CN101998991B - 用于生产生物分子的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于生产生物分子，特别是药物级质粒DNA的可以规模化的过程和设备。所述过程包括碱裂解步骤、中和步骤以及可以进一步扩展到澄清步骤。本发明公开了用于分离溶胞产物和沉淀物的改进的漂浮方法。该方法基于CO2气泡在沉淀絮凝物上的附着。该CO2由碳酸盐释放，在中和(酸化)过程中或之后。优选本发明的方法使用用于溶胞和中和的设备以及用于完全连续澄清(分离絮凝物和澄清的溶胞产物)的新型设备，以自动的连续方式来进行。

Description

用于生产生物分子的方法和设备
技术领域
本发明涉及生产生物分子，特别是多核苷酸例如质粒DNA的领域。特别地，本发明涉及温和的澄清步骤，其利用通过产生气体气泡(无气体/空气的喷射)来调节的先进的漂浮方法(floatation method)。本发明特别适合于工业规模的方法，其包括以下步骤：在碱条件下的细胞溶胞，之后的中和以及随后的细胞溶胞产物的澄清，而所有这些步骤以完全连续方式运行。
发明背景
在二十世纪最后二十五年以及二十一世纪初，在分子和细胞生物学上的发展导致用于生产重组生物分子(生物聚合物)的新技术的产生。这组大分子包括，例如蛋白质、核酸和多糖。它们越来越多地用于人类的卫生保健、用于疾病的诊断、预防和治疗领域。
近年来，在诊断、基因治疗和核酸疫苗领域中用多核苷酸取得了一些最具革命性的进步。这些应用的共同之处在于，将DNA引入到细胞中，特别是将染色体外DNA或RNA引入到细胞中以辅助诊断、治疗或预防的效果。
多核苷酸有代表性的成员为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)、基因组DNA(gDNA)或染色体DNA(cDNA)、以及质粒DNA(pDNA)。这些大分子可以是单链或双链的。
根据其大小和形状，多核苷酸对于酶降解(DNA酶和RNA酶)和剪切力是敏感的。尤其是染色体DNA，当处于其变性形式和纠缠形式(entangledform)时，其对于机械压力非常敏感，产生与pDNA具有相似性质的片段。对于暴露在剪切力下的期间，这一点变得越来越重要(Ciccolini LAS，Shamlou PA，Titchener-Hooker N，Ward JM，Dunnill P(1998)BiotechnolBioeng 60：768；Ciccolini LAS，Shamlou PA，Titchener-Hooker N(2002)Biotechnol Bioeng 77：796)。
质粒(pDNA)是双链的染色体外环状多核苷酸。大部分药物用质粒的大小范围为3～10kbp，相当于2×106～7×106的分子量且其具有的旋转半径为100nm或更高(Tyn M，Gusek T(1990)Biotech.Bioeng.35：327)。有报道显示在某些情况下，多顺反子/多价质粒大于20kbp，其编码几个不同的蛋白质(Müller PP，Oumard A，Wirth D，
Figure BPA00001234101900021
A，Hauser H，in：Schleef M(2001)Plasmids for Gene Therapy and Vaccination，Wiley-VCH，Weinheim，p119)。可以区分pDNA的不同拓扑形式。超螺旋(sc)或共价闭合环状(ccc)形式被认为对于治疗用途是最稳定的，因此其是所期望的形式。其它的拓扑pDNA形式是从ccc形式通过单链切口(开环的或oc)或双链切口(线性的)而产生，或者由接合产生。物理的、化学的或酶的活性可以引起链的断裂。对于治疗用途而言，ccc形式的比例是用于评价pDNA制品质量的主要参数。
在基因治疗和遗传疫苗领域，不断增加的临床试验数量反映出pDNA的潜在优点。目前，还观察到根据cGMP规则生产药物级pDNA的需求在持续不断的增加。特别是针对基于pDNA的疫苗(pDNA-based vaccine)的市场供应，预计确定每年将需要许多克或甚至几千克的经纯化的pDNA。因此，需要可以在工业规模上运行的过程。这些生产过程必须满足规章的要求(例如FDA，EMEA)，并应当是经济上可行的和必须是具有生产性和耐用的。
以往，已经开发出的大部分生物技术生产过程是用于生产经纯化的重组蛋白质的。由于多核苷酸和蛋白质在物理-化学性质上存在不同，这些方法难以适用于多核苷酸的生产。建立了基于传统实验室规模实验设计的生产过程的制造业者，面临涉及生产性、可规模化以及产品的成本(COGS)方面的越来越多严格的限制。因此，需要可以用于多核苷酸的方法，特别是用于在制造业规模生产pDNA的方法。
简言之，用于生产不被宿主分泌的重组生物分子的过程，特别是pDNA和大蛋白质，其步骤如下：
a)发酵(培养携带有目标生物分子的细胞以及任选从发酵液中收获所述细胞)，
b)细胞破碎(从细胞中释放目标生物分子)，
c)分离和纯化(从杂质中分离出目标生物分子)。
更为具体地，上述这些步骤的特征在于用于多核苷酸的生产，特别是用于生产pDNA，如下所述。
通常，大肠杆菌是用于pDNA生产的最为常用的宿主。其它细菌、酵母、哺乳动物和昆虫细胞也可以在发酵步骤中用作宿主细胞。将选择适合的宿主菌株、良好限定的培养基用于高细胞密度过程以及保持高质粒拷贝数，这对于pDNA的质量是非常重要的，对于实现耐用经济的过程也是非常关键的(Werner RG，Urthaler J，Kollmann F，Huber H，Necina R，Konopitzky K(2002)Contract Services Europe，a supplement to Pharm.Technol.Eur.p.34)。
发酵之后，通常收获细胞，大部分是通过离心装置。将收获的湿生物质重悬在适合的缓冲液中。在最终从杂质(与宿主相关的：例如蛋白质、gDNA、RNA和内毒素；与产物相关的：例如不期望的多核苷酸亚型(polynucleotide isoforms)；与过程相关的：例如发酵培养基的剩余化合物)中分离出多核苷酸之前，需要对细胞进行处理，即可以直接处理也可以在冷冻和解冻之后处理。任选地，在进一步处理前收获和重悬细胞，对发酵液本身可以进行进一步处理(WO 97/29190)。
处理过程从破碎细胞开始(释放多核苷酸)并以回收含有目标多核苷酸的澄清的溶液为终止。在后续的分离目标多核苷酸的过程中(通过例如柱色谱、超渗滤(ultradiafiltration)、提取或沉淀)需要将其从杂质中分离出来。
可以通过物理的、化学的或酶方法来实现细胞的破碎。通常，破碎和从细菌细胞中释放出目标多核苷酸是通过Birnboim和Doly(Birnboim HC，Doly J(1979)Nucl Acids Res 7：1513)所描述的碱裂解来进行的。
本文中公开的破碎/释放过程可以分为两个步骤，第一步是内部的细胞破碎或溶胞步骤，和第二步中和步骤。
在碱裂解中，细胞经碱溶液(优选NaOH)和表面活性剂(优选十二烷基硫酸钠(SDS))处理。在这种环境下，细胞壁结构被破坏从而释放出目标多核苷酸及其它与细胞相关的化合物。最后，通过加入酸性盐来中和该溶液，优选加入醋酸盐，特别优选醋酸钾(KAc)或醋酸钠(NaAc)。在中和细胞碎片的过程中，蛋白质以及gDNA通过形成絮状沉淀物与十二烷基硫酸盐共沉淀(Levy MS，Collins IJ，Yim SS，et al.(1999)Bioprocess Eng 20：7)。
在碱裂解和中和之后的步骤中，需要将沉淀物从含有质粒的溶液中分离出来。这个步骤，在本发明的含义下，被称为“澄清步骤(clarification step)”。
关于澄清步骤，利用固定角转子的离心是最经常使用的、用于实验室和预准备规模的方法(Ferreira GNM，Cabral JMS，Prazeres DMF(1999)Biotechnol Prog 15：725)。当溶胞产物的量通常控制在瓶子中时，澄清的液相(clearer liquid phase)从漂浮的絮凝物，以及一会儿之后一些下降(不漂浮)的沉淀物的较大的相中分离出来。仅吸取和过滤澄清的液相。另外大量的絮凝物立即被使用的过滤器所阻挡。当由于机械压力导致絮凝物被破坏时，会导致漂浮的趋势降低以及差的相分离，在澄清液体中不断增加的絮凝物的量甚至会更为阻碍过滤过程。通常来说，漂浮的絮凝物层不是非常致密的，因此下面的澄清相的比例占总体积(澄清相和絮凝物相)的约50-70％。由于在絮凝物相的液体中含有剩余的质粒DNA(Theodossiou I，Collins IC，Ward JM，Thomas ORT，Dunnhill P(1997)Bioproc Eng 16：175)，必须重视此时损失高达至40％(Urthaler J，Ascher C，
Figure BPA00001234101900041
Necina R(2007)J Biotechnol128：132)。进一步，还应当考虑(多)核苷酸例如pDNA和不同的过滤器介质之间较强的吸附(Theodossiou I，Collins IJ，Ward JM，Thomas ORT，Dunnhill P(1997)Bioprocess Eng 16：175；Theodossiou I，Thomas ORT，Dunnhill P(1999)Bioprocess Eng 20：147)。通常主体过滤器(bulk filter)材料或袋式过滤器用来使溶胞产物澄清。由于这些材料即不能经检验有无法规模化，因此它们不能应用于制造业规模上的药物级质粒的生产中。近期的技术利用膨胀床吸附(expanded bed adsorption)(EBA)，该技术可以在捕获所期望的产物的同时除去沉淀物质(Chase HA(1994)Trends Biotechnol 12：296)。然而，应当考虑由于在中和过程中产生的凝聚絮凝物的较大的直径，EBA之前的预澄清是重要的(Ferreira GNM，Cabral JMS，Prazeres DMF(2000)Bioseparation 9：1；Varley DL，Hitchkock AG，Weiss AME，et al.(1998)Bioseparation 8：209)。
已经有一些尝试来开发针对上述每一个步骤的改进技术，这些步骤通常以非连续的开放系统来运转，这承担着可能污染的风险。该处理步骤不是自动的，因此其结果是取决于使用者的。因此所使用的方法和设备不适合用于制造业规模上的药物级多核苷酸的生产。对于这些过程，控制大pDNA量的唯一方式就是增加设备，例如平行地运行这些设备。
考虑到目标多核苷酸的进一步纯化，通常需要调整溶液的参数(例如盐的组分、导电性、pH值)以保证所期望的多核苷酸与树脂的结合(该调整步骤，在本发明的含义内，被称为“调节步骤(conditioning step)”)。随后，将该溶液经过第一色谱步骤(捕获步骤)。
