JPH0667959B2

JPH0667959B2 - 生体高分子のクロマトグラフィー分離方法

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Publication number: JPH0667959B2
Application number: JP60299778A
Authority: JP
Inventors: ヴイクトール・サンシエ; ベアトリス・ネー・ミルカン・ビスカン; ジアン・ピエール・クーデルク; ジアン・ピエール・リバ
Original assignee: サントル・ナシヨナル・ド・ラ・ルシエルシユ・シアンテイフイク（セ・エヌ・エル・エス）
Priority date: 1985-01-04
Filing date: 1985-12-27
Publication date: 1994-08-31
Anticipated expiration: 2009-08-31
Also published as: FR2577258A1; FR2577258B1; JPS61225197A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は１種または複数種類の生体高分子（biological
macromolecule）の濃厚溶液を得るために、クロマトグ
ラフィー即ち蛋白質、酵素、毒素、抗体などのような生
体高分子の選択的吸着を重要な特徴とする吸着工程によ
って分離する方法に関する。

従来技術ある種の生体高分子は例えば5000以上の高い分子量を有
しており、生物学的活性、又は例えば蛋白質をペプシド
に変質させるような機能的能力を失わせる変質を生ずる
傾向を有し、このような特性は純化（沈殿、超微粒子濾
過およびクロマトグラフィー）の為の工業的規模におけ
る分離方法を制限する。クロマトグラフィー（選択的吸
着）方法は実際上高い純度の生体高分子を工業的規模で
生産するための最も適切な製造技術である。

この方法は、生体高分子の選択的吸着を行うに適した特
定のクロマトグラフィー樹脂が固定されたベッドを横切
って生体高分子を含む溶液の濾過を行うことに適用され
る。１種または複数種類の生体高分子が樹脂上に吸着さ
れる場合には、pHすなわち適当なイオン力の溶液による
樹脂の溶離が対象高分子を分離させ、純化して濃縮を可
能とする。対象高分子が処理溶液内に留まる（他の高分
子が吸着される）場合には対象高分子を直接に分離する
ことができる。

固定されたベッドによるクロマトグラフィー技術および
その性能は生物工学の分野で公知であり、以下の文献が
ある。

「プラズマ蛋白分離方法」ジェー・エム・カーリング、
アカデミック・プレス1980年149〜160頁「イオン交換樹脂による蛋白質の回収」ティー・ティー
・ジョーンズ、ピーエスシー・フード・プロセシング・
インダストリ、1975年４月、21、23頁「乳漿の新しい評価方法」ビー・ミラベル、ローヌ・プ
ーランク・アンデュストリー、アンフォルマン・シミ
ー、第175号1978年３月105〜109頁フランス国特許第2321932号明細書、フランス国特許第2
359634号明細書（蛋白質を分解するためのイオン交換樹
脂の記載あり）固定ベッドによるクロマトグラフィー分離方法の最大の
欠点は、ベッドが次第に閉塞することであり、閉塞は溶
液内に懸濁状態で存在する固体不純物、特に該固体不純
物の或る成分の沈殿によって生ずる。これは工業計画に
著しく重大である。時間の経過に伴って濾過される量が
変化することを防止するため、流入圧力を標準値より３
〜４倍程度大とする必要があり、技術的の問題点が生
じ、ある場合には実施不能となる。更に、クロマトグラ
フィー樹脂の定期的な清掃は実際上著しく困難であり、
通常は分離して清掃するが、設備の連続的な作動と妨げ
るのみでなく、費用がかかる。注意すべきことは、通常
は無機材料となされるクロマトグラフィー樹脂の支持体
が脆く、清掃時に割れるおそれがあり、これはベッドの
一部に障害を与える。また、有機材料となされる別のク
ロマトグラフィー樹脂の場合は目詰りを生じた場合に清
掃を行うことが出来ず、廃棄しなければならない場合も
ある。或る場合には、閉塞状態でベッドが全体的に固化
して清掃不能となる。閉塞以外にも多数回の清掃によっ
てベッドの能力が低下する問題があり、充分に注意して
も若干の量の不純物がクロマトグラフィー樹脂上に拘
留、保持されてクロマトグラフィー樹脂の能力が次第に
減少し、その結果として廃棄を必要とするようになる。

このような問題点は生物学的クロマトグラフィーの分野
で公知であり、従来は処理の前に溶液を充分に洗浄する
必要がある、洗浄はコストを著しく増加させ、価値の高
い製品（例えば医薬品）を得るためにはこの方法の運用
面が制限され、従って応用面における有用性が低下し、
高分子生成物の価値が低下する（生物学的起源の天然生
成物又は工業的二次生産物特に農業食品の処理）。

固定ベッドによるクロマトグラフィー方法の他の欠点
は、樹脂が受ける圧縮および洗浄の中間的な種々の処
理、および閉塞解除によって生ずる拘束によって生ずる
拘束により充分に速く破壊される、樹脂の短い寿命であ
る。

