JPS61225197A - 生体高分子のクロマトグラフィー分離方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、探究される１つ又はそれ以上の生物学的巨大
分子の濃厚溶液を得る為に、クロマトグラフィー即ち蛋
白質、酵素、毒素、抗体等のような生物学的巨大分子の
選択的吸着を重要な特徴とするような吸着工程によって
分離するのを可能になす方法に関する。

従来技術 例えば生物学的巨大分子のような成る種の生物学的分子
は、５０００より大なる甚だ高い分子量及び生物学的活
性又は例えば蛋白質をペプチッドに変質させるような機
能的な能力を失わすようになす変質を生ずる傾向を特徴
とし、このような特性は純化（沈澱、超微粒子濾過及び
クロマトグラフィー）の為の工業的規模に於ける有用な
分離方法を制限するのである。クロマトグラフィー（選
択的吸着）方法は実際上高い純度の生物学的巨大分子を
工業的規模で生産する為に最も特徴があり最も適当な製
造技術を構成するものである。

このような方法は生物学的巨大分子の選択的吸着を生じ
させるのに適した特定のクロマトグラフィー樹脂の固定
されたベッドを横切って生物学的巨大分子を含む溶液の
濾過を行うことに利用されるのである。１つ又はそれ以
」二の探究される巨大分子が樹脂上に固定される場合に
は、ｐＨ即ち適当なイオン力の溶液による樹脂の溶離が
巨大分子を分離させ、純化させて濃縮されるのを可能に
なすのである。、探究される巨大分子が処理溶液内に留
まる（他の巨大分子が樹脂上に固定される）場合には、
探究される巨大分子を直接に分離することが出来る。

固定されたベッドによるクロマトグラフィー技術及びそ
の性能は生物工学の分野では公知であり、その例を示す
次のような文献が特に参照されるのである。

「プラズマ蛋白質分別方法」、ジェー・エム・カーリン
グ、アカデミツク・プレス、１９８０年第１４９−１６
０頁、 「イオン交換による蛋白質の回収」、ディー・ティー・
ジョーンズ　ビーニスシー、フード・プロセシング・イ
ンダストリー、１９７５年４月、第２１．２３頁、 「乳米の新しい評価方法」、ビー・ミラベル、ロース・
ブーランク・アンデュストリー、アンフォルマション・
シミー、第１７５ゴウ、１９６７８年３月、第１０５−
１０９頁、 「仏画時第２，３２Ｌ９３２号及び第２，３５９，６３
４号」（蛋白質を分離する為の新しいイオン交換樹脂を
記載）、 併し、これらの固定ベッドによるクロマトグラフィー分
離方法の最大の欠点は、ベッドの閉塞が次第に生ずるこ
とであって、このような閉塞は実際上溶液内に懸濁状態
で存在する固体の不純物、大抵はこのような固体の不純
物の成る成分の沈澱によって生ずるのである。その結果
は、工業計画に対して著しく重大なことである。時間の
経過につれて濾過される流量を一定に保つ為に、溶液の
流入圧は、公称値よりも３−４倍程度大きくしなければ
ならず、このことは技術的に著しい困難を生じさせ、又
は成る応用分野では実施不可能になすのである。更に、
クロマトグラフィー樹脂の周期的な清掃は実際上著しく
デリケートな作業であり、通常は分離された囲いの中で
洗浄するようになされるが、このことは設備の連続的な
作動に対して障害となると共に、デリケートな費用のか
−る作業になるのである。注目すべきことは、一般に無
機材料である成るクロマトグラフィー樹脂の支持体が脆
く、良好な性能を与える為の清掃の際に割れる恐れがあ
り、従ってベッドの成る部分に障害を与える恐れがある
ことであって、又一般に有機材料である他のクロマトグ
ラフィー樹脂は目詰りを生じた時に清掃を行うことが出
来ず、廃棄しなければならないことである。成る場合に
は、閉塞を生ずると、ベッドが全体的に固化して清掃が
出来なくなるのである。このような閉塞の他の著しく有
害な結果は多回数の清掃の後で樹脂ベッドの固定能力が
劣下することであり、たとえ慎重に用心しても、若干の
量の不純物がクロマトグラフィー樹脂上に固定されて保
持され、クロマトグラフィー樹脂の固定能力が次第に減
少して廃棄しなければならなくなるのである。

このような困難は生物学的クロマトグラフィーの専門家
には公知のことであって、多くの場合処理の前に溶液を
著しく洗浄しなければならないのである。このような洗
浄はこの方法のコストを著しく増大させる要因であって
、価値の高い製品（医薬品等）を得る為のこの方法の応
用面を制限し、多くの応用面に於ける有用性を奪い、巨
大分子生成物の価値を減少させるのである（生物学的な
超厚の成る天然生成物又は工業的二次生成物特に農業食
品の処理）。

固定ベッドによるクロマトグラフィ一方法の他の欠点は
、樹脂が受ける圧縮及び洗浄の中間的な種々の処理及び
閉塞解除によってによって生ずる拘束により充分に速く
破壊されるようになる樹脂の短い寿命である。

実際上、上述の困難な問題は解決されておらず、又は生
物学的巨大分子の場合に生ずる大なるコストの増加を伴
わなければ解決されないのであって、薬剤学、獣医学等
の分野のみでなく、食品の分野にも関係するこの型式の
処理の経済的な重大性を考慮して、生物学的巨大分子を
分離する為にクロマトグラフィ一方法の性能を完全に活
用出来るようになす為に上述された有害な結果を最少限
になすことを試みる為に多数の研究が行われて来たので
ある。このようにして成る著者は、洗浄及び清掃の後で
一方の端部から樹脂を取出して他端から投入するように
してバンド毎に移動されるベッドによって構成される可
動の充填ベッドを利用することを推奨している（ディー
・ジョーンズ。ビーニスシー、「イオン交換による蛋白
の回収」）。