可能是最难以克服的限制因素即溶胞产物的澄清。为了获得澄清的溶胞产物，经沉淀的物质必须从含有多核苷酸的溶液中分离出来。传统地，该澄清步骤以分批的方式(batchwise mode)来进行，利用本领域中已知的技术，例如过滤或离心(例如US 2001/0034435，WO 02/04027)。最为普遍的是，所述过滤器是深度过滤器(depth filter)(WO 00/09680)。其它用于粗过滤(macrofiltration)的过滤方式是由压缩滤网(compressed gauze)或与此相当的过滤器材料构成的大孔隔膜(macroporous diaphragm)(EP 0376080)。根据一些方案，过滤在存在助滤器(filter aid)的条件下进行(WO 95/21250，WO02/057446，US 2002/0012990)。WO 96/21729公开了如下方法：在离心步骤之后包含使用硅藻土的过滤步骤，从而实现减少RNA含量的额外效果。另外，EP 0814156中描述了以膜过滤器和疏松基质(loose matrix)(玻璃、硅胶、阴离子交换树脂或硅藻土)协同地作为DNA的载体。根据WO 96/08500，WO 93/11218，EP 0616638和EP 0875271，通过下述设备来完成澄清，该设备的过滤部分可以由不同材料(例如玻璃、硅胶、氧化铝)以疏松颗粒、层或过滤器板的形式(特别是具有不均匀的孔径分布)构成。由重力、真空、压力或离心来实现通过过滤器的流动。在WO 2004/024283和WO 2004/108260中描述了实现絮凝物和溶胞产物分离的其它选择。其中，在中和之前或中和的过程中用于该过程的缓冲液/溶液中的一种，与通过气体通道(gas port)导入的可控气流相混合。气体的良好分布是通过鼓泡石(sparge stone)来实现的，该鼓泡石在与溶液/悬浮液相连的流体中且提供一定大小的小气泡。小气泡附着到中和过程中产生的沉淀物上。经中和的已溶解的细胞溶液被收集到槽中并且保持一段时间，需要该过程以使得大量絮凝物漂浮(由吸附的气泡来调节)。然后，通过一组过滤器分批地过滤下面的溶胞产物相。在另一个方案中，收集溶胞产物絮凝物混合物(在具有或不具有气体喷射的条件下得到)到槽中，设计该槽从而使得还可以在絮凝物/溶胞产物相上施用减压(真空)(WO 03/070942，WO 2004/108260)。真空促进絮凝物的漂浮并引导它们到收集槽的顶部。这些方法均以非连续的模式进行澄清，并且需要用于澄清的额外的过滤步骤。在WO 99/37750和WO 96/02658中公开了将离心用作连续的澄清方法(例如碟式离心(disc stack centrifuge)或沉降式离心)。还公开了为了澄清的目的，在过滤之后结合离心的方法(WO 02/26966，WO96/02658)。
上述澄清方法通常在物质与中和缓冲液温育一定的时间后进行。该步骤无法与在前的和随后的步骤连续连接，其规模受到限制。除此之外，过滤技术通常在可能具有污染风险的开放设备中进行。由于用于cGMP过程的任何材料必须经过验证，尽管另外的助滤器提高了过滤过程的性能，但通常避免使用。本领域中已知的澄清方法的另一个缺点是絮凝物和溶胞产物的接触时间长(在分离之前/分离过程中)，应当避免这样长时间的接触从而减少杂质再溶解和酶降解的风险。
通常来说，传统的过滤器具有受限的生产量以及会迅速地被大量絮凝物堵塞。此外，通过沉淀物的持续流动被物质所阻挡可能会导致絮凝物的破坏和杂质的再溶解，这会再次对后续步骤产生负面影响。对于大量pDNA，已经有建议增加一些设备(例如平行运行这些设备)，这不是所期望的而且对于制造业规模是不利的。
一些离心技术可以(半)连续地运行，但是由于多核苷酸对于剪切力的敏感性，这种处理可能会导致质粒DNA和基因组DNA的降解，以及由于絮凝物的破裂经沉淀的杂质也会发生脱离。
当在最终纯化之前进行调节步骤时，调节澄清的溶胞产物的盐组成和/或导电性和/或pH值到预定的数值，从而确保在后续的捕获步骤中期望的分子结合到树脂上。有时，添加调节步骤是因为预纯化的原因(例如如WO00/09680所述的内毒素的除去)。
在本领域中已知一些用于捕获目标多核苷酸的技术，例如切向流过滤(WO 01/07599)、大小排阻色谱法(WO 96/21729，WO 98/11208)、阴离子交换色谱法(WO 00/09680，US 6,410,274，WO 99/16869)和疏水作用色谱法(WO 02/04027)。
大多数上述过程步骤是以非连续和/或非自动模式运转的。通常来说，程序步骤不与完全连续系统相连。
在EP 0814156、WO 93/11218、EP 0616638和EP 0875271中公开了如下过程，其中细胞溶胞、中和、澄清、洗涤、任选调节和捕获步骤是在同一设备中进行的。这些方法是开放系统，其以非自动/非连续方式运行，包括一些贮藏步骤(holding step)。所述设备仅适用于实验室规模，且无法转移为制造业规模。这些技术还缺乏用于cGMP大规模生产的再现性和适应性。
另外，还描述了结合使用不同的设备，其中单个步骤以连续方式直接彼此相连(WO 96/02658，WO 00/09680，WO 02/26966，US 2001/0034435 WO97/23601，WO 00/05358，WO 99/37750)。但是这些过程中没有一个联合了多于三个的步骤，所述步骤属于以重悬步骤为开始到以捕获步骤为终止的一系列步骤。在这些方法中使用的设备即无法保证均匀地进行混合还可能会对溶解物施加不利的剪切力。另外，之前描述的一些缺点会阻碍所使用的澄清技术(过滤，离心)。
WO 2004/085643以及Urthaler J，Ascher C，
Figure BPA00001234101900071
和Necina R(2007)(J Biotechnol 128：132)公开了联合多于三个步骤的、能够实现自动连续模式且适合用于目标多核苷酸工业生产的方法和设备。这样的分离不被宿主细胞分泌的多核苷酸的过程包括：以改进的碱裂解方法作为细胞破碎步骤、中和步骤、澄清步骤、以及任选调节步骤和/或在纯化生物分子之后的浓缩步骤。进行所述澄清，通过使包含中和过程中得到的沉淀物和溶胞产物的混合物、温和地分散并且在澄清反应器中分离，在所述澄清反应器的下部部分地填充保留材料(retention material)。将沉淀物保持在保留材料层的顶部和内部。所述澄清的溶胞产物经由反应器底部的出口连续地聚集。尽管该方法和该设备可以规模化并且可以以连续方式工作，但澄清设备的容量受到限制。为了增加在上述这个装备中可以处理的生物质的量，不得不增加澄清槽的体积或者必须使用另外的澄清槽来收集所有量的絮凝物，从而增加了设备成本。任选地，为了从澄清反应器中除去絮凝物不得不中止生产过程，由此延迟了生产过程并导致额外的工作努力，以及还会增加污染的风险。
发明内容
本发明的目标是提供用于从细胞培养物中分离目标多核苷酸的方法和设备，从而克服已知方法的限制。这样的方法和设备还应当适用于治疗用途多核苷酸的连续生产。因此，这样的过程应当即不需要使用酶例如RNA酶和溶菌酶，也不需要使用除SDS之外的表面活性剂。另外，所述方法和设备应当适用于高达至数千克的大量多核苷酸的工业规模生产。工业规模生产过程的先决条件是完全连续地进行细胞溶胞、中和以及后续的澄清过程(参考图1)。
为了解决所述问题，下述发明进行了如下步骤：
基于WO 2004/085643所公开的方法和设备，进行了大量的实验以克服WO 2004/085643中所描述的澄清步骤的限制。尽管在WO 2004/085643中说明的所述方法和设备是可以规模化的，并且可以以连续方式工作，但是所述澄清设备的容量受到了限制。这些实验是针对提高絮凝物的漂浮，以及同时实现完全连续地分离所述絮凝物和溶胞产物的实验。除了向溶胞产物絮凝物混合物通气之外，还检测了缓冲液标准组成的不同的添加物以提高漂浮。
令人惊奇地是，发现了在中和步骤之前，之时或之后添加碳酸盐导致显著地改善了在中和步骤中产生的絮凝物的漂浮。因此，由化学反应产生的小气泡调节改善的漂浮。当作为固体盐或溶解于中性到碱性的水溶液中的碳酸盐与酸性溶液接触时，根据下述反应方程式，从碳酸盐中释放出CO2：
Figure BPA00001234101900081
在本发明的一个实施方式中，所述碳酸盐溶解于单独的缓冲液/溶液中。在另一个实施方式中，所述碳酸盐溶解于重悬缓冲液或溶胞溶液中。
任选地，将所述碳酸盐溶解到中和步骤之前产生的悬浮液中(例如将所述碳酸盐添加到用于重悬的缓冲液或溶胞溶液中)。溶解在所述重悬缓冲液或溶胞溶液中(在中和之前溶解)的碳酸盐的使用浓度的范围为约0.01～1M，优选为0.02～0.1M。CO2气泡的产生开始于当将溶解的细胞溶液与酸性的中和溶液相接触时，并随着混合继续产生。同时小气泡附着在产生的沉淀物(十二烷基硫酸盐(钾)与细胞碎片、蛋白质和基因组DNA共沉淀的絮凝物)上，从而促进了后续的漂浮。该过程实现了絮凝物和溶胞产物的优异的相分离。这是以下过程的先决条件：该过程步骤的完全连续运行，絮凝物和澄清的溶胞产物的快速分离，以及经沉淀的杂质和含有pDNA的溶液的接触时间短。
这些结果令人惊奇地显示出在特定位置上具有入口的简单容器可以实现在容器的底部连续地排出(收集)(预)澄清的溶胞产物。可以在容器的顶部收集所述絮凝物，包括少量的剩余溶胞产物。所述容器，其也为本发明的主题，是一个流体可以通过的容器(flow-through container)，优选形成圆柱体或管的中空体，特别是玻璃或不锈钢管。该管也可以由塑料或任何其它生物药物生产可以接受的材料制成。
可以进一步处理所述收集的絮凝物，例如通过清洗和/或排液(drain)来回收絮凝物内的剩余溶胞产物。除了传统方法例如离心和/或过滤之外，在优选的实施方式中，可以将WO 2004/085643中所描述的澄清设备用于上述这些目的。通过后续的纯化步骤进一步处理在圆柱体出口收集的所述溶胞产物。
可以将从絮凝物清洗和排液步骤中又回收的液体添加到在圆柱体底部收集的溶胞产物中。在任选的实施方式中，可以再处理在圆柱体顶部收集的所述絮凝物，通过将这些絮凝物加入到已中和的溶解的细胞溶液中或者直接加入到分离圆柱体中的混合物中。
在酸性条件下，从碳酸盐(在中和之前，之时或之后加入溶解的或固体形式)中连续释放CO2，结果促进了中和过程中产生的沉淀絮凝物的连续漂浮，这是新颖的，所述酸性条件是在连续工业规模的碱裂解过程中由碳酸盐与已中和的溶解的细胞溶液的化学反应所形成的。另外，应用/结合上述新颖的技术与允许在工业规模连续分离絮凝物和溶胞产物的设备是新颖的。新型CO2-调节漂浮和用于连续絮凝物分离具有自动的连续溶胞和中和的新型设备(如WO 2004/085643所述)的结合提供了下述显著的优点，并解决了规模的限制，因此其对于大量质粒DNA的经济生产是至关重要的：
-用于由生物质产生澄清的溶胞产物的完全连续和自动的生产线
-完全封闭的可CIP系统
-减少了设备的大小和成本
-不需要额外设备或处理(例如不需要喷射气体)而改善了漂浮
-简单并且无需进行复杂的调节和维护
-耐用并且可重现
-温和的(减少了絮凝物上的机械压力从而减少了已沉淀杂质(杂质附着在沉淀物上)的再溶解
-提高了产率，由于更为致密的絮凝物层从而使留在絮凝物-溶胞产物之间的pDNA更少)
-最小化已沉淀杂质(絮凝物)和含有pDNA的液体(溶胞产物)的接触时间
具体实施方式
本发明利用在酸性条件下由碳酸盐释放出的CO2，其具有的促进絮状沉淀物漂浮的效果，所述絮状沉淀物是在pDNA碱裂解步骤的中和过程中产生的，并可以在特别设计的设备中实现上述这些絮凝物的连续分离。因此，所述碳酸盐只要在絮凝物分离之前加入到所述过程中即可，其加入的时间或将其加入到缓冲液、溶液或悬浮液中不重要。碳酸盐即可以在中性或碱性条件下在中和之前加入，也可以加入到已经被中和的、具有酸性pH含有絮凝物的溶解的细胞溶液中。在所有的情况中，CO2释放发生于含有碳酸盐的溶液或悬浮液或者固体碳酸盐与已中和的溶解的细胞溶液或中和溶液相接触时。
在生物分子(特别是pDNA)的生产过程的单个步骤中应用碱裂解如下所述。可以根据已知的方法进行步骤a)～c)和步骤e)。
a)发酵/培养(以及任选收获和重悬)：
在本发明的方法中，优选使用大肠杆菌作为宿主，特别是当目标生物分子为DNA时。根据本领域中已知的方法以分批、流加或连续方式来进行发酵。
收获也可以根据本领域中已知的方法来进行。在本发明的一个实施方式中，使用连续运转设备，例如管式离心机(tube centrifuge)或分离器从培养培养基中分离出细胞。如果在进一步处理在先冷冻细胞(生物质)，则可以在收获后直接或将细胞重悬到适合的缓冲液之后进行细胞的冷冻(包括冷冻造粒(cryopelletation))，常用的缓冲液在pH8的条件下，含有0.05M Tris、0.01M EDTA。在这种情况下，在碱裂解之前不需要加入另外的重悬缓冲液或只需加入少量的重悬缓冲液。在本发明优选的实施方式中，所述重悬缓冲液任选含有碳酸盐。
