CN101987364A - 一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法 - Google Patents

一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法，属于材料化学技术领域。本发明包括采用DNA辅助合成金纳米粒子，合成的金纳米粒子的耐盐实验，合成的金纳米粒子的表征，DNA在金纳米粒子表面的的生物识别；本发明利用三种不同长度及四种不同类型的DNA，采用柠檬酸三钠还原氯金酸进行金纳米粒子的辅助合成。通过电镜进行表征得出12个碱基的DNA能够辅助合成出均匀的球形的金纳米粒子，尤其是12-G辅助合成的金纳米粒子的形状规则、粒径均一。通过对合成出来的金纳米粒子的耐盐性试验得出此种金纳米粒子的耐盐效果可以提高20倍。并且此种金纳米粒子能够对FAM-DNA的荧光进行增强。此种金纳米粒子期望能够在纳米医药和纳米器件的制备上有良好的应用。

Description

一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法
技术领域
一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法，属于材料化学技术领域。
背景技术
近年来，由于金纳米粒子在光学、化学、电子、催化及在表面增强拉曼散射光谱等方面有其独特的性质，因而其制备及应用日益引起广大科学工作者的研究兴趣。通过对金纳米粒子的这些性质进一步的利用进行金纳米粒子的自组装，高特异性的选择催化，晶体材料的合成，灵敏传感器等方面进行应用。
目前为止，制备金纳米粒子已经有很多种不同的制备方法，例如柠檬酸三钠还原法、硼氢化钠还原法，柠檬酸三钠鞣酸还原法及晶种生长法等。柠檬酸三钠还原合成金纳米粒子是被最为广泛使用的一种合成金纳米粒子的方法。简单地说是，柠檬酸三钠在沸腾的条件下还原氯金酸形成晶核，而后，还原出来的金原子沉积到合成出来的晶核上面最终形成具有一定尺寸和形状的金纳米粒子，在这种合成金纳米粒子的方法中柠檬酸三钠的作用为还原剂和稳定剂。这种合成方法较为方便，合成出来的金纳米粒子的化学及物理性质比较稳定，但是在含有盐浓度比较高的生物缓冲液中不能够稳定存在——盐能够比较容易地诱导金纳米粒子发生聚集。有报道称，当生物缓冲液中的盐浓度≥50mM时金纳米粒子就会发生聚集。并且此种方法需要在溶液接近沸腾的情况下合成浪费资源。鉴于上述问题，我们需要开发出一种在温和的条件下合成出更加稳定的并且便于应用的金纳米粒子的新方法。
核酸例如DNA由于具有纳米尺度的分子直径、分子内和分子间的特异识别特性、良好的力学性能、负电性的磷酸骨架结构等特性，其在自组装技术和功能纳米器件的构建中已经扮演了十分重要的角色。最近，巯基修饰的DNA可以有效地对金纳米粒子起到抵抗盐引起的金纳米粒子的聚集现象。经过DNA保护的金纳米粒子的耐盐能力要比普通的柠檬酸三钠合成的金纳米粒子的耐盐性能至少高出六倍。单链DNA被发现能够很好地和柠檬酸三钠保护的金纳米粒子进行结合。脱氧核糖核苷酸A、C、G和金纳米粒子的亲和能力要比T的亲和能力要高。最近有人通过在以20纳米的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子为金种，加入30碱基的A或者C进行吸附到金纳米粒子的表面，而后通过羟胺还原氯金酸以吸附到金纳米粒子的DNA为模板合成出金纳米花粒子。然而，羟胺已经被证明只能作为一种还原剂而存在不能够形成晶核。因此，在柠檬酸三钠还原合成金纳米粒子的初始阶段加入DNA，对此时合成出来的金纳米粒子有必要进行研究。
本发明利用三种不同长度及四种不同类型的DNA，采用柠檬酸三钠还原氯金酸进行金纳米粒子的辅助合成。通过电镜进行表征得出12个碱基的DNA能够辅助合成出均匀的球形的金纳米粒子尤其是12-G合成的金纳米粒子的形状规则、粒径均一。通过对合成出来的金纳米粒子的耐盐性试验可得出此种金纳米粒子的耐盐效果比不用DNA辅助合成的球性金纳米粒子可以提高20倍。并且此种金纳米粒子能够对FAM-DNA(FAM为一种荧光染料)的荧光进行增强。此种金纳米粒子期望能够在纳米医药和纳米器件的制备上能够有良好的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法，制备出形貌规则、粒径均一并且具有生物活性和耐受高浓度的电解质环境的金纳米粒子。
本发明的技术方案：一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法，采用DNA辅助合成金纳米粒子，合成的DNA-金纳米粒子的耐盐实验，合成的DNA-金纳米粒子的表征，DNA在金纳米粒子表面的生物识别；工艺为：
(1)DNA辅助合成金纳米粒子：
采用三种不同长度及四种不同序列的DNA辅助柠檬酸三钠还原氯金酸合成出DNA-金纳米粒子，所用的DNA为下列的DNA之一：
编号      序列(5’-3’)       长度
1         dATP                1
2         dTTP                1
