发作期和慢性缓解期。

肺间质纤维化是各种不同病因肺间质疾病的共同结局，以活动后呼吸困难、逐渐加重，干咳、喘憋为主要特征。近年来该病的发病率呈明显上升趋势，预后较差，且缺乏有效的治疗方法，被世界卫生组织列为难治性疾病。近年来，中医药对该病进行了深入的探讨。本病可分为急性加重期，慢性迁延期，重症多变期。邪盛正衰，慢性消耗，是肺间质纤维化的起始原因；气虚阴伤，肺络瘀阻，是肺间质纤维化形成的基本病理；损及他脏，反复感邪是肺间质纤维化病理演变的重要因素，本病总属本虚标实，以肺气虚损为本，以瘀血、痰、热为标，本病总由肺气虚损，气不行血，以致瘀血内停，或肺气不足，气不布津，聚而成痰。日久痰瘀互结，瘀久化热，内舍肺络以使痰、瘀、热三者相互并见，错杂为患，内客于肺，肺失宣降而发为本病。

COPD稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期的合理、有效的治疗对于该病患者长期预后具有重要的临床意义。

中医的辨证论治在上述疾病分期的防治中具有明显优势，通过综合调理，可以多途径、多方面打断病程链，从而缓解病情，减少急性发作次数及程度，达到改善活动能力，提高生活质量和延长寿命的目的。但是目前尚没有临床专门针对COPD稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期治疗的中成药，因此开发可用于治疗和/或预防此病症的药物具有非常重要的意义。

发明内容

本发明以中医的辨证论治为基础，发现了一种可用于治疗和/或预防呼吸系统疾病的药物组合物，特别是可用于治疗和/或预防COPD、支气管哮喘、支气管扩张和肺纤维化的药物组合物，更特别是发现了一种可用于治疗和/或预防COPD稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期的药物组合物。基于上述发现，完成了本发明。本发明第二方面提供了所述药物组合物在制备治疗和/或预防呼吸系统疾病的药物中的用途。

概括地说，本发明第一方面提供一种用于治疗和/或预防呼吸系统疾病药物组合物，其特征是制备其有效成分的原料是：

1)补中益气，健脾益肺药，其选自：党参、黄芪、人参、太子参、西洋参；

2)滋阴补血，益肾精药，其选自：熟地黄、当归、生地黄；

3)补益肝肾、固本定喘药，其选自：山萸肉、何首乌、五味子、紫河车、蛤蚧；

4)解表散寒，宣肺平喘药，其选自：炙麻黄、桑白皮、白果；

5)清热燥湿，泻火解毒药，其选自：黄芩、金荞麦；

6)理气健脾，燥湿化痰药，其选自：陈皮、青皮、枳壳、橘红；

7)润肺下气，消痰止咳药，其选自：紫菀、百部、款冬花；

8)清热凉血，活血化瘀药，其选自：赤芍、丹参、郁金；

9)甘草。

本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防呼吸系统疾病，特别是可用于治疗和/或预防COPD、支气管哮喘、支气管扩张和肺纤维化，更特别地是可用于治疗和/或预防COPD稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期。

根据本发明第一方面所述的药物组合物，其特征是制备其有效成分的原料是：党参、熟地黄、山萸肉、当归、炙麻黄、黄芩、陈皮、紫菀、赤芍、和甘草。

根据本发明第一方面任一项所述的药物组合物，其特征是制备其有效成分的原料和比例是：

党参(18--22)   熟地(18--22)   当归(18--22)   山萸肉(18--22)

炙麻黄(4--8)   黄芩(8--12)   陈皮(8--12)   紫菀(8--12)

赤芍(18—22)   甘草(4--8)。

根据本发明第一方面任一项所述的药物组合物，其特征是处方和比例是：

党参20g   熟地20g   当归20g   山萸肉20g

炙麻黄6g  黄芩10g   陈皮10g   紫菀10g

赤芍20g   甘草6g。

本发明第二方面提供本发明第一方面任一项所述的药物组合物的制备方法，其包括使所述的党参、熟地黄、山萸肉、当归、炙麻黄、黄芩、陈皮、紫菀、赤芍、和甘草十味药材用水煎煮、过滤、浓缩滤液、和干燥的步骤。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其包括使所述的党参、熟地黄、山萸肉、当归、炙麻黄、黄芩、陈皮、紫菀、赤芍、和甘草历经以下处理步骤：将十味药材用水煎煮二次，每次2小时，第一次10倍量水，第二次8倍量水，滤过，合并滤液浓缩至相对密度为1.30～1.32的清膏，干燥，粉碎成细粉，过筛，任选加入稀释剂，混合均匀。

本发明第三方面提供本发明第一方面任一项所述药物组合物在制备用于治疗和/或预防呼吸系统疾病的药物中的用途。

根据本发明第三方面的用途，其中所述的呼吸系统疾病包括但不限于COPD、支气管哮喘、支气管扩张和肺纤维化。

根据本发明第三方面任一项所述的用途，其中所述的呼吸系统疾病包括但不限于COPD稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期。

