CN101786168A

CN101786168A - 花状纳米金的制备方法

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Publication number: CN101786168A
Application number: CN201010044822A
Authority: CN
Inventors: 翁建; 李林梅; 钟鹭斌
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2010-01-08
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2030-01-08
Also published as: CN101786168B

Abstract

花状纳米金的制备方法，涉及一种纳米金。提供一种稳定性较高、生物相容性较好、粒子较均一的胰蛋白酶包覆的花状纳米金的制备方法。所述花状纳米金由纳米颗粒组成，胰蛋白酶包覆，产物粒径为100～200nm，形状粒径均一。将氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗坏血酸，得反应溶液；收集反应产物，洗涤后得产物花状纳米金。

Description

花状纳米金的制备方法

技术领域

本发明涉及一种纳米金，尤其是涉及一种以胰蛋白酶和氯金酸为原料，抗坏血酸为还原剂，水为溶剂，采用常温搅拌法一步控制合成花状纳米金。

背景技术

纳米颗粒作为一种典型的介观系统，具有很多不同于本体材料和单个分子的独特性质。作为纳米颗粒体系中极其重要的一员，纳米金颗粒本身还具有独特的物理化学性能，如良好的生物相容性，使纳米金颗粒在生物标记和生物传感方面得到广泛应用，优异的电学、化学性能使之用于电子产品及高效催化剂。目前纳米金的制备方法主要有：液相还原法、光化学法、气相蒸发法、种金生长法、电化学还原法、相转移法、水热法、微波法等。文献报道采用的还原剂较多为化学试剂，其中强还原剂，如柠檬酸三钠和硼氢化钠等；弱还原剂，如抗坏血酸、多醇类等化合物。在生物领域，也涉及生物大分子、生物小分子、以及生物有机体作为还原剂合成纳米颗粒。

胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰岛中提取的一种蛋白水解酶。中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。胰蛋白酶为白色或米黄色结晶性粉末，溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。pH值2～3是稳定的。pH值5以上易白溶失活。Ca²⁺对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。

生物分子用于纳米金颗粒的合成主要有以下三类：

第一类以植物提取物为还原剂，K.Badri Narayanan.等(K.Badri Narayanan，N.Sakthivel.Materials.Letters.2008，62，4588-4590)采用胡妥叶提取物用于合成纳米金颗粒，产物为球形、三面体、缺角三面体以及十面体纳米颗粒，粒径在6.75～57.91nm范围内。Shankar等(ShankarS S，Rai A，Ankamwar B，Singh A，Ahmad A，Sastry M.Nat.Mater.，2004，3：482-488)利用柠檬香草的萃取液在室温下还原得到三角形的金纳米薄片。

第二类以微生物为还原剂，Murali Sastry等(Murali Sastry，Absar Ahmad，M.Islam Khan.Current Science，2003，85，162-170)采用放射菌和真菌类作为还原剂，合成了金银纳米颗粒。

第三类以蛋白酶、DNA和氨基酸等为还原剂，Kei Yasui等(Kei Yasui，Nobuo Kimizuka.Chem.Lett,2005，34，416-417)采用葡萄糖氧化酶催化合成金纳米颗粒，BETA-D-glucose包覆稳定纳米金。Shao等(Wang L，Guo S J，Hu X G，Dong S J.Electrochem.Commun.，2008，10(1)：95-99)采用赖氨酸、色氨酸、精氨酸、酪氨酸在水溶液中还原氯金酸得到金纳米粒子，而采用天东氨酸还原得到了大量金纳米薄片。Wallen(Raveendran P，Fu J，Wallen S L.Green Chem.，2006，8(1)：34-38)发现了一种金纳米颗粒的绿色合成方法。用葡萄糖作为还原剂，淀粉作为保护剂，可以制备金银颗粒以及金银合金颗粒。但是这些方法制备的金纳米颗粒粒径并不均一，产率不高且反应时间较长。