3         dCTP                1
4         dGTP                1
5         AAAAAA              6
6         TTTTTT              6
7         CCCCCC              6
8         GGGGGG              6
9         AAAAAAAAAAAA        12
10        TTTTTTTTTTTT        12
11        CCCCCCCCCCCC        12
12        GGGGGGGGGGGG        12
洁净的玻璃瓶中加入1.9mL的Milli-Q超纯水，而后加入0.1mL的5mM氯金酸溶液，37℃混匀，然后分别加20μL的50μM的上述不同长度及不同序列的DNA中的一种DNA到这个混合体系中，37℃搅拌混匀15min，而后在搅拌的条件下快速加入40μL的质量浓度1％新配制的柠檬酸三钠溶液，此混合体系随后在37℃搅拌反应12小时，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应得到的DNA-金纳米粒子分散液4℃保藏；
(2)普通的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子的合成：
洁净的三角烧瓶中加入95mL的Milli-Q超纯水，而后加入5mL的5mM氯金酸溶液，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL质量浓度1％新配制的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降，最后，金纳米粒子分散液冷却至室温，用Milli-Q超纯水定容到100mL，4℃保藏；
(3)合成出的DNA-金纳米粒子的表征：
采用电镜和动态光散射仪对步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子进行表征，取1mL步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15min，弃上清，将沉淀分散在1mL的Milli-Q的超纯水中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质；取7μL清洗后分散在1mL的Milli-Q超纯水中的DNA-金纳米粒子样品滴加到碳膜支持的铜网上，在红外灯下进行干燥，投射电镜采用JEOL JEM-2100型号的电镜，其加速电压为200kV；将100μL清洗后的DNA-金纳米粒子分散液和900μL的Milli-Q超纯水进行混合加入到比色皿中，25℃平衡2min，而后进行动态光散射仪测定，重复三次取平均值；
(4)合成出的DNA-金纳米粒子的耐盐实验：
采用步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子在不同的盐浓度中进行聚集程度的实验，此时的盐选用氯化钠；取100μL步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15分钟，弃上清，将沉淀分散在100μL的Milli-Q的超纯水中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质，DNA-金纳米粒子分散在不同浓度的氯化钠溶液中，氯化钠浓度分别为0、10mM、20mM、30mM、50mM、100mM、200mM、400mM、1M，每个浓度下重复三遍，溶液的颜色在DNA-金纳米粒子分散在各个不同浓度的氯化钠溶液10min后进行记录；
(5)DNA在金纳米粒子表面的生物识别：
采用互补DNA诱导步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子聚集，及步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子对FAM-DNA的荧光实验进行DNA在金纳米粒子表面的生物识别；
1)互补DNA诱导DNA-金纳米粒子聚集
取100μL步骤(1)合成出来的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15min，弃上清，将沉淀分散在30μL的pH 8.0、含0.01M Tris-HCl和0.13MNaCl的杂交缓冲液中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质；再将20μL的10μM的与步骤(1)合成出来的DNA-金纳米粒子表面的DNA互补的二倍长度的DNA加入到该体系中，室温反应12小时，对其进行制备铜网，进行投射电镜表征；
2)金纳米粒子对FAM-DNA的荧光实验
