CN101981202A - 发酵生产1,5-二氨基戊烷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从含1，5-二氨基戊烷(DAP)的发酵液中分离DAP的方法、一种使用所述分离方法发酵生产DAP的方法以及一种使用根据所述方法分离的DAP或发酵生产的DAP生产含DAP的聚合物的方法。

Description

发酵生产1，5-二氨基戊烷的方法
本发明涉及一种从含1，5-二氨基戊烷(DAP)的发酵液中分离DAP的方法、一种使用该分离方法发酵生产DAP的方法以及一种使用以该方式分离和发酵生产的DAP制备含DAP的聚合物的方法。
发明背景
1，5-二氨基戊烷(也常称为1，5-戊二胺或尸胺；下文称为DAP)是化学工业中重要的原料。DAP例如用于制备聚酰胺、聚脲或聚氨酯及其共聚物。
此外，已知经赖氨酸脱羧发酵生产或酶催生产DAP一段时间了。就此已经描述了从发酵液中分离目标产物的各种方法。
如EP-A-1482055描述了在反应期间调节pH的二羧酸存在下赖氨酸的酶催脱羧。通过首先将含目标产物的溶液脱色和浓缩并然后在冷却结晶法中结晶DAP二羧酸盐来分离该方法中产生的DAP二羧酸盐。
WO-A-2006/123778描述了在二氧化碳存在下通过赖氨酸酶催脱羧制备DAP碳酸盐。通过浓缩反应溶液和消除二氧化碳形成DAP。
JP 2004-208646描述了通过将含L-赖氨酸二羧酸盐的溶液酶催脱羧并加入选自醇、酮和腈的有机溶剂将DAP二羧酸盐沉淀来制备DAP二羧酸盐。
JP 2004-222569描述了通过使用表达L-赖氨酸脱羧酶的棒状细菌，调整培养上清液到pH 12并用极性有机溶剂萃取DAP来制备DAP。
最后，JP 2004-000114描述了通过使用表达L-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌(E.coli)细胞转化高度浓缩的L-赖氨酸单盐酸盐，调整反应溶液到pH≥13并用极性有机溶剂萃取反应产物，随后蒸馏来制备DAP。
然而，基于借助有机溶剂的DAP萃取的现有技术方法尤其不利，因为目标产物的产量不是最理想且尤其是萃取步骤太慢以及整个方法太耗时，这极其不利于以工业规模实施该制备。
发明简述
因此本发明的目的是进一步改进从发酵液中分离DAP(尸胺)。更特定地，其旨在进一步提高目标产物的产量和改进分离，尤其是溶剂型萃取所需时间。
令人惊奇的是，通过提供如下一种方法实现该目的，其中a)首先调整发酵液到碱性pH，然后热处理，并此后用合适的有机萃取剂萃取。含DAP的发酵副产物，尤其是乙酰基-DAP，在这里惊奇地发现水解裂解而释放出目标产物。另一惊人之处是发现萃取步骤中相分离速率可大幅度提高。该相分离速率的增加例如在复合营养培养基如酵母提取物存在下后处理来自微生物发酵的发酵液时尤其明显。
附图描述
图1描述了从发酵液中分离DAP的整个方法的本发明特定实施方案的流程图。
图2显示了在pH 13.7下通过回流发酵液进行五小时的热处理期间乙酰基-DAP(三角形)水解裂解形成DAP(菱形)。残留的赖氨酸含量(正方形)在热处理期间保持不变。
图3显示了在加热方法中和随后发酵液的回流期间氨的释放。下曲线-气体量；上曲线-内部温度线图。
发明详述
1.优选实施方案
本发明涉及一种从含1，5-二氨基戊烷(DAP)的发酵液中分离DAP的方法，其中a)碱化发酵液，b)热处理发酵液，c)用有机萃取剂萃取DAP，和d)从取出的有机相中分离DAP。
在该方法的第一特定方案中，调整发酵液到pH＞11，例如尤其是≥11.5或≥12，例如尤其是≥12-14，或12.5-13.8，或13-13.8，或13.5-13.7。为此，尤其通过加入碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物如钠、钾或钙的氢氧化物调整pH。
通过调整pH可将材料分布进一步优化，最佳传质条件可设定在约pH12.5以上。
通过调整pH也可将任选存在的乙酰基-DAP裂解进一步优化，最佳裂解条件(裂解动力学)可设定在约pH 13以上-取决于存在的乙酰基-DAP量。
如果合适，细胞组分可在碱化之前从发酵液中去除。技术人员熟悉去除该细胞组分的方法(如分离器、倾析器、絮凝、过滤方法或多个这类工艺步骤的组合)。
在本方法的另一个方案中，将碱化的发酵液通过例如分批或连续地加热到回流温度，例如在大气压下加热到90-110℃，或在过压下加热到更高温度进行热处理。该热处理在引起任选存在的乙酰基-DAP水解裂解的条件下进行，优选以基本定量的方式。为此技术人员可按需调整重要的工艺参数如压力、温度和停留时间。术语“乙酰基-DAP”包含单乙酰基-DAP和二乙酰基-DAP，然而通常主要是单乙酰基的形式。在另外的实施方案中，该加热可分多步进行，例如也通过中间膨胀回收释放的氨。
在本发明方法另外的方案中，用与水有混溶性区的有机溶剂萃取DAP，该有机溶剂尽可能呈极性并在碱性pH下稳定，例如尤其是极性有机溶剂，更具体为偶极质子性有机溶剂。将在下文段落中描述合适的溶剂。
在优选实施方案中，DAP萃取和/或随后的相分离在升高的温度下分批进行。将在下文段落中描述萃取和后处理含DAP的萃取液的进一步方案。
本发明方法尤其适合后处理来自微生物在复合培养基如包含酵母提取物的培养基中发酵的发酵液。
本发明还涉及一种发酵生产DAP的方法，其中产生赖氨酸的微生物在产生赖氨酸和如果合适产生DAP的条件下培养并使用上述DAP分离方法分离形成的DAP。
该发酵可尤其在含复合培养基组分的培养基中进行。这可能包括使用产生赖氨酸的微生物，其额外表达赖氨酸脱羧酶活性如异源赖氨酸脱酸酶(LDC)，即来源于不同有机体的赖氨酸脱羧酶。
根据本发明，“复合营养或培养基”或“复合培养基”是本身已知的培养基，其包含物质混合物的复合组合物，例如玉米浆、胰胨、细菌用胨(bactone)、大豆水解产物以及尤其是酵母提取物。