生物有机体合成的纳米颗粒，因其良好的生物相容性以及环保性，在生物、医学和工业等领域具有很好的应用前景。蛋白-纳米复合体，在基因表达中，可能增强DNA到细胞核的传递作用(参见文献：Austin RH，Tegenfeldt JO，Cao H，Chou SY，Cox EC.IEEE TransacNanotechnol.2002，1，12-18)。同样，蛋白-纳米复合物在纳米探针，医疗以及诊断器件中都有很好的发展前景(参见文献：Pennadam SS，Firman K，Alexander C，Gorecki DC.JNanobiotechnol，2004，2，8)。

胰蛋白酶修饰纳米材料的应用：胰蛋白酶具良好的生物特性，其特定的裂解功能备受关注，是常用的蛋白裂解酶。目前针对胰蛋白酶的研究，主要涉及酶的固定，稳定胰蛋白酶活性，提高其在生产、研究中的再利用。Liu JY等人(Liu JY，Lin S，Qi DW，Den CH.Journal ofChromatography A，007，1176，169-177)采用超磁性纳米粒子，固定胰蛋白酶，制备成磁性的酶复合物，能降低生产成本以及提高利用率。Liu CG等人(Liu CG，Chen XG，Park Hyun-Jin。Carbohydrate Polymers 2005，62，293-298)利用两性聚合物特殊的结构性质，其疏水和亲水基团，能自由结合蛋白分子，通过条件的控制，能制备得到胰蛋白酶-两性复合物，产物具优良的生物相容性，且能稳定胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶制备纳米颗粒的优势，胰蛋白酶的氨基酸组成中，亲水性的基团占一半以上，在酶分子表面，有大量的亲和力强的侧链基团，这些基团极易与金离子或纳米金颗粒结合。在特定的条件下，胰蛋白酶利用这些基团，通过各种化学结合能，如离子键、范德华力以及静电吸引力，使大部分的金离子吸附在酶的表面。抗坏血酸作为还原剂，在室温中即能还原氯金酸，促使原位还原金离子，以胰蛋白酶的3D结构为模板，合成了花状纳米金颗粒。该方法操作工艺简单易行、原料容易获得，成本低廉、使用于大规模工业化生产，还可通过改变溶剂，用胰蛋白酶作单一还原剂，在高温90℃条件下能迅速合成纳米金颗粒，并且在一定的条件下，能维持部分酶活力。另外，生产过程对环境无污染，符合倡导的“绿色化学”的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定性较高、生物相容性较好、粒子较均一的胰蛋白酶包覆的花状纳米金的制备方法。

本发明所述花状纳米金由纳米颗粒组成，胰蛋白酶包覆，产物粒径为100～200nm，形状粒径均一。

本发明所述花状纳米金的制备方法包括以下步骤：

1)将氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；

2)在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗坏血酸，得反应溶液；

3)收集反应产物，洗涤后得产物花状纳米金。

在步骤1)中，所述氯金酸和胰蛋白酶溶液，按体积比最好为(1～10)∶1，所述氯金酸的浓度最好为0.02～1.0mM，所述胰蛋白酶的浓度最好为0.08～1.5mg/mL。

在步骤2)中，所述抗坏血酸的浓度最好为0.5～6.0mM，所述反应的温度最好为25～90℃，反应的时间最好为5min～24h。反应溶液pH值最好为3.0～10.0。