取100μL步骤(1)合成出来的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15min，弃上清，将沉淀分散在30μL的pH 8.0、含0.01M Tris-HCl和0.13MNaCl的杂交缓冲液中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质；再将20μL的10μM的与步骤(1)合成出来的DNA-金纳米粒子表面的DNA互补的FAM-DNA加入到该体系中，避光反应12小时，此溶液和970μL的杂交缓冲液进行混合，采用F-7000 FL 220-240荧光光谱仪对荧光光谱和荧光强度进行鉴定，重复三遍，采用490nm的光进行激发。
本发明的有益效果：本发明利用三种不同长度及四种不同类型的DNA，采用柠檬酸三钠还原氯金酸进行金纳米粒子的辅助合成。通过电镜进行表征得出12个碱基的DNA能够辅助合成出均匀的球形的金纳米粒子，尤其是12-G合成的金纳米粒子的形状规则、粒径均一。通过对合成出来的金纳米粒子的耐盐性试验可得出此种金纳米粒子的耐盐效果可以提高20倍。并且此种金纳米粒子能够对FAM-DNA(FAM为一种荧光染料)的荧光进行增强。此种金纳米粒子期望能够在纳米医药和纳米器件的制备上能够有良好的应用。
附图说明
图1不同长度和不同类型的DNA辅助合成出的金纳米粒子的TEM图。
A：普通的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子；B：加DNA的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子；C：单个碱基DNA辅助合成出来的金纳米粒子；D：六个碱基DNA辅助合成出来的金纳米粒子；E：十二个碱基DNA辅助合成出来的金纳米粒子。
图2不同长度和不同类型的DNA辅助合成出的金纳米粒子的电位图。
A：单个碱基DNA辅助合成出来的金纳米粒子的Zeta电位图；B：六个碱基DNA辅助合成出来的金纳米粒子的Zeta电位图；C：十二个个碱基DNA辅助合成出来的金纳米粒子的Zeta电位图。
图3DNA辅助合成出的金纳米粒子的耐盐实验。A：普通的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子；B：单个碱基G辅助合成的金纳米粒子。
图4DNA辅助合成出的金纳米粒子的聚集实验。A：12个碱基A辅助合成出的金纳米粒子；B：12个碱基T辅助合成出的金纳米粒子；C：12个碱基C辅助合成出的金纳米粒子；D：12个碱基G辅助合成出的金纳米粒子。
图5DNA辅助合成出的金纳米粒子对荧光的影响。
具体实施方式
(1)DNA辅助合成金纳米粒子
氯金酸水溶液的配制：将1g的氯金酸一次溶解于500mL的双蒸水中配成约5mM的溶液。纳米金的制备是通过柠檬酸三钠还原氯金酸制备的。本发明所使用的DNA和FAM-DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用。
DNA辅助合成金纳米粒子具体的步骤是：向洁净的玻璃瓶中加入1.9mL的Milli-Q超纯水，而后加入0.1mL的氯金酸溶液(浓度5mM)，37℃混匀。然后加20μL的50μM的不同长度及不同序列的DNA到这个混合体系中(各种DNA分别做试验)。37℃搅拌混匀15min，而后在搅拌的条件下快速加入40μL的1％(质量浓度)新配制的柠檬酸三钠溶液。此混合体系随后在37℃搅拌反应12小时。溶液颜色从淡黄色变成红色。反应得到的金纳米粒子4℃保藏以进行下一步的实验。合成出来的金纳米粒子见图1，除单个碱基的DNA辅助合成出来的金纳米粒子为不规则形态外，其余的均为球形粒子且随着碱基数的增长金纳米粒子的形态和粒径均一性都逐渐变好。12个碱基的DNA能够辅助合成出均匀的球形的金纳米粒子，尤其是12-G辅助合成的金纳米粒子的形状规则、粒径均一。
(2)普通的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子的合成
对照实验即普通的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子的合成，对照实验和上述的实验的方案的唯一区别在于没有向氯金酸溶液中加入不同长度不同序列的DNA。其余的步骤和上述实验方案相同。
普通的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子的合成的实验方案为：洁净的三角烧瓶中加入95mL的Milli-Q超纯水，而后向Milli-Q超纯水中加入5mL的浓度为5mM的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 1％的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降。最后，溶液冷却至室温，用Milli-Q超纯水定容到100mL，4℃保藏。
(3)金纳米粒子的表征
对合成出来的金纳米粒子进行处理以进行下一步的透射电镜和动态光散射仪的表征。简单来说如下：
