KR101728901B1 - 생분자 제조 방법 및 장비 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생분자, 특히 약제학적 등급의 플라스미드 DNA를 제조하기 위한 확장가능한 방법 및 장비에 관한 것으로, 본 방법은 알칼리 용해 단계, 중화 단계 및 정화 단계를 포함하며, 더 확장가능하다. 용해물과 침전을 분리하기 위해 개선된 부유 방법이 개시되며, 이 방법은 침전 플록에 CO2 방울의 부착에 기초한다. 중화 단계(산성화) 동안 또는 후에 카보네이트로부터 CO2 가 방출된다. 본 방법은 바람직하게 자동화된 연속 모드로, 용해 및 중화 장비 및 완전히 연속적인 정화를 위한 새로운 장비(플록 및 투명 용해물의 분리)를 응용하여 수행된다.

Description

생분자 제조 방법 및 장비{METHODS AND DEVICES FOR PRODUCING BIOMOLECULES}
본 발명은 생분자, 특히 플라스미드 DNA와 같은 폴리뉴클레오타이드의 제조분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 기체/공기 주입없이 기체 방울의 생성에 의해 매개되는 진보된 부유법에 의한 부드러운 정화 단계(gentle clarification step)에 관한 것이다. 본 발명은 특히 알칼리 조건하에서 세포 용해, 후속하는 세포용해물의 중화 및 정화를 포함하는 산업적 규모의 방법에 적당하며, 한편 이들 모든 단계들은 전적으로 연속 모드에서 수행된다.
지난 20세기 후 반세기 및 21세기 초반에 이루어진 분자 및 세포 생물학의 진보는 새로운 재조합 생분자(바이오폴리머) 제조 기술을 이끌었다. 이러한 거대분자 그룹은 예컨대, 단백질, 핵산 및 폴리사카라이드를 포함한다. 이들은 질병의 진단, 예방 및 치료분야에서, 인간 건강 보건에 점점더 사용되어 오고 있다.
최근, 대부분의 혁명적인 진보는, 진단, 유전자 치료 및 핵산 백신분야에서 폴리뉴클레오타이드에 대해 이루어져 왔다. 이러한 응용은 진단, 치료 또는 예방적 효과를 나타내기 위해, DNA, 특히 염색체외(extrachromosomal) DNA, 또는 RNA를 세포내로 도입하는 것으로 이루어진다.
대표적인 폴리뉴클레오타이드로는 메신저 RNA (mRNA), 전이 RNA (tRNA) 및 리보솜 RNA (rRNA), 게놈 DNA (gDNA) 또는 염색체 DNA (cDNA), 및 플라스미드 DNA (pDNA)이다. 이들 거대분자들은 단일- 또는 이중- 나선이다.
이들 폴리뉴클레오타이드는 그 크기나 형상에 따라, 효소 분해 (DNases and RNases) 및 전단력에 민감하다. 특히 염색체 DNA는 변성 형태 및 꼬인 형태에서, 기계적 스트레스에 매우 민감하여, pDNA와 유사한 성질을 갖는 단편이 된다. 이는 전단력에 노출되는 동안 더욱더 심해진다 (Ciccolini LAS, Shamlou PA, Titchener-Hooker N, Ward JM, Dunnill P (1998) Biotechnol Bioeng 60:768; Ciccolini LAS, Shamlou PA, Titchener-Hooker N (2002) Biotechnol Bioeng 77:796).
플라스미드 (pDNA)는 이중 나선 염색체외 선형 폴리뉴클레오타이드이다. 대부분의 약제학적 플라스미드는 3-10 kbp의 크기를 가지며, 이는 회전 반경이 100 nm 이상인 분자량 2 x 106-7 x 106에 상당한다(Tyn M, Gusek T (1990) Biotech. Bioeng. 35:327). 일부 케이스에서, 몇개의 상이한 단백질을 코딩하는, 20 kbp 보다 더 큰 폴리시스트론/다가 플라스미드가 보고되었다 (Muler PP, Oumard A, Wirth D, Kroer A, Hauser H, in: Schleef M (2001) Plasmids for Gene Therapy and Vaccination, Wiley-VCH, Weinheim, p 119). 상이한 위상형태의 pDNA가 구별될 수 있다. 다중고차코일형태(supercoiled;sc) 또는 공유폐쇄선형형태(covalently closed circular;ccc)가 치료적 응용에 있어 가장 안정한 형태로 간주되며, 따라서 바람직한 형태로 간주된다. 다른 위상 형태의 pDNA가 단일 나선 닉(개방 선형 또는　oc) 또는 이중 선형 닉(선형)에 의해 ccc로부터 유래되거나 콘쥬게이션에 의해 결과된다. 물리적, 화학적 또는 효소 활성에 의해 나선 붕괴가 유발될 수 있다. 치료적 용도에 있어, ccc 형태의 퍼센트가 pDNA 제조품질을 평가하는 주-파라미터이다.
유전자 치료 및 유전자 백신 분야에서 임상 시험 수가 늘어나는 것은 pDNA의 잠재적 장점을 반영하는 것이다. 따라서 cGMP에 따라 제조되는 약제학적 등급의 pDNA의 수요가 꾸준히 증가되고 있다. 특히 pDNA-기반 백신에 대한 시장 공급에 대한 전망에 의하면 다량의 심지어 수킬로그램의 정제된 pDNA가 매해 필요하다. 따라서 산업적 규모로 수행될 수 있는 공정이 요구된다. 이러한 제조 공정은 반드시 허가 요건(예, FDA, EMEA)를 만족하여야 하며, 경제적으로도 가능하고, 생산적이며 탄탄하여야 한다.
과거 대부분의 제조 공정에 대한 생명공학기술은 정제된 재조합 단백질의 제조에 대해 개발되어 왔다. 폴리뉴클레오타이드와 단백질의 물리화학적 성질 차이로 인해, 이들 방법은 폴리뉴클레오타이드의 제조에 용이하게 적용될 수 없다. 전통적인 실험실-규모의 프로토콜에 기반한 제조공정을 수립한 제조자들은 점점 생산성, 규모 및 제품 경비(COGS)의 측면에서 많은 한계에 직면한다. 따라서 제조 규모에 기반한 폴리뉴클레오타이드에 적용가능한, 특히 pDNA의 제조방법이 요구된다.
간략하게, 숙주에 의해 분비되지 않는 재조합 생분자, 특히 pDNA 및 큰 단백질은 다음의 단계에 따라 제조된다:
a) 발효 (대상 생분자(biomolecule of interest)를 갖는 세포의 배양 및 임의로 발효 브로스(broth)로부터의 세포 수확),
b) 세포분해 (세포로 부터 대상 생분자를 방출),
c) 분리 및 정제 (대상 생분자를 불순물로부터 분리).
이들 단계는 후술하는 바와 같이, 특히 폴리뉴클레오타이드, 특히 pDNA의 제조를 특징으로 한다.
현재, 대장균(E. coli)은 pDNA 제조에 있어 가장 통상적으로 사용되는 숙주이다. 다른 박테리아, 효모, 포유류 및 곤충 세포도 발효단계에서 숙주세포로 사용될 수 있다. 적당한 숙주 종의 선택, 높은 세포 밀도 공정에 적용되는 잘 정의된 배양매질, 높은 플라스미드 복제수의 유지가 특히 pDNA의 품질을 위해 중요하며, 탄탄한 경제적 공정에 필수적이다 (Werner RG, Urthaler　J, Kollmann F, Huber H, Necina R, Konopitzky　K (2002) Contract Services Europe, a supplement to Pharm. Technol. Eur. p. 34).
발효후, 세포는 일반적으로 원심분리에 의해 수확된다. 수확된 습윤 바이오매스 (wet biomass)는 적절한 버퍼에 재부유된다. 최종적으로 대상 폴리뉴클레오타이드를 불순물로부터 분리하기 전에 (숙주 관련 물질: 예, 단백질, gDNA, RNA 및 엔도톡신; 산물 관련 물질: 예, 원하지 않는 폴리뉴클레오타이드 이소폼; 공정 관련 물질: 예, 발효 매질 잔여 화합물), 세포는 바로 또는 동결 및 해동 후 프로세싱되어야 한다. 또는 수확 및 재부유한 후 계속 프로세싱하는 대신, 발효 브로스를 그대로 계속 프로세싱할 수 있다 (WO 97/29190).
프로세싱은 세포 분해(폴리뉴클레오타이드 방출)로 시작되며, 대상 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 정화 용액(clarified solution)의 회수로 종결된다. 후속되는 대상 폴리뉴클레오타이드 분리 동안(예, 컬럼 크로마토그라피, 울트라다이아필터레이션, 추출 및 침전에 의해), 이들은 분순물에서 분리되어야 한다.
세포 분해는 물리적, 화학적 또는 효소적 방법으로 이루어진다. 통상, 박테리아 세포로부터 대상 폴리뉴클레오타이드의 분해 및 방출은 Birnboim 및 Doly (Birnboim HC, Doly J (1979) Nucl Acids Res 7: 1513)에 의해 기술된 바 있는 알칼리 용해에 의해 수행된다.
상기 간행물에 개시된 분해/방출 공정은 두단계로 나뉠 수 있는데, 첫 단계는 고유(intrinsic) 세포 분해 또는 용해 단계이고 두번째 단계는 중화단계이다.
알칼리 용해동안, 세포는 세제(바람직하게 소듐 도데실 설페이트; SDS)와 함께 알칼리 용액(바람직하게 NaOH)에 넣는다. 이러한 환경에서 세포벽 구조가 파괴되어 대상 폴리뉴클레오타이드 및 기타 세포 관련 화합물들이 방출된다. 최종적으로, 상기 용액은 산성염용액, 바람직하게 아세테이트, 특히 포타슘 아세테이트 (KAc) 또는 소듐 아세테이트 (NaAc) 용액의 추가에 의해 중화된다. 중화과정동안, 세포 부스러기, 단백질 및 gDNA는 도데실-설페이트와 함께 공-침전되어 양털모양 (floccose; 플록)의 침전을 형성한다 (Levy　MS, Collins IJ, Yim SS, et al. (1999) Bioprocess Eng 20:7).
알칼리 용해 및 중화의 다음 단계에서, 상기 침전물들은 플라스미드 함유 용액으로부터 분리되어야 한다. 이 단계는, 본 발명의 맥락에서, "정화 단계 (clarification step)"로 지칭된다.
정화 단계에 관하여, 고정된 각 로터(fixed angle rotors)상에서의 원심분리는 실험실 및 전-준비 규모에서 채용되는 가장 빈번히 사용되는 방법이다 (Ferreira GNM, Cabral JMS, Prazeres DMF (1999) Biotechnol Prog 15:725). 병에서 통상 조작되는 양의 용해물에 대해서, 잠시 후 큰 상의 부유하는 플록(floc) 및 약간의 하강(비부유) 침전물로부터 투명한 액체상이 분리된다. 오직 투명한 액체상만이 흡인되고 여과된다. 그렇지 않으면 큰 플록이 즉시 사용되는 필터를 막는다. 기계적 스트레스로 인해 플록이 방해를 받아 투명상내에 플록 양이 증가되어 부유 경향이 줄어들고 상분리가 나빠지게 되면, 여과 과정은 더욱 힘들어진다. 일반적으로 부유하는 플록층은 컴팩트하지 않으며, 따라서 하부 투명층의 퍼센트는 전체 부피(투명상 및 플록상)의 약 50-70 %이다.
플록상 내 액체는 잔여 플라스미드 DNA를 함유하기 때문에 (Theodossiou I, Collins IC, Ward JM, Thomas ORT, Dunnhill P (1997) Bioproc Eng 16:175), 40%에 이르는 높은 소실율이 고려되어야 한다 (Urthaler J, Ascher C, Wohrer H, Necina R (2007) J Biotechnol 128:132). 더구나, 다양한 여과-매체에 대한 pDNA와 같은 (폴리)뉴클레오타이드의 강력한 흡착이 고려되어야 한다 (Theodossiou I, Collins IJ, Ward JM, Thomas ORT, Dunnhill P (1997) Bioprocess Eng 16:175; Theodossiou　I, Thomas ORT, Dunnhill P (1999) Bioprocess Eng 20: 147). 종종 대량의 여과 물질 또는 백(bag) 필터가 용해물의 정화에 사용된다. 이들 물질은 인증되거나 확장가능(scalable)하지 않기 때문에, 제조 규모로 약제학적-등급의 플라스미드를 제조하는데 적용할 수 없다. 더욱 최근의 기술은 확장된 베드 흡착법 (EBA)을 사용하며, 이는 원하는 산물을 포획하는 동시에 침전 물질을 제거할 수 있다 (Chase HA (1994) Trends Biotechnol 12: 296). 그러나, 중화중 생성된 응집된 플록의 큰 직경으로 인해 EBA 전에 선-정화하는 것이 필수적임을 고려하여야 한다 (Ferreira GNM, Cabral JMS, Prazeres DMF (2000) Bioseparation 9:1; Varley DL, Hitchkock　AG, Weiss AME, et al. (1998) Bioseparation 8:209).
상술한 각 단계에 대한 기술을 개선하려는 여러 시도가 있었으며, 이들은 통상 비-연속성 시스템내에서 작동되고 따라서 오염 가능성의 우려가 있었다. 이들 공정 단계는 자동화되지 않으며 따라서 결과가 사용자-의존적이다. 사용된 방법 및 장비는 따라서 약제학적 등급의 폴리뉴클레오타이드를 제조적 규모로 제조하는데 적합하지 못하다. 이러한 공정을 위한 다량의 pDNA를 조작하는 유일한 방법은 장비를 복수화하는 것, 예를 들면 이들을 병행 작동하는 것이다.
대상 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 정제하는 것을 고려하면, 용액 파라미터(염 조성, 전도성, pH-값)들을 원하는 폴리뉴클레오타이드가 수지에 확실히 결합할 수 있도록 조정하는 것이 필요하다 (이러한 조정 단계는 본 발명에서 "컨디셔닝(conditioning step)"로 지칭된다). 후속하여 용액에 제1 크로마토그라피 단계를 수행한다 (포획 단계).