在本发明任选的实施方式中，可以省略收获和重悬细胞的步骤。在这种情况下，可以直接在溶胞步骤b)中进一步处理所述发酵液，而不需要分离细胞和培养上清液。
b)通过碱裂解破碎：
原则上，步骤b)可以根据本身已知的方法来进行，优选根据温和的，并且可以使用含有表面活性剂的碱裂解溶液，以连续和自动模式运行的方法来进行。常用的溶胞溶液由NaOH(0.2M)和十二烷基硫酸钠(SDS)(1％)组成(优选的)，但原则上来说，也可以使用其它碱溶液、表面活性剂和浓度(参考例如WO 97/29190)，在本发明的方法中，只要在过程中产生絮状沉淀物即可。在本发明的一个实施方式中，所述溶胞溶液还含有碳酸盐。
已收获的步骤a)的细胞既可以直接处理，也可以进行解冻，如果在先将其冷冻(例如包括冷冻造粒)。两个步骤的相同点在于，在内部细胞破碎步骤b)之前，将已收获的细胞重悬到如a)所述的重悬缓冲液中。
任选得，直接进一步处理步骤a)中得到的发酵液，而不收获和重悬细胞。在这种情况下，细胞可以直接进行碱裂解(以及任选后续的中和)而将其破碎，该过程可以在发酵罐中进行，或者将发酵液转移到溶胞反应器中进行。在该实施方式中，无重悬过程，可以将所述碳酸盐加入到中性或碱性的发酵液中，加入到溶胞溶液中，或加入到已中和的溶解的细胞溶液中，从而获得CO2释放带来的漂浮促进效果(参考步骤c))。
优选使用WO 2004/085643中所描述的方法和设备的原理来实行步骤b)。
接下来，关于步骤b)中的细胞破碎，术语“细胞悬浮液”用于收获后重悬的细胞和发酵液两者。
c)中和/沉淀/CO2释放：
通常将具有酸性pH和高盐浓度的经缓冲的溶液用于中和。优选这样的溶液在pH5.5的条件下，含有3M醋酸钾(KAc)。但是也可以使用或加入其它中和盐(neutralizing salt)，例如醋酸钠、醋酸铵或磷酸钾。
原则上，该步骤还可以根据本身已知的方法来进行，优选根据温和的并且能够以连续和自动模式运行的方法来进行。
在中和步骤c)的一个实施方式中，以连续的，优选为自动的方式将溶解的细胞溶液与中和溶液混合。上述这样的步骤可以通过混合溶解的细胞溶液和中和溶液来完成，例如通过T连接器(connector)或Y连接器的方式，在流速(flow rate)的恒定比例(＝恒定的混合比例)条件下并确保混合，从而在后续的混合阶段彻底地实现溶液的中和/沉淀。
在本发明的一个实施方式中，在中和之前加入碳酸盐，CO2释放与中和/沉淀同时发生。
优选，使用WO 2004/085643中所描述的方法和设备的原理来进行步骤c)。
一旦，所述溶解的细胞溶液与中和溶液相接触，混合物的pH下降到酸性，就开始形成絮凝物。如果在中和之前已经加入了碳酸盐，则由于酸化，CO2的释放和絮凝物的形成在同一时间开始。然后，在混合阶段(例如WO2004/085643中所描述的管道系统)进一步混合所述溶解的细胞溶液和中和溶液，并同时输送到澄清设备中，优选通过泵或加压气体。
在另外的实施方式中，使用了含水的“漂浮溶液(floatation solution)”。在本发明中，术语“漂浮溶液”表示含水的碳酸盐溶液。这样的漂浮溶液与其它处理溶液的不同之处在于其含有碳酸盐，以及将其加入到任何其它处理溶液中(术语“处理溶液(process solution)”是指用于进行碱裂解、中和及任选重悬的任何液体)。这样的漂浮溶液可以在中和步骤之前与处理溶液中的一种混合，或者与在过程中产生的悬浮液中的一种混合。任选地，所述漂浮溶液可以与已中和的溶解的细胞溶液混合。碳酸盐在所述漂浮溶液中的浓度范围为0.01M～1M，优选为0.025～1M。因此，漂浮溶液的混合比例为2∶1～1∶50。优选使用少量的浓度更高的浓缩碳酸盐溶液。当连续使用所述漂浮溶液时，通过流速的比例来调节混合比例(漂浮溶液：过程悬浮液(processsuspension))。
在本发明的这个实施方式中，在步骤c)中使用“漂浮溶液”，可以以连续、优选为自动方式将已中和的溶解的细胞溶液与漂浮溶液混合。按照下述方式来完成上述这个过程：在流速的恒定比例(＝恒定的混合比例；例如通过T连接器或Y连接器的方式)的条件下，混合已中和的溶解的细胞溶液(含有絮状沉淀物)和“漂浮溶液”，并且确保充分地混合从而在将反应混合物运输到后续的澄清设备的过程中释放出CO2。在这个实施方式中，可以在溶解的细胞溶液和中和溶液以及澄清设备会合时的任何点上将所述“漂浮溶液”与已中和的溶解的细胞溶液混合，优选在该距离的前半部分中。
同时独立的(与中和/沉淀同时)或随后的(使用“漂浮溶液”)CO2释放所产生的小气泡附着到絮凝物-沉淀物上，从而促进在后续澄清过程中的溶胞产物和絮凝物的相分离。在得到的溶胞产物-絮凝物混合物(附着有CO2气泡)中的计算出的理论碳酸盐浓度范围应当为约0.003～0.35M，优选为约0.005～0.05M。浓度较低可能会导致CO2释放可忽略不计，而浓度过高则会导致不利的起泡现象。
通过一个优选的实施方式来实现CO2的释放，优选使用在WO2004/085643中所描述的中和设备。该设备为管道，其内径为约3～200mm(取决于所述过程的规模)，为了避免在管道壁上的对絮凝物的剪切，优选大于8mm。流动的方向可以是以任何方向，优选为向上方向(形成螺旋形)。30cm～数米的混合距离可以使得溶液温和且充分地混合，从而沉淀来源于细胞的杂质和释放CO2。混合距离、管的内径以及混合设备中的停留时间影响混合的质量，以及从而影响沉淀物的形成和CO2的释放。
另一个实施方式中包括步骤d)，用非连续的方式，将所述碳酸盐以“漂浮溶液”的形式或以固体盐的形式加入到收集在澄清设备中的已中和的溶解的细胞溶液中。优选按照WO 2004/085643所述来设计澄清设备。在这个实施方式中，优选从底部出口加入“漂浮溶液”，通过位于澄清设备底部的保留材料，以维持在澄清设备的整个直径范围内的均匀分布。对于加入固体碳酸盐的实施方式，从顶部的额外入口处加入固体盐，可以通过另外安装在澄清设备下部的搅拌器来实现均匀地混合。在已中和的溶解的细胞溶液中提供充分均匀的CO2释放的、用于添加“漂浮溶液”或固体碳酸盐的任何其它位置或混合方法，均可以用来进行本发明方法的改进的温和沉淀物漂浮。
在所有实施方式中，在使用“漂浮溶液”时(在加入中和溶液之后加入)，优选根据下面两个方面来选择混合比例(加入的“漂浮溶液”的量比已中和的溶解的细胞溶液的量)，所述两个方面为，一方面所提供的CO2释放对于完全和致密的沉淀物的漂浮是充分的，一方面避免溶胞产物的过分稀释。
d)分离/澄清(以及任选清洗)
在用于澄清(絮状沉淀物的分离)的工业规模过程的方法和设备中应用如下方法是非常关键的，所述方法利用由碳酸盐释放出的CO2，以促进碱裂解过程中的中和过程所产生的沉淀物的漂浮。
对于有利的应用本发明方法，三种澄清方式是可行的：
I.连续
II.半连续
III.非连续(分批)
根据使用其本身是新颖的以及是本发明重要部分的设备，来进行第一种澄清方式，而第二种和第三种澄清方式部分基于已经在WO 2004/085643中公开的澄清设备和方法。
在连续系统(I)中，CO2的释放通常在已中和的溶解的细胞溶液进入澄清设备之前发生。然而如下所述，通过在澄清设备出口的上方加入漂浮溶液，使CO2在澄清设备中释放(如步骤c)所述)也是可行的。在完全连续系统中，在澄清设备中连续地分离絮凝物和溶胞产物。可以在底部出口处收集溶胞产物，而通过澄清设备的顶部的出口收集絮凝物。本发明方法的优点在于：由于连续因此快速的分离絮凝物和溶胞产物，接触时间被最小化，从而将降解和引入杂质的风险最小化，并由此在收集的溶胞产物中得到高质量的pDNA。
新型澄清设备可以由玻璃、不锈钢、塑料或药物生产可以接受的任何其它材料制成。所述澄清设备的基本结构如图13a所示。还可以扩展澄清设备，如图13b所述。澄清设备的主要部分的形状可以是圆柱形的，但是原则上来说，所有其它中空体均可以使用。本发明方法中的步骤d)是独立于反应器形状的。
澄清设备在底部(6)具有出口，以及在顶部(9)具有另一个出口，有利地设计该设备以实现在底部连续地回收预澄清的溶胞产物，以及在顶部连续地除去漂浮的沉淀絮凝物。出口优选位于部分地穿过澄清设备顶部和底部的中心的位置处，尽管底部和顶部的任何其它位置也是可以行的。另外，所述澄清设备包含在底部和顶部出口之间的开口(port)(15)，优选位于这个距离的中间。优选在出口和入口(1)处安装阀(2，5，8)，其可以分别打开和关闭。在本发明的含义内，所述阀可以是任何适合于打开和关闭导管(conduit)的设备(优选为薄膜阀(membrane valves))。
由于所述新型的澄清设备可以以完全连续方式运转，所以与半连续或分批澄清设备相比，可以减少其大小。以基于占主流的圆柱形状为例，用于工业规模生产的常用维度，在处理10～1500kg生物质，优选50～750kg时，直径为20～100cm以及长度为50～300cm，优选直径为30～80cm以及长度为100～250cm。直径和长度的比例应当在1∶1～1∶10的范围，优选为1∶2～1∶5。增加设备的长度可能会获得甚至更好的分离以及更好地漂浮的絮凝物的排液。
澄清设备安装了与管道相连的开口(15)，在管中进行中和/沉淀以及优选释放CO2。上述该开口本身也可以是澄清设备的入口，并直接与中和/沉淀管道相连。任选所述开口与分配管道(distributing tubing)(3)相连，所述分配管道本身与中和/沉淀管道相连。在该实施方式中，其中开口为入口，该入口是在所述澄清设备的外壳的侧面的简单的孔，没有在澄清设备中设置任何更多的部分。在其它实施方式中，优选可拆卸的分配管道(任选由适用于药物生产的刚性材料制成；例如不锈钢)延伸到澄清设备中。任选所述管道的末端在澄清设备的中部。该末端为开放的。
在两个实施方式中，所述开口(第一个实施方式中的连接开口或延伸管道的末端)所在的高度位于如上所述的底部和顶部出口之间，优选在这个距离的中间。与中和管道(16)相比，开口/入口可以具有相同或更大的直径。在第二个实施方式中，所述开口可以位于澄清设备的任何位置。优选定向所述分配管道使得已中和的溶解的细胞溶液向上流动，并且所述分配管道的末端优选在澄清设备的中部。
经由开口(15)或分配管道(3)，已经含有附着气泡的絮凝物的、已中和的溶解的细胞溶液进入(1)澄清设备，立即发生相分离。由于附着有气泡，与无CO2释放的过程相比，絮凝物的密度(每单位体积的质量)显著降低。因此，所述絮凝物(7)开始漂浮到或多或少澄清的液体(溶胞产物)在澄清设备中的界面之上。当在澄清设备中液体水平面高于所述入口时，迫使气泡-沉淀物-复合物(7)向上到达顶部出口。
在澄清步骤开始时，所述澄清设备是空的。关闭底部出口/阀(5/6)直到所述澄清设备中充满已中和的溶解的细胞溶液。由于附着有气泡，与无CO2释放的过程相比，絮凝物的密度(每单位体积的质量)显著降低。因此所述絮凝物(7)在设备的上部分聚集，以及或多或少澄清的液体溶胞产物位于设备的下部分。
任选的，所述澄清设备已经填充有液体，通常是含有与溶胞产物相似成分的缓冲液。启动所述过程，打开底部出口/阀(5/6)及调节流出量使得在整个过程中在澄清设备中维持溶胞产物-絮凝物界面的水平面恒定。溶胞产物-絮凝物界面的恒定水平面是通过底部阀的打开程度来控制的，任选其是自动的。在底部单位时间上的体积流出量低于每单位时间的体积进料量(入口)。因此，额外的量必须经由顶部出口(8/9)离开澄清设备。由于溶胞产物-絮凝物界面低于顶部出口，在该过程中迫使大部分絮凝物(其中具有最少量的剩余液体)通过顶部出口。为了结束所述过程，通过关闭入口阀来停止进料，并通过底部出口(5/6)回收剩余的溶胞产物，直到漂浮在溶胞产物顶部的剩余絮凝物到达底部出口(5/6)。
