JPS63500216A - 醗酵器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 醗　酵　器 本発明は細胞の撹拌された懸濁培養液を受容する連続ｔＢ４Ｆｆ槽に関する。

細胞の”Ｅ　隻ｎ　ｍ　Ｆｔにより生成される製品の商業化が近年進歩するにつ れ、醗酵槽および醗酵工程に関する設計の改良に関心が高まっている。

醗酵は通常、回分法もしくは連続法として実施される。

連続法は所与の醗酵器の生産率を増大しかつ回分式醗酵器で通常必要となる清掃 および殺菌に要する休止時間を減少するので有利である。

既知の連続ｉｇ３酵槽においては、適当な培養媒体中の細胞の懸濁液が撹拌され かつ醗酵に適当な温度に保たれる。

懸濁培養液は、連続供給される新規な培養媒体に見合って醗酵器から抜出す。こ のようなｌ！ｌ醇器の重大な欠点は培養液の抜き出しにより惹起される細胞の継 続的な損耗である。抜出した懸濁培養液を、培養液の上澄み液から細胞を分離す る連続的遠心分離手段に通過する醗酵器が知られている。次に細胞を懸濁培養液 に返還する。

既知の別な醗酵器においては、培養液内に部分的に浸漬するように濾材でできた 回転バスケットが設けられている。従って、バスケットの内側がフィルターによ って懸濁培養液から隔離されている。培養液の上澄み液はフィルターを通過して 連続的に抜出すことができる一方細胞は懸濁培養液中に残留する。懸濁培養液内 でバスケットが回転するので、濾材の閉塞が減少する。

連続懸濁培養液中に細胞を返還するためのこれらの既知の手段は、機械的に複雑 であり、その操作にエネルギーを必要とし、また細胞の破壊といったような懸濁 培養液に対する悪影響を及ぼしうる。こういった点から重なって、このようなｔ ｉｉ１酵器による醗酵工程の経済的な実施可能性が低くなっている。

本発明の目的は、これらの欠点を実質的に克服する連続ｌｌＯ酵槽を提供するこ とである。

本発明に従うに、細胞の懸濁培養液を受容するための連続醗酵槽が提供される。

この醗酵槽は、使用時に、槽内に受容した懸濁培養液を撹拌しかつ培養液の全体 的な流動を惹き起すための手段、培養媒体を槽に連続的に供給するための流入口 、培養液の上澄み液を抜き出すための流出口、およびこの流出口と槽との間にあ る、懸濁培養液から細胞を抜き出すことを防止する濾材を包含し、この濾材は、 使用時に、懸濁培養液の全体的流動のため、細胞および（もしくは）細胞の残骸 による濾材の閉塞が実質的に防止されるよう配置されている。

本発明の培養槽は、培養液の上澄み液を懸濁液から分離するために可動部を必要 とせず、従って費用が節減されて有利である。濾材は培養すべき細胞の直径によ って決まる細孔寸法をもつ。動物１１１胞の場合、濾材は１〜１Ｏｔｌ？ＴＬ　 、望ましくは１〜５μｍそして最も望ましくは３〜５μｍの細孔寸法をもつであ ろう。濾材はセラミックス材料、焼結ステンレス鋼もしくはステンレス鋼、金網 であってよい。

培養液の上澄み液の全体的流動はポンプもしくは羽根車を用いて発生することが できる。しかしこのような手段は費用を嵩ませかつＫＩＨ器の複雑さを増す。本 発明の望ましい態様にあっては、醗酵器は、技術上「上昇管」として知られてい る上方に延びる部分に空気のようなガスが噴入されるいわゆる「エアーリフト」 醗酵器である。

上昇管はその頂部および底部において、技術上「下降管」として知られているＩ Ｎ器の上方に延びている別な部分のそれぞれ頂部および底部と連絡している。エ アーリフト醗酵器の既知の形状には、槽を二つの部分（上昇管および下降管）に 分ける、醗酵槽内にある中央隔離体（Ｃｅｎｔｒａｌ　ｄｉｖｉｄｅｒ　）が含 まれる。エアーリフト醗酵器の別な形状には、円筒状の醗酵槽と実質的に同心で あるドラフト管（ｄｒａｕｇｈｔ　ｔｕｂｅ）が含まれ、この管は醗酵器を上昇 管（ドラフト管の内側にある）と下降管（ドラフト管と［？槽の内側との間の円 環状空間内にある）とに分ける。（上昇管がドラフト管と醗酵槽の内側との間の 円環状空間内にあり、また下降管がドラフト管の内側にあってもよい、）空気の ようなガスを上昇管の下方部に噴入すると、上昇管内の嵩密度が減少し、上昇管 内の液体の上方流が発生し、従って下降管の内容物が排除され、上昇管の底部に 循環して戻る。このようにして循環流体の流れが発生され、培養液が混合されか つ細胞の懸濁が維持される。このような醗酵器の利点は、回転阻分が必要でない ことおよび培養液の酸素化（ｏｘｙｏｅｎａｔｉｏｎ　）が起ることである。典 型的には上昇管の断面積は下降管の断面積と実質的に同じである。