가장 극복하기 어려운 제한 인자는 용해물의 정화이다. 투명 용해물을 수득하기 위해, 침전 물질을 폴리 뉴클레오타이드 함유 용액으로부터 분리하여야 한다. 통상적으로 이 정화 단계는 여과나 원심분리와 같은 본 기술분야의 공지 기술을 이용하여 회분식 모드(batch-mode)로 수행된다 (예, US　2001/0034435, WO 02/04027). 대부분의 필터는 깊이 필터 (depth filters)이다(WO　00/09680). 거대여과를 위한 다른 필터 수단은 예를 들면 압착 거즈나 동등한 필터물질로 구성되는 매크로기공성의 격막이다 (EP 0376080). 어떤 프로토콜에 따르면, 여과는 필터 보조물 존재하에 이루어진다 (WO　95/21250, WO 02/057446, US　2002/0012990). WO　96/21729는 원심분리 단계후 규조토를 사용하는 여과단계를 포함함으로써, RNA 함량을 감소시키는 부가적인 효과를 달성하는 방법을 개시한다. 또한 막 필터를, DNA에 대한 담체로도 작용하는 느슨한 매트릭스(유리, 실리카겔, 음이온교환수지 또는 규조토)와 조합하여 사용하는 것이 EP　0814156에 개시되어 있다. WO 96/08500, WO　93/11218, EP 0616638 및 EP 0875271에 따르면, 상이한 물질 (예, 유리, 실리카겔, 알루미늄 옥사이드)를 느슨한 입자 형태, 층 또는 여과 플레이트(특히 비대칭적 기공 크기 분포를 갖는 것)의 형태로 포함하는 장비를 사용하여 정화한다. 필터를 통한 흐름은 중력, 진공, 압력 또는 원심분리에 의해 수행된다. 플록 및 용해물을 분리하는 다른 방법이 WO 2004/024283 및 WO　2004/108260에 개시되어 있다. 여기에서, 중화전 또는 중화 동안의 과정에서 사용되는 버퍼/용액 중 하나를 기체 포트를 통해 도입되는 조절가능한 기체 기류와 혼합한다. 용액/현탁액과 유체 교류상태에 있고, 일정 크기의 작은 기체 방울을 제공하는 살포돌(sparge stone)에 의해 기체가 미세하게 분포된다. 작은 기체 방울은 중화동안 생성된 침전물에 부착된다. 중화된 용해 세포 용액은 탱크에 수집되고 일정 기간동안 보유되며, 이 기간 동안 대다수의 플록이 부유시키는 것이 필요하다(부착된 기체 방울에 의해 매개된). 이후 필터 세트에 의해 하부 용해상이 배치별로 여과된다. 다른 셋업에서, 용해물 플록 혼합물(기체 주입과 함께 또는 없이 수득된)이, 부가적으로 플록/용해물 상 위로 저압(진공) 적용이 허용되도록 디자인된 탱크내에 수집된다 (WO 03/070942, WO 2004/108260). 진공은 플록의 부유를 개선하며, 이들을 수집 탱크의 상단으로 유도한다. 양 방법이 비-연속성 모드로 정화를 수행하며 정화를 위한 부가적인 여과 단계를 필요로한다. 연속성 정화법으로서 원심분리(예, 디스크 스택 원심분리 또는 디켄팅 원심분리)가 WO 99/37750 및 WO 96/02658에 개시되어 있다. 또한 원심분리 및 후속하는 여과의 조합이 정화 목적으로 기술되어 있다 (WO　02/26966, WO 96/02658).
상술한 정화법은 통상 물질이 특정 기간동안 중화버퍼와 함께 인큐베이션된 후 시행된다. 이는 전단계 및 후속단계의 계속적 연결을 허용하지 않으며, 규모면에서 제한적이다. 이와 별도로, 여과 기술은 종종 오염 가능성의 위험이 있는 개방 장비에서 수행된다. cGMP 공정에서는 어떠한 물질도 검증되어야 하므로, 부가적인 필터 보조제는 여과 공정의 성과를 개선시킨다 할 지라도, 일반적으로 피하여야 한다. 본 기술분야에 공지된 정화법의 다른 문제점은 플록 및 용해물의 긴 접촉시간 (분리 전/동안)이며, 이는 불순물 재용해 및 효소 분해의 우려를 감소시키기 위해, 회피되어야 한다.
일반적으로, 통상의 필터는 제한된 용량을 가지며 다량의 부피가 큰 플록에 의해 곧 막혀버린다. 또한 물질에 의해 정체된 침전물 상으로의 계속적인 유입은 플록의 파괴 및 불순물의 재용해를 결과하며, 이는 후속하는 단계에 부정적인 영향을 미친다. 대량의 pDNA에 대해서는, 일부 장비를 복수화하는 것이 제안된 바 있으나(예, 병행하여 수행할 수 있는), 이는 제조규모의 관점에서 바람직하지 못하며 불편하다.
일부 원심분리 기술은 (반)연속적으로 수행될 수 있으나, 전단력에 대한 폴리뉴클레오타이드의 민감성으로 인해 이러한 처리는 플라스미드 DNA 및 게놈 DNA의 분해를 유발할 수 있으며, 플록의 포획으로 인한 침전 불순물의 탈리를 유발할 수 있다.
최종 정제 전에 컨디셔닝 단계가 적용되는 경우, 투명 용해물의 염 조성 및/또는 전도성 및/또는 pH값은 원하는 분자가 후속하는 포획 단계에서 수지에 결합될 수 있도록 예정된 값으로 조절되어야 한다. 종종 컨디셔닝 단계는 전-정제를 위해 추가된다 (예, WO 00/09680에 개시된 바와 같은 엔도톡신의 제거).
대상 뉴클레오타이드의 포획을 위해, 여러 기술이 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 탄젠트 흐름 여과 (WO 01/07599), 크기 배제 크로마토그라피 (WO　96/21729, WO 98/11208), 음이온 교환 크로마토그라피 (WO 00/09680, US　6,410,274, WO　99/16869) 및 소수 상호작용 크로마토그라피 (WO　02/04027)를 들 수 있다.
대부분의 상술한 공정 단계는 비-연속 및/또는 비-자동 모드로 조작된다. 일반적으로 상기 단계는 전적으로 연속적인 시스템에 연결되어 있지 않다. EP 0814156, WO　93/11218, EP 0616638 및 EP 0875271에는 세포 용해, 중화, 정화, 세척 및 임의의 컨디셔닝 및 포획이 동일한 장비에서 수행되는 공정이 개시되어 있다. 이들 방법은 개방시스템으로서 수개의 보유 단계를 포함하며 비-자동/비-연속 모드로 조작된다. 이들 장비는 오직 실험실 규모에 적합하며, 제조 규모로 이전될 수 없다. 이 기술은 또한 재현성이 부족하며, cGMP 대규모 제조에 적합하지 않다.
또한, 상이한 장비를 사용하는 조합도 개시된 바 있으며, 이 조합에서는 개별적인 단계가 연속 모드로 서로에 직접 연결되어 있다 (WO 96/02658, WO 00/09680, WO 02/26966, US　2001/0034435 WO 97/23601, WO 00/05358, WO　99/37750). 그러나 이들 공정 중 어떤 것도, 재현탁 단계로 시작하고 포획단계로 끝나는 시리즈내에 세단계 이상을 조합하지 않는다. 이들 방법에서 사용된 장비는 균일한 혼합을 보장하지 않을 뿐 아니라 용질에 불리한 전단력을 적용할 수 있다. 또한 적용된 정화 기술(여과, 원심분리)는 상술한 여러 문제점들에 의해 방해받을 수 있다.
대상 폴리뉴클레오타이드의 산업적 제조에 적당한 세 단계 이상을 자동화된 연속 모드로 조합하는 것을 허용하는 방법 및 장비가 WO 2004/085643, 및 Urthaler J, Ascher C, Wohrer H, Necina R (2007) (J Biotechnol 128:132)에 의해 개시된 바 있다. 이 공정에 따르면, 숙주 세포에 의해 분비되지 않는 폴리뉴클레오타이드의 분리는 개선된 알칼리 용해법을 포함하며, 세포 분해 단계, 중화단계, 정화단계, 및 임의의 컨디셔닝단계 및/또는 농축 단계 및 후속하는 생분자의 정제와 같은 한다. 정화는 하부 섹션이 부분적으로 정체(retention) 물질로 채워져 있는 정화 반응기에 중화에서 수득된 침전 및 용해물을 포함하는 혼합물을 부드럽게 분포시키고 분리되게 함으로써 수행된다. 침전물은 정체 물질층의 상단 또는 그 내부에 정체된다. 투명한 용해물은 연속적으로 반응기 하부의 출구를 통해 수집된다. 비록 이 방법 및 장비는 확장가능하며 연속 모드로 작동하지만, 정화 장비의 용량이 제한적이다. 이 셋업내에서 프로세싱될 수 있는 바이오매스의 양을 증가시키기 위해서는, 정화 탱크의 부피를 증가시키거나 다른 정화 탱크를 적용하여 전체 플록-부피를 수집하여야 하며, 결과적으로 장비 경비가 증가된다. 또는 제조 공정을 중단하여 플록을 정화 반응기로부터 제거하여야 하는데, 이는 제조 공정을 지연시키고 부가적인 작업-노력이 소요되며 또한 오염될 위험이 증가한다.
본 발명은 기존 방법의 한계를 극복할 수 있는, 세포 배양물로부터 대상 폴리뉴클레오타이드를 분리하는 방법 및 장비를 제공하는 것이다.
본 발명의 방법 및 장비는 치료적으로 적용가능한 폴리뉴클레오타이드를 연속적으로 제조하기에 적합하며, 본 방법은 RNase 및 리소자임과 같은 효소의 사용이 필요하지 않고, 또한 SDS 외에는 세제(detergent) 사용이 요구되지 않는다. 또한 본 발명의 방법과 장비는 수 킬로그램에 달하는 다량의 산업적 규모의 제조에 적합하다. 산업적-규모 제조공정의 선결조건은 완전히 연속적인 세포 용해, 중화 및 후속하는 정화 공정의 수행이다(도 1 참조).
상술한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함한다.
WO 2004/085643에 개시된 방법 및 장비에 기초하여, WO　2004/085643에 기재된 정화 단계의 한계를 극복하기 위해 다수의 실험이 수행되었다. WO 2004/085643에 개시된 방법 및 장비는 확장가능하며 연속 모드로 작동하지만, 정화 장비의 용량이 제한적이다. 이 시험들은 플록의 부유를 개선하고 동시에 플록 및 용해물의 완전하고 연속적인 분리를 위한 것이다. 용해물-플록 혼합물의 기체 첨가이외에, 상이한 첨가제를 버퍼의 표준 조성에 첨가하여 부유를 개선하는지 여부를 테스트하였다.
놀랍게도, 중화 단계전, 동안 또는 후에 카보네이트 염을 첨가하면 중화단계중 생성된 플록의 부유가 상당히 개선되는 것을 발견하였다. 증강된 부유는 화학반응에서 생성된 작은 기체 방울에 의해 매개된다. 카보네이트가 고체염형태나, 중성 내지 알칼리 수성용액으로 용해되어 산성용액과 접촉하는 경우, 하기 반응식에 따라 카보네이트 염으로부터 CO2가 방출된다:
Figure 112010057820209-pct00001
본 발명의 일실시형태에서, 카보네이트염은 분리된 버퍼/용액내에 용해된다. 다른 실시형태에서 카보네이트염은 재현탁버퍼 또는 용해용액내에 용해된다.
또는 카보네이트염은 중화 단계 전에 생성된 현탁액 내에 용해된다(예, 카보네이트염은 재현탁용 버퍼에 첨가되거나 용해 용액 내에 첨가된다). 재현탁버퍼 또는 용해용액에 용해될 때(중화 단계 전에 용해), 카보네이트염의 농도는 약 0.01 내지 1 M, 바람직하게 0.02 내지 0.1 M이다. CO2 기포의 생성은 용해세포용액이 산성 중화용액과 접촉하였을 때 시작되며, 혼합되는 동안 진행된다. 작은 기체 방울은 동시에 생성된 침전물 (세포 부스러기, 단백질 및 게놈 DNA과 공침전된 (포타슘)도데실-설페이트 플록)에 부착하며, 따라서 후속되는 부유를 촉진한다. 이러한 공정은 플록과 용해물의 우수한 상분리를 초래한다. 이는 이들 공정 단계의 완전한 연속 조작, 플록 및 정화된 용해물의 신속한 분리 및 침전 불순물 및 pDNA-함유 용액의 짧은 접촉시간을 위한 선결조건이다.
이들 결과는 놀랍게도, 주어진 위치에 입구를 갖는 간단한 용기로 (전) 정화된 용해물이 용기 바닥에서 연속적으로 유출(수집)되는 것을 보여주었다. 최소 잔여 용해물을 함유하는 플록은 용기 상부에서 수집될 수 있었다. 본 발명의 일 주제이기도 한 용기는 플로우-쓰로 용기(flow-through container)이며, 바람직하게 실린더 또는 튜브, 특히 유리나 스텐레스 스틸 튜브로 형성된 중공 몸체이다. 이들 튜브는 플라스틱이나 바이오약제학적 제조에 허용가능한 어떠한 물질로도 만들어질 수 있다.
수집된 플록은 예를 들어 잔여 플록-내부 용해물을 세척 및/또는 배수(draining)로 회수하기 위해 추가적으로 프로세싱될 수 있다. 원심분리 및/또는 여과와 같은 종래 방법 이외에도, 바람직한 실시형태에서는 WO　2004/085643에 개시된 정화 장비를 이 목적으로 적용할 수 있다. 실린더의 하부 출구에서 수집된 용해물은 후속하는 정제 단계에 의해 더 프로세싱된다.
플록 세척 및 배수 단계에서 부가적으로 회수된 액체는 실린더 하부에서 수집된 용해물에 추가될 수 있다. 대체 실시예에서, 실린더 상부에서 수집된 플록은 이들 플록을 중화된 용해 세포 용액에 추가하거나 또는 분리 실린더 내 혼합물에 직접 첨가함으로써 재프로세싱될 수 있다.
연속적인 산업적 규모의 알칼리 용해 공정에서 중화된 용해 세포 용액과의 화학적 반응으로 인해 전개된 산성 조건하에서 카보네이트염(중화전, 동안 또는 후에 용해형태 또는 고체형태로 첨가된)으로부터의 연속적인 CO2 방출은 중화동안 생성된 침전 플록의 연속적이고 개선된 부유를 결과하며, 이는 신규하다. 또한, 이러한 새로운 기술을, 플록 및 용해물을 연속적으로 산업적 규모로 분리할 수 있게 하는 장비와의 응용/조합도 신규하다. 신규한 CO2-매개 부유 및 WO　2004/085643에 개시된 바와 같은 자동화된 연속적인 용해 및 중화와 함께 연속적인 플록 분리를 위한 신규한 장비와의 조합은 하기와 같은 현저한 이점을 제공하며, 규모의 한계를 해결해주며, 따라서 다량의 플라스미드 DNA를 경제적으로 제조하는데 불가결하다:
- 바이오매스에서 정화된 용해물을 생성하기 위한 전적으로 연속적이며 자동화된 생산 사슬
- 전적으로 폐쇄된 CIP가능(CIPrable)한 시스템
- 장비 크기 및 경비의 경감
- 부가적인 장비나 프로세싱(예, 공기 주입)없이 부유를 개선
- 간단하며, 복잡한 조정이나 유지가 필요없음
- 탄탄하며 재현가능
- 부드러움(플록에 대한 기계적 스트레스가 감소되어 침전 불순물 (및 침전에 부착된 불순물)이 재용해되는 것이 감소됨)
- 더 컴팩트한 플록층 및 따라서 pDNA를 함유하는 플록-내부 용해물이 적어져 수율이 증가
- 침전 불순물(플록) 및 pDNA-함유 액체 (용해물)의 접촉 시간 최소화.