取1mL的合成出来的金纳米粒子采用10000转/分钟离心15分钟，弃上清，将沉淀分散在1mL的Milli-Q超纯水中，此过程需要重复两次以便对合成的金纳米粒子进行清洗，去除杂质。取7μL清洗后分散在1mL的Milli-Q超纯水中的DNA-金纳米粒子样品滴加到碳膜支持的铜网上，在红外灯下进行干燥，投射电镜采用JEOL JEM-2100型号的电镜，其加速电压为200kV；将100μL清洗后的DNA-金纳米粒子分散液和900μL的Milli-Q超纯水进行混合加入到比色皿中，25℃平衡2min，而后进行动态光散射仪测定，重复三次取平均值(图2)。
(4)合成的金纳米粒子的耐盐实验
取100μL的上述步骤(1)和步骤(2)合成出来的金纳米粒子分别采用10000转/分钟离心15min，弃上清，将沉淀分散在100μL的Milli-Q的超纯水中，此过程需要重复两次以便对合成的金纳米粒子进行清洗，去除杂质。最终，金纳米粒子分散在不同浓度的氯化钠溶液中。氯化钠的浓度如图3所示。不同的浓度的氯化钠通过5M的氯化钠溶液进行稀释得到的。每个样品的浓度重复三遍。溶液的颜色在金纳米粒子分散在各不同浓度的氯化钠溶液10分钟后进行记录。
(5)DNA在金纳米粒子表面的的生物识别
1)互补DNA诱导金纳米粒子聚集
取100μL的合成出来的金纳米粒子采用10000转每分钟离心15min，弃上清，将沉淀分散在30μL的杂交缓冲液中(pH 8.0的0.01M的Tris-HCl，0.13M的NaCl)，此过程需要重复两次以便对合成的金纳米粒子进行清洗，去除杂质。20μL的10μM的与金纳米粒子表面的DNA互补的DNA的二倍长度(编号13和编号10互补、编号14和编号9互补、编号15和编号12互补、编号16和编号11互补)的DNA加入到该体系中。室温反应12小时，对其进行制备铜网进行投射电镜表征。如图3所示金纳米粒子发生聚集即可得出金纳米粒子的表面的DNA具有生物活性。
2)金纳米粒子对FAM-DNA的荧光实验
取100μL的合成出来的金纳米粒子采用10000转每分钟离心15min，弃上清，将沉淀分散在30μL的杂交缓冲液中(pH 8.0的0.01M的Tris-HCl，0.13M的NaCl)，此过程需要重复两次以便对合成的金纳米粒子进行清洗，去除杂质。20μL的10μM的与金纳米粒子表面的DNA互补的FAM-DNA加入到该体系中，避光反应12小时。此溶液和970微升的杂交缓冲液进行混合，采用F-7000FL220-240荧光光谱仪对荧光光谱和荧光强度进行鉴定。重复三遍。采用490nm的光进行激发。如图4所示，金纳米粒子能够对互补与金纳米粒子表面的DNA的FAM-DNA的荧光增强。
表1不同长度的和不同类型的DNA
  编号   序列(5’-3’)   长度
  1   dATP   1
  2   dTTP   1
  3   dCTP   1
  4   dGTP   1
  5   AAAAAA   6
  6   TTTTTT   6
  7   CCCCCC   6
  8   GGGGGG   6
  9   AAAAAAAAAAAA   12
  10   TTTTTTTTTTTT   12
  11   CCCCCCCCCCCC   12
  12   GGGGGGGGGGGG   12
  13   AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA   24
  14   TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT   24
  15   CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC   24
  16   GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG   24

Claims (1)

1.一种高稳定性和功能化的金纳米粒子的制备方法，其特征在于采用DNA辅助合成金纳米粒子，合成的DNA-金纳米粒子的耐盐实验，合成的DNA-金纳米粒子的表征，DNA在金纳米粒子表面的生物识别；工艺为：
(1)DNA辅助合成金纳米粒子：
采用三种不同长度及四种不同序列的DNA辅助柠檬酸三钠还原氯金酸合成出DNA-金纳米粒子，所用的DNA为下列的DNA之一：
编号          序列(5’-3’)        长度
1             dATP                1
2             dTTP                1
3             dCTP                1
4             dGTP                1
5             AAAAAA              6
6             TTTTTT              6
7             CCCCCC              6
8             GGGGGG              6
9             AAAAAAAAAAAA        12
10            TTTTTTTTTTTT        12