下面对本发明进行进一步的描述。本文所用的术语，如未明确说明或定义，则它们具有本领域技术人员公知的一般含义。

本发明人长期致力于呼吸系统疾病特别是COPD、支气管哮喘、支气管扩张和肺纤维化等疾病的研究与治疗，并针对COPD秋冬季容易发病而春夏季易于缓解的特点，提出在该病的稳定期扶正固本，使“正气存内，邪不可干”，以减少急性发作，延缓疾病进展。在总结多年临床经验的基础上，认为本病稳定期的主要疾病机理是肺脾肾虚、痰瘀互结。本发明人针对该疾病的临床特点，发挥中医药复方多靶点，整体调节的优势，凝练处方，创制本发明的可用于补肺药物组合物和相应的药物组合物。本发明补肺药物组合物是在大量总结此类病症临床资料的基础上研发的可用于治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期的中药复方。本发明药物组合物由党参、熟地黄、山萸肉、当归、炙麻黄、桑皮、陈皮等中药组成，具有健脾益肾补肺，祛瘀化痰平喘之功效，主治慢性阻塞性肺疾病稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期。中医辨证属肺脾肾虚夹痰瘀互结之证，因此本发明的药物组合物可以称之为补肺药物组合物。本发明的处方中，党参健脾益气、培土生金为君药；熟地黄和山萸肉滋肾、以期金水相生为臣；当归活血化瘀，炙麻黄宣肺平喘，黄芩清热，陈皮行气化痰，共为佐药，诸药共同可以起到健脾益肾补肺，祛瘀化痰平喘之用为使。使气得复，痰浊瘀热得清，脾肺之气升清降浊，金水二脏相互滋生，功能恢复正常，临床症状得以缓解或消失。

如本文使用的，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患呼吸系统疾病特别是本发明所述的呼吸系统疾病的动物个体采用本发明的药物组合物或药物组合物进行处理，以期对所述呼吸系统疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患本发明所述呼吸系统疾病或者对本发明所述呼吸系统疾病具有罹患风险的动物个体采用本发明的药物组合物或药物组合物进行处理，以期对所述呼吸系统疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

可采用制剂领域中的常规技术，将补肺药物组合物的原料通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到其有效成分，与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，并形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。

本发明药物组合物中可用的“药学上可接受的赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂。特定赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

如本文使用的，术语“COPD(慢性阻塞性肺疾病)”、“支气管哮喘”、“支气管扩张”和“肺纤维化”分别具有其医学领域的一般含义。

如本文使用的，术语“COPD稳定期”、“支气管哮喘慢性持续期”、“支气管扩张慢性缓解期”和“肺间质纤维化慢性迁延期”分别是指“COPD”、“支气管哮喘”、“支气管扩张”和“肺纤维化”的疾病进展的一定阶段。

如本文使用的，术语“有效量”是指本发明所述活性成分的量，该量可以对本发明所述呼吸系统疾病进行有效的治疗和/或预防。

如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义，并且在本文中可以指本发明的十味中药的原植物药材组合、或者十味中药材的提取物组合、或者是前述提取物进一步加工而成的制剂例如药物制剂。此外，本发明的“药物组合物”还可以呈保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，将本发明具有补肺作用的药物组合物的原料通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到其有效成分，任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，并形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。根据本发明的药物组合物，其为可以适用于口服给药、胃肠外给药或局部给药、外用给药的药物剂型。本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本发明的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

如本文使用的，术语“个体”或者“动物个体”具有其一般含义，并且在本文中可以指罹患或可能罹患本发明所述呼吸系统疾病的个体或动物个体，还可以指为了某种目的例如为了科学研究目的而使用的个体或动物个体。具体地说，所述的个体例如是动物个体，特别是哺乳动物个体，例如人、猪、狗、猫、牛、羊、马、大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、猴等。更具体地说，本发明所述的个体是人。

当本发明的药物组合物或者药物组合物作为药物施用于受试个体人或动物时，它们可以以其本身给予，即不加任何的上述药学可接受的载体，将本发明的药物组合物或者药物组合物以原形直接施用于患者；或者可以是以含有例如1～99％(更优选例如10～90％)的药物组合物(该药物组合物可以是本发明十味药材的提取物的形式)或者药物组合物(该药物组合物可以是本发明十味药材的提取物的形式)与药学可接受的载体组合后给予人或动物。

在本发明的药物组合物或药物组合物中的活性成分，其实际的剂量水平和施用的时程可以改变，以便获得一种活性成分的量，该量对于特定的受试个体、组合物和施用方法而言，可以有效地获得期望的治疗应答，而对受试个体无毒性。