본 발명은 산성 조건하에서 카보네이트염에서 방출된 CO2 를 사용하여, pDNA 알칼리 용해 과정의 중화 중 생성된 플록 침전물의 부유를 개선하는 효과를 나타내고, 이들 플록을 특별히 고안된 장비내에서 연속적으로 분리할 수 있게 한다. 카보네이트염을 플록 분리전에 첨가하는 한, 공정에서 언제 또는 어떤 버퍼, 용액 또는 현탁액에 카보네이트염을 첨가하는지는 본질적인 것이 아니다. 카보네이트염은 중성 또는 알칼리 조건하에서 중화전에 첨가될 수도 있고, 이미 중화된, 산성 pH의 용해세포 용액을 함유하는 플록에 가할 수도 있다. 이 모든 경우, CO2는 카보네이트염을 함유하는 용액 또는 현탁액 또는 고체 카보네이트염을 중화된 용해세포 용액과 또는 중화 용액과 접촉시킴으로써 방출된다.
알칼리 용해를 적용하는 생분자(특히 pDNA) 제조를 위한 공정의 개별적인 단계가 후술된다. 단계 a) 내지 c) 및 단계 e)는 공지 방법에 따라 수행될 수 있다.
a) 발효/배양 (및 임의의 수확 및 재현탁):
본 발명의 방법에서, 특히 대상 생분자가 pDNA인 경우, 바람직하게 대장균이 숙주로서 사용된다. 발효는 본 기술분야의 공지방법에 따라, 회분(batch) 모드, 유가 모드(fed-batch) 또는 연속(continuous) 모드로 수행된다.
수확단계 또한 본 기술분야의 공지방법에 의해 수행된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 연속적으로 작동되는 장비, 예를 들면 튜브 원심분기기 또는 분리기가 세포들을 배양매질로부터 분리하는데 사용된다. 만약 세포(바이오매스)가 더 프로세싱되기전에 동결되는 경우, 세포는 수확후 바로 또는 적절한 버퍼, 통상 0.05 M Tris, 0.01　M　EDTA를 함유하며 pH 8인 버퍼에 세포를 재현탁한 후 동결(냉동 펠릿화(cryopelletation) 포함)될 수 있다. 이 경우 알칼리 용해 전에 어떠한 부가적인 재현탁 버퍼도 첨가되어서는 안되며 또는 부피를 적게 유지할 필요가 있다. 바람직한 본 발명의 일 실시형태에서 재현탁 버퍼는 부가적으로 카보네이트를 함유한다.
본 발명의 대체적인 실시형태에서, 세포의 수확 및 재현탁이 생략될 수 있다. 이 경우, 발효 브로스는, 세포 및 배양 상등액의 분리없이 바로 b)의 용해단계에서 프로세싱된다.
b) 알칼리 세포 용해(alkaline lysis)에 의한 분해:
원리적으로, 단계 b)는 공지 방법 그 자체, 특히 세제를 포함하는 알칼리 용해 용액을 사용하여 연속적이고 자동화된 모드로 수행될 수 있으며 부드러운 방법에 따라 수행될 수 있다. 전형적인 용해 용액은 NaOH (0.2　M) 및 소듐 도데실 설페이트(SDS) (1%) (바람직함)으로 구성되며, 과정중에 플록 침전물이 생성되는 한, 원리적으로 다른 알칼리 용액, 세제(detergents) 및 농도(예, WO　97/29190 참조)도 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시형태에서, 용해 용액은 부가적으로 카보네이트염을 함유한다.
수확된 단계 a)의 세포는 바로 프로세싱되거나 또는 냉동된 경우(냉동 펠릿화 포함) 해동된다. 양 과정은 공통적으로, 고유 세포 분해 단계 b)전에 수확된 세포가 a) 단계에서 기술된 재현탁 버퍼에 재현탁된다.
또는 세포의 수확과 재현탁 과정 없이, a) 단계에서 수득된 발효 브로스가 직접 계속 프로세싱된다. 이 경우, 세포는 발효기내에서 알칼리 용해 (및 임의의 후속 중화)를 직접 수행하거나, 또는 발효 브로스를 용해 반응기내로 이송함으로써 분해된다. 이러한 재현탁을 하지 않는 실시형태에서는 카보네이트염을 중성 또는 알칼리성 발효 브로스, 용해 용액에 또는 중화된 용해 세포용액에 가하여 CO2 방출에 따른 부휴 개선 효과를 얻는다 (단계 c) 참조).
바람직하게 단계 b)는 WO 2004/085643에 기술된 방법 및 장비의 원리를 사용하여 수행된다.
이하에서, 단계 b)의 세포 분해에 대해, "세포 현탁액"은 수확후 재현탁된 세포 및 발효 브로스 양자에 대해 사용된다.
c) 중화/침전화/CO2 방출:
통상적으로 산성 pH의 높은 염농도를 갖는 버퍼 용액이 중화에 사용된다. 바람직하게 이 용액은 pH 5.5의 3　M 포타슘 아세테이트 (KAc)를 함유한다. 그러나 다른 중화 염, 예를 들면 소듐 아세테이트, 암모늄 아세테이트나 포타슘 포스페이트가 사용되거나 첨가될 수 있다.
또한 이 단계는, 원칙적으로, 공지 방법 그 자체, 바람직하게는 부드러우며, 연속적이고 자동화된 모드로 수행될 수 있는 방법에 따라 수행될 수 있다.
중화 단계 c)의 일 실시형태에서, 용해세포 용액은 연속적으로, 바람직하게 자동화된 방식으로 중화 용액과 혼합된다. 이는 용해세포 용액과 중화 용액을, 예를 들면, T나 Y연결자를 사용하여, 일정비율의 유속으로(= 일정 혼합 비율) 조합하여, 완전히 혼합되게 하고 후속하는 혼합 섹션에서 완전히 용액을 중화/침전화시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 카보네이트염은 중화전에 첨가되며. CO2 방출은 중화/침전과 동시에 일어난다.
바람직하게 단계 c)는 WO 2004/085643에 개시된 방법 및 장비의 원리를 이용하여 수행된다.
일단 용해세포 용액이 중화 용액과 접촉하면, 혼합물의 pH가 감소 되어 산성으로 되며, 플록이 형성되기 시작한다. 카보네이트염을 중화 전에 첨가하면 산성화로 인해 CO2 방출과 플록 형성이 동시에 시작된다. 용해세포 용액 및 중화 용액은 이후 혼합 섹션에서 혼합되며(예, WO 2004/085643에 개시된 바와 같은 튜브 시스템), 동시에 정화 장비로 바람직하게 펌프나 가압 기체에 의해 수송된다.
다른 실시형태에서, 수성 "부유 용액"이 적용된다. 본 발명에서 "부유 용액"은 수성 카보네이트 용액을 의미한다. 이 부유 용액은 카보네이트 염을 포함하고 있다는 점에서 다른 공정 용액과 구별되며, 다른 공정 용액 중 어느 하나에 첨가된다("공정용액"은 알칼리 용해, 중화 및 임의의 재현탁을 수행하는데 사용되는 모든 액체를 지칭한다). 이러한 부유 용액은 중화단계 전에 공정 용액 중 하나와 혼합되거나 또는 공정에서 생성되는 현탁액 중 하나와 혼합된다. 또는 부유용액은 중화된 용해 세포 용액과 함께 혼합될 수 있다. 부유용액내 카보네이트 농도는 0.01 M 내지 1 M, 바람직하게 0.025 내지 1　M의 범위로 존재한다. 부유용액의 혼합비는 따라서 2:1 -1:50이다. 바람직하게 적은 부피의 고농도 카보네이트 용액을 적용한다. 부유용액이 연속적으로 적용될 때 혼합비는 유속 비율(부유용액:공정 현탁액)에 의해 조절된다.
단계 c)에서 "부유용액"을 사용하는 본 발명의 일 실시형태에서, 중화된 용해 세포 용액은 계속적으로, 바람직하게 자동화된 방식으로 부유용액과 혼합될 수 있다. 이는 중화된 용해 세포 용액(플록 침전물을 함유하는) 및 "부유용액"을 일정비의 유속으로(=일정 혼합비:예, T나 Y연결자를 사용하여) 혼합하고, 완전히 혼합되어 반응혼합물이 후속하는 정화 장비에 수송되는 동안 CO2가 방출됨으로써 달성된다. 이 실시형태에서, "부유용액"은 용해세포용액과 중화용액이 만나는 지점과 정화 장비사이의 어떤 지점에서, 바람직하게는 상술한 거리의 처음 반 이내에서, 중화된 용해 세포용액과 혼합된다.
CO2 방출이 동시에(중화/침전과 동시) 또는 후속하여("부유 용액"을 사용하여) 이루어지는 것과 관계없이, 생성된 작은 기체 방울은 플록-침전물에 부착되어, 추후 정화동안의 용해물 및 플록의 상분리를 개선한다. 생성되는 용해물-플록 혼합물(부착된 CO2 방울과 함께)내 존재하는 카보네이트의 이론적 농도를 산출하면, 이는 약 0.003 내지 0.35　M, 바람직하게 약 0.005 내지 0.05 M의 범위에 존재한다. 농도가 낮으면 CO2 방출이 너무 적고, 농도가 지나치게 높으면 불리한 방울현상을 초래한다.
바람직한 실시형태 중 하나에 의해 CO2 방출을 수행하기 위해서, WO 2004/085643에 개시한 바와 같은 중화 장비가 바람직하게 사용된다. 이 장비는 약 3 - 200 mm의 내경(공정 규모에 따라)을 갖는 튜브(tubing)으로서, 바람직하게는 튜브벽에 플록이 전단되는 것을 피하기 위해 8 mm 이상의 내경을 갖는다. 흐름 배향은 어떤 방향이든 좋으며, 바람직하게는 상향(나선형)이다. 혼합거리가 30 cm 내지 수 미터에 이름으로써 용액이 부드럽고 완전하게 혼합되게 하며 따라서 세포-유래 불순물의 침전 및 CO2 방출이 완전하게 이루어지게 한다. 혼합거리, 튜브의 내부 직경 및 혼합 장비내 정체 시간은 혼합의 질에 영향을 미치며, 따라서 침전물의 형성 및 CO2 방출에도 영향을 준다.
단계 d)를 비-연속성 모드로 포함하는 다른 실시형태에서, 카보네이트염은 "부유 용액"으로서 첨가되거나 고체염으로서 정화 장비에 수집된 중화된 용해 세포 용액에 첨가된다. 정화 장비는 바람직하게 WO 2004/085643에 개시된 바와 같이 디자인된다. 이 실시형태에서 "부유용액"은 바람직하게 바닥의 출구로부터 첨가되어, 정화장비의 바닥에 위치하는 정체 물질을 통해 정화 장비의 전체 직경에 대해 부유 용액이 고르게 분포하도록 한다. 고체 카보네이트염을 추가하는 실시형태에 대해서는 고체염은 상부의 부가적인 입구로부터 첨가되며, 정화장비의 하부에 부가적으로 설치된 혼합기에 의해 균일하게 혼합될 수 있다. 중화된 용해 세포 용액에서 충분히 균일하게 CO2가 방출된다면, "부유 용액" 또는 고체 카보네이트는 어떤 다른 위치에 또는 어떤 혼합법으로도 첨가할 수 있으며, 이로써 본 발명 방법의 개선된 부드러운 침전물 부유를 수행할 수 있다.
모든 실시형태에서 "부유용액"이 사용되는 경우(중화 용액 첨가후 가해짐), 혼합비(중화된 용해 세포 용액의 부피당 첨가된 "부유용액"의 부피)는 바람직하게 한편으로는 침전물이 완전하고 컴팩트하게 부유할 수 있게 CO2가 방출되도록, 다른 한편으로는 용해물이 너무 심하게 희석되지 않도록 선택된다.
d) 분리/정화(및 임의의 세척)
산업적 규모의 공정에서, 카보네이트염에서의 CO2 방출에 의해 알칼리 용해 공정의 중화 동안 생성된 침전물의 부유를 증강시키는 방법을 유리하게 적용하기 위해서는, 정화(플록 침전물의 분리)를 위한 방법 및 장비가 결정적이다.
본 발명의 방법을 유리하게 적용하기 위해서, 3개의 정화 모드가 가능하다:
I. 연속식
II. 반연속식
III. 비연속식(회분식)
첫번째 정화 모드는 그 자체가 신규하고 본 발명의 중요한 일 부분인 장비를 사용하는 방법에 따라 수행되는 반면, 두번째와 세번째 정화모드는 부분적으로는 WO 2004/085643에 이미 개시된 바 있는 방법 및 정화-장비에 기반한다.
연속 시스템 (I)에서, CO2 방출은 통상 중화된 용해세포용액이 정화 장비내로 들어가기 전에 일어난다. 그럼에도 불구하고, 정화 장비(c 단계에서 상술한 바와 같은)에서 후술하는 정화 장비의 출구위로 부유용액을 첨가함으로써 CO2가 방출되는 것도 가능하다. 완전 연속 시스템에서 플록과 용해물은 연속적으로 정화 장비내에서 분리된다. 용해물은 바닥의 출구에서 회수되며 플록은 정화 장비의 상부에서 출구를 통해 회수된다. 본 발명 방법의 장점은, 플록와 용해물이 연속적이고 신속하게 분리되기 때문에 접촉 시간이 최소화되고, 이로써 분해 및 불순물이 도입될 우려가 최소화되며, 따라서 고품질의 pDNA가 수집된 용해물내 존재하게 된다.
신규한 정화 장비는 유리, 스테인레스스틸, 플라스틱 또는 약제학적 제조에 허용가능한 물질로 제조될 수 있다. 정화장비의 기본적인 셋업은 도 13a에 도시되어 있다. 정화장비는 도 13b에 도시된 바와 같이 확장될 수 있다. 정화장비의 주요부의 형태는 실린더형일 수 있으나, 원칙적으로 중공형 몸체이면 모두 적용가능하다. 단계 d)는 본 발명의 방법에서 반응기의 형상에 무관하다.
정화장비는 바닥에 출구(6)가 있고 상부에 다른 출구(9)가 있으며, 이들은 바닥에서 전-정화 용해물을 연속적으로 회수하고 상부에서 부유하는 침전 플록을 연속적으로 제거하기에 유리하도록 디자인되어 있다. 출구는 바람직하게 정화장비의 상부 및 바닥에서 단면의 중심에 위치되나, 상부 및 바닥의 다른 위치도 가능하다. 또한 정화장비는 바닥과 상부 출구사이의 위치, 바람직하게는 이 거리의 중간에 포트(15)를 가지고 있다. 출구 및 입구(1)들은 바람직하게 밸브(2, 5, 8)와 함께 장착되어 있으며, 이는 별개로 개방되거나 폐쇄될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 밸브는 개방 및 폐쇄 도관으로 적절한 장비(바람직하게는 막 밸브)이다.
이 신규한 정화장비는 완전히 연속적 모드로 작동될 수 있기 때문에, 반-연속 또는 회분식 정화장비에 비교하여 그 크기를 줄일 수 있다. 산업적 규모의 제조를 위한 주로 실린더형의 전형적인 치수예를 보면, 10-1500 kg, 바람직하게는 50 -750 kg의 바이오매스의 프로세싱에는 직경 20-100 cm이고, 길이는 50-300 cm, 바람직하게 직경 30-80 cm 및 길이 100-250 cm이다. 길이에 대한 직경비율은 1:1 내지 1:10, 바람직하게 1:2 내지 1:5이다. 장비의 길이를 증가시키면 부유 플록의 분리 및 배수가 더 좋아질 수 있다.
