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Der
Verabreichung von DNAs als therapeutischen Mitteln (d. h. der DNA-Gentherapie) für die Behandlung
genetisch bedingter Erkrankungen und für die genetische Immunisierung
ist bisher wachsendes Interesse geschenkt worden. Auf Grund von
Bedenken bezüglich
der Sicherheit der Anwendung potentiell ansteckungsfähiger Viren
haben die Forscher unter Anwendung nackter DNA oder anderer Nichtvirenmethoden
der DNA-Verabreichung Alternativen zu Viren untersucht. Eine der
erfolgversprechendsten Nichtvirenmethoden bei der DNA-Therapie ist
die Verwendung kationischer Lipide als Verabreichungsvehikel (Felgner,
Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 7413–7417, 1987). Die kationischen
Lipide adsorbieren an negativ geladene DNA und ermöglichen
das Einführen
der DNA in Zielzellen. Von der erfolgreichen Verabreichung von Genen über Lipide
in die Atemwegepithele von Nagetieren (Hyde, Nature, 362: 250–255, 1993)
ist schon berichtet worden. Falls die „Gentherapie" in der Zukunft sich
als wirksam erweisen sollte, werden riesige Mengen an Plasmiden oder
entsprechender DNA benötigt.
Die gegenwärtigen
Methoden für
das Isolieren begrenzter Mengen DNA könnten den Fortschritt auf diesem
Gebiet jedoch eventuell hindern.
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Im
Allgemeinen beginnt der erste Schritt der Erzeugung von Kopien eines
Gens, das von Interesse ist, mit dem Einbauen des entsprechenden
Teils der DNA in Plasmide, die daraufhin in „Wirtszellen" repliziert werden.
Wirtszellen umfassen eukaryotische und prokaryotische Zellen. Ist
einmal eine ausreichende Menge an Plasmiden in den Wirtszellen erzeugt
worden, so werden die Wirtszellen unter Freisetzung der intern replizierten
Plasmide lysiert.
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Es
sind schon zahlreiche mechanische Methoden für das Lysieren von Zellen entwickelt
und veröffentlicht
worden. Sie umfassen das Anwenden von Druck, die Kavitation, Schall-
oder Ultraschallwellen, das mechanische Schütteln mit Schleifmitteln oder
Mahlen (Sadeva, Biopharm 7(2): 26–36, 1994). Nur wenige dieser
Methoden eignen sich jedoch für das
Gewinnen von DNA oder anderen gegen Schubkräfte empfindlichen Materialien
aus Zellen. Chemische (Foster, Biotechnol. 10: 273–277) und
enzymatische (Andrews und Asenjo, Tibtech. 5: 273–277, 1987)
Behandlungen sind weniger aggressiv und können für die Gewinnung gegen Scherkräfte empfindlicher
Produkte wie DNA verwendet werden.
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Im
Allgemeinen beinhalten Methoden für die Plasmidisolierung das
Lysieren der plasmidhaltigen Zellen mit Alkali (d. h. Ätzmitteln)
oder Enzymen in einem Reagenzglas durch vorsichtiges mehrmaliges Umdrehen
des Glases. Nach dem Lysieren der Zellen wird das Zellysat mit einer
ausfällenden
Lösung
in einem Reagenzglas wiederum durch wiederholtes vorsichtiges Umdrehen
des Reagenzglases gemischt. Das Ziel besteht darin, kontaminierende
Zellkomponenten, z. B. genomische DNA, Proteine und Protein-Nucleinsäurekomplexe
auszufällen,
wobei die Plasmide in der Lösung
zurückbleiben.
Die Plasmide können
daraufhin durch Zentrifugieren vom Niederschlag getrennt werden.
Während
dieser Ansatz für
das Isolieren in kleinem Maßstab
angewendet werden kann, ist er für
die Produktion im großen Maßstab nicht
praktisch, da das Lysat nach Freisetzen genomischer DNA äußerst zähflüssig ist.
Obwohl das effektive und vorsichtige Mischen großer Mengen von zähflüssigem Material
durch Verwendung von Spezialrührern/-mischern
(z. B. Planetenrührwerken)
erzielt werden kann, sind diese Arten von Geräten kostspielig und nicht leicht
zu automatisieren. Außerdem
ist die Expositionszeit jedes einzelnen Plasmids Alkali gegenüber in dem
großen
Lösungsvolumen
schwierig unter Kontrolle zu halten und kann sehr unterschiedlich
sein und dies kann die Plasmidqualität beeinflussen. Des Weiteren
ist es äußerst wichtig,
das Lysat sehr vorsichtig zu handhaben, da Scherkräften ausgesetzte
genomische DNA die Probe kontaminieren und die spätere Plasmidreinigung
ungeheuer erschweren kann.