それにも拘わらず、応用面に於ける一般的な満足な解決
方法は現在まで発見されておらず、例えばクロマトグラ
フィー樹脂の清掃の必要性、固定能力の変化及び劣下の
ような若干の重大な欠陥が常に存在したのである。

併し、その後長い間、他の技術の分野及び特に鉱物質の
分離の分野に於ては閉塞を回避し、樹脂の劣下を減少さ
せる流動体化されたベッドによるクロマトグラフィ一方
法を実施して来た。即ち金属イオンの分離、「連続的な
イオン交換塔」、ターナ−及びチャーチ、トランザクシ
ョン・インスティテユーション・ケミカル・エンジニア
リングズ、第４１巻、１９６３年第２８３−２８８頁、
ウランの抽出、「流動体化ベッドのイオン交換設備の評
価」、ミカエル・ディー・スレイター、シアーナル・ア
プライド・ケミカル・バイオチクノロジー、１９７５年
、第２５巻、第３６７−３７８頁。

大きさの小さい分子（良好な安定性を有する）を分離す
る為のこれらの流動体化ベッドによるクロマトグラフィ
一方法は２０年以上前から公知である。併し、生物学的
技術者はこれを生物学的巨大分子のクロマトグラフィー
分離の為に利用することを試みなかった。何故ならば、
この技術は常に多少とも客観的な種々の理由の為に、こ
の種の処理には適用不可能であると思われていたからで
ある。若干の理由は、専門家の考えでは、生物学的巨大
分子（甚だ微量の粒子測定量、水の密度に甚だ近い密度
、不適当な物理的性質）に特定的な型式のクロマトグラ
フィー樹脂に対して、これが流れの中に粒子を随伴させ
なければ流動体化が不可能であることに起因している。

他の理由は、特に甚だ大なる関ｗＡ間容積の為にこの方
法を実施不可能になすような流動体化ベッドの能力の劣
下を生じさせる生物学的巨大分子を固定する動力学に起
因するのである。更に他の理由は、溶液を流動体化され
たパッドを横切って導くこと（工業的な生産に適用不可
能）を必要とする極微速度に起因している。

従って既に１９８０年には、優れた生物学的技術者が既
に述べた刊行物「プラズマ蛋白質分別方法」、ディー・
エム・カーリング、第１５２頁に記載しているような予
測が人間の精神に充分に定着していたのである。以下に
その翻訳を示す。

［我々は、どちらかと言えば流動体化ベッドによる塔よ
りも固定ベッドによる塔を選ぶ。流動体化は上昇する濾
過の流れ及びこの上昇力の下で平衡を保つために充分に
蜜な大きい粒子の流れを与える。併し、蛋白質の分別の
為に自由に処理出来　、るゲルは稀にしか水よりも蜜で
なく、流れと同じ僅かな速度の著しく希薄な懸濁物を与
える。更に、巨大分子の拡散が遅い為に粒子の大きさ及
び間隙容積の大きさが多孔部の内部容積内に液体素子の
浸入の確保を向上させる為に、出来るだけ小さくなけれ
ばならない。固定ベッドは塔の容積を最小限になし、水
の消費を経済的になす。これらの総ての議論は財政上の
結果を有し、一般的な方法論を選択する時に無視するこ
とが出来ない。これらの総て要求によって生物学的工業
に於てクロマトグラフィ一方法を実施することは並外れ
た機械的な品質を有する特別の支持体を必要とする。こ
れらのものは最も小型の形態の塔内で使用される時に殺
菌性でなければならず、毎日の処理溶液量が数百又は数
千リッターの場合に甚だ大なる速度を可能としなければ
ならない。」 注目すべきことは、甚だ古い２つの特許（１９６６年５
月６日の英国時第１，１４８，６６１号及び１９７０年
９月１７日の仏画特許第２．１０５．０３２号）が、一
方は固定、流動体化ベッド又は開放された塔による生物
学的分子のクロマトグラフィーを、他方は生物学的物質
の純化の応用を可能として引用して硬水又はウランの塩
の純化の為の流動体化ベッドによるイオン交換を述べて
いることである。併し、これらの特許は前述で述べた予
測を形成するのを妨げるには不適当であることを知って
いる。実際上、固定ベッドでも流動体化ベッドでも又は
開放された塔であっても授乳状態で処理を行うことを目
的としている最初の特許は単に大きさの小さい分子、コ
ディン及びアトロピンのクロマトグラフィー分離の２つ
の例を記載しているのみであって、その他の点ではこの
特許は一般的な記載の部分で可能な応用面のリスト、即
ちホルモン、ビタミン、アルカロイド、総てが一部成る
ホルモンの小さい分子である抗生物質的を参照している
ものである。

第２の特許は独特の例として塩を除去する為に硬水の純
化及びウランの塩の純化を示していて、この特許は一般
的な冒頭の記載で生物学的物質に対するイオン交換工程
の応用可能性を記載していて、単なるイオン交換工程が
大きさの小さい分子にしか応用出来ないことを知ってい
る（特別の型式の選択的クロマトグラフィー樹脂を介在
させるクロマトグラフィ一方法とは反対）。

発明の目的 本発明は生物学的技術即ちバイオテクノロジーの分野の
生物学的巨大分子のクロマトグラフィー分離の実際の技
術を改良することを提案するものである。本発明は５０
００よりも大なる分子量の蛋白質、酵母、毒素、抗体の
ような分子のクロマトグラフィー分離を企図するもので
ある。