実際上、上述の問題点は解決されておらず、生体高分子
の場合に生ずる大きいコスト増加を伴わずには解決され
ない。薬剤学、獣医学などの分野のみでなく、食品にも
関係するこの形式の処理の経済的な重要性を考慮して、
前述有害の結果を最少とするクロマトグラフィー技術を
生体高分子の分離に適用するために多くの研究が行われ
てきた。ディー・ジョーンズ、ピーエスシー「イオン交
換樹脂による蛋白の回収」には、洗浄および清掃の後に
一方の端部から樹脂を取出して他方端から投入し、パッ
ド毎に移動するベッドによって構成される可動の充填ベ
ッドを提案しているが、不十分である。

応用面における満足な解決方法は現在まで提案されてお
らず、例えばクロマトグラフィー樹脂の清掃の必要性、
固定能力の変化、および劣化のような重大な欠点が存在
している。

他の技術分野及び特に鉱物質の分離の分野においては、
閉塞を回避し樹脂の劣化を減少させる、流動化ベッドに
よるクロマトグラフィー技術が実施された。

金属イオンの分離、「連続的なイオン交換塔」ターナー
及びチャーチ、トランザクション・インスティテューシ
ョン・ケミカル・エンジニアリングス、41巻、1963年第
283〜288頁、ウランの抽出、「流動体ベッドのイオン交換設備の評
価」ミカエル・ジェー・スレイター、ジャーナル・アプ
ライド・ケミカル・バイオテクノロジー、1975年、第25
巻、367〜378頁。

分子量の小さい分子（安定性が高い）を分離するための
流動化ベッドを使用するクロマトグラフィー技術は20年
以上前から公知である。しかし生物学技術者はこれを生
体高分子のクロマトグラフィー分離の為に利用すること
を試みなかった。この技術は下記の理由により適用不能
であると考えられていた。即ち、第１に生体高分子（粒
子量が少ない、密度が水の密度に近い、物理的性質が不
適当）に特定的な形式のクロマトグラフィー樹脂に対し
ては、流動化のためには流れの中に粒子を随伴させる必
要がある。第２は生体高分子の固定の動力学に関連し、
これは分子間隙の容積が大であるから流動化ベッドの能
力が低下することによっている。さらに、溶液を流動化
ベッドに導くときに極微速度が必要であり、これが工業
的生産に不適当である。

1980年には前述刊行物「プラズマ蛋白分別方法」ジェー
・エー・カーリング、第152頁に示される予測が当業者
に定着していた。

（訳文）「我々は、流動化ベッドの塔よりも固定ベッド
の塔を選択する。流動化は上昇する濾過流、およびこの
上昇流で平衡を保つために密であるより大である粒子が
望ましい。併し、蛋白質の分別のために利用されるゲル
は通常は水より密でなく、流速を小としても著しく希薄
な懸濁物を与える。更に、高分子の拡散特性のために、
多孔性部分内への液体素子の侵入性を向上させるために
は粒子の大きさ及び間隙容積をできるだけ小とする必要
がある。固定ベッドは塔の容積を最小とし、水の消費を
減少させる。これらは経済的な影響を有し、無視するこ
とができない。これらの要求により、クロマトグラフィ
ー技術を生物学的工業に適用するためには、特に優れた
機械的品質を有する特殊の支持体を必要とする。これら
は小型の塔内で使用するために殺菌性でなければなら
ず、処理溶液量が数百または数千リットルのとき速度が
著しく大である必要がある。」古い英国特許第1,148,861号明細書（1966年５月６日）
およびフランス国特許第2,105,032号明細書（1970年９
月17日）があり、一方は固定、流動化ベッドまたは開放
された塔による生体高分子のクロマトグラフィー技術を
示し、他方は生物学的物質の純化の応用として硬水また
はウラン塩純化のための流動体化ベッドによるイオン交
換を示している。併し、これらの特許は前述見解を覆す
には不十分であることは理解されよう。実際上、前述英
国特許は固定ベッドでも流動化ベッドでも又は開放され
た塔でも、攪乱状態で処理することを示しており、分子
量の小さい２つの例、コデインおよびアトロピンのクロ
マトグラフィー処理を示しているのみであるが、一般的
な記載において可能な応用例としてホルモン、ビタミ
ン、アルカロイド、抗生物質を示しており、これらは一
部のホルモン以外は小分子である。フランス国特許は主
として、塩を除去するための硬水の純化、及びウラン塩
の純化を示しており、一般的な冒頭の記載において、生
物学的物質に対するイオン交換工程の適用可能性を示し
ており、単なるイオン交換工程は分子量の小さい分子に
のみ応用可能であることは公知技術であった。これは特
殊の選択的クロマトグラフィー樹脂を使用するクロマト
グラフィー技術とは全く相違する。

