JP3030516B2 - 懸濁細胞培養系から実質上細胞のない培養培地を除去するためのスピンフィルター - Google Patents

懸濁細胞培養系から実質上細胞のない培養培地を除去するためのスピンフィルター

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は動物細飽の生体外培養に関し、さらに特定的
には灌流式懸濁細胞培養系から実質上細胞のない培養培
地を除去するためのスピンフイルターに関する。
治療、診断及び研究目的のための大量のタンパク質に
対する増大する必要性の結果として、及び動物細胞（そ
れ自体、またはハイブリッドパートナーとして、または
外来遺伝子の宿主として）が、調節、免疫応答及他の同
様な機能を生体内で行うときに動物（例えは人）によつ
て実際に用いられるタンパク質と同じであるか非常に似
ているタンパク質の最良のソース（資源）を提供すると
いう認識の結果として、動物細胞の生体外培養、特にか
かる細胞によつて正常に分泌されるか、または遺伝子機
構の操作によるかかる細胞によつて分泌されるタンパク
質を回収する目的のための動物細胞の生体外培養は、増
加するより大なる注目を集める（assume prominence）
に至つている。
生体外動物細胞培養の認識された利点及び必要性にも
拘らず、動物体外での細胞の培養は、最善の条件でも
（at best）困難な課題であり、かかるプロセスを過度
に高価でない最終タンパク質生産物を達成するよう効率
的かつ経済的に行うという今日の要請によつてより一層
困難になる。
細胞分泌タンパク質の大量生産の可能性を示す既知の
生体外動物細胞培養装置及び系の中に、灌流培養槽（pe
rfused fermenters）、すなわち均質性を促進するため
攪拌した培養培地中で動物細胞を懸濁培養する培養容器
であつて、そこにおいては培養流体を連続的にもしくは
間欠的に回収し（抜き出し）、対応量の新鮮な培養培地
で置き代える培養容器がある。かかる懸濁培養系は固定
源依存性細胞（anchorage−dependent cells）を適当な
基体材料（微小担体粒子）上に配列することによつて培
養するのに用いることができ、またもちろん成長及び増
殖に表面への付着を要しない細胞の培養にも有用であ
る。
灌流懸濁培養系に関してより重要な問題の中に、流体
中に懸濁した細胞を同時に除去することなしに容器から
培養流体を周期的もしくは連続的に除去することの困難
性がある。この問題を多少とも解決するために多くの提
案及び装置が考えられ及び／または構築された。それら
は一般に、容器から培地を回収するのに、培地から細胞
を分離するためのある種の過手段を含む。ある程度の
商業的評価を受けた１つの装置はいわゆる「スピンフイ
ルター」、すなわち容器内の細胞／培地懸濁液に浸漬し
た回転ゲージ様、中空円筒であつて、系からそれと連合
した（in association therewith）適当な流出液（effl
uent）オーバーフロー管を経て培地を回収する内部空間
に細胞が入ることを排除するが液が入ることを排除しな
いよう設計した回転ゲージ様中空円筒である。代表的に
は、スピンフイルターは同心の液体透過性円筒形網（me
sh or screen）によつて囲まれたコア液体不透過性円筒
よりなり、輪状の円筒形空間がコア円筒の外部表面と同
心円筒網の内部表面の間に存在して、懸濁培養容器から
細胞フリー培地（cell-free medium）を回収し得る領域
を画定する。一体化された（combined）コアと同心網は
１つの単位（unit）として、独立した回転手段によつて
または細胞と培養液との懸濁液を攪拌するための培養容
器インペラを駆動するシヤフトに付随させて、回転させ
る。
培地の回収に先立つ細胞分離を行うためのフイルター
の開発において、過表面（filtering surface）の孔
径もしくは開口を適当な一定の大きさにすること（sizi
ng）に多大の関心が向けられた。明らかに、容器からの
除去のために内部輪状領域にフイルターを通して培地を
移行させるが細胞を移行させないことを確保する１つの
方法は細胞サイズより小さな開口径を有するフイルター
材を用いることである。微小担体上で成長する細胞や懸
濁液中で集合体として成長する細胞に対しては、かかる