在步骤3)中，所述洗涤最好以超纯水超声洗涤3次。

与现有的花状纳米金的制备方法相比，本发明具有以下突出优点：

1)将水作为溶剂的优点是来源最为丰富、无毒、价廉、使用安全、不危害环境；

2)原料：胰蛋白酶的生物相容性好，对环境无害，解决其他制备方法携带的化学试剂造成纳米金生物相容性差的障碍，纳米金容易制备、粒径、形貌容易调控；

3)还原剂采用抗坏血酸，其成本低廉、容易获得、生物相容性好、对环境无害；

4)合成方法是胰蛋白酶与氯金酸水溶液混合，抗坏血酸为还原剂，利用常温搅拌法制得的纳米金颗粒分散性好，形状均一，粒径分布窄，稳定性好，操作简单易行；

5)通过对合成条件的控制能得到形貌均一的花状纳米金颗粒；

6)所采用的合成方法工艺简单，得到的产物易于分离、清洗、保存。

附图说明

图1为实施例1制备的产物的透射电镜图。在图1中，标尺为20nm；由图1可见，产物均为分散的纳米金颗粒；抗坏血酸为单一还原剂时不能生成花状纳米金，反应迅速。

图2为实施例2制备的产物的透射电镜图。在图2中，标尺为20nm；由图2可见，产物均为分散的纳米金颗粒，胰蛋白酶为单一还原剂时不能生成花状纳米金，室温下胰蛋白酶不能完全还原氯金酸。

图3为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图3中，标尺为50nm；由图3可见，抗坏血酸终浓度为3.0mM得到的产物为花状纳米金，形貌均一，高浓度抗坏血酸产物稳定性好。

图4为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图4中，标尺为50nm；由图4可见，抗坏血酸终浓度为2.5mM得到的产物为花状纳米金，稳定性较好。

图5为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图5中，标尺为50nm；由图5可见，抗坏血酸终浓度为2.0mM得到的产物为花状纳米金，稳定性较差。

图6为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图6中，标尺为50nm；由图6可见，抗坏血酸终浓度为1.5mM得到的产物为花状纳米金，低浓度抗坏血酸产物稳定性差。

图7为实施例4制备的产物的透射电镜图。在图7中，标尺为50nm；由图7可见，抗坏血酸终浓度为1.0mM得到的产物为未成形的花状纳米金，颗粒团聚，稳定性差。

图8为实施例4制备的产物的透射电镜图。在图8中，标尺为20nm；由图8可见，抗坏血酸终浓度为0.5mM得到的产物为未成形的花状纳米金，颗粒团聚，稳定性差。

图9为实施例3和4制备得到的产物的紫外一可见吸收光谱图。在图9中，横坐标为波长/nm，纵坐标为吸收强度/a.u.；花状纳米金吸收峰为580nm；曲线a～f为抗坏血酸终浓度，分别为3.0mM，2.5mM，2.0mM，1.5mM，1.0mM，0.5mM。

图10为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图10中，横坐标为粒径/nm；由图10可见，抗坏血酸终浓度为3.0mM得到的产物。

图11为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图11中，横坐标为粒径/nm；由图11可见，抗坏血酸终浓度为2.5mM得到的产物。

图12为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图12中，横坐标为粒径/nm；由图12可见，抗坏血酸终浓度为2.0mM得到的产物。

图13为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图13中，横坐标为粒径/nm；由图13可见，抗坏血酸终浓度为1.5mM得到的产物。

图14为实施例4制备得到的产物的粒径分布图。在图14中，横坐标为粒径/nm；由图14可见，抗坏血酸终浓度为1.0mM得到的产物。

图15为实施例4制备得到的产物的粒径分布图。在图15中，横坐标为粒径/nm；由图15可见，抗坏血酸终浓度为0.5mM得到的产物。

图16为实施例5制备得到的产物的透射电镜图。在图16中，标尺为20nm；由图16可见，改变胰蛋白酶和抗坏血酸的加入顺序，会形成完全不同的产物。

图17为实施例6制备得到的产物的紫外一可见吸收谱图。在图17中，横坐标为波长/nm，纵坐标为吸收强度/a.u.；图中pH值从上至下分别为11.0、9.0、7.0、5.0、3.0；由图17可见，只有pH 5.0产生580nm的花状纳米金吸收峰。