発明の目的本発明は生物学的技術、すなわちバイオテクノロジーの
分野の生体高分子のクロマトグラフィー分離の実際の技
術の改良を提案する。本発明は5000以上の分子量の蛋白
質、酵母、毒素、抗体などの生体高分子のクロマトグラ
フィー分離を企図するものである。

本発明の本質的な目的は、生体高分子を処理してベッド
の閉塞という欠点を回避するクロマトグラフィー分離技
術を得るにある。

前述目的に関連する別の目的はベッドを構成する樹脂の
粒子の損耗および劣化を著しく減少させることにある。

更に他の目的は連続的な分離を可能とするにある。

更に他の本発明の目的は、農業的食品の工業的な蛋白質
の二次製品でも、乳、血液、血漿または血液の血清で
も、又は合成生成物でも、これらの評価を確実とし、工
業的規模で適用可能な経済的な、生体高分子のクロマト
グラフィー分離を達成するにある。

発明の概要本発明によれば、選択的吸着により分離を行うように、
分子量5000以上の生体高分子に対して特定の選択性を有
するクロマトグラフィー樹脂ベッドに溶液を接触させる
ことを含む分離方法に於いて、該分離方法が第１図の線図のハッチングされていない領域Ｚ内に位置
するような値の平均粒子寸法G_mおよび容積当り質量M_vを
有するクロマトグラフィー樹脂を使用し、下記ａ〜ｃの特性を与えるような開口を有する分離装置
が底部に設けられた少くとも１つの段を含む塔の内部に
前記クロマトグラフィー樹脂を配置し、 a)開口された部分の割合がほぼ0.1〜10％の範囲にあ
り、 b)開口の平均直径が約300ミクロン以上であり、 c)開口の平均直径が約２G_m〜20G_mであり、該クロマトグラフィー樹脂のベッドを流動化するように
塔の各段に対し分布装置を横切って溶液を供給し、樹脂
の流動化のための最小速度をV_mfとしたとき、液体がほ
ぼ1.5V_mfないし12V_mfの範囲の直線的速度を塔内で得る
ように溶液の流量を調節する、クロマトグラフィー分離
方法が提供される。

G_m＝（ΣxiGi）／Σxi ここに、xiは粒子寸法Giを有する粒子の質量である。

このようにして以前の技術によっては予期し得ない方法
でクロマトグラフィー樹脂および溶液の分布に対して上
述条件（分布状態、供給速度）を組合せて流動化ベッド
によって生体高分子のクロマトグラフィー分離が可能な
ことが確認された。以下の実施例のように、流動化ベッ
ドによる方法がクロマトグラフィー樹脂の能力を減少さ
せることがなく、材料の選択的な搬送能力が固定ベッド
の場合と実質的に同等に達成される。

第１図の線図で限界曲線Ｃ、および２つの直線D₁および
D₂の間に含まれる水平の領域に対応する75〜300ミクロ
ンの平均粒子寸法G_mのクロマトグラフィー樹脂を選択す
ることが望ましい。粒子の拡散が過大でなく、樹脂を予
め篩分けして拡散を平均値G_mの約50％に制限することが
有利である。

本発明の望ましい実施態様によれば、クロマトグラフィ
ー樹脂は溶液によって順次循環される２〜５段の重ね合
わされた段を有するほぼ垂直な塔内に配置されて、溶液
の交換は溢流によって上部の段の上方部分において行わ
れ、該上部の段を除く各段が開口を有する２つの分布装
置によって境界され、一方の分布装置がその段の底部に
て溶液を分布させ、他方の分布装置がその段の直接上方
の段に向けて溶液を分布させる。

クロマトグラフィー樹脂の全体的な量については、流動
化ベッドを多数の段に分割すると分離性能が著しく改善
され、固定ベッドで得られた性能に近くなることが確認
されている。これは分離に対して有利な温度勾配が、固
定ベッドでは当然存在するが、流動化ベッドが１段の場
合は存在せず多数の段では実現できることによる。

本発明の方法は、従来のベッドの欠点すなわち、閉塞、
清掃の必要性、圧縮および清掃による樹脂の劣化などの
重大な欠点を排除し、固定ベッドによる方法の性能を実
質的に達成可能とする。本発明の流動化ベッドは、閉塞
を生ずることなく、溶液の不純物を自由に通過せしめ、
清掃作業を不要として、樹脂の寿命を著しく増大せしめ
る。

本発明の方法は清掃による拘束を受けないから、連続的
に実施することが可能であり、クロマトグラフィー樹脂
は塔内の底部の位置で連続的に循環され、樹脂は高い位
置から連続的に供給され、底部で連続的に交換すること
ができ、洗浄、抽出および、塔の外部における洗浄作業
を同時に行うことにより、流動化ベッドによる分離作業
を塔内部で連続的に行うことを可能とする。