另一种终止所述过程的选择是，首先关闭底部出口(5/6)并持续向澄清设备进料，任选含有与溶胞产物相似成分的缓冲液，直到迫使所有的剩余絮凝物经由顶部出口(8/9)离开该设备。然后，经由底部出口(5/6)简单地回收所述设备中存有的澄清的溶胞产物，如上所述(关闭顶部出口(8/9)和入口(1/2)；打开位于顶部的单独的通气阀(venting valve)(10))。
用于终止所述过程的两种选择也可以按照下述方式结合：首先根据选择1回收溶胞产物，随后根据选择2迫使絮凝物经由顶部出口离开澄清设备。
在任选的实施方式中，其中CO2释放在澄清设备中(如步骤c)所述)，连续地将“漂浮溶液”经由额外的开口/入口，加入到澄清设备中的溶胞产物-絮凝物混合物中，所述开口/入口设计成与上述用于已中和的溶解的细胞溶液的开口/入口相似。任选，可以在该开口/入口的与澄清设备相连或延伸到澄清设备中的末端处安装用于使流动分布更好的装置(例如穿孔板(perforatedplate)或玻璃料(frit))。该入口必须设置于用于已中和的溶解的细胞溶液的底部出口和入口之间。
新型澄清设备的底部部分任选稍成圆锥形，从而保证在终止所述过程之后完全回收溶胞产物(完全卸出)以及完全去除清洗溶液。这个底部部分上可以安装有适合于使剩余的不漂浮絮凝物保留在底部出口之上的固定设备(fixture)(4)。为了可以拆卸固定设备，澄清设备的底部部分可以从剩余设备上拆卸。固定设备可以是穿孔板、筛、网、玻璃料或任何其它设备(installation)或可透过溶胞产物的材料。这些固定设备的材料以至于整个澄清系统的材料可以是不锈钢、玻璃、聚丙烯或适合药物生产的任何其它材料。在特殊的实施方式中，所述固定设备为滞留层，与WO 2004/085643中所描的澄清反应器的滞留层具有相似或相同的部分。
任选地，可以将深层过滤器安装在所述澄清设备的底部出口路线上，以确保安全其关系到不期望溢出最少量的不漂浮絮凝物。任选地，可以将回收的溶胞产物输送到WO 2004/085643所述的用于精细澄清(fineclarification)的澄清反应器中。
任选所述新型澄清设备顶部部分为逐渐变细的，优选为锥形渐细，直到其内径与顶部出口阀(8)的内径相似，以及与在阀的后面相邻的、由适合药物生产的任何材料构成的出口管道的内径相似。澄清设备顶部部分的上部锥形末端(所以也是顶部阀和随后的管道)的内径范围为约3～200mm(取决于所述过程的规模)，优选大于8mm，从而避免在管道壁上的对絮凝物的剪切。澄清设备的顶部部分的锥角(tapering-angle)的范围为10°～80°，优选为25°～65°。所述逐渐变细的结构在顶部部分制造了瓶颈，其能够促进漂浮的絮凝物(7)的排液以及减少通过输出絮凝物而导致的溶胞产物的损失。上述这个澄清设备的逐渐变细的顶部部分任选为可以拆卸的(例如对于单独清洗)。
在另一个实施方式中，用于分离絮凝物和溶胞产物的额外单元(图13b)与澄清设备的顶部出口/阀(8/9)相连接，优选直线连接。这个额外单元的特征在于其形状与澄清设备的上部部分相似(主要部分为圆柱形)。这个额外单元的长度可以短于主澄清设备，例如是主设备长度的约1/3。上述额外单元的入口(11)与主澄清设备的顶部出口(9)以相同的内径相连接。靠近该入口(11)的额外单元的直径增大(例如与主澄清设备的内径相似)。在一个优选的实施方式中，所述额外单元的入口(11)不是该单元的最低点。在这个任选的实施方式中，上述额外单元的底部既可以是从入口到外壳整个底部区域逐渐降低，也可以是在一个确定位置。具有阀(12)的出口(13)可以位于底部最低的部位处。当预排液絮凝物进入到这个额外单元的扩大部分并直到靠近其入口(11)时，发生进一步的相分离过程。当絮凝物再次漂浮(7)到额外设备的顶部，之前陷在絮凝物之间的剩余的溶胞产物聚集在较低的区域，并可以通过阀(12)从出口(13)回收，任选自动地、定期地或连续地启动上述过程，从而使携带溶胞产物输出的絮凝物最少化。设计该额外单元的顶部使得其与主澄清设备的顶部相似，具有出口(14)、阀(8)和单独的通气阀(10)，以及任选包含第二出口。在具有单一顶部出口(14)的实施方式中，按照与所述主澄清设备相同的方式输出所述絮凝物。在以下实施方式中，所述实施方式具有两个顶部出口，其中一个出口配备有可拆卸的玻璃料或连接的过滤器，是回收溶胞产物的另一个位点。当在过程中关闭第二顶部出口时(假设这个额外单元的底部出口是关闭的)，溶胞产物通过其它顶部出口输出，而絮凝物被玻璃料或过滤器保留。
可以将在这个单元中被额外回收的溶胞产物加入到在主澄清设备出口(6)回收的澄清的溶胞产物中，或者通过合适的管道加入到主澄清设备中处于较低位置的溶胞产物相中。
所述主澄清设备可以扩展(类似级联)多于一个的上述所述额外单元。
在又一个实施方式中，另一种额外的澄清单元可以与主澄清设备的顶部出口相连接。这个额外单元包括放入另一个管中的管(管套管(tube-in-a-tube))。该内管与主澄清设备的顶部出口相连接并且具有与上述出口相似或更小的内径，但最小为8mm。在其整个长度范围上外部管道包围内部管道，并且外部管道具有靠近内部管道与主澄清设备连接部分的出口(任选配备有阀)。通过例如合适的垫片将外部管道固定在内部管道的两个末端上。该管套管组合的方向从主澄清设备的出口处(微)向上倾斜。长度范围为30cm～3m，优选范围为0.5～2m。上述这个内部管道在其整个长度上均有穿孔，其内径小于外壳的一半，优选具有(圆)孔且其大小(直径0.5～3mm)阻止絮凝物通过。迫使通过主澄清设备的出口输出的絮凝物通过内部管道。由于附着有气泡，大部分絮凝物在管道的径向上的上部进行输送，而剩余的溶胞产物可以可以通过穿孔离开所述内部管道，在外部管道中被收集并在外部管道的出口处被回收。由此，可以进一步对絮凝物进行排液和增加对溶胞产物的回收。可以将在这个单元中被额外回收的溶胞产物加入到在主澄清设备出口回收的澄清的溶胞产物中，或者通过合适的管道加入到主澄清设备中处于较低位置的溶胞产物相中。
在又一个实施方式中，所述新型澄清设备的顶部部分可以安装机械撇沫器(mechanical skimmer)，其可以连续地将絮凝物撇去从澄清设备的顶部出口排出。在这个实施方式中，顶部出口安装有可以收集被撇去的用于进一步处理的絮凝物的撇去顶部(skimming top)。
在又一个实施方式中，所述絮凝物可以简单地在顶部出口处溢流，并收集于在径向上附着在顶部出口的收集环(collection ring)中。在掉入到收集环之前，通过顶部出口溢流，可以使絮凝物排液并且通过流过多孔板筛(perforated screen)(具有收集下述已排液的溶胞产物的环)进行清洗。收集环的底部优选倾斜放置从而使收集的絮凝物自动地指向收集已排液的(“干燥的”)沉淀物的槽。
在又一个实施方式中，可以通过泵的方式在主澄清设备的顶部出口吸出漂浮的絮凝物。
每一个上述额外的澄清单元可以与其它单元结合。
任选进一步处理经分离的絮凝物(例如剩余排液、清洗)。剩余排液可以根据本领域已知的方法例如过滤(优选深层过滤)来完成，使用压滤机、离心或等同物。WO 2004/085643描述了有利的温和的排液方法，其可以与絮凝物清洗步骤组合，其使用特别设计的包括在底部具有保留材料的温和分布器(gentle distributor)的澄清反应器。可以将其中所述方法和设备简单地与本发明结合，通过将已输出的絮凝物应用到WO 2004/085643的澄清反应器以及进行WO 2004/085643所述的排液和清洗步骤。
选择不会再溶解絮凝物的组合物用作清洗溶液/缓冲液。清洗还可以按照下述方式进行：通过结合排出絮凝物的物流和清洗溶液/缓冲液并在与中和管道(WO 2004/085643)相似的设备中进行混合/接触。任选地，还可以在单独的槽中清洗絮凝物(分批或流加培养方式)。
在本发明的另一个实施方式中，可以在新型澄清设备中回收所述絮凝物。因此，部分在澄清设备顶部出口输出的漂浮的絮凝物，经由适合的管道和靠近进料溶液入口的单独的入口，被输送(例如通过泵)回澄清设备。对于这个实施方式，在新型澄清设备中提供额外的漂浮溶液是有利的。
在所述实施方式中，所有的阀均优选是薄膜阀，但是也可以是例如球阀、闸阀或任何其它适合打开/关闭的线/管和/或容器。在不会影响本发明的基本/原则特征的情况下还可以省略在该实施方式中所述的一些阀(例如顶部出口阀)。
在半连续系统(II)中，CO2的释放通常在已中和的溶解的细胞溶液进入澄清设备之前发生。然而，通过在所述澄清设备出口上方加入漂浮溶液，在澄清设备中释放CO2(如步骤c)所述)也是可行的。
为了以半连续方式应用本发明的方法，优选将WO 2004/085643中所述的澄清反应器用作澄清设备。可以经由顶部入口和新颖或适应经特殊设计的如WO 2004/085643所述的分布器，来引入已中和的溶解的细胞溶液(含有沉淀物)。
在另一个实施方式中，入口可以位于高于保留材料的澄清反应器的任何位置。由于通过本发明的方法改进的漂浮是基于利用酸化由碳酸盐释放出CO2来实现的，因此在该过程中堵塞保留材料的风险被显著降低。从而，滞留层的厚度和组成可以与例如减少层的数量或改变保留材料的细度(fineness)/孔隙率相适应。仅通过举出底部玻璃料上可以使用玻璃珠的实例。
在本发明方法的半连续方式的另一个实施方式中，在WO 2004/085643的澄清反应器中，仅使用最小限度的(例如单独使用玻璃料)或不使用保留材料。任选，可以将深层过滤器安装在澄清反应器的底部出口路线上，以确保安全其关系到不期望溢出最少量的不漂浮絮凝物。
当澄清反应器完全充满(漂浮)絮凝物时所述半连续过程结束。可以根据WO 2004/085643中所述的方法对澄清反应器中的絮凝物进行清洗或排液。
虽然WO 2004/085643中所述的澄清反应器是有益的，对于以半连续方式进行本发明的方法是优选的，但是任何其它具有入口和底部出口的用于(半)连续回收溶胞产物的中空体对于上述这个目的均是适合的。
与本领域已知的其它半连续澄清方法相比，半连续澄清方式的优点在于其增大的容量。由于通过附着在沉淀絮凝物上的CO2气泡改善了漂浮，因此漂浮的絮凝物层更为致密，陷在絮凝物之间的溶胞产物更少。因此，在澄清设备中用于聚集絮凝物的特定体积内，可以处理更多的生物质。与回收陷在絮凝物之间的溶胞产物相比，回收已分离的溶胞产物更为容易。
也可以在上述用于半连续澄清的系统/方法中应用/进行非连续(分批)方式。
在非连续(分批)系统(III)中，在全部已中和的溶解的细胞溶液充满所述设备，留下一些空间用于添加漂浮溶液之后，在澄清设备中发生CO2释放。通过在澄清设备的出口上方加入漂浮溶液，在澄清设备中直接进行CO2的释放(如步骤c)所述)。这个非连续系统被澄清设备的体积容量所限制。一旦当澄清设备几乎被已中和的溶解的细胞溶液(含有絮凝物沉淀物)完全充满，就开始进行CO2-调节的漂浮。关闭底部出口直到漂浮结束。然后以用于半连续系统的所述的相似方法来回收溶胞产物。可以设计所述澄清设备使得其与特定用于半连续系统的实例相似，优选根据WO 2004/085643中所述的澄清反应器(对于半连续系统的上述相似的改进/变化是可能的)来进行设计。任选，按照半连续系统所述进行絮凝物排液和清洗。
通过上述系统中的任何一个回收的收获的溶胞产物，其既在视觉上是澄清的，并可以直接进行进一步处理例如捕获(通常利用色谱技术)，也可以通过额外简单的精细澄清例如过滤来进一步纯化。
e)纯化：
在本发明步骤a)～d)之后的过程促进在后续步骤(例如连续或非连续的浓缩、调节、过滤、色谱法)中分离(捕获)和纯化标生物分子。
本发明的使用上述澄清系统中的一种来改善漂浮的过程适合用于，但不限于对剪切力敏感的生物分子，优选多核苷酸，特别优选质粒DNA，以及大蛋白质，例如抗体。