11            CCCCCCCCCCCC        12
12            GGGGGGGGGGGG        12
洁净的玻璃瓶中加入1.9mL的Milli-Q超纯水，而后加入0.1mL的5mM氯金酸溶液，37℃混匀，然后分别加20μL的50μM的上述不同长度及不同序列的DNA中的一种DNA到这个混合体系中，37℃搅拌混匀15min，而后在搅拌的条件下快速加入40μL的质量浓度1％新配制的柠檬酸三钠溶液，此混合体系随后在37℃搅拌反应12小时，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应得到的DNA-金纳米粒子分散液4℃保藏；
(2)普通的柠檬酸三钠保护的金纳米粒子的合成：
洁净的三角烧瓶中加入95mL的Milli-Q超纯水，而后加入5mL的5mM氯金酸溶液，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL质量浓度1％新配制的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降，最后，金纳米粒子分散液冷却至室温，用Milli-Q超纯水定容到100mL，4℃保藏；
(3)合成出的DNA-金纳米粒子的表征：
采用电镜和动态光散射仪对步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子进行表征，取1mL步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15min，弃上清，将沉淀分散在1mL的Milli-Q的超纯水中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质；取7μL清洗后分散在1mL的Milli-Q超纯水中的DNA-金纳米粒子样品滴加到碳膜支持的铜网上，在红外灯下进行干燥，投射电镜采用JEOL JEM-2100型号的电镜，其加速电压为200kV；将100μL清洗后的DNA-金纳米粒子分散液和900μL的Milli-Q超纯水进行混合加入到比色皿中，25℃平衡2min，而后进行动态光散射仪测定，重复三次取平均值；
(4)合成出的DNA-金纳米粒子的耐盐实验：
采用步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子在不同的盐浓度中进行聚集程度的实验，此时的盐选用氯化钠；取100μL步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15分钟，弃上清，将沉淀分散在100μL的Milli-Q的超纯水中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质，DNA-金纳米粒子分散在不同浓度的氯化钠溶液中，氯化钠浓度分别为0、10mM、20mM、30mM、50mM、100mM、200mM、400mM、1M，每个浓度下重复三遍，溶液的颜色在DNA-金纳米粒子分散在各个不同浓度的氯化钠溶液10min后进行记录；
(5)DNA在金纳米粒子表面的生物识别：
采用互补DNA诱导步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子聚集，及步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子对FAM-DNA的荧光实验进行DNA在金纳米粒子表面的生物识别；
1)互补DNA诱导DNA-金纳米粒子聚集
取100μL步骤(1)合成出来的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15min，弃上清，将沉淀分散在30μL的pH 8.0、含0.01M Tris-HCl和0.13MNaCl的杂交缓冲液中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质；再将20μL的10μM的与步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子表面的DNA互补的二倍长度的DNA加入到该体系中，室温反应12小时，对其进行制备铜网，进行投射电镜表征；
2)金纳米粒子对FAM-DNA的荧光实验
取100μL步骤(1)合成出的DNA-金纳米粒子分散液采用10000转/min，离心15min，弃上清，将沉淀分散在30μL的pH 8.0、含0.01M Tris-HCl和0.13MNaCl的杂交缓冲液中，此过程需要重复两次以便对合成的DNA-金纳米粒子进行清洗，去除杂质；再将20μL的10μM的与步骤(1)合成出来的DNA-金纳米粒子表面的DNA互补的FAM-DNA加入到该体系中，避光反应12小时，此溶液和970μL的杂交缓冲液进行混合，采用F-7000FL 220-240荧光光谱仪对荧光光谱和荧光强度进行鉴定，重复三遍，采用490nm的光进行激发。
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