图18为实施例6制备的产物的扫描电镜图。在图18中，横坐标为200nm；由图18可见，pH 3.0的条件下，不能得到花状纳米金，生成团聚纳米颗粒。

图19为实施例6制备的产物的扫描电镜图。在图19中，横坐标为200nm；由图19可见，pH5.0的条件下，生成花状纳米金。

图20为实施例6制备的产物的扫描电镜图。在图20中，横坐标为500nm；由图20可见，pH 7.0-11.0的条件下，不能得到花状纳米金，生成纳米金颗粒。

图21为实施例7制备的产物的透射电镜图。在图21中，横坐标为50nm；由图21可见，氯金酸浓度为0.2-0.4mM的条件下，生成花状纳米金。

图22为实施例7制备的产物的透射电镜图。在图22中，横坐标为20nm；由图22可见，氯金酸浓度为0.6-2.0mM的条件下，不能得到花状纳米金，生成纳米金颗粒。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

量取0.2mM的氯金酸溶液8mL，以0.015M抗坏血酸为还原剂，搅拌混匀，溶液pH为5.0，室温下反应24h～10d。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，15000rpm离心，收集样品。反应得到球形纳米粒子，参见图1。

实施例2

量取0.2mM的氯金酸溶液8mL，以1mg/mL的胰蛋白酶溶液1.6mL(为超纯水分散)为还原剂，搅拌混匀，溶液pH为5.0，室温下反应10d。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，15000rpm离心，收集样品。反应得到球形纳米粒子，参见图2。

实施例3

量取0.2mM的氯金酸溶液8ml与1mg/mL的胰蛋白酶溶液1.6mL(均为超纯水分散)，充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5∶1，溶液pH为5.0；加入一定量的0.015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，搅拌混匀。室温下反应5min～24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。反应得到花状纳米金，参见图3～6和图9～13。

实施例4

量取0.2mM的氯金酸溶液8mL与1mg/mL的胰蛋白酶溶液1.6mL(均为超纯水分散)，充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5∶1，溶液pH为5.0；加入一定量的0.015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为0.5mM、1.0mM，搅拌混匀。室温下反应1h～24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。反应得到未成形的花状纳米金颗粒，参见图7～8和图14～15。

实施例5

量取0.2mM的氯金酸溶液8mL，加入一定量的0.015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为3.0mM，充分搅拌混匀，溶液pH为5.0；再加入1mg/ml的胰蛋白酶溶液1.6ml(为超纯水分散)，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5∶1，搅拌混匀。室温下放置24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。反应得到团聚的纳米金颗粒，参见图16。

实施例6

量取0.2mM的氯金酸溶液8mL与1mg/mL的胰蛋白酶溶液1.6mL(均为超纯水分散)，充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5∶1，用0.1M HCl或0.1M NaOH将溶液pH调为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0；加入一定量的0.015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为3.0mM，搅拌混匀。室温下反应1h～24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。反应得到不同的纳米材料，只有pH 5.0条件下能生成花状纳米金，参见图17～20。

实施例7

量取1mg/mL的胰蛋白酶溶液1.6mL(为超纯水分散)，与0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.2mM、2.0mM的氯金酸溶液8mL充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5∶1，溶液pH为5.0；加入一定量的0.015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为3.0mM，搅拌混匀。室温下反应1h～24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。氯金酸浓度为0.2～0.4mM得到花状纳米金，浓度为0.6-2.0mM得到纳米金颗粒，参见图21～22。

Claims

1.花状纳米金的制备方法，其特征在于所述花状纳米金由纳米颗粒组成，胰蛋白酶包覆，产物粒径为100～200nm，形状粒径均一；

所述花状纳米金的制备方法包括以下步骤：

3)收集反应产物，洗涤后得产物花状纳米金。

2.如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述氯金酸和胰蛋白酶溶液，按体积比为1～10∶1。

3.如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述氯金酸的浓度为0.02～1.0mM。

4.如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述胰蛋白酶的浓度为0.08～1.5mg/mL。

5.如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述抗坏血酸的浓度为0.5～6.0mM。

6.如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述反应的温度为25～90℃，反应的时间为5min～24h。

7.如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述反应溶液pH值为3.0～10.0。

8.如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述洗涤是以超纯水超声洗涤3次。