정화장비는 포트 (15)를 장착하며, 이는 중화/침전 및 바람직하게 CO2 방출이 일어나는 튜브와 연결된다. 이 포트는 그자체로 정화장비의 입구이며 중화/침전 튜브와 직접 연결된다. 또는 포트는 분배 튜브 (3)와 연결되며, 이 튜브가 중화/침전 튜브와 연결된다. 포트가 입구인 실시형태에서, 이 입구는 정화장비내로 투사되는 어떤 추가적 부분을 갖고 있지 않는 정화장비의 측면 자켓의 단순한 구멍이다. 다른 실시형태에서 바람직하게 제거가능한 분배튜브(임의로 약제학적 제조에 적합한 강성물질로 제조된; 예, 스테인레스스틸)이 정화장비에 연장된다. 튜브는 임의로 정화장비의 중간에서 끝난다. 단부는 개방되어 있다.
양 실시형태에서 포트(제1 실시형태에서 연결 포트 또는 연장된 튜브에서 말단)는 전술된 바와 같이 바닥과 상부 출구의 중간 높이, 바람직하게 거리 중간에 위치한다. 포트/입구는 중화 튜브(16)와 비교시 동일하거나 더 큰 직경을 갖는다. 두번째 실시형태에서 포트는 정화장비의 어느위치에든 위치할 수 있다. 바람직하게 분배튜브는 중화된 용해세포용액의 상향흐름이 허용되도록 그리고 정화장비의 중간에서 종결되도록 배향된다.
기체 방울이 부착된 플록을 이미 함유하는 중화된 용해세포용액이 포트(15)나 분해튜브(3)를 통해 정화장비로 들어가면(1), 즉시 상이 분리된다. 부착된 기체방울덕분에 플록의 밀도(부피당 질량)는 CO2의 방출이 없는 공정과 대비시 훨씬 감소된다. 따라서 플록(7)은 정화장비에서 다소 투명한 용액(용해물)의 계면상에서 부유되기 시작한다. 정화장비내 액체수준이 입구보다 더 위인 경우에는, 기체 방울-침전-복합체 (7)는 상부 출구쪽으로 상향 이동된다.
정화단계의 초기에는 정화장비가 비어있다. 바닥 출구/밸브 (5/6)는 정화장비가 중화 용해 세포용액으로 채워질때까지 폐쇄된다. 부착된 기체 방울로 인해 플록의 밀도(부피당 질량)는 CO2의 방출이 없는 공정과 대비시 훨씬 감소된다. 따라서 플록(7)은 장비의 상부에 모이게되고, 다소 투명한 액체 용해물은 장비의 하부에 모인다.
또는 정화장비가 이미 액체, 일반적으로 용해물과 유사한 성분을 포함하는 버퍼로 채워진다. 공정을 시작하면, 바닥 출구/밸브 (5/6)가 개방되고, 전 공정동안 정화장비내에서 용해물-플록 계면이 일정한 수준을 유지하도록 유출이 조절된다. 용해물-플록 계면은 임의로 자동화된 바닥 밸브의 개방범위를 조절함으로써 일정 수준이 유지된다. 바닥에서 시간당 유출 부피는 시간당 공급부피(입구)보다 적다. 따라서 추가적인 부피는 상부 출구(8/9)를 통해 정화장비밖으로 나가야 한다. 용해물-플록 계면이 상부 출구아래이기 때문에 대부분의 플록(최소한의 잔여 액체를 포함하는)은 공정 동안 상부출구를 통해 빠져나가게 힘을 받는다. 공정이 종결되기 위해, 입구 밸브를 폐쇄함으로써 공급을 중지하고, 용해물 상부에 부유하는 잔여플록이 바닥 출구(5/6)에 도착할 때까지, 잔여 용해물을 바닥 출구(5/6)를 통해 회수한다.
공정을 종결하는 다른 옵션은 먼저 바닥 출구(5/6)를 폐쇄하고, 모든 잔여 플록이 상부 출구(8/9)를 통해 장비밖으로 나갈때 까지, 임의로 용해물과 유사한 성분을 갖는 버퍼용액을 계속적으로 정화장비에 공급하는 것이다. 장비내 존재하는 투명한 용해물은 이후 상술한 바와 같이 바닥 출구(5/6)를 통해 간단히 회수된다(상부 출구 (8/9) 및 입구 (1/2)는 폐쇄되고; 상부의 별개의 벤팅 밸브 (10)는 개방된다).
이상의 공정 종결을 위한 두 옵션은 후술하는 바와 같이 결합될수도 있다: 먼저 용해물을 옵션 1에 따라 회수하고, 두번째로 플록을 옵션 2에 따라 상부 출구를 통해 정화장비로부터 내보낸다.
CO2가 정화장비로부터 방출되는 대체 실시예에서(단계 c)에 전술된 바와 같이), 정화장비내 중화된 용해 세포용액을 위해 상술된 것과 유사하게 디자인된 부가적인 포트/입구를 통해 용해물-플록 혼합물내로 연속적으로 "부유용액"이 첨가된다. 임의로 이 포트/입구는, 더 나은 흐름 분포(예, 천공 플레이트나 프릿)를 위해 정화장비와 연결되거나 이에 도달하는 수단을 말단부에 장착할 수 있다. 이러한 입구는 바닥 출구와 중화된 용해세포용액을 위한 입구 사이에 위치되어야 한다.
새로운 정화장비의 바닥부는 임의로, 공정이 중단된 후 완전한 용해물 회수(완전한 방출) 및 완전한 세척용액의 제거를 보증하기 위해, 약간 원추형이다. 이러한 바닥부는 바닥 출구위로 잔여하는 비-부유 플록을 정체시키기에 적당하도록 픽스쳐 (4)를 장착할 수 있다. 제거가능한 픽스쳐를 위해, 정화장비의 바닥부는 나머지 장비에서 분리할 수 있다. 픽스쳐는 천공 플레이트, 체, 네트, 프릿 또는 용해물을 투과할 수 있는 다른 장비나 물질일 수 있다. 이러한 픽스쳐 물질은 전체 정화 시스템에 대해 스테인레스스틸, 유리, 폴리프로필렌 또는 약제학적 제조에 적합한 기타 물질일 수 있다. 특히 일 실시형태에서 픽스쳐는 WO 2004/085643의 정화장비에서 상술된 정체층과 유사하거나 동일한 파트를 갖는 정체층이다.
최소량의 비-부유 플록이 원하지 않게 나오는 것과 관련되어 안전함을 보증하기 위해, 부가적으로 깊이 필터(depth filters)를 상술한 정화장비의 바닥 출구 라인에 설치할 수 있다. 또는 질높은 정화를 위해 WO 2004/085643에 기재한 바와 같은 정화장비에 회수된 용해물을 공급할 수도 있다.
신규한 정화장비의 상부는 임의로 테이퍼링되며, 바람직하게 상부 출구 밸브 (8) 및 약제학적 제조에 적합한 물질로 이루어진 밸브옆에 오는 출구 튜브의 내경과 유사한 내경에 원추형으로 테이퍼링된다. 정화 장비 상부(결과적으로 상부 밸브 및 이에 따르는 튜브)의 상부 테이퍼된 말단의 내경은 약 3-200 mm (공정 규모에 따라)이며, 바람직하게 튜브벽에서의 플록의 전단을 회피하기 위해 8 mm 이상이다. 정화장비의 상부의 테이퍼링각은 10°- 80°, 바람직하게는 25°- 65°이다. 테이퍼링은 상부 출구에 병목을 생성하며, 부유 플록(7)의 배수를 증가시키고, 배출되는 플록을 통한 용해물의 소실을 감소시킨다. 이러한 정화장비의 테이퍼된 상부는 임의로 탈착가능하다 (예, 분리 세척을 위해).
다른 실시형태에서, 플록과 용해물 분리를 위한 부가 유니트 (도 13 b)가 정화 장비의 상부 출구/밸브 (8/9)에 바람직하게 직선으로 연결되어 있다. 이 부가 유니트는 정화장비(실린더형의 주부분)의 상부와 유사한 형태를 특징으로 한다. 이 부가 유니트의 길이는 주된 정화장비에 비해 더 짧을 수 있으며, 예컨대 주 장비 길이의 약 1/3이다. 이 부가 파트의 입구 (11)는 같은 내경으로 주 정화장비의 상부출구(9)와 연결된다. 입구 (11) 옆에서, 부가 유니트의 직경은 증가된다(예, 주 정화장비의 내경과 동일한 정도). 바람직한 일 실시형태에서 부가 유니트의 입구 (11)는 이 유니트의 최저점이 아니다. 이 대체 실시형태에서는 부가 유니트의 바닥이 전체 바닥 영역에 걸쳐 입구에서 자켓까지 내려가거나 어떤 지점에 있다. 밸브 (12)를 갖는 출구 (13)가 바닥의 최저부에 위치할 수 있다. 전-배수된 플록이 부가 유니트의 입구 (11) 옆의 확장부에 들어갈 때, 추가적인 상분리 공정이 일어난다. 플록이 다시 부가 장비의 상부로 부유하는 동안(7), 플록사이에 붙들여 잔여하는 용해물이 하부 영역에 모이고 밸브 (12)를 통해 출구 (13)에서 회수될 수 있으며, 상기 밸브는 임의로 자동적으로, 주기적으로 또는 연속적으로 개방되어 최소한의 플록이 용해물과 함께 배출되도록 한다. 이 부가 유니트의 상부는 주 정화장비의 상부와 유사하게 디자인되며, 출구 (14), 밸브 (8) 및 분리 벤팅 밸브 (10)를 가지고 있으며, 임의로 제2의 출구를 갖는다. 단일 상부 출구 (14)를 갖는 실시형태에서 플록은 주 정화장비에서 상술한 것과 동일한 방식으로 배출된다. 두개의 상부 출구를 갖는 실시형태에서, 출구중 하나는 제거가능한 프릿 또는 연결 필터를 장착하며, 이는 용해물을 회수하는 또다른 지점이다. 두번째 상부 출구의 밸브가 공정동안 폐쇄된 때(이 부가 유니트의 바닥 출구가 폐쇄된 것으로 가정)에는 용해물은 다른 상부 출구를 통해 배출되고 플록은 프릿이나 필터에 의해 정체된다.
부가적으로 이 유니트에서 회수된 용해물은 주 정화장비의 출구(6)에서 회수된 투명한 용해물 또는 주 정화장비내 하부 용해물 상에 적절한 튜브로 첨가될 수 있다.
장비의 주된 정화는 상술한 하나이상의 부가 튜브로 확장될 수 있다(캐스캐이드처럼).
또 다른 실시형태에서 다른 부가 정화 유니트가 주 부가 장비의 상부 출구에 연결될 수 있다. 이 부가 유니트는 다른 튜브내 들어있는 튜브(튜브내 튜브)로 구성된다. 내부 튜브는 주 정화장비의 상부 출구와 연결되며 출구와 유사한 그러나 최소한 8 mm의 내경을 갖는다. 외부 튜브는 전체 길이를 따라 내부 튜브를 감싸며, 주 정화장비와 내부 튜브가 연결된 지점 옆에 출구(임의로 밸브를 장착한)를 갖는다. 외부 튜브는 예컨대 적당한 개스킷에 의해 양단에서 내부 튜브에 고정된다. 이러한 튜브내 튜브 조합의 방향은 주 정화장비의 출구에서 상향으로 약간 경사되어 있다. 길이는 30 cm 내지 3 m, 바람직하게는 0.5-2 m이다. 내부 튜브는 전체 길이를 따라 재킷의 방사상 하부 중간에, 바람직하게 플록이 통과하는 것을 피할 수 있는 크기(직경 0.5-3 mm)의 홀로 천공된다. 주 정화 장비의 출부로부터 배출되는 플록은 내부 튜브를 통과하도록 강제된다. 부착된 기체 방울 때문에 플록은 튜브의 방사상 윗부분에서 주로 이송되며, 잔여하는 용해물은 천공을 통해 내부 튜브에서 나오며 외부 튜브에 수거되고 외부 튜브 출구에서 회수된다. 이로써 플록은 더 배수되고 용해물 회수가 증가된다. 이 유니트에서 부가적으로 회수된 용해물은 주 정화 장비의 출구에서 수집된 정화된 용해물에 추가되거나, 적절한 튜브에 의해 주 정화 장비의 하부 용해물상에 첨가된다.
또 다른 실시형태에서 신규한 정화 장비의 상부는 기계적 스키머(skimmer)를 장착할 수 있으며, 이는 연속적으로 정화 장비의 상부 출구에서 배출되는 플록을 걷어낸다. 이 실시형태에서 상부 출구는 추가적인 프로세싱을 위해 걷어진 플록을 수집할 수 있는 스키밍 톱(skimming top)을 장착한다.
또 다른 실시형태에서, 플록은 상부 출구에서 단순히 넘쳐나와 상부 출구에 방사상으로 부착된 수집링에 수집된다. 상부 출구에서 넘쳐나옴으로써 플록은 배수되고, 수집링에 떨어지기 전에 천공 스크린(아래 배수된 용해물을 수집하는 링을 갖는)상으로 흐름으로써 세척된다. 수집링의 바닥은 바람직하게 경사져서 수집된 플록들이 자동적으로 배수된 ("건조") 침전물을 수집하는 탱크로 유도된다.
또 다른 실시형태에서 부유 플록은 주 정화 장비의 상부 출구에서 펌프로 흡인될 수 있다.
상술한 모든 부가적 정화 유니트는 서로 조합될 수 있다.
분리된 플록은 임의로 추가 프로세싱된다(예, 잔여 배수, 세척). 잔여 배수(Residual draining)는 본 기술분야의 공지 방법에 따라 수행될 수 있다(예, 여과(바람직하게 깊이 여과)), 필터 프레스 적용, 원심분리 또는 이들 균등물). 유리한 부드러운 배수법은 플록 세척단계와 조합될 수 있으며, WO 2004/085643에 개시되어 있고, 특별히 디자인된 바닥에 정체 물질을 갖는 부드러운 분배기를 포함하는 정화 반응기를 사용한다. WO 2004/085643의 정화 반응기에 배출된 플록을 적용하고 상술된 대로 배수 및 세척 과정을 수행함으로써 거기 기술된 방법 및 장비는 본 발명의 방법과 용이하게 조합할 수 있다.
세척용액/버퍼 조성물은 플록을 재용해시키지 않도록 선택된다. 세척은 또한 배출하는 플록 흐름과 세척 용액/버퍼를 조합하고, 이를 중화 튜브(WO 2004/085643)와 유사한 장비내에서 혼합/접촉함으로써 수행될 수 있다. 임의로 플록은 별도의 탱크에서 세척될 수 있다(회분 또는 유가 모드).