単に蒸留水またはその他の溶液による濯ぎより成る古典
的な洗浄作業、または再生溶液を通過させる抽出作業
と、公知の方法において樹脂のエネルギ的な機械的処理
を必要とし樹脂の劣化および連続的な作業の困難の原因
である清掃または閉塞（つまり）解除作業とを混同する
ことがないようにする。

重なり合う２つの段の間のクロマトグラフィー樹脂を循
環させることは、流過管によって確実に実施できるが、
流過管は樹脂が溢流によって管内を上方の段から下方の
段に循環することを可能とする。

望ましくは１つ以上のそらせ板を各段に配置して各段の
樹脂の完全な交換を確実とし、死領域を生じないように
する。

本発明の方法は不連続的に実施することもでき、その場
合クロマトグラフィー樹脂が１つの段から別の段に循環
しないように塔の各段に拘留され、流動体化ベッドによ
る分離が塔内部における選択的な固定、洗浄、抽出およ
び洗浄のサイクルによって行われる。この方法は固定ベ
ッドによる分離に対比して有利であり、特に閉塞状態を
排除するために塔を分解する必要がない。

連続的および不連続的な２つの実施方法において、塔の
内部に対する溶液の流入量が少くとも選択的固定の位相
の間に実質的に一定で、公称値に対する流入量の変動が
±５％以内であるように供給を行うことが有利である。

この実施方法は事故による粒子の随伴を防止し、クロマ
トグラフィー樹脂の安定した流動体化を保証する。

本発明の方法は生体高分子の分離ために一般的に適用可
能であり、当業者はそれぞれの分野で選択的クロマトグ
ラフィー樹脂の安定した流動化を達成するものである。

本発明の方法は生体高分子の分離のために適用可能であ
り、当業者はそれぞれの分野で選択的クロマトグラフィ
ー樹脂（第１図の線図によって与えられる容積当り質量
および粒子寸法の条件）を選択し、樹脂の粒子寸法に適
当な穿孔された分布装置（開口の大きさについての条
件）を製造することができる。

本発明の方法は乳漿の蛋白質のクロマトグラフィー分離
に適用可能であり、使用される樹脂は「ローヌ・プーラ
ンク」社から「レジーヌ・スフェロシェル」の商標名に
て販売され、フランス国特許第2,321,932号明細書に記
載されている形式の樹脂とすることができる。これは第
１図の線図を満足する。

本発明の例示として実施例１および実施例２に不連続的
な設備を、実施例３に連続的設備を示し、添付図面と共
に説明する。

発明の実施例第２図および第３図に示す設備は固定相と洗浄相と抽出
相と別の洗浄相とを交代的に行う周期的作動による生体
高分子のクロマトグラフィー分離を行う。

これらの相の進行中に特定のクロマトグラフィー樹脂は
符号３、４に示す複数の段を有する垂直な塔１内に配置
されている。実際上３つ又は４つの段を設けることが望
ましい。

塔１は支持部２を含み、支持部２は開口を有する分布装
置を横切って下方の段３に向って溶液を分布させること
ができる。分布装置は各段について同様であって、第３
図に符号５として拡大尺度で示す。

分布装置５は開口を有する２つの円筒形プレート６、７
（さらに多数であってもよい）を含み、各プレートは上
下関係に配置され、間隔片８によって保持される空間が
プレート間に設けられる。

プレート６、７には開口6a、7aが設けられ、各開口は隣
接するプレート間で位置がずらされている。

プレートの開口の分布密度は、開口部分の割合が0.1〜1
0％の範囲で、特に後述する実施例では５％となされて
いる。開口部分の割合という用語はプレートの有効面積
に対する開口の合計断面積の比率をいう。

各プレートの開口はそれぞれの直径が300ミクロン以上
のものとなされる。入口の上方において直径は対象樹脂
の平均粒子寸法G_mに適応するもので、適当な値は平均直
径が約２G_m〜20G_m、さらに望ましくは４G_m〜６G_mとす
る。例えば、スフェロシル樹脂に対して直径１mmの開口
を有するプレートとする。

プレート６、７は縁部をボルト止めされる環状フランジ
９により緊締され保持されている。円筒形の段３又は４
又は底部２は周囲をフランジの環状内面に接着されてい
る。符号10に示す環状の接合部が一方ではプレートの間
の、他方ではフランジと周囲との間の密封作用を保証す
る。

溶液（固定相で処理されている溶液、洗浄相における蒸
留水溶液、抽出相における再生溶液）は導管11を通って
底部２に進入する。正確に一定の流入量を得るため、こ
れら溶液は容器12（処理溶液または再生溶液）および容
器13（蒸留水溶液）内に入れられるが、これら容器は塔
１の上方の適当な位置に配置されて、所望の流量を供給
可能となされる。流量計14およびダイアフラム15が流量
の制御を可能とする。