经动物实验和临床研究表明，本发明的药物组合物或药物组合物可以有效地治疗和/或预防本发明所述呼吸系统疾病。具体地说，本发明的补肺药物组合物可用于治疗和/或慢性阻塞性肺疾病稳定期和支气管哮喘慢性持续期，效果显著，优于目前常用临床使用的阳性对照药。通过以补肺药物组合物为干预手段对稳定期COPD患者进行冬病夏治，能明显改善COPD稳定期的症状，使COPD患者保持在稳定状态；对于咳嗽、咯痰、喘息气短症状均有显著改善；圣·乔治医院呼吸问题调查问卷结果显示，患者服用补肺药物组合物后，在呼吸症状和疾病影响方面均较用药前减轻，改善方面主要表现在日常起居、户外活动的受限程度，咳嗽、咯痰、喘息对其带来的痛苦及对日常生活的影响，用药治疗带来的困扰及药物副作用等，与对照组相比，在呼吸症状和疾病影响方面均有显著改善。

具体实施方式

下述实施例中所用的实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。

实施例1、药物组合物的制备

准确称取党参200g，熟地黄200g，山萸肉200g，炙麻黄60g，当归200g，赤芍200g，黄芩100g，陈皮100g，紫菀100g，甘草60g十味药材，加水煎煮二次，每次2小时，第一次10倍量水，第二次8倍量水，滤过，合并滤液浓缩至相对密度为1.30～1.32(55℃)的清膏，干燥(干燥温度为60℃)，粉碎成细粉，过筛，加入适量乳糖，混匀，干法制成颗粒，得本发明组合物，称之为“补肺颗粒”(以代号“BFKL”表示，下同)，512g。批号：BFKL-1。

实施例2、药物组合物的制备

准确称取党参180g，熟地黄180g，山萸肉180g，炙麻黄80g，当归220g，赤芍220g，黄芩120g，陈皮120g，紫菀80g，甘草40g十味药材，加水煎煮二次，每次2小时，第一次10倍量水，第二次8倍量水，滤过，合并滤液浓缩至相对密度为1.30～1.32(55℃)的清膏，干燥(干燥温度为60℃)，粉碎成细粉，过筛，加入适量乳糖，混匀，干法制成颗粒，得补肺颗粒518g，即得本发明补肺药物组合物。批号：BFKL-2。

实施例3、药物组合物的制备

准确称取党参220g，熟地黄220g，山萸肉220g，炙麻黄40g，当归180g，赤芍180g，黄芩120g，陈皮80g，紫菀80g，甘草80g十味药材，加水煎煮二次，每次2小时，第一次10倍量水，第二次8倍量水，滤过，合并滤液浓缩至相对密度为1.30～1.32(55℃)的清膏，干燥(干燥温度为60℃)，粉碎成细粉，过筛，加入适量乳糖，混匀，干法制成颗粒，得补肺颗粒540g，即得本发明补肺药物组合物。批号：BFKL-3。

实施例4、药物组合物的制备

准确称取党参200g，熟地黄200g，山萸肉200g，炙麻黄80g，当归180g，赤芍180g，黄芩120g，陈皮100g，紫菀100g，甘草60g十味药材，加水煎煮二次，每次2小时，第一次10倍量水，第二次8倍量水，滤过，合并滤液浓缩至相对密度为1.30～1.32(55℃)的清膏，干燥(干燥温度为60℃)，粉碎成细粉，过筛，加入到80℃烘干并过80目筛的处方量乳糖中，混匀，检测含量，合格后装入1号胶囊即得。批号：BFJN-4。

质量控制例1、本发明药物组合物中陈皮药材的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取BFKL-1、BFKL-2、BFKL-3、BFJN-4分别10g，研细，加甲醇40ml，加热回流30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：按处方比例除去陈皮药材，同法制成阴性对照品。取阴性样品10g，研细，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

对照药材的制备：另取陈皮对照药材0.5g，加甲醇10ml，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液6μl，对照药材溶液2μl，分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯—甲醇—水(100:17:13)为展开剂，展至约3cm，取出，晾干，再以甲苯—乙酸乙酯—甲酸—水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂，展至约8cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

质量控制例2、本发明药物组合物中盐酸麻昔碱的薄层鉴别

供试品溶液的制备：分别取BFKL-1、BFKL-2、BFKL-3、BFJN各10g，研细，加水20ml使溶解，加浓氨试液1ml，三氯甲烷20ml超声处理50分钟，分取三氯甲烷层，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：按处方比例除去麻黄药材，同法制成阴性对照品。取阴性样品10g研细，按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

对照品的制备；取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液6～10μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—甲醇—浓氨试液(40:10:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。

质量控制例3、本发明药物组合物中黄芩苷含量的测定

色谱条件：色谱柱：Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇—水—冰醋酸(48:52:1)；柱温：室温；体积流量：1.0ml/min；检测波长280nm。

对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.200mg/ml溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的样品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，超声处理(功率250W，频率20KHz)60min，放冷，50％乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

分别取BFKL-1、BFKL-2、BFKL-3样品，按供试品溶液的制备方法处理，测定黄芩苷含量，结果见表1。

表1、组合物中黄芩苷含量测定结果

试验例1、药物组合物对哮喘豚鼠缓解期气道炎症和重塑的影响

一、实验材料

1.实验动物：

雄性清洁级豚鼠48只，月龄8～10周，平均体重250g～300g，购自中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心(编号：津实动质准字第6001号2005年获准)。