本发明的过程可以用于任何目标生物分子。对于生产蛋白质，可以对其进行设计从而满足目标蛋白质的具体要求。所述本发明方法不受发酵过程和蛋白质来源(例如细菌、酵母)的限制。
对适合用于细胞破碎和后续处理步骤的具体方法的选择受到发酵之后细胞中蛋白质状态的显著影响：
如果蛋白质被过表达，其可能以被称为“包涵体”的形式存在。在这种情况下，在溶胞过程中利用例如强碱和还原试剂(例如二硫苏糖醇，DTT)处理导致蛋白质的再溶解(resolubilization)，在这个阶段蛋白质是处于其变性形式的。为了重构蛋白质的天然结构，可以通过中和(例如通过添加磷酸)来实现重折叠，并同时释放CO2，上述过程在所述中和反应器或与溶胞反应器相似的第二反应器中进行。在澄清设备中，从含有蛋白质的溶液分离出不可溶组分。
当目标蛋白质在细胞中是可溶时，在溶胞反应器中以与上述相似的方式进行细胞的破碎。
在所述溶胞反应器中，可以选择条件(接触时间、溶胞溶液的浓度)从而使得蛋白质保持可溶或，任选地，设定参数具体地变性和沉淀蛋白质。在第一种情况下，进一步处理所述溶液，在中和反应器(其结构与用于多核苷酸的溶胞反应器或中和反应器相似)和澄清设备(如上所述用于已溶解的包涵体)中。如果所述蛋白质是处于其变性的状态，则既可以是在溶胞反应器中已经进行沉淀，也可以之后在中和反应器中进行沉淀(通过加入中和和/或沉淀试剂并同时释放CO2)。在这两种情况下，优选选择沉淀条件以具体地沉淀目标蛋白质(而不期望的杂质，例如RNA、内毒素和DNA保持可溶)。随后，在澄清设备中从溶液中分离出所述沉淀物。然后，既可以将沉淀从澄清设备中移出(连续地如本发明连续系统(I)所述，或者通过例如吸出，或利用合适的缓冲液冲洗)，也可以在上述这个设备中直接进一步处理。在将其从所述设备中移出后，利用合适的缓冲液在单独的容器中再溶解沉淀物(目标蛋白质)，该过程基于每个实例不同的情况，按经验来确定。当沉淀物保留在澄清设备中时，在此进行再溶解(通过加入适当的缓冲液以及任选混合)。一旦沉淀物(特别是目标蛋白质)被再溶解，就可以通过在底部的出口简单地将其移出澄清设备。
在蛋白质生产方面，本发明方法所有变形的共同之处在于对得到的蛋白质溶液进一步处理的选择。除了额外的重折叠步骤之外，还可以进行所述用于处理多核苷酸溶液的相同步骤(连续或非连续的浓缩、调节、过滤、捕获)。
本发明的过程满足针对生产治疗生物分子的所有规章要求。当其用于多核苷酸时，本发明的方法产出(如果已经优化发酵步骤以提供高质量的粗原料)高比例的处于ccc形式的质粒DNA以及低比例的杂质(例如蛋白质、RNA、染色体DNA、内毒素)。所述过程既不需要使用酶，例如RNA酶和溶菌酶，也不需要使用表面活性剂，除在溶胞步骤b)中。澄清之前溶胞产物和絮状沉淀物的接触时间被显著降低。另外，在不提供气体(通过外部来源)的情况下进行了所述过程。
本发明的过程可以规模化以处理大量含有多核苷酸的细胞，其可以在“工业规模”运转，通常可以处理多于1千克的湿细胞，并产出从一克到几百克以及高达至千克量的目标多核苷酸，所述多核苷酸满足临床实验以及市场供应的要求。
所述过程的适用范围不受目标生物分子的大小、序列或功能的局限或限制。目标多核苷酸可以是大小范围从0.1～约100kb或更大的DNA或RNA分子。优选，所述目标多核苷酸为环状DNA，即质粒DNA，优选大小为1～20kbp(无限制)。
本发明的过程和设备不受获得目标生物分子的细胞的来源的限制。
可以简单地实施所述过程，并且在自动化和所期望的规模方面所述过程是灵活的；可以利用可市购的泵和压力系统来调节流动和反应时间，从而确保稳定的流动和较小的机械压力影响。
本发明的另一个优点在于，所述设备是可清洁的(sanitizeable)，抗高温分解的(depyrogenizeable)以及能够允许原位清洗(cleaning in place)(CIP)和在线灭菌(steaming in place)(SIP)。
在此使用的方法和设备在不开放的系统中提供了可控的、稳定的性能，允许直接进一步处理连续生产的、在澄清之后得到的细胞产物，例如将其上样到色谱柱上或能够在线调节和/或在柱子上样之前过滤溶胞产物(图2-4)。澄清之后，还可以在调节或上样到色谱柱之前进行中间浓缩步骤(图5)。
在本发明的过程中，无论步骤a)是否是以分批还是以连续方式进行，后续每一步均可以以连续和自动模式运行。优选，选自步骤b)～e)中的至少两个步骤的结合是单个步骤相连接的连续运行。
在溶胞步骤b)为自动的/连续步骤的情况下，其与如何获得细胞悬浮液(分批或连续操作，任选在冷冻之后，直接利用发酵液或收获以及重悬)无关。其与用来得到溶胞产物的宿主也无关。
在中和步骤c)为自动的/连续步骤的情况下，应用与如何制备经处理的碱溶解的细胞溶液(例如分批或连续)无关。在一个优选的实施方式中，按照与WO 2004/085643所述的澄清反应器(在分批或半连续进行澄清的情况下)的相同方式，设计中和步骤后的收集器槽。
在澄清步骤d)为自动的/连续步骤的情况下，应用与如何制备经处理的、含有絮凝物的已中和的溶解的细胞溶液(例如分批或连续)无关。还与何时和何处(在澄清设备之前或在澄清设备中)发生本发明方法的CO2释放无关，只要其在澄清过程之前(或之时)即可。另外，与如何进一步处理获得的澄清的溶胞产物也无关。
在一个优选的实施方式中，将澄清设备的流出物与对以后的处理步骤(例如调节溶液)是必须的溶液流混合在一起，通过连接器的方式混合，例如T或Y连接器，或直接在混合设备中混合。可以通过传统的泵，以特定的流速抽吸两种溶液。
在另一个实施方式中，仅调节第二溶液的流速以适应离开澄清设备的溶胞产物的流速。为了上述这个目的，混合设备可以是充满小球的设备，类似于所述用于自动溶胞步骤的设备，或管道系统类似于所述用于中和步骤的设备(WO 2004/085643)。可以使用这样的设置，如果对于第一色谱步骤溶胞产物的调节是必须的。例如，可以以这种方式加入硫酸铵(或简单地水)溶液。
在另外的实施方式中，所述过程还包括中间浓缩步骤(图5)：一旦出现溶胞产物的足够量离开澄清设备，在调节和/或上样到色谱柱上之前，就浓缩该溶胞产物，例如通过超滤方式。可以进行一个或多个段(passage)的浓缩，其本身可以以连续或分批方式进行。如果仅进行一段，随后可以对截留物质(retentate)(例如含有pDNA)直接进行调节或将其上样到色谱柱上。在有几段的情况下，回收所述截留物质直到所期望的终体积/浓度，并随后进一步对其进行处理。对于上述这个浓缩步骤，可以使用传统的设备，例如盒式(cassette)或中空纤维形式的膜。适合膜的截留(cut-off)取决于被处理的生物分子的大小。对于pDNA通常使用具有截留在10～300kDa之间的膜。
在一个优选的实施方式中，联合所述溶胞反应器和中和反应器以形成两步骤自动的/连续系统。在这种情况下，溶胞反应器的流出物与中和溶液流相连接及混合，以所述用于自动的/连续中和步骤的方式(WO2004/085643)。这时，调节经抽吸的中和溶液的流速使得其适应溶胞反应器流出物的流速。
在另一个优选的实施方式中，联合所述中和反应器和澄清设备以形成两步骤自动的/连续系统。在这种情况下，将中和反应器的流出物与本发明的自动的/连续澄清设备相连接。在这种情况下，必须调节澄清设备的底部出口阀的打开程度(以及任选顶部出口阀)，使得漂浮的絮凝物和澄清的溶胞产物的界面的水平面(澄清设备中界面的高度)保持恒定。上述过程能够以通过组合浮标(integrated floater)的装置测定界面的水平面来实现，所述浮标漂浮在液体上但不漂浮在絮凝物上。另一个选择是，测量澄清设备底部出口处的流量，该流量可以用于计算界面的理论水平面，根据基于由经验确定的参数(分配系数)的具体算法。底部流出物不能低于进料流量的50％。其它系统如挡光板(light barrier)也是可适用的。原则上，可以使用每一个适合于识别所述界面的系统。通过与出口阀电连接的方式，根据絮凝物-溶胞产物界面的水平面或出口流量，可以逐步地或连续地调节流出物。
在另一个实施方式中，通过直接连接两个设备而无中间不同的中和步骤的方式，连接所述溶胞步骤和所述澄清步骤。在这种情况下，可以在非/半连续系统(系统II和III)的澄清设备中进行中和。因此在这个实施方式中，中和及澄清以非连续方式进行。首选关闭非连续澄清设备的出口，以及将所述溶解的细胞溶液与一定体积的中和溶液混合。该中和溶液可以在澄清设备中。如果在全部溶解的细胞溶液被收集于澄清设备之后，加入中和溶液，则这个步骤优选经由非/半连续澄清设备的底部入口来进行。在这两种情况下，通过搅拌器(缓慢的)搅拌，或者通过位于设备底部的入口、或位于液面以下的额外的入口引入气体，可以促进与溶解的细胞溶液的混合。在这个实施方式中，通过直接连接溶胞步骤与澄清设备，CO2释放发生在所述澄清设备中。因此，优选所述碳酸盐是溶解的细胞溶液的成分，或在中和之前或之后额外地加入所述碳酸盐(以固体盐或以“漂浮溶液”的形式，其优选通过非/半连续澄清设备(系统II和III)的底部出口加入)。在中和/漂浮的末尾，非连续-澄清按照与WO 2004/085643中所述的相同方式来进行。
在更为优选的实施方式中，通过在连续系统中使用至少步骤b)～d)的全部，以及任选另外步骤a)和/或e)，使整个系统完全自动化。在这个实施方式中，溶胞反应器的流出物直接连接中和设备，且中和设备的流出物直接连接澄清设备。在这个实施方式中，为了通过CO2的释放来改善澄清，可以使用完全连续系统(I)或半连续系统(II)。用于个体连接和设备的设计与上述相同。
在最为优选的实施方式中，完全自动的系统与任选自动的(及连续的)调节步骤(和设备)相连接。这个实施方式可以实现澄清的溶胞产物的连续混合，所述澄清的溶胞产物与调节溶液(例如硫酸铵溶液)一起离开澄清设备。如上所述，对于制备用于后续的(色谱的)纯化步骤(例如疏水作用色谱)的含有多核苷酸的溶胞产物，这样的调节步骤可能是必要的。
加入这样的调节步骤的结果是将自动和连续的三步骤系统延伸成为连续的四步骤系统。在这个实施方式中，使用设备可以连续地混合调节溶液和澄清的溶胞产物，所述设备优选与溶胞反应器是相同的类型。已经发现，这个设备是用于连续混合含有多核苷酸的溶液的最为温和的设备，所述多核苷酸对于剪切力敏感。为了上述这个目的，还可以另外使用其它设备(例如所述用于中和步骤的设备)，例如传统的静态混合器。通过安装流量测量单元，可以调节抽吸调节溶液的泵的流速，以适应澄清设备的流出物流速。可以将泵与上述这个单元相连接，从而可以控制该泵，以保持两种混合溶液的流速比恒定。
在调节和捕获步骤之间，可以插入在线的过滤步骤。
在本发明的又一个实施方式中，加入超滤步骤。通过自动的三步骤系统这样的延伸，所述过程即代表了连续的四步骤系统。在这个实施方式中，通过超滤浓缩之前步骤获得的溶胞产物。但省略渗透，截留物质既可以通过调节步骤被直接进一步处理，和/或通过上样步骤(其表示通过一个或两个额外的步骤来延伸连续系统)或循环直到达到所期望的终浓度/体积。在后一种情况中，在浓缩结束之后进一步处理获得的浓缩物(调节和/或上样)。
在另外的实施方式中，可以直接将流出澄清设备的溶胞产物上样到色谱柱中，或可以在浓缩和/或调节之后，上样到色谱柱上(具有或不具有后续的在线过滤)。
在所有所述的实施方式中，利用自动的经改善(CO2释放)的澄清步骤，得到的澄清的溶胞产物即可以被收集在适合的槽内，也可以直接对其进行进一步处理(例如通过将澄清设备的流出物与另一个设备(例如色谱柱)连接)。如果将浓缩和/或调节步骤应用到这个自动的过程中，则经浓缩的和/或调节的溶胞产物既可以被收集在适合的槽内，也可以直接对其进行进一步处理。
本发明的方法和设备与用于抽吸溶液的泵无关。在特殊的实施方式中，一些悬浮物和溶液的流动是通过加压容器中的空气压力来代替泵而完成的。