処理溶液は貯槽16に貯蔵され、溶液は貯槽内で攪拌さ
れ、制御された温度に保持される。蒸留水は貯槽18内に
貯蔵される。ポンプ20、導管及び堰板装置が適当な溶液
を貯槽16〜18から容器12、13に供給して、各相間にレベ
ルが実質的に一定になるように供給する。

上述の装置は流量の変動を実質上±５％以内として塔１
に溶液を供給する。

塔１の出口として液体は上方の高い段で溢流によって集
められ、一時的に貯槽19に貯蔵される。

第４図は連続的作動を可能とするように修正された設備
の概略図である。この実施例において、塔、開口を有す
る分布装置、および液体を一定流量で供給する装置は前
述実施例と同様である。

この実施例ではクロマトグラフィー樹脂は１つの段から
下方の段に順次に連続的に循環せしめられ、洗浄相およ
び抽出相は塔の外部で行われ、抽出相で連続的にクロマ
トグラフィー固定が行われる。

この装置の相違点はつぎの通りである。

第５図に示すように、塔の互いに上下に重なる２つの段
の間に、開口を有する分布装置を横切って樹脂の流過管
21が配置されている。管21は上方段のベッドの上部21a
と下方段の底部21bとの間に延長している。樹脂は溢流
によって順次１つの段から下方の段に管21を通って循環
される。

この溢流を可能とするためにそれぞれの流過管21は当該
段の下方の高さH_Bからベッドのない部分の高さH_Sまで貫
通している。各管21の内部に形成される流動化された樹
脂のベッドが上方の段の管に溢流することがなく、これ
が１つの段から下方の段に重力によって樹脂が循環する
条件が構成される。

各段に対して、そらせ板22がその段に連通する２つの管
の２つのオリフィス（上方の段に連通する管21′の下方
のオリフィス21′ｂおよび下方の段に連通する管の上方
のオリフィス21a）の間に配置されている。そらせ板22
は管21を囲む管状のスリーブとして構成することがで
き、このスリーブをオリフィス21aの高さの上方まで延
長するものとし、下方の部分で樹脂の通路22aを与える
ようにする。

上方の段から流入してオリフィス21′ｂを通って出てく
る樹脂は負荷、即ち吸着が少なく、従って一般的に更に
軽く、ベッド内で上昇する傾向を有し、オリフィス21′
ｂとオリフィス21aとの間で樹脂の短絡を生ずることを
回避し、樹脂が交換されることを防止する。ベッドの無
効領域を縮小せしめ、樹脂の完全な交換を保証する（注
目すべきことは、或る樹脂および固定される或る高分子
に対しては、樹脂の容積当り質量が交換作業間に変化し
ないが、この場合そらせ板はあまり重要ではないが、全
体的な固定の均一性を改善する。

塔の底部において、下方の流過管23は供給支持部を貫通
し、樹脂推進用流体圧力作動装置24に組合わされ、回収
貯槽25に延びている。貯槽25の樹脂は流動体化ベッドと
して作用する外部の塔内で再生されるが、該外部の塔へ
の供給は連続的に行われる。

再生されたクロマトグラフィー樹脂は再生塔から移送装
置により又は手動的に貯蔵容器26に導入される。密封状
態に閉鎖されたこの容器は蒸留水が充満されており、堰
板および流量計を含む導管27を経て蒸留水が供給され
る。

樹脂は流体圧作動により、管26を経て真空ポンプに組合
わされたベルトコンベア29に向って移送され、樹脂の粒
子を囲む水が除去される。

ベルトコンベア29は再生された樹脂を調節可能な流量で
頂部漏斗が設けられた上部の流過管21内に供給する。

実施例１および２は第２図に示す形式の設備について実
施され、実施例３は第４図および第５図に示す形式の設
備について実施されるに適している。

実施例１塔は３つの段を有し、各段の高さは50cm、塔の直径は５
cmである。

この実施例は、「フロマジェリー・ベル」によって作ら
れるチーズの生産時の残留物である甘味乳漿（un lacto
serum doux）のβラクトアルブミン（二量体の形状の分
子量：34,000）およびαラクトアルミン（14,000）のア
ルブミンの抽出を目的とするものである。

使用されるクロマトグラフィー樹脂は「ローヌ・プーラ
ンク」によって作られた樹脂「スフェロシルQMA」であ
る。最初の粒子寸法の分布は100〜300μｍであった。20
0〜250μｍの粒子範囲、すなわち平均粒子寸法G_m＝225
μｍの粒子範囲を保持するように乾燥状態で篩分けを行
う。「スフェロシルQMA」樹脂の容積質量はM_v＝1,400kg
/m³である。この樹脂の組合わせ（G_m、M_v）は第１図の
線図上の点Ｒとして示される。