本発明の木質的な目的は生物学的巨大分子に対してベッ
ドの閉塞による分離の重大な欠点を回避してクロマトグ
ラフィー分離を実施するのを可能になすことである。

前述の本発明の目的に関係する他の目的はベッドを構成
する樹脂の粒子の損耗及び劣下を著しく減少させること
である。

更に他の目的は分離を連続的になし得るようにすること
である。

又更に他の目的は特に、農業的食品の工業的な蛋白質の
二次製品でも、又は乳、血液、血漿又は血液の血清でも
、又は合成生成物でも何れのものであっても、これらの
もの＼評価を確実になす目的で、大なる分子量の甚だ多
数の固体に対して工業的な規模で応用し得るような経済
的に生物学的巨大分子のクロマトグラフィー分離を行う
ことである。

光ｙ坏υ」！ 上述の目的を達成する為に、溶液中に含まれる生物学的
巨大分子のクロマトグラフィー分離を行う為の本発明に
よって企図される方法は選択的な吸着を行う為に、分離
される巨大分子に対して特定的な選択的クロマトグラフ
ィー樹脂のベッドに溶液を接触させることを含む型式の
ものであって、この方法は、 第１図の線図のハンチングされていない領域Ｚ内に位置
するような値の平均粒子寸法Ｇ８及び容積質量Ｍｖを有
するクロマトグラフィー樹脂を使用すること、 下記の特性を与えるような穿孔された分布装置を底部に
設けられた少なくとも１つの段を含む塔の内部に前記ク
ロマトグラフィー樹脂を配置すること、 即ち、 開放された部分の割合が大体０．１％乃至１０％の範囲
にあり、 前記開放された部分の平均直径が約３００　ミクロン以
上であり、且つ、 前記開放された部分の平均直径が大体２Ｇｍ乃至２０Ｇ
ｍの範囲にある、 ような特性を与えるようになっていること、前記クロマ
トグラフィー樹脂のベッドを流動体化するように前記基
の各段に対して前記分布装置を横切って前記溶液を供給
し、その際にＶｍｆを前記樹脂の流動体化の為の最小速
度として大体１．５Ｖｆｆｌｆ乃至１２■１の範囲の液
体の直線的速度を前記塔内に得られるように（全横断面
積に戻すように）前記溶液の流量を調節すること、 を特徴とするものである。

樹脂の平均粒子寸法Ｇ１は通常のように次の式によって
定義される。即ち こ５にｘｉは粒子寸法Ｇｉを有する粒子の一部分の質量
である。

このようにして古い技術の教義では予期し得ないような
方法で、クロマトグラフィー樹脂及び溶液の分布に対し
て上述した条件（分布の状態、供給速度）を組合せて流
動体化ベッドによる選択的吸着によって生物学的巨大分
子のクロマトグラフィー分離を実施することが可能なこ
とが確認されたのである。以下に示される実施例のよう
に、驚くべきことには、流動体化ベッドによる方法がク
ロマトグラフィー樹脂の交換能力を減少させることがな
く、しかも材料の選択的な搬送能力が固定ベッドにより
得られたものと全体として実質的に同一に保たれたので
ある。

第１図の線図で限界曲線Ｃ及び２つの直線り。

及びＤ２の間に含まれた水平の領域に対応する７５乃至
３００　ミクロンの平均粒子寸法Ｇ１のクロマトグラフ
ィー樹脂を選ぶのが望ましい。粒子の拡散が過大でなく
、前述の樹脂の予めの篩分けが望ましくは拡散を平均値
Ｇｍの大よそ約５０％に制限するようになすのが有利で
あることが確認されている。

その他の点で、本発明の望ましい実施態様によれば、ク
ロマトグラフィー樹脂は溶液によって順次循環される重
ね合された２乃至５の段を含む大体垂直な塔内に配置さ
れ、前記溶液の交換が溢流によって上部の段の上方部分
で行われ、各段（上部の段を除く）が穿孔された２つの
分布装置によって境界されて、一方の分布装置が今考え
ている段の底部にて溶液を分布させ、他方の分布装置が
溶液をこの段の直接上方に位置する段に向って分布させ
るようになすのである。

クロマトグラフィー樹脂の全体的な量に対しては、流動
体化ベッドを多数の段に分割することが与えられた時間
内の分離性能を著しく改善し、固定ベッドにて得られる
性能に近付くのを可能になすことが確認されている。こ
のような現象は、固定ベッドに於て当然存在するが、単
に１つの段のみしか有しない流動体化ベッドにては存在
しない分離に対して有利な濃度勾配を実現する事実によ
って説明出来るのである。

このようにして、本発明の方法は、総て本発明の型式の
ような従来のベッドの欠点即ち閉塞及び清掃の必要性、
圧縮及び清掃によって生ずる樹脂の劣下の重大な欠点を
排除して固定ベッドによる方法の性能を実質的に達成出
来るようになすのである。実際上、本発明の流動体化ベ
ッドは閉塞の危険を生ずることなく溶液の不純物を自由
に通過させるのを可能にし、如何なる清掃をも不要にな
して樹脂の寿命を著しく増大させるのである。

更に、本発明の方法は清掃によって生ずる拘束を受ける
ことがないから連続的に実施することが出来、クロマト
グラフィー樹脂は塔内の底部の位置で連続的に循環され
ることが出来、樹脂を高い位置で連続的に供給され、底
部で連続的に交換されることが出来、洗浄、抽出及び塔
の外部に於ける洗浄作業を同時に行って流動体化ベッド
による分離が塔内で連続的に行われるのである。