本发明的过程和设备适合用于cGMP(动态药品生产质量管理规范(Current Good Manufacturing Practice))药物级pDNA的生产。可以使该过程适用于任何pDNA的来源，例如对于任何细菌细胞来源。特别是，由于所述系统的性质，本发明的过程可以实现大容量快速处理，这对于处理细胞溶胞产物具有重要价值。由于溶胞产物含有不同的降解pDNA的物质，例如DNA酶，因此过程时间是高产品质量和高产率的关键因素。特别是在本文中，澄清之前，絮状沉淀物和溶胞产物的短接触时间，是可以通过本发明获得的主要优点。
本发明的过程和设备适合用来生产用于人类和动物的pDNA，例如针对疫苗和基因治疗用途。由于其的高生产能力，所述过程可以用于临床前和临床材料的生产，以及用于已注册产品的市场供应。
由于本发明的方法和设备可以实现完全连续地进行如上所述的碱裂解、中和及澄清，和相应的和连接步骤，本发明的方法和设备是完全可规模化的(可以处理通过发酵获得的高达至4000L或更多的生物质)。
附图说明
图1：流程图，包含碱裂解、中和(包括同时的/后续的CO2释放)和澄清的连续三步骤组合过程。
图2：流程图，图1的连续三步骤组合过程外加连续调节步骤(例如浓缩和/或高盐沉淀)。
图3：流程图，图2的连续组合过程加额外的捕获步骤。
图4：流程图，图3的连续组合过程在调节步骤和捕获步骤之间包括在线过滤步骤。
图5：流程图，图4的连续组合过程在调节步骤之前再加浓缩步骤。
图6：碱裂解反应器、中和反应器和(经适应的)WO 2004/085643的半连续澄清设备连续组合的方案图，可应用于澄清方式“系统II”和“系统III”。
图7：澄清方式“系统II”：比较改进了的漂浮的新方法(a)，和标准方法(b)(无CO2释放)获得的漂浮的絮凝物(在WO 2004/085643的经适应的小试规模的澄清设备中)。上面的图示出整个絮凝物层，而下面的图示出絮凝物层的放大部分。
图8：通过传统手工方法，在实验室规模(无CO2释放)得到的对照溶胞产物的分析性HPLC色谱图。
图9：澄清方式“系统II”：利用包括溶胞步骤、中和步骤(包括CO2释放)和半连续澄清步骤的本发明连续方法，在经适应的规模放大的WO2004/085643的设备中得到的溶胞产物的分析性HPLC色谱图。
图10：SEC池(SEC Pool)的分析性HPLC色谱图，所述SEQ池是利用包括溶胞步骤、中和步骤(包括CO2释放)和半连续澄清步骤的本发明的连续方法，在经适应的规模放大的WO 2004/085643的设备-澄清方式“系统II”中获得的含有pDNA的溶胞产物的最后纯化步骤所得。
图11：澄清方式“系统II”：通过本发明新的集成式漂浮方法得到的、在经适应的规模放大的WO 2004/085643的澄清设备中的漂浮絮凝物。
图12：澄清方式“系统II”：利用在经适应的规模放大的WO 2004/085643的澄清设备顶部的CIP喷球(CIP ball)，在回收过程的结尾清洗絮凝物的程序(絮凝物是利用本发明的新方法分离的)。
图13：澄清方式“系统I”：本发明的新型连续澄清设备的方案图-a)基本设置，b)用于基本设置的优选的任选扩展部分的实例。
图14：澄清方式“系统I”：实验室规模研发设置。
图15：通过传统手工方法，在实验室规模(无CO2释放)得到的对照溶胞产物的分析性HPLC色谱图。
图16：澄清方式“系统I”：利用包括溶胞步骤、中和步骤(包括CO2释放)和连续澄清步骤的本发明的连续方法，在实验室规模研发设置上得到的溶胞产物的分析性HPLC色谱图。
图17：SEC池的分析性HPLC色谱图，所述SEC池是利用包括溶胞步骤、中和步骤(包括CO2释放)和连续澄清步骤(“系统I”)的本发明的连续方法，在实验室规模研发设置中获得的含有pDNA的溶胞产物经最后纯化步骤所得。
图18：澄清方式“系统I”：实验室设置的样机(prototype)。
实施例1
含有pDNA的大肠杆菌细胞的生产
根据WO 2004/085643或根据WO2005/097990制备含有pDNA的大肠杆菌生物质。
实施例2
在碱裂解过程中在中和时，从碳酸盐释放出的CO2促进漂浮的原理的适用性验证
第一个实验在仅有缓冲液，无生物质的条件下进行。将不同的碳酸盐(例如K2CO3和NaHCO3，因为作为CO3 2-的反荷离子的K+和Na+已经存在于用于溶胞或中和的缓冲液/溶液中，所以其是有利的)加入到重悬缓冲液或溶胞溶液中，浓度为0.5M。一方面测定在缓冲液中的溶解度，另一方面测定在中和和从而引起的絮凝物(在中和过程中产生)漂浮的过程中的CO2释放强度。
已经观测到0.5M的NaHCO3可以较好的溶解于通常用于重悬生物质的缓冲液(含有0.05M Tris和0.01M EDTA，pH为8)中，并且当通过混合中和溶液进行酸化时导致大量的CO2释放，产生沉淀的SDS的漂浮泡沫。
在具有5g生物质的条件下重复上述这个实验，所述生物质重悬于50mL重悬缓冲液中。将加入重悬缓冲液的NaHCO3的浓度降低到0.1M从而避免过多地发泡(如第一个实验中所观察到的)。温和地混合重悬的生物质与50mL溶胞溶液(0.2M NaOH，1％SDS)，并保持接触2min，随后通过中和溶液(3M KAc)进行中和。这个体系运行地非常顺利，这是由于适度的(不是过于大量的)CO2释放，以及同时由于附着有CO2气泡加强了沉淀物-絮凝物的漂浮。对漂浮的絮凝物下面的溶胞产物进行分析(HPLC)，并与利用无CO2释放的标准程序得到的溶胞产物进行比较。
通过具有CO2释放的方法得到的溶胞产物中的pDNA-浓度(产率)为对照溶胞产物的约70％。在两种情况下，pDNA的均匀度(homogeneity)均高于80％。在具有CO2释放的实验中，漂浮的絮凝物层明显更为致密(与无CO2释放的实验相比)，这一点对工业规模的澄清提供了主要好处。
这个初步实验示出了碳酸盐的原则适用性，基于用于促进沉淀絮凝物漂浮的CO2释放，所述沉淀絮凝物是在用于pDNA生产的碱裂解程序的中和步骤中产生的。
实施例3
优化碳酸盐浓度(在重悬缓冲液中)
如实施例2所述地进行这些实验，分别使用重悬缓冲液(P1)中的不同的NaHCO3浓度(0M＝对照，0.05M，0.07M，0.1M和0.2M)和1.1g生物质。在中和含有絮凝物的溶胞产物并保持3min之后，通过离心来进行澄清(实验室离心机，7500rpm)。分析所述溶胞产物(离心之后作为上清液回收)的浓度(产率)和pDNA的均匀度(HPLC)。清洗粒状沉淀(pellet)并用同样的方式还对洗脱-级分(wash-fraction)进行分析。另外，研究了加入NaHCO3对于得到的具有溶胞产物溶液(P2)的混合物的pH的影响。所述实验重复4次，结果总结于表1中。
表1：实施例3的结果(4次重复的平均值)
Figure BPA00001234101900291
  0.20M   38.8/48   71.3   10.9
当重悬缓冲液中含有0.05M的NaHCO3时，得到优化的产率。当使用的碳酸盐浓度更高时，产率降低并且当为0.2M时明显下降。pDNA均匀度相对稳定，似乎没有受到明显地影响。NaHCO3的浓度越高产率越低，这主要是由于得到的重悬缓冲液和溶胞溶液的混合物的较低的pH。由于pH对于细胞破碎的程度/完全度(completeness)较为关键，因此当碳酸盐浓度更高时必须考虑pH降低的影响。在此描述的实施例中的临界pH为12.5。因此，在不改变溶胞溶液中的NaOH浓度或不改变每单位体积重悬的生物质的NaHCO3使用量的情况下，不能使用更高的NaHCO3浓度。
所有经分析的洗脱级分显示出相似的pDNA浓度和均匀度。
实施例4
中和过程中来自碳酸盐的CO2释放和在利用连续碱裂解、中和(CO2释放)和半连续澄清(“系统II”)的过程中的经改善的漂浮
使用WO 2004/085643中所述的实验室/小试-规模系统的原理，使用半连续澄清(系统II)来进行这个实验。与原有的澄清反应器相比，改变分布器以适应根据本发明方法的具有改善的漂浮/CO2释放的方法。使用具有开放末端并且无穿孔的管来代替具有槽(slot)的管，其到达澄清反应器底部(在保留材料上)(图6)。由于附着有气泡引起改善漂浮的效果，所述絮凝物立即向上漂浮，穿过较低的溶胞产物相，到达絮凝物/液体的界面。因此，下述过程不是必须的：通过经由原来使用的分布器的穿孔离开，而将进入澄清反应器的絮凝物直接分布到已经存在的絮凝物层(在过程中水平面发生变化)上。另外，形成中空螺旋从而使的可以在整个絮凝物层/反应器直径上均匀地分布絮凝物清洗溶液(在所述过程的结尾)。
使用100g生物质进行该实验两次。在第一次实验中(改善的漂浮)将0.05M的NaHCO3加入到重悬缓冲液中。在第二次实验中，使用了WO2004/085643中所述的标准参数和原始的澄清反应器结构。用于两次实验的流速(影响混合以及确定在溶胞和中和设备中的接触时间)和其它任选参数相似。在两次实验中，对于全部三种溶液/悬浮物(重悬的生物质、溶胞溶液、中和溶液)，将流速均调节到20mL/min，相应的对于溶胞和中和的接触时间分别为约1.5min。
对通过具有改善的漂浮的设备得到的溶胞产物进行进一步处理，利用中空纤维超滤对其进行浓缩，为了与后续的疏水作用色谱(HIC)步骤结合，通过将其与4M硫酸铵溶液混合以及过滤(HIC上样)对其进行调节。
作为对照样品，溶解相当于1g湿生物质的悬浮细胞的等分试样(无碳酸盐)，并且在根据传统的实验室规模的程序在小管中对其进行中和，通过离心来进行澄清(12.000g)。使用这个样品来计算具有在此所述的改善的漂浮的实验室/小试-规模过程的产率，以及用于比较均匀度(针对平温性(smoothness)和质量的指标)。所有的样品均通过HPLC分析(浓度、均匀度、近似纯度)。结果总结于表2中。
表2：具有改善的漂浮的连续溶胞/中和/澄清(系统II)的结果与对照的比较
Figure BPA00001234101900311
*直到HIC-上样的总产率(包括所有在先步骤，特别是溶胞)
结果显示出通过改进的连续方法(系统II澄清)得到的溶胞产物的均匀度与对照具有可比性。产率和纯度(直到HIC-上样时)与利用无漂浮的连续方法所得到的产率和纯度是可比的。后续的HIC步骤起到与预期一样的作用(与通过无改善的漂浮获得溶胞产物的标准系统是可比的)。
在图7(a和b)中，对通过具有CO2释放和无CO2释放的方法获得的絮凝物(在WO 2004/085643的澄清反应器中)的漂浮情况进行了比较。
明显地，具有CO2释放的方法得到了明显更为致密的絮凝物层(a1)和a2)中的放大部分)，与无CO2的方法(b1)和b2)中的放大部分)相比。这一点对于絮凝物澄清具有重要的意义，其对于半连续澄清反应器的容量以及因此对于产率是有益的，并且是完全连续澄清系统的先决条件。
实施例5
通过本发明方法生产溶胞产物(具有改善的漂浮；澄清方式系统II)以及后续的纯化。
按照实施例4所述破碎100g生物质，应用具有CO2释放和改善的漂浮的本发明方法。通过中空纤维超滤将收集的溶胞产物(3050mL)浓缩至600mL。在接下来的步骤中，通过与4M硫酸铵储备液混合以及之后的过滤来调节经浓缩的溶胞产物。将经调节的溶胞产物的等分试样(575mL)上样到适当尺寸的HIC柱上，并用降低的盐梯度进行洗脱。进一步纯化HIC池(HICpool)，通过阴离子交换色谱(AEC)和大小排阻色谱(SEC)，以及最终通过0.22μm的过滤器进行过滤(原料药(drug substance))。结果总结于表3和4中。
按照实施例4所述制备对照溶胞产物。
表3：具有改善的漂浮的连续溶胞/中和/澄清(系统II)和后续纯化步骤的产物(pDNA)的具体结果与对照的比较
  样品  均匀度(％ccc)   产率(％)
  对照  91.1   100
  溶胞产物  92.0
  原料药  94.6   47.3
表4：原料药中的杂质结果分析.