또 다른 본 발명의 실시형태에서, 플록은 신규한 정화 장비내에서 재순환될 수 있다. 따라서 정화 장비의 상부 출구에서 나간 부유 플록의 일부는 다시 적절한 튜브와 원료 용액의 입구 근처의 별개의 입구를 통해 다시 정화 장비로 이송된다(예, 펌프에 의해). 이 실시형태를 위해서는 새로운 정화 장비에 부가적인 부유 용액을 공급하는 것이 유리하다.
상술한 실시형태에서 모든 밸브는 바람직하게 막 밸브이나, 예컨대 볼 밸브, 게이트 밸브 또는 개방/폐쇄 라인/파이프 및/또는 용기에 적합한 모든 것일 수 있다. 본 실시형태에 상술된 일부 밸브(예, 상부 출구 밸브)는 본 발명의 기본적인/주된 특징에 영향을 미침없이 생략될 수 있다.
반-자동식 시스템(II)에서 CO2 방출은 통상 중화된 용해 세포 용액이 정화 장비내로 들어가기전에 일어난다. 그럼에도 불구하고, 정화 장비에서 (단계 c)에서 언급된 대로), 상술한 정화 장비의 출구위로 부유 용액을 첨가함으로써 CO2가 방출되게 할 수도 있다.
본 발명의 방법을 반-연속식 모드에 적용하기 위해서, WO 2004/085643 에 개시된 정화 반응기가 정화 장비로서 바람직하게 사용된다. 중화된 용해 세포 용액(침전물을 함유하는)은 WO　2004/085643에 기술된 상부 입구 및 원래의 또는 특별히 디자인된 분배기를 통해 적용될 수 있다. 산성화에 의한 카보네이트염으로부터의 CO2방출에 기초한 본 발명의 방법에 의해 부유가 개선되기 때문에, 공정 동안 정체 물질이 막힐 우려는 상당히 감소된다. 따라서 정체층의 두께 및 조성은 예를 들면 층수 감소 또는 정체 물질의 미세성/공극성 변화 등이 조정된다. 예로서 단지 성근 유리 비드가 하부 프릿위에 사용될 수 있다.
본 발명의 반-연속식 모드 방법의 다른 실시형태에서, 단지 최소한의 정체물질(예, 단일 사용 프릿)이 WO 2004/085643의 정화 반응기에 사용되거나 또는 전혀 사용되지 않는다. 부가적으로, 최소량의 비-부유 플록이 원하지 않게 나오는 것과 관련되어 안전함을 보증하기 위해, 부가적으로 깊이 필터(depth filters)를 상술한 정화장비의 바닥 출구 라인에 설치할 수 있다.
반-연속식 공정은 정화 반응기가 완전히 (부유)플록으로 채워질때 종결된다. 정화 반응기내 플록은 WO 2004/085643에 상술된 방법에 따라 세척 및 배수될 수 있다.
비록 WO 2004/085643에 기술된 정화 반응기가 본 발명의 방법을 반-연속식 모드로 수행하는데 바람직하고 이롭기는 하나, (반)연속식 용해물의 회수를 위한 출구 및 입구를 갖는 어떤 중공 몸체도 본 목적에 적합하다.
본 발명의 반-연속식 정화 모드는 다른 본 기술분야 공지의 반-연속 정화법에 비교하여 용량이 증가된다는 장점이 있다. 침전 플록에 부착된 CO2 방울에 의해 부유가 개선되기 때문에 부유 플록층은 더 콤팩트해지고 플록간 갇힌 용해물의 양이 적어진다. 분리된 용해물상의 회수는 플록간 갇힌 용해물의 회수보다 훨씬 쉽다.
상술된 반-연속식 정화를 위한 시스템/방법은 비-연속식(회분)모드에서도 적용/수행될 수 있다.
비-연속식(회분)시스템(III)에서, 전체 중화된 용해세포 용액에 의해 장비가 채워지고, 부유용액을 첨가하기 위한 약간의 공간이 남은 후에 CO2 방출이 일어난다. CO2 방출은, 정화장비의 출구위로 부유 용액을 첨가함으로써, 정화 장비내에서 직접 수행된다(단계 c)에서 언급된 바와 같이). 이 비-연속식 시스템은 정화 장비의 부피 용량에 의해 제한된다. 일단 정화 장비가 플록 침전물을 함유하는 중화 용해세포 용액으로 거의 완전히 채워지면, CO2 -매개 부유가 시작된다. 바닥 출구는 부유가 종결될때까지 폐쇄된다. 그 뒤 용해물은 반-연속식 시스템에서 상술된 것과 유사한 방법으로 회수된다. 정화 장비는 반-연속식 시스템에 주어진 예와 유사하게, 바람직하게 WO 2004/085643 에 상술된 정화 반응기에 따라 디자인된다(반-연속식 시스템을 위해 전술된 바와 같은 유사한 적용/변화 가능). 반-연속식 시스템에서 상술된 바와 같이 임의로 플록을 배수하고 세척한다.
상술된 시스템 중 어느 하나에 의해 회수된 생성 용해물은 광학적으로 투명하고 직접 추가적으로 프로세싱 예컨대 크로마토그라피 기술로 포획하거나 또는 부가적인 간단한 미세 정화, 예컨대 여과로 더 정제될 수 있다.
e) 정제:
본 발명의 a) 내지 d) 단계에 후속하는 공정은 후속 단계에서 대상 생분자의 분리(포획) 및 정제를 촉진하는 것이다(예, 연속 또는 비-연속 농축, 컨디셔닝, 여과, 크로마토그라피).
상술한 정화 시스템 중 하나를 사용한 부유가 개선된 본 발명의 공정은, 비제한적으로, 전단력에 민감한 생분자, 바람직하게 폴리뉴클레오타이드, 특히 플라스미드 DNA, 및 큰 단백질, 예컨대 항체에 적합하다.
본 발명의 방법은 어떤 대상 생분자에도 사용될 수 있다. 단백질 제조를 위해, 대상 단백질의 특이한 요구를 만족시키도록 디자인될 수 있다. 본 발명의 방법은 발효 공정이나 단백질 공급원(예, 박테리아, 효모)에 독립적이다.
세포 분해 및 뒤따르는 프로세싱 단계에 적합한 특이한 방법의 선택은 발효후 세포내 단백질의 상태에 강하게 영향을 받는다: 만약 단백질이 과발현되면, 소위 "봉입체(inclusion bodies)의 형태로 존재할 수 있다. 이 경우, 세포 용해동안 환원제(예, 디티오트레이톨, DTT)와 함께 예를 들어 강한 알카리와 함께 처리하는 경우, 이 단계에서 변성된 형태인 단백질의 재용해를 초래한다. 단백질의 원래 구조를 재구축하기 위해, 중화(예, 인산의 첨가에 의해)에 의해 리폴딩할 수 있으며, 이때 CO2 방출이 동시에 중화 반응기 또는 용해 반응기와 유사한 제2의 반응기에서 일어난다. 불용성 성분은 정화 장비에서 단백질-함유 용액으로부터 분리된다.
대상 단백질이 세포내에서 용해성인 경우, 세포는 상술한 것과 유사한 방식으로 용해 반응기에서 분해된다.
용해 반응기에서, 조건(접촉 시간, 용해 용액의 농도)는 단백질이 용해상태로 존재하도록 선택되거나 또는 특이적으로 변성되거나 단백질을 침전시키게 파라미터를 세팅한다. 처음의 경우, 용액은 중화 반응기(구조 측면에서 폴리뉴클레오타이드에 사용되는 중화 반응기나 용해 반응기와 유사하다)나 정화 장비에서 더 프로세싱되며, 이는 용해된 봉입체에 상술된 바와 같다. 단백질이 변성된 상태로 존재하는 경우, 침전은 용해 반응기에서 이미 일어날 수도 있고 또는 이후 중화 반응기에서 일어날 수도 있다(CO2 방출과 함께, 중화/침전제의 첨가에 의해). 양 경우 모두, 침전 조건은 바람직하게 대상 단백질을 특이적으로 침전시키도록 선택된다(원하지 않는 불순물 예컨대 RNA, 엔도톡신 및 DNA는 용해된 상태로 존재). 침전은 이후 정화장비내에서 용액으로부터 분리된다. 이후 침전은 정화장비에서 제거되거나(본 발명의 연속적 시스템(I)에 상술된 바와 같이, 적절한 버퍼로 흡인하거나 씻어냄으로써 연속적으로) 또는 이 장비에서 직접 더 프로세싱된다. 장비에서 제거된 후, 침전(대상 단백질)은 적합한 버퍼를 사용하여 별개 용기에서 재용해되며, 적합한 버퍼는 케이스별로 경험적으로 결정된다. 이 경우 침전은 정화장비에 남으며, 거기에서 재용해가 수행된다(적합한 버퍼의 첨가 및 임의의 혼합에 의해). 침전(특히 대상 단백질)이 재용해되자 마자, 바닥의 추구를 통해 정화장비로부터 용이하게 제거될 수 있다.
본 발명의 단백질 제법 방법의 모든 변형에서 공통적인 것은 생성되는 단백질 용액을 더 프로세싱하기 위한 선택들이다. 부가적인 리폴딩 단계 옆에, 폴리뉴클레오타이드 용액을 프로세싱하기 위해 상술된 동일한 단계(연속적 또는 비-연속적인 농축, 컨디셔닝, 여과, 포획)를 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은 치료적 생분자의 제조에 요구되는 모든 허가요건을 만족한다. 폴리뉴클레오타이드에 적용되는 경우, 본 발명의 방법은, 발효단계가 고품질의 원료물질을 공급하도록 적정화되어있기만 하면, 고율의 플라스미드 DNA를 ccc 형태로 산출하며 불순물은 낮은 비율로 존재한다(예, 단백질, RNA, 염색체 DNA, 엔도톡신). 본 방법은 RNase나 리소자임과 같은 단백질이 요구되지 않으며, 용해 단계 b)를 제외하고는 세제의 사용도 요구되지 않는다. 정화전 용해물과 플록 침전의 접촉 시간은 상당히 줄어든다. 또한 본 방법은 기체의 공급(외부 공급원으로부터) 없이 수행된다.
본 발명의 방법은 다량의 폴리뉴클레오타이드 함유 세포의 처리를 위해 규모확장이 가능하며, "산업적 규모"로 통상 1 킬로그람 이상의 습윤 세포를 처리하도록 작동될 수 있으며, 시장 공급뿐 아니라 임상시험을 위한 요구를 충족하도록 대상 폴리뉴클레오타이드를 1g 에서 수백그람 내지 수킬로그램에 이르는 수율로 제조할 수 있다.
본 방법은 대상 생분자의 크기, 순서나 기능에 제한되거나 한계없이 적용될 수 있다. 대상 폴리뉴클레오타이드는 0.1 내지 약 100　kb 이상의 크기를 갖는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 바람직하게, 대상 폴리뉴클레오타이드는 선형 DNA, 즉, 바람직하게 1　내지 20 kbp의 크기를 갖는 플라스미드 DNA (제한없이)일 수 있다.
본 발명의 방법 및 장비는 대상 유전자를 수득하는 세포 공급원에 의해 제한되지 않는다. 본 공정은 쉽게 시행될 수 있으며, 자동화 및 원하는 규모에 유여하며; 꾸준한 흐름이나 낮은 기계적 스트레스 충격을 보증하는 시판 펌프나 압력 시스템으로 흐름이나 반응시간을 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 이점은 본 장비가 살균가능하며, 발열원제거가 가능하며, 제위치세척 (CIP) 및 제위치 증기살포 (SIP)가 가능하다는 것이다.
본 발명에서 채용되는 방법과 장치는 폐쇄 시스템에서 조절가능하며 일정한 성능을 제공하여, 정화후 수득되는 연속적으로 제조된 용해물의 직접적인 추가적 프로세싱이 가능하며, 예컨대 이를 크로마토그라피 컬럼으로 로딩하거나, 컬럼 로딩전 용해물의 온라인 컨디셔닝 및/또는 여과가 가능하다는 것이다(도 2-4). 정화후, 컨디셔닝 또는 크로마토그라피 컬럼에 로딩하기 전에 중간 농축단계가 있을 수 있다(도 5).
본 발명의 방법에서, 단계 a)가 회분 또는 연속 모드로 수행되는지에 관계없이, 각 후속 단계는 연속적이고 자동화된 방식으로 수행될 수 있다. 바람직하게 b) 내지 e)단계에서 선택되는 최소한 두 단계의 조합은 각 단계를 계속적으로 연결하여 수행된다.
용해 단계 b)가 자동화/연속 단계인 경우, 이는 어떻게 세포 현탁액의 수득되는가(회분 또는 계속 조작, 발효 브로스를 직접 사용하는지 또는 임의로 동결후 수확 및 재현탁하는지)에 독립적이다. 또한 용해물이 수득되는 숙주에도 독립적이다.
중화 단계 c)가 자동화/연속 단계인 경우, 이는 어떻게 프로세싱된 알칼리 용해세포 용액이 준비되는지(예, 회분 또는 연속)에 관계없다. 바람직한 일 실시형태에서 중화단계에 후속되는 수집 탱크는 WO　2004/085643에 상술된 정화 반응기와 동일한 방식으로 디자인된다 (정화가 회분 또는 반-연속식으로 수행되는 경우).
정화 단계 d)가 자동화/연속 단계인 경우, 이는 어떻게 플록을 함유하는 프로세싱된 알칼리 용해세포 용액이 준비되는지(예, 회분식 또는 연속적)에 관계없다. 또한 정화 단계 전(또는 동안)이기만 하면, 언제 또는 어디에서 (정화 장비전 또는 정화장비에서) 본 발명 방법의 CO2 방출이 일어나는지에 관계없다. 나아가 생성되는 정화 용해물이 어떻게 더 프로세싱되는지에 독립적이다.
바람직한 일 실시형태에서, 정화장비의 유출은 다음 프로세싱 단계(예, 용액 컨디셔닝)에 필요한 용액의 흐름과 커넥터, 예컨대 T-　또는 Y-커넥터로 조합되거나 또는 직접 혼합 장비에서 조합된다. 두 용액은 특정 유속에서 통상적인 펌프로 펌핑될 수도 있다.
다른 실시형태에서, 제2 용액의 유속만이 정화장비를 떠나는 용해물의 유속에 조절된다. 이 목적을 위한 혼합 장비는 자동화된 용해 단계에서 상술된 것과 같은 비드로 체워진 장비 또는 중화단계에 상술한 것과 같은 튜브 시스템 일 수 있다(WO 2004/085643). 이러한 셋업은, 제1 크로마토그라피 단계를 위해 용해물의 컨디셔닝이 필요한 경우, 사용될 수 있다. 예를 들면, 암모늄 설페이트 용액(또는 간단히 물)을 이러한 방식으로 첨가할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 방법은 중간 농축 단계를 포함할 수 있다 (도 5): 정화장비를 떠나는 충분한 부피의 용해물이 존재하자마자, 용해물은 예컨대 한외여과 등에 의해 농축된후 컨디셔닝 및/또는 크로마토그라피 컬럼으로 로딩된다. 농축은 하나 이상의 패시지로 수행될 수 있으며, 그 자체로 연속식 또는 회분식 모드로 수행될 수 있다. 만약 오직 하나의 패시지가 일어나면, 정체물(예, pDNA를 함유하는)은 후속하여 직접 컨디셔닝되거나 크로마토그라피로 로딩된다. 여러번 패시지되는 경우, 정체물은 원하는 부피/농축에 도달할 때까지 재순환되며, 이후 더 프로세싱된다. 이러한 농축단계를 위해, 통상적인 장비, 예를 들어 카세트나 중공 파이버 형태의 막이 사용된다. 적합한 막의 컷-오프는 프로세싱되는 생분자의 크기에 의존한다. pDNA의 경우, 통상 10 내지 300 kDa의 컷오프를 갖는 막이 사용된다.
