CN109822109B

CN109822109B - 一种具有过氧化物酶活性的花状银纳米酶的制备方法

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Publication number: CN109822109B
Application number: CN201910278589.4A
Authority: CN
Inventors: 张丽娟; 韩延东; 张小玉; 杨文胜
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN109822109A

Abstract

本发明的一种具有过氧化物酶活性的花状银纳米酶的制备方法属于纳米材料制备的技术领域。在持续搅拌条件下，将pH为11.2～11.8的组氨酸水溶液与硝酸银溶液混合，然后加入还原剂羟胺溶液；反应5分钟后，得到单分散性良好的花状的银纳米酶；通过改变组氨酸的pH值调控产物的花枝长度，通过改变组氨酸的最终浓度调控产物的尺寸。本发明操作简单，通过改变反应条件，可制备出不同尺寸、不同枝长度的花状的银纳米酶，制备的花状的银纳米酶单分散性良好，且具有极高的过氧化物酶活性，可更好地满足实际应用需要。

Description

一种具有过氧化物酶活性的花状银纳米酶的制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料制备的技术领域，具体涉及一种一步法制备单分散的、具有过氧化物酶活性的、花状的银纳米酶的方法。

技术背景

近年来研究发现，一些金属纳米粒子在特定的反应条件下具有生物酶的活性，因此被称为纳米酶(Chem.Soc.Rev.2013,42,6060-6093)。相比天然酶，纳米酶因具有生产成本低、稳定性好、产量高及可循环使用等优点，得到了越来越广泛的关注。常见的金属纳米酶有Au，Ag，Pt，Pd及其多种金属复合粒子。其中银纳米酶，具有优异的表面增强拉曼效应(Analyst 2017,142,2484)，因而更利于痕量分子的分析及活化，此外其价格相对低廉，更利于工业化的生产及应用。因此，相比其他金属纳米酶，银纳米酶具有更加实际的应用价值。在已知的银纳米酶的研究中，研究人员发现，无论是球形还是核壳复合结构，都有可能具有生物酶活性，特别是过氧化物酶活性(Sensors Actuators B:Chem.2017,247,98；ACSApplied Materials&Interfaces 2015,7,14463；RSC Advances 2013,3,6095-6105)。然而，直到目前还少见报道花状的银纳米酶的制备。理论研究表明，相比于其他形貌结构的银纳米酶，花状的银纳米酶中具有高密度的棱边、角及阶梯原子，可能会展现出更高的比表面积及更多的活性位点(Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,76；Angew.Chem.2017,129,14455)。现有已有数篇工作合成出了具有过氧化物酶活性、且具有花状形貌的银合金纳米酶：壳聚糖为配体的金@银纳米酶(Talanta 2015,140,204-211)，以CTAB为配体、花枝较短的Ag-Pd纳米酶(Chem.Mater.2010,22,2988-2994)及以PVP等为配体的片状的Au-Ag纳米(ACSApplied Materials&Interfaces 2016,8,27140-27150)。但这些合成方法均使用了高分子或表面活性剂，容易占据活性位点，从而影响酶活性，且存在花枝长度不可调控，纳米酶适用范围窄(如pH、温度)等问题。此外，第一个工作中，纳米酶在酸性条件下表现出一定的过氧化物酶活性，但在中性条件下则活性明显下降(许多酶催化反应及检测应用都必须在中性条件下进行)；后两者存在合成过程耗时长、实验操作繁琐、且合成条件苛刻等局限性。直到目前，利用简单的实验方法，制备出普适性更强的具有过氧化物酶活性的花状的银纳米酶，还一直是个挑战。

发明内容

本发明的目的是克服背景技术存在的不足，提供一种条件温和，产物枝长、尺寸均可控且在中性条件下具有较高过氧化物酶活性的花状银纳米酶的制备方法。

具体的技术方案如下：

一种具有过氧化物酶活性的花状银纳米酶的制备方法，其特征在于：在室温条件下，在持续搅拌条件下，将pH为11.2～11.8的组氨酸水溶液与硝酸银溶液混合，然后加入还原剂羟胺溶液，混合后，硝酸银的最终浓度为0.25mM，组氨酸的最终浓度为0.2～0.625mM；还原剂的最终浓度为0.5mM；反应5分钟后，得到单分散性良好的花状的银纳米酶；通过改变组氨酸的pH值调控产物的花枝长度，通过改变组氨酸的最终浓度调控产物的尺寸。

所述的通过改变组氨酸的pH值调控产物的花枝长度，具体是指：固定组氨酸与硝酸银摩尔比为2:1，在pH＝11.2～11.8范围内，随着pH值升高，银纳米酶各向异性生长，粒子表面粗糙程度逐渐增加，花枝长度也依次增加，当pH值为11.2～11.8时，得到银纳米酶的花枝长度为9nm～23nm。