本発明の望ましい態様においては、連続醗酵槽はエアーリフト醗酵器でありまた 流出口は下降管と上昇管との間の隔離体内に形づくられる導管を含み、この導管 は隔離体の少くとも一部をなす濾材を介して醗酵槽と連絡している。このように して、上昇管内を上昇するが下降管内を下降する懸濁培養液は濾材に接しつつこ れを横断して流れ、培養液の細胞でフィルターが閉塞するのを実質的に防止する 。培養液の上澄み液は隔離体内の導管中に抜き出され、流出孔を経て導管から除 去される。隔離体は二重壁のドラフト管からなるのが望ましく、このドラフト管 は、濾材からなるその少くとも一部分を通じて懸濁培養液と使用時に連絡する導 管空間を二重壁の間に形づくっている。ドラフト管は、その内側（すなわち上昇 内）が連続的な材料からなっており、またその外側（すなわち下降管内）は焼結 ステンレス鋼もしくは金網状ステンレス鋼のような濾材からなるように形づくら れるのがよい。

循環流量はガス流量を増加することにより増大することができ、従って循環速度 が増大される。醗酵器内容物の過剰の酸素化を防ぐためには、全体的なガス流向 を十分＾く保ちつつ一方酸素移動量を制限するために空気に璽究のような不活性 ガスを混合するとよい。醗酵、器の形状比（ａｓｐｅｃｔ　ｒａｔｉｏ）　（高 さ：直径）を増加すると、循環距離が増加し、従って特定の循環流ｍ（特定の空 気流量によってもたらされる）について、循環速度が増加するであろう。

醗酵器は懸濁培養液（マイクロキャリヤー培養液を含む）中で生体内生育のでき るあらゆる細胞について用いることができるが、例えばハイブリドーマ細胞系列 （ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）のような動物細胞の培養に特に 有用である。

本発明は添附の図面を参照しつつ以下の記載によって例解される。この図面は醗 醇槽と同心の二重壁ドラフト管を含む本発明のエアリフト醗酵器の軸方向断面の 概略図である。

第１図を参照するに、エアーリフト醗酵器は全体が１として示される円筒状の外 槽を含む。全体が３で示されるドラフト管は外ｌＷ１内に同心内に配置されてい る。ドラフト管は、円環状のキャップ１１および１３で両端が密封されて円環状 の導管を形成する円筒状の内壁５および外壁７を含む二重壁円筒からなる。円筒 状ドラフト管３の内壁５および（もしくは）外壁７の少くとも一部分は、培養液 の上澄み液の通過は許すが、細胞の通過は阻止することのできる濾材からなって いる。適当な濾材は焼結ステンレス鋼もしくはステンレス鋼金網である。濾材の 細孔寸法は培養する細胞による。動物細胞の場合、１〜１０μｍの範囲の細孔寸 法が効果的である。、ドラフト管３の内側は使用時に上昇管１５として働き、ま たドラフト管３の外壁７と外槽１の内壁との間の円環状空間は下降管１７として 働く。

外１ｉ１の底部には、上昇管１５の概ね中央の直下にある空気流入口１９がある 。導管９の頂部には、培養液の上澄み液を抜き出すだめの流出口２１が設けられ ている。

醗酵器にはそれに培養媒体を供給するための流入口２３が設けられている。恒温 に制御されている加熱手段を外槽１内もしくは周囲に設けることができる。外槽 １は、例えば水で充満されるジャケットとなるように二重壁であってよい。