바람직한 일 실시형태에서, 용해 반응기 및 중화 반응기는 조합하여 두-단계 자동화/연속적 시스템을 형성한다. 이 경우, 용해 반응기의 유출액은, 자동화/연속적 중화 단계에 대해 상술된 방식(WO 2004/085643)으로 중화 용액의 흐름과 연결 및 혼합된다. 이렇게 함으로써, 펌핑된 중화 용액의 유속이 용해 반응기의 유속에 맞춰진다.
다른 바람직한 실시형태에서 중화 반응기 및 정화 장비가 조합하여 두-단계 자동화/연속적 시스템을 형성한다. 이 경우, 중화 반응기의 유출액은, 본 발명의 자동화/연속적 정화장비와 연결된다. 이 경우, 중화장비의 바닥 출구 밸브(및 임의로 상부 출구 밸브)의 개방도는 부유 플록 및 투명한 용해액의 계면 수준(정화장비에서 계면 높이)이 일정하게 유지되도록 조절되어야 한다. 이는 플록상이 아닌 액체상에 부유하는 통합된 플로터를 사용하여 계면 수준을 측정함으로써 달성할 수 있다. 다른 옵션은 정화장비의 바닥 출구에서의 흐름을 측정하는 것인데, 이는 경험적으로 정의된 파라미터(분배 계수)에 기초한 특별한 알고리즘에 따라 계면의 이론적 수준을 산출하는데 사용될 수 있다. 바닥 유출은 공급 흐름의 50% 미만이 되어서는 안된다. 가벼운 장애물과 같은 다른 시스템도 적용할 수 있다. 원칙적으로 계면을 인식하는데 적합한 모든 시스템이 사용될 수 있다. 출구 밸브에 부착된 전자 연결기로, 플록-용해물 계면 수준 또는 유출 흐름에 따라 단계적으로 또는 단계없이 유출을 조절할 수 있다.
다른 실시형태에서 용해 단계 및 정화 단계는 중간의 구별되는 중화 단계없이 두 장비를 직접 연결하여 연결될 수 있다.
중화는 이 경우 비/반 연속식 시스템(시스템 II 및 III)의 정화 장비에서 수행된다. 이 실시형태에서 중화 및 정화는 따라서 비-연속적으로 수행된다. 비-연속적 정화 장비의 출구는 처음에는 폐쇄되고 용해세포용액은 일정 부피의 중화용액과 결합된다. 중화용액은 정화장비내에 제시될 수 있다. 전체 용해세포용액이 정화장비내 수집된 후 중화용액이 첨가되는 경우, 이는 바람직하게 비/반 연속적 정화장비내 바닥 입구를 통해 수행된다. 양 경우에서 용해세포용액과의 혼합은 스터러로 (천천히) 교반함으로써 또는 장비 바닥의 입구를 통해 또는 액체 수준 및의 부가적 입구를 통해 공기를 도입함으로써 증강시킬 수 있다. 이 실시형태에서는 용해단계를 정화장비와 직접 연결되는데, CO2 방출이 정화장비에서 일어난다. 카보네이트(염)은 따라서 바람직하게 용해세포 용액의 성분이거나 또는 중화전 또는 후에 부가적으로 첨가된다(고체염으로 또는 "부유용액"으로 첨가되며, 이는 바람직하게 비/반연속식 정화장비(시스템 II 및 III)의 바닥 출구를 통해 첨가된다). 중화/부유가 끝날때, 비연속적-정화는 WO 2004/085643에 개시된 것과 동일한 방식으로 일어난다.
더욱 바람직한 일 실시형태에서, 모든 시스템은 완전히 자동화되며, 이는 최소한 모든 단계 b) 내지 d) 및 임의로, 부가하여 단계 a) 및/또는 e)를 연속적 시스템으로 채용함으로써 이루어진다. 이 실시형태에서, 용해 반응기의 유출액은 중화장비에 직접 연결되며, 중화장비의 유출액은 정화장비에 직접 연결된다. 이 실시형태에서 완전 연속 시스템(I) 또는 반-연속 시스템(II)이 CO2 방출에 의한 정화 개선을 위해 적용될 수 있다. 각 연결 및 장비 디자인은 상술한 바와 같다.
가장 바람직한 일 실시형태에서, 완전 자동화 시스템은 임의의 자동화된(및 연속적인) 컨디셔닝단계(및 장비)와 연결된다. 이 실시형태는 정화 장비를 떠나는 정화된 용해액과 컨디셔닝 용액(예, 암모늄 설페이트 용액)과 연속적으로 혼합되게 한다. 전술한 바와 같이, 이러한 컨디셔닝 단계는 후속하는 (크로마토그라피)정제 단계(예, 소수성 상호작용 크로마토그라피)를 위한 폴리뉴클레오타이드 함유 용해물 제조에 필요할 수 있다.
이러한 컨디셔닝 단계를 추가함으로써, 자동화 및 연속적인 세-단계 시스템이 연속적인 네-단계 시스템으로 확장된다. 이 실시형태에서, 바람직하게 용해 반응기와 동일한 타입의 장비를 사용하여, 컨디셔닝 용액은 정화된 용해물과 연속적으로 혼합된다. 이 장비는 전단력에 민감한 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 연속적으로 가장 부드럽게 혼합하는 것으로 판명되었다. 그러나 예컨대 통상적인 스터틱 믹서와 같은 다른 장비(예, 중화단계에서 상술된 바와 같은)도 이 목적으로 사용될 수 있다. 컨디셔닝용액을 펌핑하는 펌프의 유속은 흐름측정 유니트를 설치하여 정화장비의 유출속도에 맞출 수 있다. 펌프는 이 유니트에 연결되어, 두 혼합된 용액의 유속비가 일정하도록 조절될 수 있다. 컨디셔닝 및 포획 셋업 사이에, 온라인 여과 단계를 삽입할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 한외 여과 단계가 추가된다. 자동화된 세-단계 시스템의 확장에 의해, 본 공정은 연속적인 네-단계 시스템이 된다. 이 실시형태에서 전 단계에서 생성된 용해물은 한외여과에 의해 농축된다. 침투액이 버려지는 동안, 정체액은 컨디셔닝단계 및/또는 다른 로딩 단계에서 직접 더 프로세싱되거나(이는 하나 또는 두개의 부가적 단계에 의해 연속적인 시스템이 확장되는 것을 의미) 또는 원하는 최종 농도/부피가 도달될 때까지 재순환된다. 후자의 경우, 생성되는 농축액은, 농축이 완료된 후, 더 프로세싱된다(컨디셔닝 및/또는 로딩).
다른 실시형태에서, 정화장비에서 나오는 용해물은 크로마토그라피 컬럼으로 직접 로딩되거나, 농축 및/또는 컨디셔닝(후속 온라인 여과와 함께 또는 없이)후에 컬럼으로 로딩될 수 있다.
모든 상술한 자동화되고 개선된 (CO2 방출) 정화단계를 사용하는 실시형태에서, 수득된 투명한 용해물은 적합한 탱크에 수집되거나 또는 직접 더 프로세싱될 수 있다(예, 정화 장비의 유출액을 다른 장비, 예컨대 크로마토그라피 컬럼과 연결함으로써). 농축 및/또는 컨디셔닝 단계가 이 자동화 방법에 채용되는 경우, 농축 및/또는 컨디셔닝된 용해액은 적절한 탱크에 수집되거나 직접 더 프로세싱될 수 있다.
본 발명의 방법 및 장비는 용액을 펌핑하는데 사용되는 펌프에 독립적이다. 특정 실시형태에서, 수개의 현탁액 및 용액의 흐름은 펌프 대신 압력통 내 공기압에 의해 이루어진다.
본 발명의 방법 및 장비는 약제학적 등급의 pDNA 제조를 위한 cGMP (현행 우수의약품 제조기준)에 적합하다. 본 방법은 어떠한 pDNA 공급원, 예컨대 어떠한 박테리아 세포 공급원에도 적용될 수 있다. 특히 시스템의 특성상, 본 발명의 방법은 세포 용해물 프로세싱에 매우 중요한 대용량의 신속한 프로세싱을 가능케 한다. 용해물은 다양한 pDNA-분해 물질, 예컨대 DNases 등을 포함하기 때문에, 공정 시간은 산물의 고품질과 수율에 핵심 요소이다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 방법으로 가능해진 정화전 플록 침전과 용해물의 짧은 접촉시간은 본 발명의 매우 중요한 이점이다.
본 발명의 방법 및 장비는 인간 및 동물에 사용되기 위한, 예컨대 백신이나 유전자 치료에 적용되기 위한 pDNA의 제조에 적합하다. 높은 생산성으로 인해 본 방법은 허가 의약품의 시장 공급뿐 아니라 전임상 및 임상용 물질의 생산에도 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 장비는 전술한 바와 같이, 알칼리 용해, 중화 및 정화 및 상응하고 연결된 단계의 완전히 연속적인 실행을 가능하게 하므로, 본 발명의 방법 및 장비는 전적으로 규모의 확장이 가능하다(4000L 이상의 발효로 수득된 바이오매스의 프로세싱이 가능해진다).
도 1은 알칼리 용해, 중화(동시/후속 CO2 방출) 및 정화를 포함하는 조합된 연속적인 세단계 공정의 흐름도이다.
도 2는 도 1의 조합된 연속적인 세단계 공정의 흐름도에서, 연속적인 컨디셔닝 단계(예, 농축 및/또는 고염 침전)에 의해 연장된 것이다.
도 3은 도 2의 조합된 연속적인 세단계 공정의 흐름도에서, 부가적인 포획 단계에 의해 연장된 것이다.
도 4는 도 3의 조합된 연속적인 세단계 공정의 흐름도에서, 컨디셔닝 단계와 포획 단계 사이에 온라인 여과 단계가 포함된 것이다.
도 5는 도 4의 조합된 연속적인 세단계 공정의 흐름도에서, 컨디셔닝 전에 농축단계에 의해 연장된 것이다.
도 6은 알칼리 용해 반응기, 중화 반응기 및 "시스템 II" 및 "시스템 III" 정화 모드로 적용가능한, WO　2004/085643의 (적응된) 반-연속식 정화 장비의 연속적인 조합에 대한 모식도이다.
도 7은 "시스템 II"의 정화 모드를 도시한 것으로: 표준 방법 (b)(CO2 방출 없음)과 부유가 개선된 새로운 방법 (a)에 의해 수득된 부유 플록(WO　2004/085643의 적응된 파일로트- 규모 정화 장비에서)을 비교하여 나타낸 것이며, 상부 이미지는 전체 플록층을 나타낸 것이고 하부 이미지는 플록층을 확대하여 나타낸 것이다.
도 8은 실험실 규모로 종래 매뉴얼 방법(CO2 방출 없음)으로 수득한 대조 용해물의 분석 HPLC 크로마토그람이다.
도 9는 "시스템 II" 정화 모드를 도시한 것으로: 용해단계, 중화단계(CO2 방출 포함), 및 WO　2004/085643의 (적응된) 업-스케일된 장비에서의 반-연속식 정화단계를 포함하는 본 발명의 연속적 방법에 의해 수득된 용해물의 분석 HPLC 크로마토그람이다.
도 10은 용해단계, 중화단계(CO2 방출 포함), 및 WO　2004/085643의 (적응된) 업-스케일된 장비에서의 반-연속식 정화단계-"시스템 II"의 정화 모드-를 포함하는 본 발명의 연속적 방법에 의해 수득된 용해물을 포함하는 pDNA의 최종 정제 단계의 SEC 풀의 분석 HPLC 크로마토그람이다.
도 11은 "시스템 II" 정화 모드를 도시한 것으로: 본 발명의 신규한 통합된 부유법에 의해 수득된, WO 2004/085643의 (적응된) 업-스케일된 정화 장비에서의 부유 플록을 나타낸 것이다.
도 12는 "시스템 II" 정화 모드를 도시한 것으로: 회수 공정이 끝날 때, WO 2004/085643의 (적응된) 업-스케일된 정화 장비의 상부에서 CIP 볼을 사용한 플록(본 발명의 새로운 방법에 의해 분리된 플록)의 세척 과정을 나타낸 것이다.
도 13은 "시스템 I" 정화 모드를 도시한 것으로: 본 발명의 신규한 연속적 정화 장비의 a) 기본 셋업, b) 기본 셋업의 바람직한 임의의 연장부의 예시의 모식도이다.
도 14는 "시스템 I" 정화 모드를 도시한 것으로: 실험실-규모의 전개 셋업이다.
도 15는 실험실 규모로 종래 매뉴얼 방법(CO2 방출 없음)으로 수득한 대조 용해물의 분석 HPLC 크로마토그람이다.
도 16은 "시스템 I" 정화 모드를 도시한 것으로: 용해단계, 중화단계(CO2 방출 포함), 및 실험실-규모 전개 셋업에 의한 연속식 정화단계를 포함하는 본 발명의 연속적 방법에 의해 수득된 용해물의 분석 HPLC 크로마토그람이다.
도 17은 용해단계, 중화단계(CO2 방출 포함), 및 실험실-규모 전개 셋업에서 연속식 정화단계("시스템 I")를 포함하는 본 발명의 연속적 방법에 의해 수득된 용해물을 포함하는 pDNA의 최종 정제 단계의 SEC 풀의 분석 HPLC 크로마토그람이다.
도 18은 "시스템 I" 정화 모드를 도시한 것으로: 실험실-규모 셋업의 프로토타입이다.
실시예 1
pDNA -함유 대장균 세포의 제조
pDNA 함유 대장균 바이오매스를 WO 2004/085643 또는 WO2005/097990에 따라 제조하였다.
실시예 2
알칼리 용해 공정에서 중화 동안 카보네이트(염)에서 방출되는 CO 2 에 의한 부유 개선 원리 적용성의 검증
첫번때 실험은 바이오매스 없이 버퍼로만 수행하였다. 상이한 카보네이트-염(예, K2CO3 및 NaHCO3, 이들은 CO3 2 - 의 대이온으로서 K+ 및 Na+ 가 용해 또는 중화를 위해 사용되는 버퍼/용액내 이미 존재하기 때문에 특히 유리하다)을 재현탁 버퍼 또는 용해 용액에 0.5 M의 농도로 첨가하였다. 버퍼내 용해도를 검사하는 한편, 중화동안 방출되는 CO2 강도 및 이것이 플록(중화동안 생성되는)의 부유에 미치는 결과를 살펴보았다.