2.实验药物：

强的松(醋酸泼尼松片)，天津力生制药股份有限公司，批号：0609044，规格5mg/片，研碎溶于生理盐水制成悬浊液。

补肺颗粒：由天津中医药大学第二附属医院制剂室提供，水煎，浓缩取汁，浓度为4.05×10-2g/L。每次250ml(相当于生药201g)

3.仪器与试剂：

卵清白蛋白(OVA)，Grade II，Sigma A5253，购于天津联星生物制品有限公司；

超声雾化器 上海合力医疗器械厂，益鸟牌402型；

豚鼠ELISA法IL-8试剂盒、IL-4试剂盒、IFN-γ试剂盒(美国MI Market Inc公司生产)，TGF-β1试剂盒：购于北京中杉生物技术有限公司；

兔抗人TGF-β1多克隆抗体，购自Santa Cruz公司；

Super Picture TM-HRP Polymer(辣根过氧化物酶多聚物)(广谱)，购自津脉生物技术有限公司；

IDA2000数字医学图像分析系统(版本2004.1，武汉千屏影像技术有限责任公司)TENCAN酶标仪(美国产)；MRW洗板机(奥地利产)等。

EppendorffCentrifuge离心机。(5417R，Germany)

二、实验方法

1.动物分组

按照随机数字表分为四组，每组12只。正常对照组(A组，亦称对照组)，哮喘模型组(B组，亦称模型组)，强的松组(C组，亦称西药)，补肺颗粒组(D组，亦称中药组)。

2.建立哮喘缓解期模型

2.1致敏：正常饲养一周后，B、C、D组每只豚鼠腹腔注射10％OVA溶液1ml，含OVA100mg。A组注射等量生理盐水。

2.2激发：从致敏后第14d开始，B、C、D组雾化吸入1％的OVA约30秒～2分钟，以豚鼠出现呼吸加快、咳嗽、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为激发成功。每天1次，持续2周。

2.3缓解：末次激发后正常饲养2周。

3.给药方法

末次激发后正常饲养2周后各组分别给药干预

动物给药剂量参照徐淑云公式：

dB＝dA·RB/RA·(WA/WB)1/3

其中，dA为每公斤体重给药剂量，dB为豚鼠每公斤体重给药剂量，RA、RB分别代表人、豚鼠给药系数，WA、WB分别代表人、豚鼠体重。计算后每天每只豚鼠给含生药3.4g的补肺颗粒溶液4ml，含强的松0.48mg的生理盐水溶液4ml，灌服。

补肺颗粒组给予补肺颗粒溶液4ml灌胃，每日1次，共14天；

强的松组给予强的松生理盐水溶液4ml，每日1次，共14天；

正常对照组(A组)和哮喘模型组(B组)给予理盐水溶液4ml，每日1次，共14天。

4.取材、样本制备：各组豚鼠在最后一次激发24h后取材处死。

1％戊巴比妥钠，按40mg/kg体重给予豚鼠腹腔注射麻醉后，固定于木制鼠板。剥离颈部组织至气管，用眼科剪做T型切口。血管钳夹闭右侧支气管，取5ml磷酸盐缓冲液(PBS溶液)灌洗左肺，抽出带有白色泡沫的混浊支气管肺泡灌洗液(BALF)。如此冲洗三次，约能回吸4ml。心脏取血，在胸骨左侧缘触摸心跳最明显处垂直进针，取6ml～8ml血液。取肺组织，统一取右肺下叶。浸泡于中性福尔马林液固定保存。血液和BALF离心取上清液，保存于-70℃低温冰箱待测细胞因子。

5.观察与检测指标：

5.1 观察并记录各组豚鼠末次引喘状态。

5.2 豚鼠血清和BALF上清液IL-8、IL-4和IFN-γ检测。

采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定，操作步骤按说明书进行。

5.3 豚鼠肺组织病理观察和炎症评分

取豚鼠右肺下叶行苏木精-伊红(HE)和Masson染色，HE染色切片观察一般病理情况，半定量评定支气管周围炎症细胞浸润程度。Masson染色观察支气管壁厚度。

炎症评判标准：(1)无炎症细胞(0分)；(2)少许炎症细胞(1分)；(3)较多分布不均的炎症细胞(2分)；(4)大量炎症细胞，分布较均匀，少见聚集成团(3分)；(5)大量炎症细胞聚集成团(4分)。

随机选取Masson染色切片中内周长<1000μm，长径/短径≤2，较规整的小支气管，每组选≥20个，采用IDA2000数字医学图像分析系统测定支气管基底膜周径(Pbm)，气管内壁面积(WAi)、上皮粘膜层面积(WAmuc)、总管壁面积(WAt)，平滑肌面积(WAm)，并用Pbm将测量值标准化，分别以WAt/Pbm、Wam/Pbm表示，代表相应管壁层的厚度。

5.4 TGF-β1检测

5.4.1 石蜡切片脱腊，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，3％ H2O2室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