単に蒸溜水又はその他の溶液による濯ぎより成る古典的
な洗浄作業、又は再生溶液を通過させることより成る抽
出作業と、公知の方法に於て樹脂のエネルギー的な機械
的な処理を必要とし、樹脂の劣下及び連続的な作業の困
難の原因である清掃又は閉塞解除作業とを混合しないよ
うになすのが適当である。

重ね合された２つの段の間にクロマトグラフィー樹脂を
循環させることは、流過管によって確実になされること
が出来るが、この流過管は樹脂が溢流によってこの流過
管内を上方の段から下方の段に循環するのを可能になす
ように配置されるのである。

更に、死んだ領域を生じないように各段から樹脂を完全
に交換するのを確実になす為に１つ又はそれ以上のそら
せ板が各段に配置されるのが望ましい。

判るように、本発明の方法は、場合によって、不連続的
に実施することも出来、その時にはクロマトグラフィー
樹脂が１つの段から他の段に循環しないように塔の各段
に閉じ込められて、流動体化ベッドによる分離が塔内に
於ける選択的な固定、洗浄、抽出及び洗浄のサイクルに
よって行われるようになされるのである。このような実
施方法は既に述べた理由によって固定ベッドによる分離
に比較して有利であり、特に閉塞排除の為に塔を分解す
る必要がないのである。

連続的及び不連続的な２つの実施方法の場合に於て、塔
の内部に対する溶液の流入量が少なくとも選択的固定の
位相の間に実質的に一定で、公称値に対する流入量の変
動が±５％以内であるようにして塔に供給を行うのが有
利である。

このような実施方法は事故による粒子の随伴の危険を伴
うことなくクロマ１−グラフィー樹脂の安定した流動体
化を行うのを保証するのである。

本発明の方法は総て生物学的巨大分子の分離の為に一般
的に応用可能であり、当業者には夫々の応用分野で選択
的クロマトグラフィー樹脂（第１図の線図によって与え
られた容積当り質量及び粒子寸法の条件）を選択し、前
述の樹脂の粒子寸法に適当な穿孔された分布装置（既述
の開放された部分の直径の条件）を製造することが出来
るのである。

特に、本発明の方法は乳漿の蛋白質のクロマトグラフィ
ー分離に応用出来、使用される樹脂は会社「ロース・ブ
ーランク」によって「レジーヌ・スフェロシル」の名称
で販売され、仏画特許第２゜３２１．９３２号に記載さ
れている型式の樹脂になすことが出来、この樹脂は第１
図の線図によって与えられる仕様に一致している。

制限を与えない例として本発明の方法の実施例を示す以
下の説明は一方で不連続的な設備（例１及び２）を、他
方では連続的な設備（例３）を示していて、これらの設
備は添付図面に示されている。

発明の実施例 実施例として第２図及び第３図に示されている設備は固
定位相と、洗浄位相と、抽出位相と、新しい洗浄位相と
を交代的に行う周期作動の方法による生物学的巨大分子
のクロマトグラフィー分離を確実になすようになされた
ものである。

これらの種々の位相の進行中に、特定のクロマトグラフ
ィー樹脂は符号３又は４のような複数の段を有する垂直
な塔１内に閉じ込められている。

実際上３つ又は４つの段が設けられることが出来る。

塔１は支持部２を含み、この支持部は溶液を下方の段３
に向って穿孔された分布装置を横切って分布させること
が出来るようになっている。この分布装置は総ての段に
対して同様のものであって第３図に５として拡大尺度で
示されている。

この分布装置５は穿孔された２つの円筒形のプレート６
及び７（場合によっては更に多くのプレートの数）を含
み、これらのプレートは互いに上下に配置され、プレー
ト間に間隔片８によって保有される空間を有する。

プレート６及び７は穿孔部６ａ及び７ａを設けられ、こ
れらの穿孔部が１つのプレート及び隣接するプレートに
於て位置をずらされるように配置されている。

プレートの穿孔部の分布の密度は、開放された部分の割
合が０．１乃至１０％の範囲で、特に後述される実施例
に於ては５％に等しくなされている。

前述の開放された部分の割合なる用語によって慣習上プ
レートの有効面に対する開放された面の合計の横断面積
の比率を意味する。

更に、各プレートの穿孔部は、夫々の穿孔部が３００　
ミクロン以上の直径を有するようになされている。入口
の上方で穿孔部の直径は使用される樹脂の平均粒子寸法
ＧＩＩに適応されていて、４Ｇｍ乃至６０ｍ程度の値が
更に良好な結果を与えるように思われる。例えば例とし
て挙げた「スフェロシル」樹脂に対しては１ｍｍに等し
い直径の穿孔部を有するプレートを使用するのである。

プレート６及び７はその縁部をボルト止めされる環状フ
ランジ９によって緊締されて保持されている。円筒形の
段３又は４又は底部２ばその周囲をこれらのフランジの
環状内面に接着されている。

更に、符号１０によって示されるような環状の接合部が
一方ではプレートの間の、又他方ではフランジとプレー
トの周囲との間の蜜封作用を保証している。

溶液（固定位相の進行中の処理溶液、洗浄の進行中の蒸
溜水溶液又は抽出位相の進行中の再生溶液）は導管１１
を通って底部２に進入する。正確に一定な流入量を保証
する為に、これらの溶液は容器１２（処理溶液又は再生
溶液）及び容器１３（蒸溜水溶液）内に入れられるが、
これらの容器は塔Ｉの上方の適当な位置に配置され、所
望の流量を供給出来るようになされる。流量計１４及び
ダイアフラム１５がこの流量の制御を行うのを可能にな
す。