0.5 M NaHCO3가 바이오매스의 재현탁에 통상 사용되는 버퍼(0.05 M Tris 및 0.01　M　EDTA를 함유하고 pH 8임)에 잘 용해되었으며, 중화용액과 혼합에 의해 산성화될 때 격렬한 CO2 방출을 나타내었으며, 침전 SDS의 부유 방울이 생성되었다.
본 실험은 50 mL 재현탁 버퍼에 재현탁된 5 g 바이오매스에 대해 반복되었다. 재현탁 버퍼에 추가된 NaHCO3의 농도는, 지나친 방울(첫번째 실험에서 관찰된)을 피할 수 있도록 0.1 M 로 하였다. 재현탁된 바이오매스는 50 mL 용해용액(0.2 M NaOH, 1 % SDS)과 부드럽게 혼합하고, 2분간 접촉하였으며, 그후 중화용액(3 M KAc)으로 중화하였다. 본 셋업은 적정한(너무 강력하지 않은) CO2를 방출하고, 동시에 CO2 방울의 부착에 의해 침전-플록의 부유가 증강되는 면에서 잘 작동되었다. 부유 플록아래의 용해물을 분석하고 (HPLC), CO2 방출이 없는 표준 과정에 의해 수득된 용해물과 비교하였다.
CO2 방출과 함께 수득된 용해물내 pDNA-농도(수율)은 표준 용해물의 약 70 %이었다. pDNA 균일성은 양 경우 모두 80 %이상이었다. 부유 플록층은 CO2 방출이 있는 실험에서 더 컴팩트하였으며(CO2 방출이 없는 실험에 비교시), 이는 산업적 규모로 정화하는데 더 많은 이점을 부여한다.
이러한 초기 실험은 pDNA 제조를 위한 알칼리 용해 과정의 중화 단계 동안 생성되는 침전 플록의 부유 개선을 위한 CO2 방출에 기초되는 카보네이트염의 원리 적용가능성을 보여주었다.
실시예 3
카보네이트 -농도의 적정화( 재현탁 버퍼에서)
재현탁 버퍼(P1)에 각각 1.1 g의 바이오매스를 넣고 NaHCO3 농도를 달리하여(M = 대조, 0.05 M, 0.07 M, 0.1 M 및 0.2 M), 실시예 2에 전술한 실험을 수행하였다. 중화후 플록 함유 용해물을 3분간 두고 이후 원심분리로 정화하였다(실험실 원심분리 7500 rpm). 용해물(원심분리후 상등액으로 회수)을 농도(수율) 및 pDNA 균일성의 측면에서 분석하였다 (HPLC). 펠릿을 세척하고 세척-분획을 동일한 방식으로 분석하였다. 나아가 생성되는 용해물 용액(P2)와의 혼합물의 pH에 NaHCO3 첨가가 미치는 영향을 살펴보았다. 이 실험은 4번 반복하였으며, 그 결과를 하기 표 1(실시예 3의 결과(4회 반복의 평균))에 나타내었다.
P1 내 NaHCO3 농도(M) 수율(㎍/mL/%) 균일성(% ccc) P1/P2 혼합물의 pH
0 = 대조 80.6 / 100 73.7 12.7
0.05M 81.8 / 102 72.8 12.6
0.07M 74.1 / 92 69.6 12.5
0.10M 71.2 / 88 71.7 12.4
0.20M 38.8 / 48 71.3 10.9
재현탁 버퍼가 0.05 M NaHCO3 를 함유하고 있을때, 적정한 수율이 얻어졌다. 고농도의 카보네이트염이 사용될 때 수율이 감소하였으며, 0.2 M로 사용된 경우에는 상당히 감소하였다. pDNA 균일성은 비교적 안정하였으며 심각하게 영향받는 것으로 보이지 않았다. NaHCO3 농도가 높을수록 수율이 낮아지는 것은 주로 재현탁 버퍼 및 용해 용액 혼합물의 pH가 낮아지기 때문이다. pH는 세포 통합성의 정도/완전성에 결정적이기 때문에, 카보네이트염의 pH 감소효과는 더 높은 농도에서 고려되어야 한다. 본 실시예에서 임계적 pH는 12.5이다. 따라서, 용해 용액내 NaOH 농도를 변경하거나 재현탁 바이오매스 부피당 적용 부피의 변경 없이 더 높은 농도의 NaHCO3를 적용해서는 안된다. 모든 분석된 세척 분획은 유사한 pDNA 농도 및 균일성을 나타내었다.
실시예 4
중화동안 카보네이트(염)에서의 CO 2 방출 및 연속적인 알칼리 용해, 중화( CO 2 방출) 및 반-연속식 정화를 사용하는 공정에서 개선된 부유("시스템 II )
본 시험은 WO 2004/085643에 개시된 실험실/파일로트-규모 시스템의 원리를 사용하고 반-연속식 정화를 적용하여(시스템 II) 수행되었다. 오리지날 정화 반응기에 비교하여, 분배기는 본발명의 방법에 따른 개선된 부유/CO2 방출을 나타내는 방법에 맞춰졌다. 정화 반응기의 바닥에 닿는 슬롯을 갖는 튜브 대신 (정체 물질 위), 개방된 단부를 가지며 천공이 없는 튜브가 사용되었다(도 6). 부착된 기체 방울에 의한 부유 효과의 개선으로 인해, 플록은 즉시 하부 용해물 상을 통과하여 플록/액체 계면을 향해 위로 부유하였다. 따라서 정화 반응기에 들어가는 플록이 처음 사용된 분배기의 천공을 통해 빠져나감으로써 기존 플록층(공정동안 수준이 다양함)에 바로 분배될 필요가 없었다. 또한 중공의 스피럴(hollow spiral)이 빌트인되어 플록-세척 용액이 전체 플록층/반응기 직경에 걸쳐 고르게 분배될 수 있게한다(공정의 마지막에서).
실험은 100 g 바이오매스로 두번 시행되었다. 첫번째 시험에서(부유가 개선된), 0.05 M NaHCO3를 재현탁 버퍼에 첨가하였다. 두번째 시험에서 WO 2004/085643에 개시한 표준 파라미터 및 초기 정화 반응기 셋업이 사용되었다. 유속(혼합에 영향을 주면 용해 및 중화 장비에서 접촉 시간을 정의하는) 및 다른 작동 파라미터는 양 시험 모두 유사하였다. 양 시험에서 모든 3 용액/현탁액(재현탁된 바이오매스, 용해 용액, 중화 용액)에 대해 유속은 용해 및 중화 각각에 대해 약 1.5 분의 접촉시간에 상당하는 20　mL/분으로 조정하였다.
부유가 개선된 셋업으로 수득된 용해물은, 중공 파이버 한외여과에 의해 농축, 후속하는 소수성 상호작용 크로마토그라피(HIC) 단계에서의 결합을 위한 4 M 암모늄 설페이트 용액과의 혼합에 의한 컨디셔닝 및 여과(HIC 로드)에 의해 추가로 프로세싱된다.
대조 샘플로서, 1 g의 습윤 바이오매스와 동일한 재현탁된 세포 분취량(카보네이트염이 없는)를 종래의 실험실-규모의 순서에 따라 작은 튜브내에서 용해하고 중화하고, 정화는 원심분리 (12.000 g)로 수행하였다. 이러한 샘플을 사용하여 여기 기술된 부유가 개선된 실험실/파일로트 규모 공정의 수율을 산출하고 균일성(평탄성 및 품질에 대한 척도)을 비교하였다. 모든 샘플은 HPLC에 의해 분석하였다 (농도, 균일성, 추정 순도). 그 결과를 하기 표 2(부유가 개선된 연속적 용해/중화/정화 시스템(시스템 II)을 대조와 비교하여 나타낸 결과)에 요약하여 나타내었다.
샘플 균일성 (% ccc) 순도(%) 수율(%)
대조 90.3 6.4 100
용해물 91.3 4.9 -
HIC 로드 89.5 40.3 75.5*
* HIC-로드까지 총 수율(모든 전 단계, 특히 용해를 포함)
개선된 연속 방법(시스템 II 정화)에 의해 수득된 용해물의 균일성은 대조와 비슷하였다. 수율 및 순도(HIC-로드까지)는 부유 없이 연속적인 방법으로 수득된 것과 비슷하였다. 후속하는 HIC 단계는 예상된 대로 작동하였다 (부유 개선없이 수득된 용해물로 한 표준 시스템과 비슷하게). 도 7의 (a 및 b)에서, CO2 방출이 있는 방법 및 CO2 방출이 없는 방법으로 수득된 플록들의 부유(WO 2004/085643의 정화 반응기에서)가 비교되었다.
명백하게 CO2 방출이 있는 방법이 CO2 방출이 없는 방법(b1 및 b2로 확대된)에 비교하여 더 컴팩트한 플록층을 초래함을 알 수 있다(a1 및 a2로 확대된).
이것이 플록 정화에 있어 가장 중요한 것으로, 이는 반-연속식 정화 반응기의 용량 및 이로 인한 수율에 유익하며 완전히 연속적인 정화 시스템의 전제조건이 된다.
실시예 5
본 발명의 방법에 의한 용해물의 제조(부유가 개선된; 정화 모드 시스템 II ) 및 유속하는 정제.
CO2 방출 및 부유가 개선된 본 발명의 방법을 적용하여, 실시예 4에 기술된 대로 100 g 바이오매스를 분해하였다. 수집된 용해물 (3050 mL)은 중공 파이버 한외여과에 의해 600 mL로 농축하였다. 다음 단계에서 농축된 용해물은 4 M 암모늄 설페이트 원액과 혼합하여 컨디셔닝하고 이어 여과하였다. 컨디셔닝된 용해물 분취물 (575 mL)을 적절한 크기의 HIC 컬럼에 로딩하고 염-구배를 감소하여 용출하였다. HIC 풀은 음이온 크로마토그라피 (AEC) 및 크기 배제 크로마토그라피 (SEC)로 더 정제하고, 최종적으로 0.22㎛ 필터(약물)로 여과하였다. 그 결과를 하기 표 3 (부유가 개선된 연속적인 용해/중화/정화 시스템(시스템 II) 및 후속하는 정제 단계로부터 수득된 산물 (pDNA)을 대조에 비교하여 나타낸 결과) 및 4(약물 내 불순물 분석 결과)에 나타내었다. 대조 용해물은 실시예 4에 상술한 대로 준비하였다.
샘플 균일성(% ccc) 수율(%)
대조 91.1 100
용해물 92.0
약물 94.6 47.3
불순물 결과
엔도톡신 < 0.480 EU/mL
> 0.240 EU/mL
게놈 DNA 1 ng/㎍
RNA < 1%
단백질 1.47 ㎍/mL
상기 결과는 pDNA 균일성이 중화중 CO2 방출을 위한 카보네이트 염 첨가에 의해 부정적인 영향을 받지 않음을 보여준다. 또한 모든(후속하는)정제단계를 포함하는 총 수율은 약 50 %(용해/중화/정화가 CO2-증강 부유없이 WO 2004/085643에 개시된 바와 같은 통상적인 방법으로 수행되었을때 얻을 수 있는 총 수율 중 상위값)로서 매우 양호하였는데, 이는 카보네이트 염의 첨가가 정제에 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않음을 보여주며, 이는 약물내 낮은 불순물 함량에 의해서도 확인된다(통상적인 방법에 따라 제조된 약물에 대해 얻어진 결과와 유사함).
완전히 연속적인 정화 시스템(시스템 I)을 시뮬레이션한 적합한 시험에서 유사한 결과가 얻어졌다. 이 실험에서 부유 플록은 펌프로 흡인하여 연속적으로 제거되었다.
실시예 6
본 발명 방법의 시스템 II (또는 III )로서 응용되기 위한 WO 2004/085643의 업- 스케일된 정화시스템의 세팅 및 본 발명의 방법에의 활용
업-스테일된 정화 시스템의 주 구성은 WO 2004/085643에 이미 개시되었다. 부유가 개선된 본 발명의 방법에 응용되기 위해 두개의 주 파트가 다시 디자인되었다. 슬롯이 있는 분배기 대신, 정화 반응기의 바닥(정체 물질 위)까지 닫는(상부, 측면에서), 천공되지 않은 튜브를 사용하였다. 또한 상부로부터 세척을 수행할 수 있는(공정이 끝날때)부가적인 세척 장비를 설치하였다(하부로부터의 세척은 WO 2004/085643에 개시된 바와 같이 수행되었다). 이 장비는 플록위를 고르게 세척 용액을 분배하기 위해 사용되는 CIPing (제위치 세척)에 사용되는 회전볼이다. 이로써 세척용액의 흐름을 CIP 모드에 사용되는 것과 유사하게 감소시켜 플록의 파괴 및 가능한 불순물의 재용해를 회피한다.
부착된 CO2 방울에 의해 증강된 플록-부유를 갖는 새롭고 개선된 정화 방법의 확장성을 보여주기 위해, WO 2004/085643의 적응된 업-스케일 시스템을 사용하여 1.25 kg 습윤 바이오매스를 프로세싱하는 정화된 용해물을 제조하였다. 미리 냉동한 바이오매스를 재현탁하여 13.5 L 재현탁액을 만든후, 시스템에서 기체를 제거하고, 실시예 4 및 5에서 상술한 방법으로 용해, 중화 및 정화를 수행하였다. 펌프는 0.75 L/분으로 조정하여 용해 및 중화 반응기에서 약 1.5분의 접촉/혼합시간을 제공하였다. 생성되는 플록/용해물 혼합물을 정화 반응기에서 분리하고, 이때 대부분의 플록은 부착된 CO2 방울에 의해 매개되어 부유하여 상층의 컴팩트한 플록층을 형성하였다. 첫 번째 배수 단계 후 공정이 끝날 즈음에, 정화 반응기의 바닥에서 정체 물질(0.42　-　0.84 mm 및 3 mm의 직경을 갖는 유리 비드 및 폴리프로필렌 규화 플레이트)에 의해 정체된 플록을 양 측면에서 유속 3 L/분의 세척수로 세척하였다. 최종적으로 플록은 0.5바 가압(압력공기)로 배수하였다. 수득된 정화 용해물은 컨디셔닝 단계(여과 포함) 및 후속하는 크로마토그라피 단계 (HIC, AEC 및 SEC)로 더 (단계별로) 프로세싱되었다. 모든 샘플은 HPLC로 분석되었다 (농도, 균일성, 추정 순도). 도 8은 대조 용해물의 분석 HPLC 크로마토그람이고, 도 9는 연속 시스템(시스템 II 정화)에 의해 이 시험에서 수득된 용해물의 상응하는 크로마토그람이고, 도 10은 SEC 풀의 분석 HPLC 크로마토그람이다. 대조 용해물은 실시예 4에 기술된 대로 제조되었다. 표 5는 부유가 개선된 연속적인 용해/중화/정화 시스템(시스템 II) 및 후속하는 정제 단계로부터 수득된 산물 (pDNA)을 적응된 정화 반응기를 갖춘 업-스케일된 시스템에 의해 수득된 대조와 비교하여 나타낸 결과이다.