基準は一般に、閉塞（clogging）または汚損（foulin
g）する傾向がより少なく、培養流体が容易に透過し得
る比較的大なる開口を可能にする。しかしながら、懸濁
液中で単一の細胞として成長する細胞（例えばハイブリ
ドーマ）に対しては、サイズによつてのみ細胞を排除す
るには極端に小さな開口が必要となる。特定の開口径、
灌流速度及び細胞密度によつては、かかる小さなフイル
ター開口の使用は非常に短い時間内、例えば約10ミクロ
ンより小さな開口径、約106cells/mlより大なる細胞密
度及び反応容器容積あたり及び１日あたり約0.5容積の
灌流培地より大なる灌流速度を含む系については、約１
週間以内でフイルター表面の強度の閉塞及び汚損を引き
起こすであろう。妥協的解決策として、細胞サイズより
大なる開口径が一般に選ばれるが、その結果培地を回収
する際の培養容器内の細胞の完全な保持が一般に不可能
となる。さらに、この様な操作でさえもスピンフイルタ
ーの有用な寿命を制限する汚損及び閉塞を完全に排除せ
ず、培養を止めてフイルターを再生するか取り替えるこ
とが必要となる。
発明の概要 本発明の第１の目的は細胞、特に懸濁液中で一般に単
一の細胞として成長する細胞の懸濁培養用スピンフイル
ターを提供することである。
本発明の別の目的は、懸濁培養容器から実質上細胞の
ない培地を回収することを可能にするスピンフイルター
であつて、同時に閉塞及び汚損をより受けにくく、合理
的に高い細胞密度及び灌流速度で長期間操作でき、従つ
て細胞を懸濁培養して、細胞分泌タンパク質の工業的規
模の生産に必要とされる高い密度にすることを可能にす
るスピンフイルターを提供することである。
これらの目的及び明らかになるであろう他の目的は液
体培養培地に懸濁した動物細胞の生体外灌流懸濁培養の
ためのインペラ駆動懸濁培養装置であつて、培養容器；
培養容器内の細胞及び培養培地の軸流を促進するため
の、与えられた方向に回転する、培養容器内のインペ
ラ；培養容器へ培養培地を添加するための入口；培養容
器インペラと独立してかつそれと反対方向に回転し得る
該容器内のスピンフイルターであつて、多孔性液体透過
性材料で作られた垂直に配向した中空容器よりなるスピ
ンフイルターであつて、かつ中空容器の内部の少なくと
も一部が中空容器の多孔性液体透過性材料を通して移行
した、培養容器からの培養培地を受け取るための、実質
上細胞のない液体の回収空間を画定するスピンフイルタ
ー；液体回収空間及び培養容器から培地を回収するため
の該空間に配置した液体回収手段；及び液体回収空間に
配置した１以上の垂直に配向したバツフルよりなる装置
によつて達せられる。中空容器の表面を形成する多孔性
液体透過性材料の平均孔径は約8-10ミクロンの大きさよ
り大なる物質を完全に排除するのに十分な平均孔径であ
り、また操作中スピンフイルターは容器インペラとは逆
の回転方向に少なくとも周期的にまたは好ましくは連続
的に回転させる。
本発明の好ましい態様においては、スピンフイルター
は中空容器によつて囲まれているが、それとは軸方向に
間隔をあけて位置した垂直に配向した液体不透過性コア
をさらに有し（その結果液体回収空間はコアと中空容器
との間の領域によつて画定される）、またバツフルがそ
の画定された空間に配置される。もつとも好ましい態様
においては、スピンフイルターは円筒形であり、すなわ
ち円筒形液体不透過性コア、それを取り囲みそれに対し
て同心の、多孔性液透過性材料の円筒、及び同心のコア
及び中空円筒の間の輪状領域によつて画定される液体回
収空間を有する。
本発明はスピンフイルターのフイルター表面の汚損及
び閉塞に関連する現象の研究、及び汚損及び閉塞を生ず
る作用の発見に基づく。特に、細胞によるフイルターの
汚損がフイルター孔を通しての細胞の移行及び引き続い
ての内部に面したフイルター表面への蓄積によつて一般
に起こることが見い出された。代表的なスピンフイルタ
ー操作では、液体回収空間中の液体はフイルターそれ自
体と同じスピードで回転し、その結果、細胞が、内部に
面したフイルター表面に（自然付着及び／または遠心力
によつて）蓄積するのを防止する表面清掃効果がない。
同時に汚損への別の貢献物は外部に面したフイルター表
面と優先的に（preferentially）結合する傾向があるタ
ンパク質破片である。
上記観察及び研究の結果として、本発明のスピンフイ