所述的通过改变组氨酸的最终浓度调控产物的尺寸，具体是指：在固定pH＝11.8条件下，混合溶液中组氨酸的最终浓度0.2mM～0.625mM时，得到尺寸为90nm～145nm的银纳米酶。

所述的搅拌，优选500rpm的搅拌速度。

在本发明的花状的银纳米酶制备方法中，所述的酶活性尤其指过氧化物酶活性。所述的单分散性是指粒子尺寸分布宽窄的一个量度，可用粒子尺寸偏差来表示。偏差越小(<5％)，表明粒子尺寸分布越窄，粒径更为均一，就认为粒子是单分散的(Langmuir 2008,24,1714)。

有益效果：

1、本发明实验操作简单，仅用一步法就能制备出花状的银纳米酶。

2、本发明通过改变反应条件，可制备出不同尺寸、不同枝长度的花状的银纳米酶，可满足更广泛的应用需求。

3、本发明制备的花状的银纳米酶单分散性良好(粒子尺寸偏差值<5％)。

4、本发明制备的花状的银纳米酶具有极高的过氧化物酶活性，且pH 4～8条件下都具有较高的过氧化物酶活性，可更好地满足实际应用需要。

附图说明

图1是实施例1，pH＝11.2条件下制得的银纳米酶的TEM图像。

图2是实施例1，pH＝11.4条件下制得的银纳米酶的TEM图像。

图3是实施例1，pH＝11.6条件下制得的银纳米酶的TEM图像。

图4是实施例1，pH＝11.8条件下制得的银纳米酶的TEM图像。

图5是实施例1中pH＝11.2～11.8条件下制得的银纳米酶的紫外-可见吸收光谱。

图6是实施例2中制得的有效粒径为90nm银纳米酶的TEM图像。

图7是实施例2中制得的有效粒径为126nm银纳米酶的TEM图像。

图8是实施例2中制得的有效粒径为145nm银纳米酶的TEM图像。

图9是实施例2制得不同有效粒径的银纳米酶的紫外-可见吸收光谱图。

图10是实施例3中pH＝11.8、组氨酸最终浓度为0.2mM条件下合成的银纳米酶在pH＝6的缓冲液中催化TMB-H₂O₂、OPD-H₂O₂、ABTS-H₂O₂反应体系数分钟后所测得的紫外-可见吸收光谱。

图11是实施例3中pH＝11.8、组氨酸最终浓度为0.2mM条件下合成的银纳米酶在pH＝6的缓冲液中催化TMB-H₂O₂、OPD-H₂O₂、ABTS-H₂O₂反应体系数反应前后对比照片。

图12是实施例3中TMB-H₂O₂体系在pH＝4、pH＝6、pH＝8条件下，前后的对比照片。

图13是实施例3中pH＝11.8、组氨酸最终浓度为0.2mM条件下合成的银纳米酶在pH＝4缓冲液中催化TMB-H₂O₂反应，经计算，得到的双倒数曲线。

图14是实施例3中pH＝11.8、组氨酸最终浓度为0.2mM条件下合成的银纳米酶在pH＝6缓冲液中催化TMB-H₂O₂反应，经计算，得到的双倒数曲线。

图15是实施例3中pH＝11.8、组氨酸最终浓度为0.2mM条件下合成的银纳米酶在pH＝8缓冲液中催化TMB-H₂O₂反应，经计算，得到的双倒数曲线。

具体实施方式

以下是本发明的实施例用到的基础条件，但本发明能实施的范围并不限于这些条件，也不限于这些实施例：

环境温度25℃，1个大气压；

硝酸银(AgNO₃),分子量169.7g/mol；

水(H₂O)，密度1g/mL，分子量18g/mol；

组氨酸(C₆H₉N₃O₂)，分子量155.15g/mol；

羟胺(NH₂OH)，分子量33.03g/mol；

乙酸(CH₃COOH)，分子量60.05g/mol；

磷酸(H₃PO₄)，分子量97.97g/mol；

硼酸(H₃BO₃)，分子量61.83g/mol；

3,3',5,5'-四甲基联苯胺(C₁₆H₂₀N₂)，分子量240.34g/mol；

邻苯二胺(C₆H₄(NH₂)₂)，分子量108.14g/mol；

2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(C₁₈H₂₄N₆O₆S₄)548.68g/mol。

实施例1：通过改变pH调节银纳米花的枝长

用0.2M NaOH溶液将组氨酸溶液pH分别调节为11.2、11.4、11.6、11.8，各取9.8125mL(含5μmol组氨酸)，在500rpm搅拌下，分别向其中加入62.5μL40mM硝酸银溶液，搅拌均匀后，再加入125μL 40mM的羟胺溶液，最终溶液总体积10mL，溶液中组氨酸、硝酸银、羟胺的浓度分别为0.5mM、0.25mM、0.5mM，继续搅拌5min后停止反应，得到尺寸约为120nm、枝长分别为9nm、11nm、20nm、23nm的银纳米酶，TEM图像分别如图1、2、3、4所示，紫外-可见吸收光谱如图5所示。