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Kann
diese Methode den oben erklärten Ausfällungsschritt
umfassen, wobei das Zellysat des zweiten statischen Mischers mit
einer ausfällenden Lösung durch
einen dritten statischen Mischer kombiniert wird.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt eine Veranschaulichung
der erfindungsgemäßen Methode
dar, bei der Zellen gleichzeitig mit einer Lyselösung durch einen statischen
Mischer geführt
werden, wobei das Ergebnis darin besteht, dass die Zellen den statischen
Mischer im lysierten Zustand verlassen.
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2 stellt eine Veranschaulichung
der erfindungsgemäßen Methode
dar, bei der ein Zellysat (oder eine Proteinlösung) gleichzeitig mit einer
ausfällenden
Lösung
durch einen statischen Mischer geführt wird, wobei das Ergebnis
darin besteht, dass das Zellysat (oder die Proteinlösung) den
statischen Mischer im ausgefällten
Zustand verlässt.
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3 stellt eine Veranschaulichung
der erfindungsgemäßen Methode
dar, bei der Zellen zuerst gleichzeitig mit einer zellverdünnenden
Lösung
durch einen statischen Mischer geführt werden, die den ersten
statischen Mischer verlassende Mischung daraufhin zusammen mit einer
Lyselösung
durch einen zweiten statischen Mischer geführt wird, diese Mischung daraufhin
gleichzeitig mit einer ausfällenden Lösung durch
einen dritten statischen Mischer geführt wird.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass statische Mischer zum
Lysieren von Plasmide enthaltenden Zellen unter Freisetzung der
Plasmide aus den Zellen verwendet werden können. Der Vorteil des Verwendens
eines derartigen Geräts
besteht darin, dass große
Volumen von Zellen sorgfältig
und kontinuierlich on-line unter Zuhilfenahme des statischen Mischers
lysiert werden können
und dass andere statische Mischer zum Erzielen anderer Funktionen,
wie beispielsweise Verdünnen
und Ausfällen, on-line
eingesetzt werden könnten.
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Dieses
Verfahren vereinfacht den Vorgang des Isolierens von Plasmiden aus
großen
Volumen von Material wesentlich derart, dass Plasmid-DNA durch den Vorgang
nicht beschädigt
wird. Bisherige Methoden für
das Isolieren von Plasmiden, die das ätzende Lysieren und Ausfällen involvierten,
was wiederum teure Spezialgeräte
erforderlich machte, waren für
die Plasmidreinigung im großen
Maßstab nicht
in der Praxis anwendbar.
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Die
erfindungsgemäße Methode
kann für das
Lysieren eines jeglichen (d. h. prokaryotischen oder eukaryotischen)
Zelltyps für
einen jeglichen, mit dem Lysieren verbundenen Zweck wie beispielsweise
Freisetzen von erwünschten
Nucleinsäuren
oder Proteinen aus daraufhin zu reinigenden Zielzellen verwendet
werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Methode
zum Lysieren von Plasmiden enthaltenden Wirtszellen unter Freisetzen
von Plasmiden verwendet.
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Der
Begriff „Lysieren" bezieht sich auf
die Maßnahme
des Aufbrechens der Zellwand und/oder Zellmembran einer Zelle, die
sich in einer gepufferten Lösung
(z. B. Zellsuspension) befindet, durch chemische Behandlung unter
Anwendung einer ein Lysiermittel enthaltenden Lösung. Lysiermittel umfassen beispielsweise
Alkali, Detergenzien, organische Lösungsmittel und Enzyme. Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
findet das Lysieren von Zellen zum Freisetzen intakter Plasmide
aus Wirtszellen statt. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung bedeutet
der sich auf das Hindurchführen
von Substanzen durch einen statischen Mischer beziehende Ausdruck „gleichzeitig", dass die fraglichen
Substanzen durch den statischen Mischer ungefähr zu gleicher Zeit hindurchgehen.
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Zum
Zweck der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck „Hindurchleiten" das Hindurchführen einer
Flüssigkeit
mit einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit
(z. B. Litern pro Minute) durch den statischen Mischer, und zwar
gewöhnlich
durch die Wirkung einer Pumpe. Man sollte beachten, dass man glaubt,
dass die Strömungsgeschwindigkeit durch
den statischen Mischer die Effizienz der Lyse, des Ausfällens und
Mischens beeinflusst.