Figure BPA00001234101900321
结果显示pDNA均匀度没有受到加入用于在中和过程中CO2释放的碳酸盐的负面影响。还包括所有的(后续的)纯化步骤的总产率非常良好，接近50％(当根据无CO2-增强漂浮的如WO 2004/085643所述的常规方法进行溶胞/中和/澄清时，总产率的可以达到的上限)，表明加入碳酸盐对于纯化没有负面影响，这一点也通过原料药中的低杂质含量得到证实(与根据常规方法制备原料药所得的结果具有可比性)。
在模拟完全连续澄清系统(系统I)的适当的实验中得到了相似的结果。在这个实验中，通过泵抽吸连续除去漂浮的絮凝物。
实施例6
构建规模放大的WO 2004/085643的澄清系统，以作为本发明方法的系统II(或III)设备来应用以及其用于本发明方法。
规模放大的澄清系统的构建原则已经在WO 2004/085643中进行了描述。为了应用具有改善的漂浮的本发明方法，重新设计了两个主要部分。一个方面，使用未穿孔管来代替开槽的分布器，所述管到达(从顶部一侧)澄清反应器的底部(高于保留材料)。另一方面，从顶部安装用于进行清洗(在过程的结尾)的额外清洗设备(从底部开始进行清洗，如WO 2004/085643所述)。该设备是用于进行CIP的旋转喷球(原位清洗)，其用于在絮凝物上均匀地分布清洗溶液。由此与其用于CIP方式时相比，减少了清洗溶液的流量从而避免了絮凝物的破坏和可能的杂质再溶解。
为了说明具有通过附着有CO2气泡来提高絮凝物漂浮的新型经改进的澄清方法的规模化能力，使用经调整的WO 2004/085643的规模放大系统来制备澄清的溶胞产物，处理1.25kg的湿生物质。重悬在先的冷冻生物质之后，得到13.5L重悬液，对系统进行脱气，按照实施例4和5所述的方法进行溶胞、中和以及澄清。将泵调节到0.75L/min从而使得在溶胞和中和反应器中的接触/混合时间为约1.5min。得到的絮凝物/溶胞产物混合物在澄清反应器中分离，在该反应器中通过附着的CO2气泡的调节，大量絮凝物漂浮从而形成致密的上部絮凝物层。在过程的结尾，在第一步排液步骤之后，从两边，对被反应器底部的保留材料(玻璃珠，直径为0.42～0.84mm以及3mm和聚丙烯烧结板)保留的絮凝物进行清洗，利用流速3L/min的清洗缓冲液。最终，通过施加比大气压多0.5巴的气压(0.5bar over pressure)(加压空气)对絮凝物进行排液。通过调节步骤(包括过滤)和后续的色谱的步骤(HIC，AEC和SEC)对得到的澄清的溶胞产物进行进一步的处理(逐步地)。通过HPLC对所有样品进行分析(浓度、均匀度、近似纯度)。图8示出了对照溶胞产物的分析性HPLC色谱图，图9是利用连续系统(系统II澄清)在这个实验中得到的溶胞产物的相应的色谱图，以及图10是SEC池的分析性HPLC色谱图。按照实施例4所述制备对照溶胞产物。
表5：具有改善的漂浮和后续纯化步骤的连续溶胞/中和/澄清(系统II)的产物(pDNA)的具体结果，与利用经调整反应器的规模放大系统得到的对照进行比较。
  样品   均匀度   纯度   产率
  (％ccc)   (％)   (％)
  对照   87.3   8.0   100
  溶胞产物   91.9   6.3   70.1
  SEC池   94.0   100   39.9*
*包括所有在先步骤总产率(与对照相比)
产品的具体结果确认了本发明方法是可以规模化的。溶胞之后的所有步骤按照预期运转，确认了通过本发明新方法得到的溶胞产物(可以进一步进行利用碳酸盐释放CO2的改善漂浮的方法，按照与由标准程序(如WO2004/085643所述)获得的溶胞产物相同的方式)。图11示出改进的漂浮方法在规模放大系统中的优点，即获得致密的漂浮絮凝物层。图12示出通过在澄清反应器顶部的CIP喷球进行的清洗过程。在多6倍的生物质条件下，还重复进行了上述这个实验。
实施例7
构建实验室规模系统，用于以完全连续澄清方式(系统I)应用本发明方法以及其的利用。
使用了以下系统进行了这个实验，所述系统原则上利用了WO2004/085643所述的实验室/小试-规模系统的溶胞和中和，并通过用于完全连续(预)澄清的装备对其进行扩展(参考图13和14)。基于如图13所示的基本设计，构建了如下的扩展设备(参考图14)用于连续(预)澄清：具有平底部的玻璃圆柱体，直径为9.4cm且高度为19.4cm，在圆柱体的中部设置有侧入口，以及在圆柱体的底部设置相对的侧出口。通过内径8mm的管道连接所述入口和出口通道。圆柱体的顶部防漏地与作为逐渐变细的延伸部分的漏斗相连接。这个漏斗逐渐变细(从与圆柱体顶部的直径相似)到直径22mm，变细部分的长度为约65mm。漏斗变细的顶部末端与具有相似直径的管道相连接，其作为用于连续(预)澄清的扩展设备的顶部出口。完全澄清设备的体积为约1450mL。如果以半连续方式，利用具有相似体积(1450mL)的澄清设备的系统II设备来进行澄清，这个体积对于收集由从约100g湿生物质的碱裂解/中和得到的絮凝物是足够的。
进行所述实验，处理重悬在含有0.05M NaHCO3的重悬缓冲液(pH 8)中的500g生物质。对于全部3种溶液/悬浮液(重悬的生物质、溶胞溶液、中和溶液)调节流速均为30mL/min。在所述过程的开始阶段，用来收集(预)澄清的溶胞产物的澄清设备的底部出口关闭，并用清洗缓冲液填充澄清设备到其入口处。
如在在先实验中观察到的一样，在启动所述过程时，在溶解的细胞溶液与中和溶液接触之后立即释放CO2，并且同时产生附着到沉淀絮凝物上的小气泡。在经过混合距离(卷曲的管道)之后，溶胞产物和沉淀物的絮凝物的混合物进入到新型澄清设备中。从而完全充满该澄清设备。由于气泡附着在絮凝物上，沉淀物向上运动，并且与下面的含有最少量絮凝物的澄清的溶胞产物相相分离。当絮凝物达到顶部出口时，打开底部出口以回收(预)澄清的溶胞产物。由于仅部分打开底部出口，经由底部出口的溶胞产物的离开流速低于进入混合物的流速。这样，迫使在澄清设备的上部分离的絮凝物通过顶部出口，并且经由在位于后面的筛中的管道来收集，所述絮凝物含有最少量的絮凝物间溶胞产物，其通过逐渐变细的设备顶部得到进一步减少。在筛下方的容器中收集剩余的溶胞产物。手动调节底部出口的打开程度，从而保持设备中的溶胞产物/絮凝物界面大致保持在设备的中间高度。将收集的(预)澄清的溶胞产物进料到含有保留材料的WO 2004/085643的澄清设备中，用于进行精细澄清。除WO 2004/085643的澄清设备之外，还可以将传统的深层过滤器用来进行在利用色谱法进行纯化之前的精细澄清。如果在色谱法之前，计划进行调节步骤(例如硫酸铵沉淀)，则可以不通过精细澄清处理所述溶胞产物。在WO 2004/085643的澄清设备的出口处收集精细澄清的溶胞产物，并与絮凝物-排液和絮凝物-清洗部分相结合。在所述过程的结尾，停止澄清设备的进料，并经由底部出口回收留在设备下部的溶胞产物相(直到絮凝物到达出口)。然后，关闭底部出口并重新再次进料清洗缓冲液，直到迫使大部分的絮凝物通过顶部出口离开澄清设备。
在所述实验中，可以不受任何限制的处理500g湿生物质。这是在大小可比的WO 2004/085643的半连续系统中可以处理的量的5倍(5-timesmore)。由于可以显示出新型(预)澄清系统不受处理的生物质的量的限制，因此所述系统能够处理比在上述这个实验中处理的500g多更多的生物质。利用完全连续(预)澄清系统进行的絮凝物和溶胞产物的分离/(预)澄清非常令人满意。在底部出口收集的溶胞产物仅含有最小量的剩余的小的絮凝物，并且经由顶部出口排出的絮凝物较为致密，仅含有最少量的剩余的絮凝物间溶胞产物。所述实验表明通过本发明的设备和方法可以处理(包括(预)澄清)无限量的生物质。在结束处理500g湿生物质(包括清洗部分)时，收集的溶胞产物的体积为约16920mL。利用HPLC分析所述溶胞产物的pDNA浓度和均匀度，以及近似纯度(后面两项作为平稳性和质量的指标)，并与对照溶胞产物的结果进行比较，所述对照溶胞产物按照实施例4所述的方法制备。收集的溶胞产物共含有约1.4g的总pDNA。
所述结果总结于表6中。
表6：通过经改善的漂浮(系统I)调节的连续溶胞/中和以及完全连续澄清的产物(pDNA)的具体结果与对照的比较。
Figure BPA00001234101900361
*与对照比较
该结果显示通过改进的完全连续方法获得的溶胞产物的均匀度和估计纯度与对照具有可比性。接近90％的产率是非常良好的结果，且好于在先的实验，具有重要的经济价值。
在图15中示出了对照溶胞产物(无CO2释放)的分析性HPLC色谱图，并且可以与在上述这个实验中利用完全连续澄清方式系统I获得的溶胞产物的分析性HPLC色谱图(图16)相比较。
两个色谱图具有可比性，且示出了相似的峰型，确认了可以应用利用新型(预)澄清设备的新方法，而不会负面地影响溶胞产物/pDNA质量并保持均匀度和估计纯度。图17示出了在上述这个实验中得到的以SEC池作为最后纯化步骤的溶胞产物的分析性HPLC色谱图。在浓缩溶胞产物、调节(硫酸铵沉淀和过滤)，以及HIC-和AEC-纯化之后，使用SEC。SEC池中的pDNA均匀度为94.3％，该数据表明在这个实验中通过本发明方法和设备得到的溶胞产物可以被成功地纯化并得到高的最终ccc pDNA-比例。
实施例8
用于以完全连续澄清方式(系统I)应用本发明方法的实验室规模系统的样机以及其的利用。
使用了以下系统进行了这个实验，所述系统原则上利用了WO2004/085643所述的实验室/小试-规模系统的溶胞和中和，并具有用于完全连续(预)澄清的新型设备。上述这个样机(参考图18)包含用于连续过程的所有必要部件。使用根据图13所示的设计的样机用于连续(预)澄清过程。与实施例7所述的扩展设备相比，该样机的新型玻璃圆柱体在底部和顶部逐渐变细。另外，入口位于底部和顶部间的中间位置的侧面，并且结束于圆柱体中间部分的径向方向上。将入口和出口连接到8mm内径的管道上。
按照与实施例7所述的类似的方法进行实验，处理高达至1000g的生物质，使用含有0.05～0.1M碳酸盐的重悬溶液。絮凝物良好地漂浮，从下面的澄清的溶胞产物相中分离并在设备的顶部部分形成致密的层，结果使得澄清过程的性能更为良好。迫使絮凝物通过顶部出口离开，且其中含有最少量的剩余溶胞产物。逐渐变细的底部支持了最大限度的回收(预)澄清的溶胞产物。溶胞产物中的pDNA的均匀度(质量)与对照相似，并且产率为约90％。没有观察到关于容量方面的限制。

Claims (45)

1.生产并非被宿主细胞分泌的多核苷酸的方法，其包括如下步骤： 
a)培养宿主细胞从而生产多核苷酸， 
b)通过碱裂解破碎细胞， 
c)中和步骤b)中得到的溶胞产物，由此形成沉淀物， 
d)将澄清的溶胞产物与步骤c)得到的沉淀物分离， 
e)纯化多核苷酸， 
其中，在步骤a～c)中的至少一步中加入碳酸盐，从而由于步骤c)中的中和，CO2被释放出，以及在步骤d)中通过澄清设备来分离沉淀物和溶胞产物， 
其中，在得到的溶胞产物-絮凝物混合物中根据步骤a～c)中加入的碳酸盐量计算出的理论碳酸盐浓度的范围为0.003～0.35M， 
其中，所述多核苷酸为质粒DNA。 
2.权利要求1所述的方法，其中，步骤a)还包括收获和重悬细胞。 
3.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤d)中获得的所述澄清的溶胞产物通过位于底部的出口离开澄清反应器/设备。 
4.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤a)中加入所述碳酸盐。 
5.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤b)中加入所述碳酸盐。 
6.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤c)中加入所述碳酸盐。 
7.权利要求1或2所述的方法，其中，在得到的溶胞产物-絮凝物混合物中根据步骤a～c)中加入的碳酸盐量计算出的理论碳酸盐浓度的范围为0.005～0.05M。 
8.权利要求3所述的方法，其中，在得到的溶胞产物-絮凝物混合物中根据步骤a～c)中加入的碳酸盐量计算出的理论碳酸盐浓度的范围为0.005～0.05M。 
9.权利要求4所述的方法，其中，在得到的溶胞产物-絮凝物混合物中根据步骤a～c)中加入的碳酸盐量计算出的理论碳酸盐浓度的范围为0.005～0.05M。 
10.权利要求5所述的方法，其中，在得到的溶胞产物-絮凝物混合物中根据步骤a～c)中加入的碳酸盐量计算出的理论碳酸盐浓度的范围为0.005 ～ 0.05M。
11.权利要求6所述的方法，其中，在得到的溶胞产物-絮凝物混合物中根据步骤a～c)中加入的碳酸盐量计算出的理论碳酸盐浓度的范围为0.005～0.05M。 
12.权利要求1或2所述的方法，其中，所述得到的溶胞产物-絮凝物混合物附着有CO2气泡。 
13.权利要求3所述的方法，其中，所述得到的溶胞产物-絮凝物混合物附着有CO2气泡。 
14.权利要求4所述的方法，其中，所述得到的溶胞产物-絮凝物混合物附着有CO2气泡。 
15.权利要求5所述的方法，其中，所述得到的溶胞产物-絮凝物混合物附着有CO2气泡。 
16.权利要求6所述的方法，其中，所述得到的溶胞产物-絮凝物混合物附着有CO2气泡。 
17.权利要求7所述的方法，其中，所述得到的溶胞产物-絮凝物混合物附着有CO2气泡。 
18.权利要求8～11任一项所述的方法，其中，所述得到的溶胞产物-絮凝物混合物附着有CO2气泡。 
19.权利要求1或2所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
20.权利要求3所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
21.权利要求4所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
22.权利要求5所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
23.权利要求6所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
24.权利要求7所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
25.权利要求8～11任一项所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
26.权利要求12所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
27.权利要求13～17任一项所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
28.权利要求18所述的方法，其中，所述碳酸盐为NaHCO3。 
29.权利要求1或2所述的方法，其中，步骤d)以半连续或连续方式运转。 
30.权利要求1或2所述的方法，其以连续方式进行，其中步骤d)在如 下所述的设备上进行，其包括 
i)容器， 
ii)两个出口，其中一个位于容器的顶部，另一个位于容器的底部，以及 
iii)在两个出口之间的入口， 
其中澄清设备或容器顶部部分为逐渐变细的。 
31.权利要求30所述的方法，其中，所述容器上连接有附加的排液和/或清洗单元。 
32.权利要求1或2所述的方法，其中，选自步骤b)～e)中的至少一个步骤以连续方式运转。 
33.权利要求1或2所述的方法，其中，使选自步骤b)～e)中的至少两个步骤的组合通过连接该两个或多个单独步骤以连续方式运转。 
34.权利要求32所述的方法，其中，通过连接至步骤b)，步骤a)也以连续方式运转。 
35.权利要求33所述的方法，其中，通过连接至步骤b)，步骤a)也以连续方式运转。 
36.权利要求32所述的方法，其中，至少一个步骤以自动模式运转。 
37.权利要求33所述的方法，其中，至少一个步骤以自动模式运转。 
38.权利要求34或35所述的方法，其中，至少一个步骤以自动模式运转。 
39.权利要求1或2所述的方法，其中，将沉淀物的清洗步骤插入步骤d)和步骤e)之间。 
40.权利要求39所述的方法，其中，所述清洗步骤由权利要求31的附加的排液和/或清洗单元来进行。 
41.权利要求1或2所述的方法，其中，将浓缩和/或调节步骤插入到步骤d)和步骤e)之间，其中，所述浓缩步骤在所述调节步骤之前进行。 
42.权利要求41所述的方法，其中，所述浓缩和/或调节步骤还包括过滤。 
43.权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤d)的溶胞产物含有多核苷酸。 
44.权利要求1或2所述的方法，其中，所述质粒DNA大小为1～20kbp。 
45.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤a)中得到的细胞群(cell mass)在重悬前经冷冻为沉淀(cryo-pelleted)。 
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255537A (zh) * 2014-05-10 2016-12-21 大集有限责任公司 用浮力分离或富集制剂的系统和装置

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1462519A1 (en) * 2003-03-24 2004-09-29 Boehringer Ingelheim Austria GmbH Method and devices for producing biomolecules