処理溶液は貯槽１６内に貯蔵され、この貯槽内で溶液が
攪拌されて制御された温度に保持されるのである。再生
溶液は同じ条件で貯槽１７内に貯蔵される。蒸溜水は貯
槽１８内に貯蔵される。塔を出た溶液は貯槽１９内に貯
蔵される。ポンプ２０及び導管及び堰板装置が各位相の
間に貯槽１６−１８から出る適当な溶液を容器のレベル
が実質的に一定になるようにして容器１２及び１３に供
給するようになっている。

上述の装置は流量の変動が実際上±５％以内になるよう
にして塔１に溶液を供給するのを保証する。

塔１の出口にて液体は上方の段の高い部分で溢流によっ
て集められ、一時的に貯槽１９に貯蔵される。

その他の点で、第４図は前述の実施例に対して連続的な
作動を可能になすように修正された設備を概略的に示す
。この実施例に於て、塔、穿孔された分布装置及び一定
の流量で液体を供給する装置は同様のものである。

併し、この実施例の設備に於ては、クロマトグラフィー
樹脂は連続的に１つの段からその下方の段に順次に循環
されるようになされ、洗浄位相及び抽出位相は塔の外部
で行われるようになっていて、抽出位相が連続的にクロ
マトグラフィー固定を行うようになされている。

この設備に対して行われた修正は次の通りである。

第５図に示されるように、塔の２つの互いに上下に重ね
合された段の間に、穿孔された分布装置を横切る樹脂の
流過管２１が配置されている。この管は上方の段のベッ
ドの上部２１ａと下方の段のベッドの底部２１ｂとの間
に伸長している。このようにして樹脂は溢流によって順
次１つの段からその下方の段に種々の管２１を通って循
環出来るのである。

このような溢流を可能になす為に、夫々の流過管２１は
各段に於て今考えている段の下方の高さＨＢからベッド
のない部分の高さＨ８まで貫通している。このようにし
て導管２１の内部に形成される流動体化された樹脂のベ
ッドが上方の段の管に溢れ入ることがなく、このことが
１つの段から下方の段に樹脂が重力によって循環する条
件を構成するのである。

更に、各段に対して、そらせ板２２が今考えている段に
対して貫通している２つの管２１の２つのオリフィス（
上方の段に連通ずる管の下方のオリフィス２１°ｂ及び
下方の段に連通している管の上方のオリフィス２１ａ）
の間に配置されている。

各間２２は管２１を取巻く管状のスリーブによって構成
されることが出来、このスリーブはオリフィス２１ａの
高さの上方の部分に伸長して、下方の部分で樹脂の通路
２２ａを保護している。

上方の段から流入してオリフィス２１゛ｂを通って出て
来る樹脂は負荷即ち吸着が少なく、従って一般的に更に
軽く、ベッド内で上昇する傾向を有し、オリフィス２１
゛ｂ及び２１ａの間で樹脂の短絡を生ずるのを回避し、
又樹脂が交換されないようになっている。ベッドの死ん
だ領域を縮小させて、このようにして樹脂の完全な交換
を保証する（注目されることは、成る樹脂及び固定され
る成る巨大分子に対しては樹脂の容積当り質量が交換の
間に変化せず、この場合、そらせ板はそれ程重要ではな
いが、全体的な固定の均一性を良好になすのである）。

併し、塔の底部に於て、下方の流過管２３は供給支持部
を貫通し、樹脂の推進用流体圧作動装置２４に組合され
、この実施例では回収貯槽２５にけけされている。この
貯槽の樹脂は同様に流動体化ベッドとして作用出来る外
部の塔内で再生されるが、この外部の塔に対する推進は
連続的に為されるように保証されている。

再生されたクロマトグラフィー樹脂は再生塔から連続的
に移送装置によるか、又は手動による供給によって貯蔵
容器２６内に導入されるようになっている。蜜封状態に
閉鎖されたこの容器はｆ４溜水を充満されていて、堰板
及び流量計を含む導管２７を経て蒸溜水を供給されるこ
とが出来るようになっている。

樹脂は流体圧作動により管２８を経て真空ポンプに組合
されたベルトコンベアー２９に向って移送されて樹脂の
粒子を取囲む水を除去するようになされる。

ベルトコンベアー２９は再生された樹脂を調節可能な流
量で頂部漏斗を設けられた上部の流過管２１内に供給す
る。

例１及び２は第２図に示された型式の設備に対して実施
されるようになっていて、例３は第４図及び第５図に示
される型式の設備に設けられるようになっている。

肛 この例の設備の塔は３つの段を存し、各段の高さは５０
ｃｍで、塔の直径は５ｃｍであった。

この例は、［フロマジェリー・ベル］によって作られる
チーズの生産時の残留物である甘味乳漿（ｕｎ　ｌａｃ
ｔｏｓｅｒｕｍ　ｄｏｕχ）のβラクトアルブミン（二
量体の形状の分子量：　３４０００　）及びαラクトア
ルブミン（１４０００）のアルブミンの抽出を目的とす
るものである。

使用されるクロマトグラフィー樹脂は「ロース・ブーラ
ンク」によって作られた樹脂［スフエロシルＱＭＡＪで
ある。最初の粒子寸法の分布は１００乃至３００μｍで
あった。２００乃至２５０μｍの粒子範囲即ち平均粒子
寸法ＧＩＩ＝２２５μｍの粒子範囲を保持するように乾
燥状態で篩分けを行うのである。樹脂［スフェロシルＱ
ＭＡＪの容積質量はＭｖ＝　１４００ｋｇ／ｍ’である
。前述の樹脂の特徴とする値の組合せ（Ｇｍ　、Ｍｖ）
は第１図の線図上の点Ｒで示されている。