この樹脂は25m²／ｇの球面、1250Ａの多孔部の平均直径
および１cm³／ｇの多孔部容積を有する球状粒子であっ
て、粒子は次の機能グループを有する網状スチレンビニ
ルトリエポキシシラン（stylene vinyl triethoxy sila
ne）重合体によって被覆されている。

この樹脂の流動化の最小速度は、V_mg＝１・４×10^-4m/s
である。

この塔の各段の分布装置の開口部分の平均直径は、ほぼ
４G_mとなる。

各段に堆積した樹脂の量は約130cm³である。

この塔は、設置されている供給装置（所定の高さに配置
された供給用貯槽）の特性によって公称値に対して５％
以上の変動を生じないようにして、９／ｈに等しい溶
液の流量で等の底部に乳漿を供給する。

塔の断面は（１・96×10^-3m²）で、流量は（１・３×10
^-3ｍ／ｓ）すなわち、９V_nfに相当する。

この流量の場合、各段のベッドが64％の膨張を受け、20
cmの高さを示すことを確認した。また、視認により安定
かつ良好な流動化が確認された。

塔の入口で乳漿の濃度は、βラクトグロブリンが3.0g／
で、αラクトアルブミンが1.2g／であった。

この方法は２時間実施された。第７図は時間の関数とし
て最初の濃度C₀に対する各段の出口の濃度Ｃの比率の曲
線を示し、曲線α₁、α₂およびα₃はそれぞれ下方の
段、中間の段および上方の段の出口におけるαラクトア
ルブミンに対するＣ／Ｃ₀の変化を示す。曲線β₁、β₂
およびβ₃はそれぞれ下方の段、中間の段および上方の
段の出口におけるβラクトグロブリンに対するＣ／Ｃ₀
の変化を示す。測定は酢酸セルローズ膜上の領域の電気
泳動による合計３分間の採取によって行われた。

30分間にβラクトグロブリンおよび、αラクトアルブミ
ンは総て樹脂上に固定され（曲線α₃およびβ₃の最初の
段階）、次にβラクトグロブリンのみが続いて15分間吸
着され、αラクトアルブミンは塔の出口から流出する。

固定作業の終了後（Ｃ／Ｃ₀＝１）、蒸留水で約20分間
洗浄を行った。

樹脂は２時間0.1Nの塩酸溶液で抽出した。

その後、約１時間蒸留水で洗浄を行い、次のサイクルの
準備が完了した。

これらの作業により塔の樹脂の流動化が完了した。

抽出相で排出された蛋白質の量はβラクトグロブリンに
対して10.5gで、これは乾燥した樹脂の1g当り102gの固
定を示し、αラクトアルブミンに対して1.7gで、これは
乾燥した樹脂の1g当り16.5gの固定を示す。従って抽出
物はβラクトグロブリンを86.1％、αラクトアルブミン
を13.9％含んでいた。利得、すなわち出発物（乳漿）の
生成物内の蛋白質の相対的比率はβラクトグロブリンが
71％、αラクトアルブミンが29％であった。すなわちβ
ラクトグロブリンに富むものとなった。

これら蛋白質を含む抽出生成物は、最初に乳漿に含まれ
ていた乳糖、カゼイン生成物および鉱物質塩が除去さ
れ、蛋白質は純粋で自然の状態であった。

３つの段の流動体化されたパッドの樹脂「スフェロシル
QMA」の固定能力は以前の作業の際の固定パッドによっ
て得られたものと実質的に同様であった。この点につい
ては以下の文献が参照される。

スカッダー・ピー・ジェー、「多孔性シリカ……基体イ
オン交換媒体を使用したときのチーズからの蛋白質の回
収および分別」ケミストリー・アンド・インダストリ、
21巻810〜814頁（1983年）ブルジョア・セ・エムおよびルロー・ペ、「動物の蛋白
質……人間の食物における濃縮抽出物および個体物」、
第３章、コレクション・スィアーンス・テクニク・アグ
ローアリアンテール、ラヴォアジェー（DR）上述の論文は、パッドの位置または分布装置の位置の何
等かの閉塞を確認しないで数十回更新されているが、注
目すべきことは使用された乳漿が自然の状態で懸濁状態
の個体不純物を含んでいることである。

樹脂の効力の減少は観察されず、樹脂の劣化も見られな
かった。

実施例２これは実施例１と同様の条件で行われたが、相違点は各
段に配置された樹脂の量が110cm³であった。

流量が確立されたときに、各段のベッドは69％の膨張を
受け、18cmの高さを示した。視認により安定した良好な
流動化が確認された。

入口において、乳漿は実施例１の場合と同様の濃度（3.
0g／のβラクトグロブリンおよび1.2g／のαラクト
アルブミン）を示した。

処理方法は２時間実施された。第８図は時間の関数とし
て最初の濃度C₀に対する各段の出口における濃度Ｃの比
率を示す曲線を与える。

各段上の樹脂の堆積は実施例１よりも少であった。ま
た、２つの蛋白質の全部が吸着される間、および引続い
てβラクトグロブリンのみが吸着される間の継続時間は
実施例１よりも短い（それぞれ15分間）ことが確認され
た。