5.4.2 抗原热修复：使用柠檬酸修复液(PH＝6.0)，微波修复10分钟，冰水浴至室温。滴加一抗，一抗采用兔抗人TGF-β1多克隆抗体，稀释浓度1:100。37℃孵育1小时。PBS冲洗，2分钟×3次。滴加二抗Super Picture TM-HRP Polymer(辣根过氧化物酶多聚物)，37℃孵育30分钟。PBS冲洗，2分钟×3次。DAB显色剂显色。自来水冲洗，复染，封片。

5.4.3 镜下观测：每片取10个视野，×400倍镜下，半定量法测定TGF-β1面积比。

6.统计学处理

实验数据采用SPSS13.0统计软件包分析，所有结果均以x±s表示。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多组间两两比较采用LSD法。对等级数据和不符合正态分布或方差齐性的计量数据，则进行秩和检验(Kruskal-Wallis法)。P<0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.各组豚鼠末次引喘状态

正常对照组(A组)豚鼠偶有呛咳，无喘息急促，腹部翕动等表现。

哮喘模型组(B组)豚鼠出现喘息急促、点头呼吸等呼吸困难表现，腹部翕动，易激惹、烦躁不安、呛咳等。

强的松组(C组)和补肺颗粒组(D组)经抗原激发后，出现呛咳、急促和烦躁不安等表现，但程度较B组明显减轻，出现症状时间明显延长。

2.HE染色各组豚鼠肺组织形态观察

正常对照组(A组)：肺组织结构完整，肺泡充气良好，肺泡间隔厚薄均匀、无增厚，支气管粘膜上皮、粘膜肌层均匀排列，无增生，支气管腔规则，无明显狭窄，部分支气管粘膜仅见极少许炎细胞浸润。

哮喘模型组(B组)：支气管壁塌陷收缩，支气管腔狭窄，部分腔内可见炎性坏死渗出物，粘膜层、粘膜肌层可见大量炎细胞浸润，炎细胞以嗜酸粒细胞成分为主，伴纤维结缔组织和气道平滑肌增生，支气管粘膜层、粘膜肌层明显增厚。肺泡间隔明显增宽，肺泡间质多量炎细胞浸润，炎细胞以嗜酸粒细胞成分为主，伴纤维结缔组织增生，部分肺泡充气不良，部分肺泡壁塌陷，呈一狭窄缝隙，部分肺泡腔内充满浆液性液体，部分肺泡破裂融合，炎细胞呈灶片状浸润，肺间质血管扩张充血。

强的松组(C组)：支气管壁收缩，支气管腔狭窄，部分腔内可见炎性坏死渗出物，粘膜层、粘膜肌层可见少到中等量炎细胞浸润(较模型组减少)，炎细胞以嗜酸粒细胞成分为主，伴纤维结缔组织和气道平滑肌增生，支气管粘膜层、粘膜肌层增厚。肺泡间隔明显增宽，肺泡间质少到中等炎细胞浸润，炎细胞以嗜酸粒细胞成分为主，伴纤维结缔组织增生，部分肺泡充气不良，部分肺泡壁塌陷，呈一狭窄缝隙，部分肺泡断裂融合，炎细胞呈灶片状浸润，肺间质血管扩张充血。

补肺颗粒组(D组)：支气管壁收缩，支气管腔轻度狭窄，部分腔内可见少量炎性坏死渗出物，粘膜层、粘膜肌层可见少量炎细胞浸润(较模型组减少)，炎细胞以嗜酸粒细胞成分为主，纤维结缔组织和气道平滑肌少量增生(较模型组和强的松组明显减少)，支气管粘膜层、粘膜肌层轻度增厚。肺泡间隔轻度增宽，肺泡间质少量炎细胞浸润，偶见小灶状炎细胞浸润，炎细胞以嗜酸粒细胞成分为主，部分肺泡充气不良，部分肺泡壁塌陷，呈一狭窄缝隙，部分肺泡断裂融合，肺间质血管扩张充血。

3.炎症细胞浸润结果

HE染色切片中，支气管周围炎症细胞浸润程度半定量评定结果见表2。

表2

 

组别	视野数n	记分
			A组	29	1.93±0.96
B组	30	2.67±0.99＊
			C组	29	2.41±0.98＊＊#

 

D组

29

2.34±0.86＊＊#Δ

用非参数法检验Mann-WhiteneyU法：与正常组比较^＊P<0.01；^＊＊P>0.05；与模型组比较#P>0.05；与强的松组比较ΔP>0.05。

4.肺泡灌洗液中IL-8、IL-4和IFN-γ变化结果

检测各组豚鼠肺泡灌洗液中IL-8、IL-4和IFN-γ变化情况，结果见表3。

表3

 

组别	动物数	IL-8	IL-4	IFN-γ
					A组	12	102.64±74.69＊＊	10.30±1.19＊＊	11.77±1.46＊＊
B组	11	203.15±56.91##	12.54±2.10##	9.54±0.82##
					C组	8	127.36±82.63#＊＊	10.20±1.43#＊＊	12.9±12.71#＊＊
D组	12	99.82±82.00Δ#＊＊	11.15±1.51Δ#＊＊	11.79±1.75Δ#＊＊