この樹脂は２５ｍ”／ｇの球面、１２５ＯＡの多孔部の
平均直径及び１　ｃｍ３／ｇの多孔部容積を有する球状
粒子によって構成された樹脂であって、これらの粒子は
次の機能グループを有する網状スチレンビニルトリエポ
キシシラン（ｓｔｙｌｅｎｅ　ｖｉｎｙｌ　ｔｒｔｅｔ
ｈＯＸｙｓｉｌａｎｅ）重合体によって被覆されている
。

即ち Ｈ３ Ｈ３ このような樹脂の流動体化の最小速度はｖｌＩｆ＝１＋
、１０−’ｍ／ｓで ある。

この塔の各段の分布装置の開放された部分の平均直径は
これらの条件に於て大体４Ｇイに相当する。

各段に配置される樹脂の量は１３０ｃｍ’である。

この塔は、設置されている供給装置（定められた高さに
配置された供給用貯槽）の特性によって公称値に対して
５％以上の変動を生じないようにして９１／ｈに等しい
溶液の流量にて塔の底部にて乳漿を供給されるようにな
っている。

１．９６．１０−３ｍ”の断面の塔の流量はＬ　３．１
０−”ｍ／ｓ即ち９ｖ、、ｆに相当する。

この流量が確立された時に、各段のベッドが６４％の膨
張を受け、２０ｃｍの高さを示すことを確認した。又視
認によって安定した良好な流動体化を確認した。

塔の入口にて乳漿は次の濃度、即ちβラクトグロブリン
が３．０ｇ／ｌでαラクトアルブミンが１．２ｇ／ｌを
示した。

この方法は２時間実施された。第７図は、時間の関数と
して最初の濃度Ｃ６に対する各段に於ける出口の濃度Ｃ
の比率を与える曲線を示し、曲線α０、α２及びα３は
下方の段、中間の段及び上方の段の夫々出口に於けるα
ラクトアルブミンに対するＣ　／　ＣＯの変化を示す。

曲線β１、β２及びβ３は下方の段、中間の段及び上方
の段の夫々出口に於けるβラクトグロブリンに対するＣ
／Ｃ０の変化を示す。測定は酢酸セルロース膜上の領域
の電気泳動による合計３分間の採取によって行われた。

３０分間にβラクトグロブリン及びαラクトアルブミン
は樹脂上に総て固定され（曲線的α３及びβ３の最初の
段階）、次いでβラクトグロブリンのみが１５分間続い
て吸着されると共にαラクトアルブミンは塔の出口から
流出していた。

固定作用が終了した時に（Ｃ／Ｃ，＝１）　、約２０分
間蒸溜水で洗浄を行った。

樹脂は２時間の間０．Ｉ　Ｎの塩酸溶液によって抽出さ
れた。

然る後約１時間の間蒸溜水で新たに洗浄が行われて塔は
次のサイクルの準備がなされた。

これらの総て作動の聞く洗浄、抽出）に、塔の樹脂は同
様の流動体化を与えられた。

抽出位相から排出された蛋白質の量はβラクトグロブリ
ンに対して１０．５　ｇで、これは乾燥した樹脂のグラ
１１当り１０２ｍｇの固定を示し、αラクトアルブミン
に対して１．７ｇの固定を示し、これは乾燥した樹脂の
クラム当り１６．５ｍｇの固定を示す。従って抽出物は
βラクトグロブリンを８６．１％、αラクトアルブミン
を１３．９％含んでいた。利得即ち出発物（乳漿）の生
成物内の蛋白質の相対的比率はβラクトグロブリンが７
１％で、αラクトアルブミンが２９％であった。従って
βラクトグロブリンに冨むものになった。

これらの蛋白質を含む抽出生成物は最初に乳ツｋに含ま
れていた乳糖、カゼイン精製物及び鉱物質塩を除去され
、蛋白質は純粋で自然の状態（変質しない）であった。

３つの段の流動体化されたバンドの樹脂「スフェロシル
ＱＭＡＪの固定能力は以前の作業の際の固定のパッドに
よって得られたものと実質的に同様であった。この点に
関しては次の文献を参照すべきである。

スカソダー・ピー・ジェー。

「多孔性シリカ　−　基体イオン交換媒体を使用した時
のチーズからの蛋白質の回収及び分別」、ケミストリー
・アンド・インダストリー、２１．８１プルショア・セ
・エム及びルロー・ぺ 「動物の蛋白質（人間の食物に於ける濃縮抽出物及び個
体物）、第３章、コレクシ田ン・スイアーンス・テクニ
ク・アグロ〜アリマンテール、ラヴオアジェー（ＤＲ） 上述の論文は、バンドの位置又は分布装置の位置の何等
かの閉塞を確認しないで数十回更新されているが、注目
すべきことは、使用された乳漿が自然の状態で懸濁状態
の固体不純物を含んでいることである。

更に、樹脂の効力の何等かの減少も観察されず、樹脂の
何等かの劣下も見られなかった。

■１ この例は例１と同様の条件で行われたが、異なることは
各段に配置された樹脂の量が１１０ｃｍ’であったこと
である。

流量が確立された時に、各段のベッドが６９％の膨張を
受け、１８ｃｍの高さを示したことを確認した。

又視認によって安定した良好な流動体化を確認した。

入口に於て、乳漿は例１に於けると同様の濃度（３，０
ｇ／βのβラクトグロブリン及び１．２ｇ／７！のαラ
クトアルブミン）を示した。

処理方法は２時間の間実施された。第８図は時間の関数
として最初の濃度Ｃ８に対する各段の出口に於ける濃度
Ｃの比率を与える曲線を示す。

例１よりも重要でない各股上の樹脂の量、一方に於て２
つの蛋白質の全部が吸着される間及び他方に於て引続い
てβラクトグロブリンのみが吸着される間の継続時間が
例１に於けるよりも短い（夫々１５分間）ことを確認し
た。