通过本实施例可以看出本发明可通过改变pH实现对银纳米酶的枝长的调控。

实施例2：通过改变组氨酸与硝酸银摩尔比调节银纳米花尺寸

将实施例1中的pH保持11.8，控制混合溶液中组氨酸的最终浓度分别为0.2mM、0.375mM、0.625mM，其他条件不变，反应结束后得到尺寸分别为90nm，126nm，145nm的银纳米酶，TEM图像分别如图6、7、8所示，紫外可见吸收光谱如9所示。

实施例3：银纳米酶的过氧化物酶活性表征

取pH＝11.8、组氨酸最终浓度为0.2mM条件下合成的银纳米酶200μL，并与含有过氧化氢和不同底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)、OPD(邻苯二胺)或ABTS(2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的pH＝6的Britton-Robinson缓冲溶液混合，使总体积为3mL。其中TMB、OPD或ABTS的浓度为0.8mM，缓冲液浓度为10mM，过氧化氢浓度为600mM。反应数分钟后，测紫外-可见吸收光谱。光谱如图10所示，反应前后的对比照片如图11所示。

取pH＝11.8，组氨酸最终浓度为0.2mM条件下合成的银纳米酶200μL，并与含有过氧化氢和底物TMB的pH＝4、6、8的10mM Britton-Robinson缓冲溶液混合，使总体积为3mL。其中TMB浓度为0.8mM。不同pH条件下的反应前后对比照片如图12所示。并分别在pH＝4、6、8条件下测653nm处的动力学曲线，监测不同过氧化氢浓度时的酶催化反应。根据动力学曲线计算，得到pH＝4、pH＝6及pH＝8条件下的双倒数曲线(如图13、图14、图15所示)，并计算动力学参数。pH＝4～8条件下的动力学参数如表1所示。由表中的数据可以看出，在酶浓度保持一致的条件下，pH为中性时可以获得最高的反应速率及催化效率。

表1

	pH＝4	pH＝5	pH＝6	pH＝7	pH＝8
						[E](10<sup>-13</sup>M)	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4
V<sub>max</sub>(nM s<sup>-1</sup>)	1030.7	2469.1	9703.0	2606.8	69.7
						K<sub>m</sub>(mM)	832.2	436.6	1100.9	79.3	3.0
K<sub>cat</sub>(10<sup>5</sup>s<sup>-1</sup>)	13.8	33.2	130.3	35.0	0.94
						K<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>(10<sup>6</sup>s<sup>-1</sup>M<sup>-1</sup>)	1.7	7.6	11.8	44.2	31.6

其中[E]为酶浓度，V_max为最大反应速度，K_m为米氏常数，K_cat为酶的催化常数，K_cat/K_m为酶的专一性常数。

由以上实施例可以看出，本发明制备的花状的银纳米酶通过改变反应条件，如pH、组氨酸的用量，可调控银纳米酶的枝长、尺寸。在不同pH的缓冲液条件下，制备的纳米酶的活性不同。在中性条件下，制备的纳米酶具有极高的过氧化物酶活性，pH＝6时，催化效率最高。

Claims

1.一种具有过氧化物酶活性的花状银纳米酶的制备方法，其特征在于：在室温条件下，在持续搅拌条件下，将pH为11.2～11.8的组氨酸水溶液与硝酸银溶液混合，然后加入还原剂羟胺溶液，混合后，硝酸银的最终浓度为0.25mM，组氨酸的最终浓度为0.2～0.625mM；还原剂的最终浓度为0.5mM；反应5分钟后，得到单分散性良好的花状的银纳米酶；通过改变组氨酸的pH值调控产物的花枝长度，通过改变组氨酸的最终浓度调控产物的尺寸；

所述的通过改变组氨酸的pH值调控产物的花枝长度，是指：固定组氨酸与硝酸银摩尔比为2:1，在pH＝11.2～11.8范围内，随着pH值升高，银纳米酶各向异性生长，粒子表面粗糙程度逐渐增加，花枝长度也依次增加，当pH值为11.2～11.8时，得到银纳米酶的花枝长度为9nm～23nm；

所述的通过改变组氨酸的最终浓度调控产物的尺寸，是指：在固定pH＝11.8条件下，混合溶液中组氨酸的最终浓度0.2mM～0.625mM时，得到尺寸为90nm～145nm的银纳米酶。

2.根据权利要求1所述的一种具有过氧化物酶活性的花状银纳米酶的制备方法，其特征在于，所述的搅拌，优选500rpm的搅拌速度。