샘플 균일성 (% ccc) 순도 (%) 수율 (%)
대조 87.3 8.0 100
용해물 91.9 6.3 70.1
SEC 풀 94.0 100 39.9*
* 모든 전단계를 포함한 총 수율 (대조와 비교)
상기 산물 특이적 결과는 본 발명의 방법이 확장가능하다(scalable)는 것을 보여준다. 용해에 후속하는 모든 단계는 예측된 대로 작동하여 본 발명의 신규한 방법(카보네이트염에서 CO2 방출에 의해 부유가 개선된)으로 수득된 용해물이 표준 과정(WO 2004/085643에 기술된 바와 같은)에 의해 수득된 용해물과 동일한 방식으로 더 프로세싱될 수 있음을 보여준다. 도 11은 업-스케일된 시스템에서 부유가 개선된 본 방법의 이점을 보여주며-컴팩트한 부유 플록층이 수득된다. 도 12는 정화 반응기의 상부에서 CIP-볼에 의한 세척 과정을 보여준다. 본 시험은 6-배 더 많은 바이오매스에 대해 반복되었다.
실시예 7
본 발명 방법의 응용을 위한 완전 연속적 정화모드(시스템 I)에서의 실험실-규모 시스템의 세팅 및 그 활용
본 실험은 완전히 연속적인 (전)정화를 위한 새로운 셋업에 의해 확장된 WO 2004/085643에 기술된 실험실/파일로트-규모 시스템의 용해 및 중화 원리를 사용하여 수행되었다(도 13 및 14 참조). 도 13에 도시한 원리적인 디자인에 기초하여, 후술하는 연속적인 (전)정화를 위한 전개 장비(도 14 참조)를 구축하였다: 바닥은 평평하고, 직경 9.4 cm 및 높이 19.4 cm인 유리 실린더로서, 실린더 중간에 측면 입구를 구비하고 실린더 바닥에 대향하는 측면 출구를 구비한다. 입구 및 출부 포트는 8 mm 내경의 튜브와 연결된다. 실린더 상부는 테퍼링 확장으로서 호퍼와 연결되어 누수방지되었다. 이 호퍼는 약 65 mm의 길이내에서 (실린더의 상부와 유사한 직경에서) 직경 22 mm로 테이퍼링되었다. 테이퍼링된 호퍼 상단은 연속적인 (전) 정화를 위한 전개 장비의 상부 출구가 되는 유사한 직경의 튜브와 연결되었다. 완전 정화 장비의 부피는 약 1450 mL이다. 정화가 반-연속식 모드로 유사한 부피 (1450 mL)의 정화 장비를 갖춘 시스템 II 셋업을 사용하여 수행되는 경우, 이 부피는 약 100 g의 습윤 바이오매스의 알칼리 용해/중화에서 수득된 플록을 수집하는데 충분하다.
본 실험은 0.05 M NaHCO3 (pH 8)을 함유하는 재현탁 버퍼에 재현탁된 500 g의 바이오매스로 수행하였다. 유속은 모든 3개의 용액/현탁액(재현탁 바이오매스, 용해 용액, 중화 용액)에 대하여 30 mL/분으로 조정되었다. 공정 시작시 (전) 정화된 용해물을 수집하는데 사용된 정화 장비의 바닥 출구는 폐쇄하고 정화장비는 입구까지 세척-버퍼로 채웠다.
전 실험에서 관찰된 바와 같이, 공정이 시작 때 용해세포용액과 중화 용액이 접촉하자 마자 즉시 CO2 방출이 시작되고 작은 기체 방울이 동시에 생성되는 침전 플록에 부착하였다. 혼합 거리(코일 튜브)를 통과한 후 용해물과 침전 플록 혼합물이 새로운 정화장비내로 들어갔다. 이로써 정화 장비는 완전히 충전되었다. 플록에 부착된 기체 방울로 인해, 침전은 위로 향하게 되며 최소한의 플록을 함유한 하부의 비교적 투명한 용해물상에서 분리된다. 플록이 상부 출구에 도달할 때, 하부 출구를 개방하여 (전)정화 용해물을 회수하였다. 바닥 출구는 단지 부분적으로만 개방되었기 때문에 하부 출구로부터 방출되는 용해물의 유속은 들어가는 혼합물의 유속보다 더 낮다. 따라서 정화장비의 상부에서 분리되고, 플록-내부 용해물이 최소한으로 함유되고, 장비의 테이퍼링된 상부에 의해 더 감소된 플록이 상부 출구를 통해 나가도록 강제되며 뒤이어 위치한 체에서 튜브를 통해 수집된다. 잔여 용해물은 채 밑의 용기에 수집된다. 바닥 출구의 개방정도는 장비내 용해물/플록 계면이 장비의 중간 높이로 되도록 수동으로 조절하였다. 수집된 (전)정화된 용해물은 더 정교한 정화를 위해 WO 2004/085643에 개시된 정화 장비를 포함하는 정체 물질내로 공급되었다. WO 2004/085643의 정화장비 대신에 통상의 깊이 필터도 크롸토그라피에 의한 정제 전에 정교한 정화를 위해 사용될 수 있다. 암모늄 설페이트 침전과 같은 컨디셔닝 단계가 크로마토그라피 전에 계획되어 있는 경우, 용해물은 정교한-정화 없이 프로세싱될 수 있다. 정교하게-정화된 용해물은 WO 2004/085643의 정화 장비의 출구에서 수집되고 플록-배수 분획 및 플록-세척 분획과 합해진다. 공증이 끝날때 정화 장비로의 공급은 중단되고, 장비에 남아있는 하부 용해물상은 하부 출구를 통해 회수된다(플록이 출구에 닿을때 까지). 이후 하부 출구는 폐쇄되고, 정화 장비에 남아 있는 플록 덩이가 상부 출구를 통해 강제적으로 배출될 때 까지 세척 버퍼와 함께 공급이 다시 개시된다.
전술한 실험에서 500 g의 습윤 바이오매스가 어떠한 제한도 없이 프로세싱될 수 있었다. 이는 유사한 크기의 WO 2004/085643의 반-연속식 시스템에서 프로세싱될 수 있는 양의 거의 5배 이상이다. 새로운 (전)정화 시스템은 프로세싱되는 바이오매스의 양에 대해서는 제한되지 않음을 보여주었으며, 이 시스템은 본 실험에서 적용된 500 g보다 더 많은 바이오매스를 처리할 수 있다. 완전 연속적인 (전)정화 시스템에 의한 플록 및 용해물의 분리/(전)정화는 매우 만족스럽게 작동되었다. 바닥 출구에서 수집된 용해물은 단지 최소한의 잔여하는 작은 플록을 함유하였으며, 상부 출구를 통해 배출되는 플록은 컴팩트하고, 오직 최소한의 잔여하는 플록-사이 용해물을 함유한다. 본 실험은 무한대의 바이오매스가 본 발명의 방법 및 장비에 의해 프로세싱될 수 있음을 보여준다((전)정화를 포함하여). 세척 분획을 포함하는 500 g의 습윤 바이오매스 프로세싱의 마지막에 수집된 용해물의 부피는 약 16920 mL이었다. 이 용해물은 HPLC 분석에 의해 pDNA 농도 및 균일성과 추정 순도 (뒤의 둘은 평탄성 및 품질의 척도이다)를 측정하고, 그 결과를, 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 대조 용해물과 비교하였다. 수집된 용해물은 전체로 약 1.4 g의 총 pDNA를 함유하였다. 그 결과를 표 6(부유 개선에 의해 매개되는 연속적인 용해/중화 및 완전 연속적인 정화 시스템(시스템 I)으로부터 수득된 산물 (pDNA)을 대조와 비교하여 나타낸 결과)에 나타내었다.
샘플 균일성 (% ccc) 순도 (%) 수율 (%)
대조 76.8 9.3 100
용해물 76.0 9.5 89.0*
*대조와 비교
상기 결과는 개선된 완전 연속적 방법에 의해 수득된 용해물의 균일성 및 추정 순도는 대조와 유사함을 보여준다. 수율은 거의 90%로 매우 양호하고, 이전 실험에 비교시 훨씬 좋으며, 이는 주요한 경제적인 이점이 된다.
도 15에서, 대조 용해물(CO2 방출이 없는)의 분석 HPLC 크로마토그람을 나타내었으며, 이는 완전 연속적인 정화 모드 시스템 I을 사용하는 본 실험에서 수득된 용해물의 분석 HPLC 크로마토그람과 대비될 수 있다(도 16). 양 크로마토그람은 유사하며 유사한 피크 패턴을 나타내는데, 이로부터 본 발명의 신규한 (전)정화 장비를 사용하는 방법은 균일성 및 추정 순도를 유지하면서 용해물/pDNA 품질에 부정적인 영향을 미침없이 적용될 수 있음을 확인해준다. 도 17에서 본 실험에서 수득된 용해물의 최종 정제 단계로서 SEC 풀의 분석 HPLC 크로마토그람이 도시되었다. SEC는 용해물의 농축, 컨디셔닝 (암모늄 설페이트 침전 및 여과) 및 HIC- 및 AEC-정제후 적용되었다. SEC-풀내 pDNA 균일성은 94.3 %이었으며, 이는 본 발명의 방법 및 장비에 의해 수득된 용해물이 성공적으로 정제되어 매우 높은 최종 ccc pDNA-비율에 도달할 수 있음을 보여주었다.
실시예 8
본 발명 방법의 응용을 위한 완전 연속적 정화모드(시스템 I)에서의 실험실-규모 시스템의 프로토타입 및 그 활용
본 실험은 완전히 연속적인 (전)정화를 위한 새로운 셋업에 의해 확장된 WO 2004/085643에 기술된 실험실/파일로트-규모 시스템의 용해 및 중화 원리를 사용하여 수행되었다. 이 프로토타입(도 18)은 연속 공정에 필요한 모든 부분을 포함하였다. 연속적인 (전)정화 공정을 위해 도 13에 개시한 디자인에 따른 프로토타입이 사용되었다. 실시예 7에 개시된 전개 장비와 비교시, 이 프로토타입의 신규한 유리 실린더는 바닥 및 상부에서 테이퍼링되었다. 또한 입구는 바닥과 상부 출구 사이 중간에서 측면에 위치되며, 실린더 중간에서 방사상으로 끝난다. 입구 및 출구는 8 mm 내경의 튜브와 연결되었다.
본 실험들은 실시예 7에 개시된 것과 유사한 방식으로, 1000 g 바이오매스에 대해 재현탁용액내 0.05 내지 0.1 M 카보네이트염을 사용하여 수행되었다. 풀록은 하부 투명한 용해물상으로부터 분리되어 매우 잘 부유하였으며, 장비의 최상부에 컴팩트한 층을 구축하여 정화 공정이 더욱 좋은 성능으로 수행되었다.
플록은 플록간에 잔여하는 용해물이 최소화된 상태로 상부 출구를 통해 배출되었다. 테이퍼링된 바닥은 (전) 정화된 용해물이 최대한으로 회수되도록 도운다. 용해물내 pDNA의 균일성(품질)은 대조와 유사하였으며, 수율은 약 90 %이었다. 용량에 대해서는 어떠한 한계도 관찰되지 않았다.

Claims (35)

  1. a) 대상 생분자를 제조하기 위해 숙주 세포를 배양하고, 임의로 이들 세포를 수확하고 재현탁하는 단계,
    b) 알칼리 용해에 의해 세포들을 분해하는 단계,
    c) b) 단계에서 수득한 용해물을 중화하여 침전을 형성하는 단계,
    d) c) 단계에서 수득된 침전에서 투명 용해물을 분리하는 단계,
    e) 대상 생분자를 정제하는 단계를 포함하고,
    상기 a) 내지 c) 단계 중 하나 이상의 단계에서 카보네이트염을 첨가하고, c) 단계의 중화로 인해 CO2 가 방출되고, CO2 방울이 부착된, 생성된 용해물-플록 혼합물 내 산출된 이론적 카보네이트 농도가 0.003 내지 0.05　M의 범위 내이며, d) 단계에서 침전과 용해물이 정화 장비에서 분리되는, 숙주 세포에 의해 분비되지 않는 대상 생분자를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, d) 단계에서 수득된 투명 용해물이 바닥의 출구를 통해 정화 반응기/장비를 나가는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 카보네이트염이 a) 단계에서 첨가되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 카보네이트염이 b) 단계에서 첨가되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 카보네이트염이 c) 단계에서 첨가되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, CO2 방울이 부착된, 생성된 용해물-플록 혼합물 내 산출된 이론적 카보네이트 농도가 0.005 내지 0.05　M의 범위 내인 방법.
  7. 삭제
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  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트염이 NaHCO3인 방법.
  17. 제1항에 있어서, d) 단계가 반-연속 또는 연속 모드로 작동되는 방법.
  18. 제1항의 방법 중 d) 단계를 반-연속 모드로 수행하기 위한 장비를 사용하는 방법으로서, 상기 장비는,
    a) 하부에 정체층,
    b) 정체층 위에 위치하는 입구,
    c) 정체층 아래에 위치하는 출구, 및
    d) 정체층의 표면에 도달하고, 알칼리 용해 및 중화에 의해 수득되는 침전 및 용해물의 혼합물을 고르고 부드럽게 용기내로 분배하는 하나 이상의 분배수단을 구비하는 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 장비는 압축 기체를 공급하기 위한 수단을 더 포함하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 방법이 연속 모드로 수행되고, d) 단계가 용기를 포함하는 장치를 이용하며, 상기 용기는
    a) 각각 용기의 상부 및 용기의 바닥에 위치하는 두 개의 출구, 및
    b) 상기 두 개의 출구 사이에 위치하는 입구를 구비하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 용기가 부가적인 배수 및/또는 세척 유니트와 연결된 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, b) 내지 e) 단계에서 선택되는 하나 이상의 단계가 연속 모드로 작동되는 방법.
  23. 제1항에 있어서, b) 내지 e) 단계에서 선택되는 두 단계의 조합이 적어도 두개 이상의 개별적인 단계를 연결함으로써 연속 모드로 작동되는 방법.
  24. 제22항에 있어서, a) 단계가 b) 단계에 연결됨으로써 연속 모드로 작동되는 방법.
  25. 제23항에 있어서, a) 단계가 b) 단계에 연결됨으로써 연속 모드로 작동되는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 단계가 자동화 모드로 작동되는 방법.
  27. 제1항에 있어서, d) 단계 및 e) 단계 사이에 침전을 세척하는 단계가 삽입되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 세척 단계가 제21항의 부가적인 배수/세척 유니트에서 수행되는 방법.
  29. 제1항에 있어서, d) 단계 및 e) 단계 사이에, 여과를 또한 포함하는 농축 및/또는 컨디셔닝 단계가 삽입되는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 농축 단계가 컨디셔닝 단계 전에 수행되는 방법.
  31. 제1항에 있어서, d) 단계의 용해물이 대상 생분자를 포함하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 대상 생분자가 폴리뉴클레오타이드인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 DNA인 방법.
  34. 제33항에 있어서, DNA가 플라스미드 DNA인 방법.
  35. 제1항에 있어서, a) 단계에서 수득된 세포 매스가 냉동-펠릿(cryo-pellet)인 방법.

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