例１に於けると同様に洗浄、抽出、洗浄を順次行った。

抽出によって得られた蛋白質の量は、βラクトグロブリ
ンに対して乾燥状態の樹脂のクラム当り１１０ｍｇで、
αラクトアルブミンに対して乾燥状態の樹脂のクラム当
り１９．５ｍｇであった。従ってこの抽出物は８、９％
のβラクトグロブリン及び１５．１％のαラクトアルブ
ミンを含んでいた。実験的及び分析的な誤差については
、その比率は例１について観察されたと同様であった。

炎１ この例は既述の設備にて実施されたが、第４図及び第５
図に示されていて、塔は夫々高さが６０．５ｃｍの３つ
の段を含んでいた。

この例は、「フロマジエリー・ベル」によって、・　１ 作られるチーズの生産の残留物である甘味乳漿のβラク
トグロブリン及びαラクトアルブミンのアルブミンを抽
出するのを目的とした。

使用された樹脂（「スフエロシルＱＭＡＪ　）は例１に
於けると同様の特徴を示した。

塔の各段の分布装置の開放された部分の平均直径は４Ｇ
□であった。

塔の底部の高さの樹脂を搬送するのに役立つ接続管は１
．４ｃｍ以下の直径を有し、ＨＢ　＝　２５ｃｍの高さ
にて各段を貫通している。

塔内に導入される樹脂の流量は０．１４　Ｉｌ／ｈに保
たれた。

塔の底部で樹脂を排出する装置はタイマーによって制御
される３つの電磁的堰板を含んでいた。

固体粒子は上部の開放された堰板を通過して柔軟なプラ
スチック管内に集められる。全部で２０秒間に上部堰板
は閉じられると共に下部の堰板と共に同時に開放される
横方向の堰板が蒸溜水を噴射し、蒸溜水は粒子を伴って
下方に向って流れるのである。

塔は底部にて９ｊ！／ｈに等しい溶液の流量にて乳漿を
供給されるが、この流量は例１に於けると同様に制御さ
れた。

流量が確立された時に各段のベッドが今考えている段の
上方の接続管の突出部ＨＢの高さに対応する２５ｃｍの
高さを示した。

各段は高さ６０．５ｃｍを有し、１つの段の接続管内に
保持される流動体化されたパッドの高さが直接上方の段
の流動体化されたパッドの高さよりも小さい高さを有し
ていて、このようにして上方の段の樹脂が溢流するのを
阻止するようになっているのである。

視認によって安定した良好な流動体化及び固体及び液体
の２つの相の良好な循環を確認出来たのである。

入口に於て、乳漿は次の濃度を有していた。

即ちβラクトグロブリンが３．０ｇ／ｊ！でαラクトア
ルブミンが１．２ｇ＃！であった。

今考えられている例に対する連続的な作動方法は３時間
の間実施された。第９図は時間の関数として最初の濃度
Ｃ０に対する各段の出口に於ける濃度Ｃの比率を与える
曲線を示す。

本発明の作動は作用の静止状態を得る前の一時的な位相
を含んでいることを確認した。

αラクトアルブミン（α１、α２、α３）がβラクトグ
ロブリン（β１、β２、β、）より更に大なる量を樹脂
上に保持されたことが注目された。

塔の出口（第３の段）で、液体は最初のαラクトアルブ
ミンの約５０％を含んでいたが、βラクトグロブリンは
２５％しか含んでおらず、残余は樹脂上に固定された。

発明の効果 上述のように本発明によれば従来技術の生物学的巨大分
子のクロマトグラフィー分離の欠点を除去して工業的な
規模でベッドの閉塞を回避し、樹脂の粒子の劣下を減少
させ、連続的なりロマトグラフィー分離をも可能になす
優れた生物学的巨大分子のクロマトグラフィー分離方法
を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用するのに適当な仕様を与える線図
。 第２図は本発明による方法を実施する為の不連続的な設
備の概略的断面図。 第３図は第２図の設備の塔の詳細を示す垂直断面図。 第４図は本発明による連続的な設備の概略的垂直断面図
。 第５図は第４図の設備の塔の詳細を示す垂直断面図。 第６図は第５図の垂直平面ＡＡ’　を通る横断面図。 第７図、第８図及び第９図は夫々時間の関数として例１
乃至３の溶液の出口に於ける濃度の変化を示す線図。 １・・・・・・・・塔 ２・・・・・・・・支持部 ３．、５・・・・段 ６．７・・・・・・穿孔された分布装置即ち円筒形のプ
レート ９・・・・・・・・ボルト止めされた環状フランジ １２．１３・・・・容器 １４・・・・・・・流量計 １５・・・・・・・ダイアフラム １６．１７．１８、及び １９・・・・・・・貯槽 ２０・・・・・・・ポンプ ２１・・・・・・・流過管 ２２・・・・・・・そらせ板 ２４・・・・・・・流体圧作動装置 ２５・・・・・・・回収貯槽 ２６・・・・・・・貯蔵容器