ルターは通常の汚損作用を打ち消すように設計した操作
の特徴及び形式を考慮している。かくして該フイルター
内の液体透過性材料の孔または開口径は細胞が開口を移
行して内部に面したフイルター表面に集合する傾向を減
ずるに足るほど小さく選択される。さらに、フイルター
をどうしても通過して液体回収空間に移行する細胞を処
理するために、液体回収空間に（例えばそこのオーバー
フロー管と連結するか及び／または例えば培養容器上の
カバープレートから発した別個の手段によつて該空間へ
吊り下げた）１以上の静止した垂直に配向したバツフル
を配置して液体回収空間中の液体運動を衰えさせ、かく
して細胞が内部に面したフイルター表面に集合するのを
実質上防止する。バツフルはそれらがスピンフイルター
表面自身と独立しており、すなわちそれらはスピンフイ
ルターが回転しても回転しないという意味で静止したバ
ツフルと称せられる。最後に、タンパク質破片が外部に
面したフイルター表面に集合する傾向を最小にするため
に、スピンフイルターは、培養容器内容物を攪拌するイ
ンペラと反対の方向に回転するよう適合化させる。
本発明に従うスピンフイルターの構築及び操作によつ
て、90％より大なる細胞保持率が単一細胞懸濁培養系に
おいて、３週間を越える有用な（汚損前の）フイルター
操作寿命、約８×106‐２×107cells/mlの細胞密度及び
反応容器１あたりかつ１日あたり1-5.5lの容積灌流速
度で、達成された。
本発明を図面及び以下に示される詳細な記述によつて
さらに説明する。
図面の簡単な説明 第１図は本発明のスピンフイルターを用いる懸濁培養
容器の断面図である。
第２及び３図は本発明のスピンフイルター系と商業上
入手し得るスピンフイルター系の比較によつて収集した
データのグラフを表す。
発明の詳細な記述 本発明の好ましい態様においては、及び第１図への参
照によつて、一般に、生物適合性で殺菌可能な材料、例
えばガラス、しかしもつとも好ましくはステンレススチ
ールから構築される懸濁培養容器100が示される。該培
養容器内に、吸出管（draught tube）101、及びその頂
部領域でのオーバーフローのために吸出管中で一般に流
れを垂直上方へ向かせるモーター駆動インペラ102があ
り、それによつて細胞及びそれらが懸濁している培地の
全体的に軸方向の混合を確立し、かつ細胞の沈降を防止
する。該容器中の一般的な操作液体レベルを103として
示す。
培養容器100内に該容器上のトップカバープレート105
から懸濁液中に吊り下げられた、一般に104と指称する
スピンフイルターであつて、インペラ102と反対の回転
方向にスピンフイルター104を回転し得る、インペラ102
の駆動手段と独立した回転駆動手段107に連結された（i
s affixed）スピンフイルターを配置する。
スピンフイルター104は液体不透過性の内部コア円筒1
08よりなる。コアシリンダー108は中実（solid）または
中空で、後者の場合、頂部及び底部は閉じられており、
好ましくはステンレススチールもしくは他の同様の材料
で構築する。コア円筒108を囲んで輪状の円筒空間110が
それらの間に存在するほどコア円筒より大なる断面直径
を有する同心中空円筒シエル109が存在する。中空円筒
シエル109は、約10ミクロンより大なる直径を有する固
体粒子を少なくとも公称上（nominally）排除できる約5
-10ミクロンの開口を有する多孔性液体透過性材料、好
ましくはステンレススチール網より構成される。コア円
筒108と同心中空円筒109は連係した回転のため、輪状空
間110が上部で開放されて残つている限り、適当な方法
で（例えばそれらの底部で）結合させる（are affixe
d）。示されるごとく、輪状空間110はスピンフイルター
の底で完全に閉鎖されている。もつとも、液体がそれを
通して移行できる網目材料による閉鎖を有することは可
能である。重要なことは輪状空間中の液体性中空円筒シ
エル109を作つている多孔性液体透過性材料を通過して
そこに到達したということである。
輪状空間110の上部領域に液体レベル管111が配置され
る。輪状空間110中の実質上細胞のない培養培地は、例
えば供給口112を通して新鮮培養培地もしくは補給培養
培地の供給によつてもたらされる液レベルの上昇に対応
して上昇し培養容器から排出される。