使用的には、細胞、好適には動物細胞の懸濁培養液を醗酵器に導入し、ドラフト 管３の頂部から外槽１の直径の０，２５〜１．０倍に相当する高さまで懸濁培養 液で満たす。懸濁培養液ｔよ空気流入口１９がら空気を押し入れることにより流 動状態に保つ。空気は上昇管１５内を上昇し、上昇管内の懸濁液の嵩密度を低下 し、かつ図１の矢印が示す方向の液体の流れを惹き起す。上昇管１５の頂部から 懸濁培養液中の空気が排出される。培養媒体は流入口２３から連続的に供給する 。培養媒体は細胞の効率的培養に必要な栄養分および他の要素を含む。培養液の 上澄み液はドラフト管３の二重壁５および７の少くとも一部をなす濾材を通過さ せて連続的に抜出す。導管９内に抜出した培養液の上澄み液は次いで流出口２１ を経て醗酵器から抜き出す。濾材はドラフト管３の、二重壁５および７の一方も しくは両方の一部もしくはすべてをなすことができる。

実験の結果、形状比（高さ：直径）が８〜１２であり、Ｑ、ｉｖｖｍの空気流量 を用いる１００〜１０００リツトルの範囲の醗酵器の場合、上昇管および下降管 内の循環速度はともに０．１５〜０．２５ｍ／秒であることが示された。濾過器 の閉塞を防止するのに十分な循環速度を確保するために、上昇管および下降管の 形状および空気流量を調節することができる。もし閉塞が起るならば、濾過器を 通過する流れを増加するために、頂部空間内の空気の圧力を増大することができ る。

呼び寸法１０μｍの細孔寸法のステンレス鋼金網濾過器を備えた３０１のＭ続式 エアーリフト＆酵器を用いて連続培養を行った。醗酵器は実質的に、添附の図面 に示すものであって、外壁７が、孔寸法が一層大きい裏当て円筒上にある呼び寸 法１０μ汎のステンレス鋼金網（“Ｈｏ１ｌａｎｄｅｒ　Ｔｗｉｌｌ　Ｗｅａｖ ｅ″−英国のＳｉｍｏｎ　Ｃａｄｉｓｈ　＆５ｏｎｓ社％りからなるものである 。内壁５は連続的なステンレス鋼円筒である。ドラフト管は槽から送入される液 体がすべて濾材を通過して内壁５および外壁７の間の空間に流入せねばならない ように密封する。

ＤＭＥＭ、３．７ｇ／ｌのＮａＨＣ○３緩衝液および５％の牛の胎児の血清から なる培養媒体を用い、稀釈率０．０３／時間にて培養槽内でハイブリドーマ細胞 系列を培養する。培養液中のそしてドラフト管から良き出される生きている細胞 を数えた。これによって、培養液中の生きている細胞全体の唯の約５％がフィル ターを通過することがわかった。

上記においては、本発明が単に例解のために説明されているのであり、本発明の 範囲および趣意のうちで詳細の変更は可能であることが了解できるであろう。

国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．使用時に、連続醗酵槽内に受容した細胞の懸濁培養液を撹拌しかつ培養液の 全体的な流動を惹き起すための手段、培養媒体をこの槽に連続的に供給するため の流入口、培養液の上澄み液を抜き出すための流出口、およびこの流出口と槽と の間にある、懸濁液から細胞を抜き出すことを防止する濾材を包含する連続醗酵 槽であつて、この濾材が、使用時に懸濁培養液の全体的流動のため、細胞および （もしくは）細胞の残骸による濾材の閉塞が実質的に防止されるように配置され ている、細胞の懸濁培養液を受容するための連続醗酵槽。
2. ２．濾材が１〜１０μｍの細孔寸法をもつ請求の範囲第１項記載の連続醗酵槽。
3. ３．連続醗酵槽がエアーリフト醗酵器である請求の範囲第１項記載の連続醗酵槽 。
4. ４．醗酵槽がエアーリフト醗酵器であり、また流出口が、下降管と上昇管との間 の隔離体の内部に形づくられる導管を含み、この導管が隔離体の少くとも一部分 をなす濾材を介して醗酵槽と連絡している、請求の範囲第１項から第３項のいづ れか１項に記載の連続醗酵槽。
5. ５．隔離体が二重壁のドラフト管からなり、このドラフト管がその二重壁の間に 導管空間を形づくり、この空間が、濾材からなるドラフト管の少くとも一部分を 通じて懸濁培養液と使用時連絡している、請求の範囲第４項記載の連続醗酵槽。
6. ６．ドラフト管の内側が連続的な材料からなつており、またドラフト管の外側の 少くとも一部分が濾材からなる、請求の範囲第５項記載の連続醗酵槽。
7. ７．請求の範囲第１項から第６項のいづれか一項に記載の連続醗酵槽内で細胞を 培養することからなる懸濁培養方法。
8. ８．細胞がハイブリドーマ細胞である、請求の範囲第７項記載の懸濁培養方法。