実施例１と同様に、洗浄、抽出、洗浄を順次に行った。

抽出によって得られた蛋白質の量は、βラクトグロブリ
ンについて乾燥状態の樹脂のグラム当り110mgで、αラ
クトアルブミンについて乾燥状態の樹脂のグラム当り1
9.5mgであった。従ってこの抽出物は84.9％のβラクト
グロブリンと、15.1％のαラクトアルブミンを含む。実
験的および分析的な誤差は実施例１の場合と同様であっ
た。

実施例３この実施例は第４図および第５図に示す設備で実施され
たが、塔は高さがそれぞれ60.5cmの３つの段を含む。

この実施例は「フロマジェリー・ベル」によって作られ
るチーズの生産残留物である甘味乳漿のβラクトグロブ
リンとαラクトアルブミンとを抽出することを目的とし
ている。

使用された樹脂「スフェロシルQMA」は実施例１と同様
な特性を有する。

塔の各段の開口の平均直径は４G_mであった。

塔の頂部から底部に樹脂を搬送する接続管は内径1.4cm
で、25cmの高さ（H_B）で各段から突出している。

塔内に導入される樹脂の流量は0.14／ｈに保持され
た。

塔の頂部から底部に樹脂を搬送する装置はタイマによっ
て制御される３つの電磁的堰板を含む。固体粒子は上部
の開いた堰板を通過して柔軟なプラスチック管の内部に
集められる。20秒毎に上部堰板は閉じられ、横方向の堰
板と共に開放される下部の堰板から蒸留水が噴射され
て、粒子を伴って下方に流れる。

塔は底部にて溶液流量９／ｈにて乳漿が供給される
が、流量は実施例１の場合と同様にして制御される。

流量が確立されたとき各段のベッドが、その段の上方の
接続管の突出部H_Bの高さは25cmであった。

各段の高さは60.5cmであり、各段の接続管内に保持され
る流動化された層は直上の段の流動体化された層より低
い高さを有し、上方の段への溢流が防止される。

適切な安定した流動体化と適切な固体相と液体相との循
環が観察された。

入口において、βラクトグロブリンの濃度は3.0g／で
あり、αラクトアルブミンの濃度は1.2g／であった。

この方法は連続的に行なってもよいが、３時間の連続的
運転を行った。第９図は時間の関数として最初の濃度C_O
に対する各段の出口における濃度Ｃの比率を示してい
る。

定常な作動状態に到達する前に過渡的状態があることが
確認された。

αラクトアルブミン（α₁、α₂およびα₃）がβラクト
グロブリン（β₁、β₂およびβ₃）より少ない量を樹脂
上に保持された。

塔の出口（第３段）で液体は最初のαラクトアルブミン
の約50％を含んでいたが、βラクトグロブリンは25％の
みを含み、固定された量の差が判る。

発明の効果上述のように本発明によれば従来技術の生体高分子のク
ロマトグラフィー分離の欠点を除去し、工業的な規模で
ベッドの閉塞を防止し、樹脂の粒子の劣化を減少せし
め、連続的なクロマトグラフィー分離を可能とする方法
を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用するに適した樹脂を決定するため
の線図。第２図は本発明の方法を実施するに適した不連
続的設備の概略断面図。第３図は第２図の設備の塔の詳
細を示す垂直断面図。第４図は本発明の方法を実施する
に適した連続的設備の概略断面図。第５図は第４図の設
備の塔の詳細を示す垂直断面図。第６図は第５図の垂直
平面AA′を通る断面図。第７図、第８図および第９図は
それぞれ時間の関数として実施例１、実施例２および実
施例３の出口における溶液の濃度の変化を示す線図であ
る。 1:塔、2:支持部、３、４、5:段、６、7:開口を有する分
布装置、すなわち多数の小孔を有する円筒形のプレー
ト、9:ボルト止めされた環状フランジ、12、13:容器、1
4:流量計、15:ダイアフラム、16、17、18、19:貯槽、2
0:ポンプ、21:流過管、22:そらせ板、24:流体圧作動装
置、25:回収貯槽、26:貯蔵容器、29:ベルトコンベア