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）選択的吸着を行う為分離を行うように巨大分子に
   対して特定的な選択性を有するクロマトグラフィー樹脂
   ベッドに溶液を接触させることを含む生物学的巨大分子
   のクロマトグラフィー分離方法に於て、前記方法が、 第１図の線図のハッチングされていない領域Ｚ内に位置
   するような値の平均粒子寸法Ｇ＿ｍ及び容積当り質量Ｍ
   ＿ｖを有するクロマトグラフィー樹脂を使用すること、 下記の特性を与えるような穿孔された分布装置を底部に
   設けられた少なくとも１つの段を含む塔の内部に前記ク
   ロマトグラフィー樹脂を配置すること、 即ち、 開放された部分の割合が大体０．１％乃至１０％の範囲
   にあり、 前記開放された部分の平均直径が約３００ミクロン以上
   であり、且つ、 前記開放された部分の平均直径が大体２Ｇ＿ｍ乃至２０
   Ｇ＿ｍの範囲にある、 ような特性を与えるようになっていること、前記クロマ
   トグラフィー樹脂のベッドを流動体化するように前記塔
   の各段に対して前記分布装置を横切って前記溶液を供給
   し、その際にＶ＿ｍ＿ｆを前記樹脂の流動体化の為の最
   小速度として大体１．５Ｖ＿ｍ＿ｆ乃至１２Ｖ＿ｍ＿ｆ
   の範囲の速度の液体の直線的速度を前記塔内に得られる
   ように（全横断面積に戻すように）前記溶液の流量を調
   節すること、 を特徴とするクロマトグラフィー分離方法。
2. （２）前記クロマトグラフィー樹脂が前記溶液を順次循
   環される互いに上下に重ね合わされた２乃至５の段を含
   む大体垂直な塔内に配置されていて、前記溶液の交換が
   上部の段の上方部分にて溢流によって行われ、前記各段
   （前記上部の段を除き）が前記穿孔された２つの分布装
   置によって境界されていて、一方の分布装置が溶液を当
   該段の底部に於て分布させ、他方の分布装置が溶液を前
   記当該段の直接上方に位置する段に向けて分布させるよ
   うになされている特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）前記塔は、この塔の内部に対する前記溶液の流量
   が少なくとも選択的に、固定を行う位相の間実質的に一
   定であり、流量の公称値に対する流量の変化が±５％以
   内であることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第
   ２項の内の何れか１項に記載の方法。
4. （４）夫々の前記穿孔された分布装置をプレート間に間
   隔を有して重ね合わされた少なくとも２つの穿孔された
   プレートによって形成し、前記プレートは、夫々穿孔部
   を設けられ、１つのプレートの穿孔部が隣接するプレー
   トの穿孔部に対して位置をずらされるように配置されて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第２項又
   は第３項の内の何れか１項に記載の方法。
5. （５）前記クロマトグラフィー樹脂が、１つの段から他
   の段に対する循環が行われないないように前記塔の各段
   に閉じ込められていて、流動体化されたベッドによる分
   離が前記塔内の選択的固定、洗浄、抽出及び洗浄のサイ
   クルによって行われるようになされている特許請求の範
   囲第１項、第２項、第３項又は第４項の内の何れか１項
   に記載の方法。
6. （６）前記クロマトグラフィー樹脂が、前記塔内にて低
   い位置で連続的に循環され、上部にて樹脂を連続的に供
   給され、底部で連続的に交換され、同時の前記塔の外部
   への洗浄、抽出及び洗浄の作動を伴って前記流動体化さ
   れたベッドによる分離が前記塔内で連続的に行われるよ
   うになされている特許請求の範囲第１項、第２項、第３
   項又は第４項の内の何れか１項に記載の方法。
7. （７）前記クロマトグラフィー樹脂が前記溶液を順次循
   環される互いに上下に重ね合わされた２乃至５の段を含
   む大体垂直な塔内に配置されていて、前記溶液の交換が
   上部の段の上方部分にて溢流によって行われ、前記各段
   （前記上部の段を除き）が前記穿孔された２つの分布装
   置によって境界されていて、一方の分布装置が溶液を当
   該段の底部に於て分布させ、他方の分布装置が溶液を前
   記当該段の直接上方に位置する段に向けて分布させるよ
   うになされていると共に、前記塔の互いに重ね合わされ
   た２つの段の間に、前記分布装置を横切って上部の段の
   ベッドの上部と下部の段のベッドの底部との間に伸長す
   る樹脂の流過管を配置し、前記樹脂が前記管内を上方の
   段から下方の段に向けて溢流によって循環するようにな
   されている特許請求の範囲第６項記載の方法。
8. （８）前記各段に於て、前記樹脂のベッド内に上方の段
   に連通する管のオリフィスと下方の段に連通する管のオ
   リフィスとの間に配置される少なくとも１つのそらせ板
   を配置し、その段の樹脂の完全な更新を確実になすよう
   になされている特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）前記流過管は、与えられた段に対する管内に形成
   された流動体化された樹脂ベッドが上方の段に於ける管
   に溢流しないように前記塔内に配置されている特許請求
   の範囲第７項又は第８項の何れか１項に記載の方法。
10. （１０）乳漿の蛋白質のクロマトグラフィー分離の為の
    特許請求の範囲第１項乃至第９項の内の何れか１項に記
    載の方法。
11. （１１）７５乃至３００ミクロンの範囲の粒子寸法の「
    スフェロシル」の型式のクロマトグラフィー樹脂を使用
    し、前記樹脂が予め濾過されて大体前記平均値の寸法の
    粒子の拡散が５０％に等しいようになされている乳漿の
    蛋白質β−ラクトアルブミン、α−ラクトアルブミンの
    抽出の為の特許請求の範囲第１０項記載の方法。