注：与正常组比#P>0.05，##P<0.01；与模型组相比^＊P<0.05，^＊＊P<0.01；与西药组比Δ>0.05。

5.血清中IL-8、IL-4和IFN-γ变化结果

检测各组豚鼠血清中IL-8、IL-4和IFN-γ变化情况，结果见表4。

表4

 

组别	动物数	IL-8	IL-4	IFN-γ
					A组	12	1.15±0.27＊	0.95±0.75＊＊＊	4.33±3.95＊＊＊
B组	11	1.42±0.28##	1.33±0.78#	2.97±2.59#
					C组	8	1.01±0.35＊＊	0.98±0.19#＊＊＊	3.99±3.57#＊＊＊
D组	12	1.12±0.24＊	1.19±0.62Δ＊＊＊	3.46±2.85Δ＊＊＊

注：与正常组比#P>0.05，##P<0.05；与模型组相比^＊P<0.05，^＊＊P<0.01，^＊＊＊P>0.05；与西药组比ΔP>0.05

6.豚鼠肺组织中TGFβ-1面积比影响

结果见表5。

表5

 

组别	例数×10个视野数	TGFβ-1
			A组	120	12.82±3.68

 

B组	110	19.26±4.46#
			C组	80	17.48±4.62＊＊
D组	120	14.77±4.87＊

与正常组比#P<0.01；与模型组相比^＊P<0.05，^＊＊P<0.01。

7.各组豚鼠气道重构程度比较

结果见表6。

表6

 

组别	视野数	WAmuc/Pbm	WAm/Pbm	WAi/Pbm
					A组	23	42.95±12.21＊	25.10±8.72＊	21.84±17.89＊
B组	20	46.54±19.58＊	22.91±8.15＊	23.19±13.34＊
					C组	29	37.99±12.13#＊	21.27±7.95＊＊	23.01±11.41＊＊
D组	22	45.09±9.64＊＊	23.77±6.05＊＊	24.06±10.48＊＊Δ

与模型组比较#P<0.05，^＊P>0.05；与正常组比较^＊P>0.05；与西药组比ΔP>0.05。

结果显示，气管粘膜面积、内壁面积和平滑肌面积除强的松组气管粘膜面积明显低于模型组外，其余各面积两两比较均无显著性差异。

四、结论总结

1.末次引喘情况显示，模型组在末次激发时出现较典型的喘息症状，证实此时豚鼠虽无哮喘发作症状，但机体仍处于敏感状态，较正常豚鼠表现出气道反应性的增高，符合人类哮喘缓解期的病理状态。经中药和强的松治疗，豚鼠接触变应原后的喘息程度明显减轻，提示哮喘缓解期合理的药物干预对减轻发作程度，防治哮喘发作有肯定的作用。

2.各组豚鼠肺组织形态和炎症状态的观察结果提示：通过末次引喘，我们模仿了哮喘从缓解到发作的过程，实验结果发现哮喘豚鼠气道出现的以平滑肌增生、粘膜层、粘膜肌层增厚等为特点的形态结构变化证实了气道重塑的存在，经过强的松和中药治疗，上述变化出现了减轻的趋势。缓解期合理的治疗可能通过抑制哮喘豚鼠气道结构的变化，减轻其气道平滑肌、气短粘膜的增厚，防止气道不可逆性气流受限的出现。

3.IL-8是哮喘气道炎症中重要的前炎因子，可促进气道炎症的发生，中药组和强的松组豚鼠血清和支气管肺泡灌洗液IL-8水平明显低于模型组，提示缓解期的合理有效治疗可以明显降低哮喘再次急性发作时豚鼠全身和肺脏局部的炎症因子水平，从而控制哮喘的气道炎症和气道高反应性，达到防治哮喘的作用。

4.“Th1/Th2失衡”学说认为哮喘主要是由Th2细胞介导的气道变应性炎症，表现为哮喘时浸润到气道的淋巴细胞主要是Th2细胞，而Th1细胞相对较少；而且由Th2细胞所产生的IL-4、IL-5等增多，而Th1类细胞因子IFN-γ相对不足。目前在有关Th1/Th2失衡的研究中多以IFN-γ代表Th1类细胞因子，以IL-4代表Th2类细胞因子。Horwitz等曾用中医的“阴阳平衡”来比喻过敏性疾病中IFN-γ和IL-4之间的关系，认为过多的IL-4或IFN-γ缺乏可以引发免疫球蛋白(Ig)E反应，相反，增加IFN-γ浓度或降低IL-4的水平则可抑制上述过程。本研究结果显示：中药组和强的松组豚鼠肺泡灌洗液中IL-4水平明显低于模型组，IFN-γ水平则明显高于模型组。豚鼠血清IL-4、IFN-γ水平在各组实验动物中无显著性差异，但其均数出现了IL-4下降，IFN-γ升高的趋势。提示缓解期治疗能通过上调TH1细胞因子(IFN-γ)水平、下调TH2细胞因子(IL-4)水平，从而纠正哮喘TH1/TH2失衡，恢复正常的免疫功能状态，达到减轻哮喘发作程度等的目的。