輪状空間110の中に、好ましくは実質上その垂直長さ
のすべてに亘つて、静止したバツフルまたは渦防止板11
3を配置する。構築上の容易さからバツフル113はレベル
管111と連結できるが、独立にカバープレートから吊り
下げるか、またはスピンフイルター装置の回転に比し、
一般的に静止した性質を保つ他の適当な方法で吊り下げ
ることも可能である。第１図には１つのバツフルが示さ
れているが、多くのバツフルを用いてもよい。
連続的または半連続的灌流操作では、ある量の培養培
地を入口管112を経由して培養容器に供給する。容器の
内容物をインペラ102の回転によつて軸方向に攪拌し、
スピンフイルター104を反対方向に回転させる。フイル
ターシエル109と接触した細胞含有培地は、フイルター
材料の小さな孔径により、実質上細胞のない状態で輪状
空間110に移行し、容器内の液レベル103がレベル管111
の底より上に上昇するにつれて、輪状空間から抜き出さ
れる。静止バツフル113は、フイルター中を移行して内
部に面したフイルター表面に集合する細胞の傾向を最小
にすべく、回転する輪状空間110中の液流を攪乱する（d
isrupt）。同時に、スピンフイルターのインペラ102と
反対の回転はタンパク質破片が外部に面したフイルター
表面に集合し、それを汚損する傾向を減ずる。
本発明の成果として、懸濁液中の大多数の細胞が輪状
空間に入れず、従つて培養容器から本質的に細胞のない
培地を除去する能力を増加せしめることを本来的に確保
するフイルター孔もしくは開口径を採用することが可能
である。しかしながら、同時に、かかる小さなフイルタ
ー孔が詰まり汚損するという公知の傾向は、バツフルの
配置及びスピンフイルターの反対回転によつて実質上最
小にされる。
本発明の利点を第２及び３図の図で示したデータにお
いてみることができる。これらのテストでは、他の点で
は同一の懸濁培養灌流容器を並べて、懸濁液中単一細胞
として成長する細胞の培養のために運転した。コントロ
ール反応器（第３図にデータを示す）では、スピンフイ
ルター（中実コアを囲む円筒網）は８ミクロンの孔径を
有し、容器インペラと同じ速度で同じ方向に回転させ
た。本発明の反応器（第２図にデータを示す）では、ス
ピンフイルターコアとそれを囲む円筒網の間の輪状空間
に容器カバーから吊り下げた垂直バツフルの存在、及び
コントロールと同じ速度であるが容器インペラと反対方
向としたスピンフイルターの回転を除き、すべての面で
同一であつた。
本発明の系では、灌流速度は経時的に徐々に反応器リ
ットルあたり１日あたり5.5lまで増加させ、高生細胞密
度を達成した。すなわち、フイルター閉塞をもつとも受
けやすい商業上好ましい条件で系を運転した。対照的に
コントロール反応器の灌流速度は約0.5l/l/dayという比
較的低いレベル及び結果としての低い生細胞密度、すな
わちスピンフイルターの能力に余り劇的に挑戦しないよ
う設定した条件に維持した。それにも拘らず、コントロ
ール反応器では１週間以内にスピンフイルターが閉塞を
起こした。他方、本発明の系のスピンフイルターは高灌
流速度／高細胞密度の条件下でも重大な閉塞を起こすこ
となく約30日稼動した。
本発明を特定した好ましい特徴及び例示的パラメータ
ーをもとに説明したが、これらは請求の範囲で画定され
る本発明の範囲を限定するのではなく説明するためのも
のである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブレイム，ルドルフ エフ アメリカ合衆国カリフオルニア州 94546 カストロバーリー バインヤー ド ロード 17971 (56)参考文献 米国特許4535062（ＵＳ，Ａ) 米国特許4649118（ＵＳ，Ａ) 英国公開4576718（ＧＢ，Ａ) Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎ ｄａｒｄ．，Ｖｏｌ．66，ｐｐ．269− 272（1987) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 3/00 - 3/10 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（イ）培養容器、 （ロ）培養容器内のインペラ手段、 （ハ）培養容器内の細胞及び培養培地の縦方向の軸に関