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Geeignete
statische Mischer, die bei der erfindungsgemäßen Methode nützlich sind,
sind jegliche Durchflußgeräte, die
im Stand der Technik als statische oder bewegungslose Mischer bezeichnet werden,
einer ausreichenden Länge,
um die erfindungsgemäßen Verfahren
stattfinden zu lassen. Zum Zweck des Lysie rens von Zellen müsste der
statische Mischer beispielsweise eine Länge aufweisen, die eine ausreichende
Kontaktzeit zwischen der Lysierlösung
und den Zellen zum Herbeiführen
der Lyse der betreffenden Zellen während des Hindurchführens durch
den Mischer bieten würde.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform
enthalten statische Mischer eine interne Spiralenstruktur, die zwei
Flüssigkeiten dazu
bringt, miteinander in entgegengesetzter Drehströmung in Kontakt zu kommen,
wobei die Flüssigkeiten
dazu gebracht werden, in einem Wirbelstrom miteinander vermischt
zu werden.
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Zum
Zweck der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Ausfällen" auf die Wirkung ausfällender
Proteine und anderer Zellkomponenten aus einer Lösung durch chemisches Ausfällen unter Zuhilfenahme
einer ein Ausfällungsmittel
enthaltenden Lösung.
Ausfällungsmittel
umfassen Natriumdodecylsulfat (SDS) und Kaliumacetat.
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Zum
Zweck der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck „Plasmid" einen jeglichen
Typ von Replikationsvektor, der es ermöglicht, dass ein nichtendogenes
DNA-Fragment darin eingebaut werden kann. Vorgehensweisen für die Konstruktion
von Plasmiden umfassen diejenigen, die von Maniatis et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989) beschrieben worden sind.
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Bei
einer in 3 veranschaulichten
bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Methode für das
Freisetzen von Plasmiden aus plasmidhaltigen Wirtszellen zuerst
das gleichzeitige Hindurchleiten des die plasmidhaltigen Wirtszellen
enthaltenden Mediums zusammen mit einer gepufferten Lösung durch
einen statischen Mischer, d. h. den ersten statischen Mischer. Die
Mischung, die den ersten statischen Mischer verlässt, wird dadurch mit dem Puffer äquilibriert.
Die gepufferte Mischung wird daraufhin gleichzeitig zusammen mit
einer Lyselösung
durch einen zweiten statischen Mischer hindurchgeleitet, welche
Lösung
während
des Hindurchführens
durch die Länge
des statischen Mischers die Zellen unter Freisetzung des Plasmids
und zellulärer
Komponenten lysiert. Das Zellysat wird daraufhin durch einen dritten
statischen Mischer zusammen mit einem Ausfällpuffer geführt, der
den größten Teil
der zellulären Komponenten,
jedoch nicht die Plasmide, ausfällt.
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BEISPIELHAFTE
VERANSCHAULICHUNG
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Zellen
des Escherichia coli (E. coli), die in einer Nährsubstanz bis zu einer hohen
Zelldichte gezüchtet
worden sind, woraufhin die Kultur direkt durch Hindurchleiten der
Zellen durch einen statischen Kenics-Mischer von ½'' × 27'' und 32 Elementen (von Chemineer, N.
Andover, MA erworben) zusammen mit einer Resuspendierlösung (50
mM Tris/HCl, 10 mM EDTA, 100 mg RNaseA/ml, pH-Wert 8,0) verdünnt wurde, bis die herausfließenden Zellen eine
optische Dichte von 25–40
bei 600 nm, wie durch ein Spektrophotometer abgelesen, aufwiesen.
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Die
den ersten statischen Mischer verlassende verdünnte Zellsuspension wurde daraufhin
durch einen zweiten statischen Mischer (vom gleichen Mischertyp
wie oben) zusammen mit einer Lyselösung (200 nM NaOH, 1% Gew.-/Volumen-% SDS) mit einer
Strömungsgeschwindigkeit
von 100–1.300 ml/min
hindurchgeleitet. Die den zweiten statischen Mischer verlassenden
Zellen befanden sich im lysierten Zustand (d. h. Zellysat).
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Das
den zweiten statischen Mischer verlassende Zellysat wurde daraufhin
durch einen dritten statischen Mischer (vom selben Typ wie oben)
zusammen mit einer ausfällenden
Lösung
(2,6 M Kaliumacetat, pH-Wert 5,2) mit einer ähnlichen Strömungsgeschwindigkeit
wie beim Hindurchführen durch
den zweiten statischen Mischer hindurchgeleitet. Die austretende
Suspension enthielt ausgefällte genomische
E. coli-DNA, -proteine und unlösliche Trümmer und
die löslichen
Plasmide. Zirka 45 Liter der Mischung wurden aus dem dritten statischen Mischer
aufgefangen und verarbeitet. Zirka 1 Gramm Plasmid wurde aus diesem
Lauf isoliert.
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Alle
obigen statischen Mischer wurden durch Rohre hintereinander geschaltet
und die jeweiligen Lösungen
wurden durch peristaltische Pumpen (Cole-Parmer, Chicago IL) durch die statischen
Mischer hindurchgeleitet bzw. -gepumpt.