SI2435569T1 (sl) * 2009-05-26 2017-03-31 Eurogentec Sa Postopek in naprava za izdelavo in/ali čiščenje polinukleotidov in proizvodi pridobljeni na ta način
KR101320954B1 (ko) * 2010-02-12 2013-10-23 (주)헤임달 건물 내 투입요원의 안전을 위한 유도등 내장 지그비 에이피 시스템을 이용한 위치추적 방법
DE102012215013A1 (de) 2012-08-23 2014-02-27 Wirtgen Gmbh Selbstfahrende Fräsmaschine, sowie Verfahren zum Abladen von Fräsgut
US10828580B2 (en) * 2013-04-11 2020-11-10 Aroostook Pure, Llc Purification and separation system and method
JP6435341B2 (ja) 2014-02-21 2018-12-05 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド ポリ（酸）膜分離マトリックスを含むスピンカラム並びにその製造及び使用方法
WO2016181024A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 Outotec (Finland) Oy A flotation tank, a tank module and its uses, a flotation plant, a method of replacing the flotation tank, and methods of maintenance of the flotation plant
CN105413211A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 天津横天生物科技有限公司 用于粉剂生产的节能浓缩器
BE1024230B1 (fr) * 2016-11-08 2017-12-20 Univercells Sa Production contenue de cellules et/ou de produits cellulaires
CN106929505A (zh) * 2017-01-26 2017-07-07 内蒙古大学 质粒提取试剂盒及提取质粒的方法
EP3549676A1 (en) * 2018-04-04 2019-10-09 Clariant International Ltd Method and system for separating a precipitate from a liquid
EP3594338A1 (en) * 2018-07-12 2020-01-15 Kaneka Eurogentec SA Method and apparatus for the purification of extra-chromosomal nucleic acid sequences
DE102019104218A1 (de) 2019-02-19 2020-08-20 Wirtgen Gmbh Arbeitszug, umfassend eine Bodenbearbeitungsmaschine und ein weiteres Fahrzeug sowie eine automatisierte Abstandsüberwachung
LT3663401T (lt) * 2019-02-28 2022-10-25 Lonza Ltd Biologinių molekulių, tokių kaip plazmidinė dnr, gryninimo būdas, panaudojant anijonų mainų chromatografiją
GB2611567A (en) * 2021-10-08 2023-04-12 Cytiva Sweden Ab Extraction of plasmid DNA
CN116987581A (zh) * 2023-08-08 2023-11-03 江苏耀海生物制药有限公司 一种质粒dna制备装置及制备工艺
CN117050865A (zh) * 2023-08-16 2023-11-14 浙江健新原力制药有限公司 一种质粒生产全自动系统及制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992017260A1 (en) * 1991-03-27 1992-10-15 Jack Baggaley Material treatment apparatus
WO2004024283A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Valentis, Inc. Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids
WO2004085643A1 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Boehringer Ingelheim Austria Gmbh Methods and devices for producing biomolecules
WO2004108260A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Advisys, Inc. Devices and methods for biomaterial production
EP1593741A1 (en) * 2004-05-03 2005-11-09 PlasmidFactory GmbH & Co. KG Method for producing extra-chromosomal nucleic acid molecules

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2931501A (en) * 1953-10-01 1960-04-05 Archer Daniels Midland Co Hydraulic flotation system
US3764479A (en) * 1970-09-28 1973-10-09 Gen Electric Disk flotation determination of catalase activity
JPH0226689A (ja) * 1988-07-15 1990-01-29 Mk Seiko Co Ltd 汚水処理装置
CH677141A5 (zh) * 1988-09-16 1991-04-15 Rosenmund Ag
IT1226210B (it) 1988-12-22 1990-12-21 Claudio Schneider Procedimento per l'estrazione e la purificazione di dna
US5348745A (en) * 1989-05-09 1994-09-20 Miles Inc. Aqueous granulation solution and a method of tablet granulation
DE4143639C2 (de) 1991-12-02 2002-10-24 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
JPH06134449A (ja) * 1992-10-22 1994-05-17 Tokai Kosan:Kk 低濃度汚水の浄化方法および装置
US5382358A (en) * 1993-03-24 1995-01-17 Yeh; George C. Apparatus for dissolved air floatation and similar gas-liquid contacting operations
US5561064A (en) 1994-02-01 1996-10-01 Vical Incorporated Production of pharmaceutical-grade plasmid DNA
DE4432654C2 (de) 1994-09-14 1998-03-26 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus natürlichen Quellen
JPH07256272A (ja) * 1994-03-22 1995-10-09 Nippon Hyomen Kagaku Kk 排水の凝集分離方法
DE4416447C1 (de) * 1994-05-10 1995-08-24 Aqua Medic Anlagenbau Gmbh Eiweißabschäumer
CA2192342A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 Ann L. Lee A method for large scale plasmid purification
US5576196A (en) 1995-01-13 1996-11-19 Vical Incorporated Process for reducing RNA concentration in a mixture of biological material using diatomaceous earth
EP0811055B1 (en) 1995-12-21 2004-06-09 Genzyme Corporation Method for lysing cells
GB9602825D0 (en) 1996-02-12 1996-04-10 Therexsys Ltd Method of plasmid dna production and purification
EP0814156B1 (en) 1996-06-18 2003-03-05 The Institute Of Physical & Chemical Research Method for the purification of DNA
US7026468B2 (en) 1996-07-19 2006-04-11 Valentis, Inc. Process and equipment for plasmid purification
US7807822B2 (en) 1996-08-01 2010-10-05 Robert Bridenbaugh Methods for purifying nucleic acids
FR2753204B1 (fr) 1996-09-11 1998-12-04 Transgene Sa Procede de preparation d'adn plasmidique
SE9703532D0 (sv) 1997-09-30 1997-09-30 Pharmacia Biotech Ab A process for the purification of plasmid DNA
FR2773818B1 (fr) 1998-01-21 2000-02-18 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede et dispositif de lyse de bacteries
US6268492B1 (en) 1998-08-10 2001-07-31 Chiron Corporation Methods for purifying non-chromosomal nucleic acid molecules from cells
US6450344B1 (en) * 1998-08-31 2002-09-17 Mazda Motor Corporation Particle separating apparatus
JP3057195U (ja) * 1998-09-01 1999-03-30 マツダ株式会社 混濁物分離装置
EP1200578B1 (en) 1999-07-23 2004-04-14 Genentech, Inc. Method for rnase- and organic solvent-free plasmid dna purification using tangential flow filtration
US20020012990A1 (en) 1999-12-22 2002-01-31 Lander Russel Jackson Process for the scaleable purification of plasmid DNA
PT102491B (pt) 2000-07-10 2003-02-28 Inst Superior Tecnico Processo para producao e purificacao de dna plasmidico
JP4786786B2 (ja) * 2000-09-20 2011-10-05 ユシロ化学工業株式会社 床洗浄廃液処理剤、床洗浄廃液処理方法及び床洗浄廃液の再利用方法
WO2002026966A2 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Transfection using plasmid preparations
CA2446478C (en) 2001-01-19 2008-02-26 Drm, Dr. Muller Ag Method for treating biomass for producing cell lysate containing plasmid dna
DE10207170A1 (de) * 2002-02-20 2003-09-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Grobklärung von Zellaufschlüssen aus Mikroorganismen
EP1584680A1 (en) 2004-04-08 2005-10-12 Boehringer Ingelheim Austria GmbH Fed-batch fermentation process for the production of plasmid DNA
JP4674073B2 (ja) * 2004-10-08 2011-04-20 栄研化学株式会社 核酸増幅反応における阻害を回避する方法
JP4971997B2 (ja) * 2005-01-31 2012-07-11 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション プラスミドｄｎａの精製方法
WO2008098233A1 (en) * 2007-02-09 2008-08-14 Environmental Stewardship Solutions, Llc. Method for recovering suspended solids from residual effluents

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992017260A1 (en) * 1991-03-27 1992-10-15 Jack Baggaley Material treatment apparatus
WO2004024283A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Valentis, Inc. Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids
WO2004085643A1 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Boehringer Ingelheim Austria Gmbh Methods and devices for producing biomolecules
WO2004108260A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Advisys, Inc. Devices and methods for biomaterial production
EP1593741A1 (en) * 2004-05-03 2005-11-09 PlasmidFactory GmbH & Co. KG Method for producing extra-chromosomal nucleic acid molecules

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255537A (zh) * 2014-05-10 2016-12-21 大集有限责任公司 用浮力分离或富集制剂的系统和装置
CN106255537B (zh) * 2014-05-10 2019-09-24 大集有限责任公司 用浮力分离或富集制剂的系统和装置

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