    連した軸流を促進するための且つ該培養容器の縦方向の
    軸に実質的に垂直な面で所定の軸方向で該インペラーを
    回転させるための第一の回転手段、 （ニ）培養容器へ培養培地を少なくとも間欠的に添加す
    るための、培養容器内と液連絡した入口、 （ホ）約８〜10ミクロンのサイズより大きな物質の通過
    を実質上排除するに十分な平均孔径を有する多孔性液体
    透過性材料より構成され、その内部の少なくとも一部が
    多孔性液体透過性材料を通して移行した培養容器からの
    培養培地を受け取るための、実質上細胞のない液体の回
    収空間をもつ中空容器からなり、培養容器の縦方向の軸
    に実質的に沿うように培養容器内に配置されているスピ
    ンフィルター、 （ヘ）インペラーとは独立して、軸方向に且つインペラ
    ーとは反対方向にスピンフィルターを少なくとも周期的
    に回転せしめるための第二の回転手段、 （ト）液体回収空間及び培養容器からの実質上細胞のな
    い培養培地を少なくとも間欠的に除去するための、液体
    回収空間に配置した液体回収手段、及び （チ）液体回収空間に配置した１以上の垂直に配回した
    静止したバッフルよりなることを特徴とする液体培養培
    地に懸濁した動物細胞の生体外灌流懸濁培養のための懸
    濁培養装置。
  2. 【請求項２】スピンフィルターが中空容器に囲まれ、そ
    こから放射状に間隔を置いて配置された、垂直に配向し
    た液体不透過コアをさらに有し、液体回収空間がコアと
    中空容器の間の領域によって画定されている請求項１の
    装置。
  3. 【請求項３】コア及び中空容器が円筒形であり、液体回
    収空間が円筒コアと円筒中空容器の間の輪状領域によっ
    て画定されている請求項２の装置。
  4. 【請求項４】培養容器上にカバーを有し、スピンフィル
    ター及びバッフルが該カバーから吊り下げられている請
    求項３の装置。
  5. 【請求項５】液体回収手段がカバーから吊り下げられて
    おり、少なくとも１つのバッフルが液体回収手段に付着
    されている請求項４の装置。
  6. 【請求項６】（ａ）請求項１の懸濁細胞培養装置を用意
    し、 （ｂ）培養装置に接種量の動物細胞及び培養培地を供給
    し、 （ｃ）培養装置の内容物を第一の回転手段による該イン
    ペラーの回転によって攪拌し、 （ｄ）培養容器と液連絡している入口を通して培養容器
    内へ培養培地を少なくとも周期的に導入し、液回収手段
    によって液回収空間から実質上細胞のない培養培地を少
    なくとも周期的に回収し、そして （ｅ）スピンフィルターを第二の回転手段によりインペ
    ラーの軸方向と反対の軸の方向で少なくとも周期的に回
    転する ことを特徴とする動物細胞を培養培地中で生体外潅流懸
    濁培養する方法。
JP2505691A 1989-03-17 1990-03-15 懸濁細胞培養系から実質上細胞のない培養培地を除去するためのスピンフィルター Expired - Fee Related JP3030516B2 (ja)

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US325,286 1989-03-17
US07/325,286 US5019512A (en) 1989-03-17 1989-03-17 Spin filter for removing substantially cell-free culture medium from suspension cell culture system

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JPH03505041A JPH03505041A (ja) 1991-11-07
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DE (1) DE69012489T2 (ja)
DK (1) DK0414887T3 (ja)
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