5.支气管哮喘是由多种细胞和细胞组份参与的气道慢性炎症性疾患，这种慢性炎症导致气道高反应和气道重塑，是引起哮喘反复发作的主要原因。哮喘气道重塑在慢性哮喘的病理生理中非常重要，决定着诸多哮喘的临床表现。气道重塑的程度与哮喘病情的严重性密切相关，严重气道重塑的哮喘患者常对糖皮质激素不敏感。因此，哮喘气道重塑是未来开发治疗哮喘药物的重要靶标，逆转哮喘气道重塑过程的药物在哮喘治疗中将起关键作用。上皮下胶原沉积及纤维化是哮喘气道重建的典型特征，转化生长因子β1(TGF-β1)在此过程中发挥了重要作用。同时，TGF-β1可能作为一个抗炎因子在哮喘的变应性炎症前阶段及炎症过程中起着重要作用，因此TGFβ-1可以体现气道炎症损伤后的气道重塑的程度，TGF-β1可刺激气道和血管的平滑肌细胞增生和肥大，诱导气道成纤维细胞的分裂增殖，促进成纤维细胞向成肌纤维细胞转化，增加纤维黏蛋白和胶原的合成及在细胞外基质的沉积，同时还抑制胶原酶和蛋白酶的产生以减少胶原的降解。

本研究显示模型组与正常组比较，豚鼠肺组织中TGFβ-1显著升高，中药组与强的松组TGFβ-1较模型组显著降低，同时中药组与强的松组比较TGFβ-1降低也具有显著性。提示缓解期合理治疗可以有效的降低TGFβ-1表达水平，补肺颗粒在缓解期治疗具有明显优势。

试验例2、补肺颗粒的临床及实验研究

(一)本发明组合物(补肺颗粒)治疗COPD稳定期临床疗效评价

1.资料与方法

1.1 一般资料

60例均为天津中医药大学第二附属医院2008年6月～2008年8月门诊患者，均符合COPD诊断标准，分期为稳定期。病情严重程度属II级～III级(中～重度)。排除合并严重肝、脑、肾、内分泌、造血系统和精神疾病。随机分为两组。治疗组30例，男性21例，女性9例；年龄40～75岁，平均60.97±8.97岁。对照组30例，男性22例，女性8例；年龄40～75岁，平均59.54±10.87岁。两组病程、病情、主要临床症状及体征、肺功能测定以及性别、年龄无显著差异(P>0.05)。

1.2 治疗方法

治疗组(A组)：补肺颗粒(天津中医药大学第二附属医院制剂室提供，每袋8g)。对照组(B组)：给予安慰剂(天津中医药大学第二附属医院制剂室提供，每袋8g)。两组均每次口服2袋，一日2次，30天为一疗程。

1.3 观察指标

(1)中医证候积分。观察记录中医四诊资料，包括咳嗽、咯痰、气短等症状及舌象、脉象，填写慢阻肺中医证候积分表。临床控制：临床症状和体征大部分消失，证候积分减少≥95％；显效：临床症状和体征大部分，证候积分减少≥70％；有效：临床症状和体征部分好转，证候积分减少≥30％；无效：临床症状和体征未有好转或加重，证候积分减少不足30％。(2)治疗前后呼吸困难量表测评(依据英国医学研究委员会的呼吸困难量表[3]进行评价)；(3)生存质量测评。采用圣乔治呼吸问卷[4]评价。(4)肺功能测定：一秒钟用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FVC)、一秒钟用力呼气容积占用力肺活量比值(FEV1％FVC)。(5)血、尿、便常规检查，心、肝、肾功能检查。(6)记录药物的不良反应。

1.4 统计学方法

所有病例资料均输入epidata建立数据库，并经统计学软件SPSS11.5处理，组内自身前后对照采用配对t检验，组间比较采用成组t检验。

2.治疗结果

2.1.1 两组疗效比较

治疗结果见表7。治疗组显效2例(6.67％)，好转15例(50％)，总有效病例17例(56.67％)。对照组显效0例(0％)，好转6例(20％)，总有效病例6例(20％)。二者有显著差异(P<0.05)。

表7 两组疗效比较(-x±s)

 

组别	例数	临床控制	显效	好转	无效	总有效率(％)
							治疗组	30	0	2	15	13	56.67
对照组	30	0	0	6	24	—20

2.1.2 两组证候及单项症状积分比较

结果见表8。治疗前两组间经T检验无显著性差异(P>0.05)，具有可比性；治疗后两组症状均有所好转，两组间对比有显著性差异(P<0.05)。

表8 两组证候及单项症状积分比较(-x±s)

2.2 两组治疗前后呼吸困难量表比较

结果见表9。治疗前两组的呼吸困难无显著性差异(p>0.05)，具有可比性；治疗后两组呼吸困难均有所好转，两组间对照无显著性差异(p>0.05)。

表9 两组治疗前后呼吸困难量表比较

 