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジアン・ピエール・クーデルクフランス共和国31100 トウールーズ・リユ・ルーヴイエール26 (72)発明者ジアン・ピエール・リバフランス共和国31400 トウールーズ・リユ・ド・ブーゲンヴイル５ (56)参考文献英国特許1148661（ＧＢ，Ａ) 仏国特許2105032（ＦＲ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】選択的吸着により分離を行うように、分子
量5000以上の生体高分子に対して特定の選択性を有する
クロマトグラフィー樹脂ベッドに溶液を接触させること
を含む分離方法において、前記方法が第１図の線図のハッチングされていない領域Ｚ内に位置
するような値の平均粒子寸法G_mおよび容積当り質量M_vを
有するクロマトグラフィー樹脂を使用し、下記ａ〜ｃの特性を与えるような開口を有する分布装置
が底部に設けられた少くとも１つの段を含む塔の内部に
前記クロマトグラフィー樹脂を配置し、 a)開口された部分の割合がほぼ0.1〜10％の範囲にあ
り、 b)開口の平均直径が約300ミクロン以上であり、 c)開口の平均直径が約２G_m〜20G_mであり、前記クロマトグラフィー樹脂のベッドを流動化するよう
に塔の各段に対して前記分布装置を横切って前記溶液を
供給し、その際に前記樹脂の流動化のための最小速度を
V_mfとしたとき、液体がほぼ1.5V_mfないし12V_mfの範囲の
直線的速度を塔内で得るように溶液の流量を調節するこ
とを特徴とするクロマトグラフィー分離方法。
【請求項２】前記クロマトグラフィー樹脂が前記溶液が
順次循環される互いに上下に重ね合わされた２ないし５
段を含むほぼ垂直な塔内に配置され、前記溶液の交換が
最上部の段の上方部分において溢流によって行われ、最
上部の段以外の各段は前記開口を有する分布装置によっ
て境界され、一方の分布装置が溶液を当該段の底部にお
いて分布させ、他方の分布装置が溶液を当該段の直接上
方に位置する段に向けて分布せしめる、特許請求の範囲
第１項記載の方法。
【請求項３】前記塔の内部に対する溶液の流量が少くと
も選択的に、固定を行う相の間、実質的に一定であっ
て、流量の公称値に対する流量の変化が±５％以内であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項の
いづれか１項に記載の方法。
【請求項４】それぞれの前記開口を有する分布装置をプ
レート間に間隔をおいて重ね合わせた少くとも２つのプ
レートを含み、該プレートはそれぞれ開口を有し、１つ
のプレートの開口が隣接するプレートの開口に対して位
置をずらされていることを特徴とする特許請求の範囲第
１項、第２項又は第３項のいづれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記クロマトグラフィー樹脂が１つの段か
ら他の段に対する循環が行われないように塔の各段に閉
じ込められていて、流動化されたベッドによる分離が前
記塔内の選択的固定、抽出および洗浄のサイクルによっ
て行われることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第
２項、第３項又は第４項のいづれか１項に記載の方法。
【請求項６】前記クロマトグラフィー樹脂が、前記塔内
にて低い位置にて連続的に循環せしめられ、上部にて樹
脂を連続的に供給され、底部にて連続的に交換されて、
同時に前記塔の外部への洗浄、抽出および洗浄の作動を
伴って前記流動化されたベッドによる分離が前記塔内に
おいて連続的に行われる、特許請求の範囲第１項、第２
項、第３項又は第４項のいづれか１項に記載の方法。
【請求項７】前記クロマトグラフィー樹脂が、前記溶液
が順次循環される互いに上下に重ね合わされた２ないし
５段の段を含む、ほぼ垂直な塔内に配置され、前記溶液
の交換が上部の段の上方部分にて溢流によって行われ、
前記上部の段を除く前記各段が前記開口を有する２つの
分布装置によって境界され、一方の分布装置が溶液を当
該段の底部において分布せしめ、他方の分布装置が溶液
を当該段の直接上方に位置する段に向けて分布させるよ
うになされ、前記塔の互いに重ね合わされた２つの段の
間に、前記分布装置を横切って上部の段のベッドの上部
と下方の段のベッドの底部との間に延長する樹脂の流過
管を配置し、前記樹脂が該管内を上方の段から下方の段
に向けて溢流によって循環するようになされている特許
請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】前記各段において、前記樹脂のベッド内
に、上方の段に連通する管のオリフィスと下方の段に連
通する管のオリフィスとの間に配置される少くとも１つ
のそらせ板を配置し、その段の樹脂の完全な更新を確実
にする特許請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】前記流過管は、与えられた段について管内
に形成された流動化された樹脂ベッドが上方の段におけ
る管に溢流しないように前記塔内に配置されている特許
請求の範囲第７項又は第８項のいづれか１項に記載の方
法。
【請求項１０】乳漿の蛋白質のクロマトグラフィー分離
のための特許請求の範囲第１項ないし第９項のいづれか
１項に記載の方法。
【請求項１１】75ないし300ミクロンの範囲の粒子寸法
の「スフェロシル」の型式のクロマトグラフィー樹脂を
使用して、該樹脂が予め濾過されており、前記平均値の
寸法の粒子の拡散が50％に等しいようになされている、
乳漿の蛋白質βラクトアルブミン、αラクトアルブミン
の抽出のための特許請求の範囲第10項記載の方法。