组别	例数	治疗前	治疗后
				治疗组	30	1.93±0.74	1.40±0.72
对照组	30	1.87±0.86	1.73±0.58

2.3 两组治疗后圣·乔治医院呼吸问题调查的变化

结果见表10。治疗后两组症状均有所好转，总积分、呼吸症状及疾病影响两组间对照有显著性差异(P<0.05)，活动受限两组间对照无显著性差异(P>0.05)。

表10 两组治疗后圣·乔治医院呼吸问题调查的变化

2.4 治疗后肺功能比较

结果见表11。治疗后两组的肺功能均有好转，肺功能变化无显著性差异(P>0.05)。

表11 治疗后肺功能比较

 

组别	例数	FEV1	FVC	FEVI％FVC
					治疗组	30	45.02±20.40	60.98±23.58	58.16±11.48
对照组	30	39.16±11.82	57.21±14.97	54.77±7.94

2.5 一般检查

患者血、尿、便常规及肝功、肾功、心电图检查，两组治疗前后均在正常范围，无统计学意义，故未做详细的统计分折。

2.6 不良反应

两组均未出现不良反应。

3.讨论

本研究显示，通过以补肺颗粒为干预手段对稳定期COPD患者进行冬病夏治，能明显改善COPD稳定期的症状，使COPD患者保持在稳定状态；对于咳嗽、咯痰、喘息气短症状均有显著改善；圣·乔治医院呼吸问题调查问卷结果显示，患者服用补肺颗粒后，在呼吸症状和疾病影响方面均较用药前减轻，改善方面主要表现在日常起居、户外活动的受限程度，咳嗽、咯痰、喘息对其带来的痛苦及对日常生活的影响，用药治疗带来的困扰及药物副作用等，与对照组相比，在呼吸症状和疾病影响方面均有显著改善；对于呼吸困难评分及肺功能无明显改善。目前尚未有专门针对COPD稳定期的治疗方法及中成药，本研究充分体现了中医药治疗COPD稳定期的优势，说明补肺颗粒能在COPD稳定期患者冬病夏治中可显著改善患者的临床症状，提高患者生存质量。

Claims (9)

1、用于治疗和/或预防呼吸系统疾病药物组合物，其特征是制备其有效成分的原料是：

1)补中益气，健脾益肺药，其选自：党参、黄芪、人参、太子参、西洋参；

2)滋阴补血，益肾精药，其选自：熟地、生地黄、当归；

3)补益肝肾、固本定喘药，其选自：山萸肉、何首乌、五味子、紫河车、蛤蚧；

4)解表散寒，宣肺平喘药，其选自：炙麻黄、白果；

5)清热燥湿，泻火解毒药，其选自：黄芩、金荞麦、桑白皮；

6)理气健脾，燥湿化痰药，其选自：陈皮、青皮、枳壳、橘红；

7)润肺下气，消痰止咳药，其选自：紫菀、百部、款冬花；

8)清热凉血，活血化瘀药，其选自：赤芍、丹参、郁金；

9)甘草。

2、权利要求1的药物组合物，其特征是制备其有效成分的原料是：党参、熟地黄、山萸肉、当归、炙麻黄、黄芩、陈皮、紫菀、赤芍、和甘草。

3、权利要求2的药物组合物，其特征是制备其有效成分的原料和比例是：

党参(18--22)    熟地(18--22)    当归(18--22)    山萸肉(18--22)

炙麻黄(4--8)    黄芩(8--12)     陈皮(8--12)     紫菀(8--12)

赤芍(18—22)    甘草(4--8)。

4、权利要求3的药物组合物，其特征是处方和比例是：

党参20g    熟地20g    当归20g    山萸肉20g

炙麻黄6g   黄芩10g    陈皮10g    紫菀10g

赤芍20g          甘草6g。

5、权利要求1至4任一项所述的药物组合物的制备方法，其包括使所述的党参、熟地黄、山萸肉、当归、炙麻黄、黄芩、陈皮、紫菀、赤芍、和甘草十味药材用水煎煮、过滤、浓缩滤液、和干燥的步骤。

6、权利要求5的制备方法，其包括使所述的党参、熟地黄、山萸肉、当归、炙麻黄、黄芩、陈皮、紫菀、赤芍、和甘草历经以下处理步骤：将十味药材用水煎煮二次，每次2小时，第一次10倍量水，第二次8倍量水，滤过，合并滤液浓缩至相对密度为1.30～1.32的清膏，干燥，粉碎成细粉，过筛，任选加入稀释剂，混合均匀。

7、权利要求1至4任一项所述药物组合物在制备用于治疗和/或预防呼吸系统疾病的药物中的用途。

8、权利要求7的用途，其中所述的呼吸系统疾病选自COPD、支气管哮喘、支气管扩张和肺纤维化。

9、权利要求7的用途，其中所述的呼吸系统疾病选自COPD稳定期、支气管哮喘慢性持续期、支气管扩张慢性缓解期及肺间质纤维化慢性迁延期。