另一方面还可使含赖氨酸的发酵液与提纯的、任选固定化的赖氨酸脱羧酶接触，从而使赖氨酸脱羧给出DAP，或将其他表达任选固定化LDC的微生物加入培养液中或使后者与其接触。在本文明确参考的现有技术(例如参见JP 2002-223771)描述了在这方面合适的方法。
这里原则上可对上述整个分离方法或上述发酵生产方法或其单个步骤作为分批或半分批或补料分批或重复(补料)分批法分批或连续进行。
本发明进一步涉及一种制备含DAP的聚合物的方法，其中DAP单体首先通过上述方法发酵生产和分离，然后与至少一种其他共聚单体一起聚合。该共聚单体可尤其选自多元羧酸如尤其是具有4-12个碳原子的二羧酸、其酯和酐；以及多异氰酸酯如尤其是具有C2-C10亚烷基桥连基或环状桥连基的二异氰酸酯。合适二羧酸的非限制性实例是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸等等。合适二异氰酸酯的非限制性实例是二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、甲苯二异氰酸酯(TDI)、六亚甲基二异氰酸酯(HDI)和异佛尔酮二异氰酸酯。这导致了尤其是聚酰胺、聚脲或聚氨酯类聚合物的形成，例如聚酰胺5，10或聚酰胺5，6。
聚合方法包括将至少一种共聚单体加入分离的DAP或使用来自DAP沉淀的DAP和至少一种共聚单体的混合物。例如通过如上所述借助蒸馏后处理的DAP萃取液的DAP盐沉淀可产生合适的DAP/共聚单体混合物。该共聚单体优选多元羧酸如癸二酸。
2发酵产生赖氨酸或DAP的总说明
2.1微生物
本发明原则上可用于任何含DAP的发酵液的后处理中。原则上对发酵所用微生物也没有限制。后者可能是天然存在的微生物、借助突变和选择改良的微生物，但尤其是重组产生的微生物，例如真菌，但尤其是细菌。这些微生物能够直接生产DAP和/或DAP衍生物如乙酰基-DAP或至少能够发酵产生赖氨酸，尤其是L-赖氨酸。更具体而言，所用重组细菌能够经二氨基庚二酸酯途径(“DAP途径”)、琥珀酰酶途径或脱氢酶途径生物合成赖氨酸。
这些微生物可由葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或由甘油、酯肪酸或植物油或乙醇产生赖氨酸，尤其是L-赖氨酸，并优选释放至少部分产生的赖氨酸进入细胞外空间。它们优选为棒状细菌，更具体为棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)。可特别提及棒状杆菌属中的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其产生L-氨基酸的能力已被本领域所知。
可提及的棒状细菌的合适菌株的实例是棒状杆菌属菌株，尤其是谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)菌株，例如谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806、嗜醋酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539、栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965，或短杆菌属菌株，例如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020；或衍生于它们的菌株，例如谷氨酸棒状杆菌KFCC10065、谷氨酸棒状杆菌ATCC21608。
缩写KFCC是指韩国联邦菌物保藏中心(the Korean Federation ofCulture Collection)。缩写ATCC表示美国典型培养物保藏中心(theAmerican Type Strain Culture Collection)。缩写FERM BP表示日本产业技术综合研究院国家生物科学和人类技术研究院保藏中心(the collection ofthe National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Japan)。
2.2发酵程序
本发明待后处理的发酵液例如来源于重组棒状细菌的培养，该细菌经由促进赖氨酸生物合成和影响至少一种赖氨酸生物合成基因的解调性(deregulating)干涉使赖氨酸，尤其是L-赖氨酸的产量或含赖氨酸的混合物的产量增加和/或其额外超表达具有赖氨酸脱羧酶活性的酶并积累DAP和/或乙酰基-DAP。后者因此能够直接生产DAP。
赖氨酸生物合成涉及的基因和伴随的促进赖氨酸生物合成的解调性干涉总结于下表1。
表1：解调性基因和基因产物的实例
Figure BPA00001230999900061
一种使用具有解调的赖氨酸脱羧酶基因和至少一种例如在赖氨酸生物合成中涉及的其他解调基因的重组微生物生产DAP的方法已在本文明确参考的WO 2007/113127中公开。
“解调”显然应作最广义的理解并包括酶活性以许多不同方式的增加或降低或消除，例如通过微生物中酶分子拷贝数的增加或降低或修饰降低赖氨酸生物合成的其他特性。
赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18.)催化L-赖氨酸脱羧生成DAP。该酶的实例是cadA基因产物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，Entryb4131)或ldcC基因产物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，EntryJW0181)。技术人员已知其在制备生产尸胺的重组微生物中的用途(例如参见EP-A-1482055)。
技术人员可采取单个或组合的不同措施实现超表达/解调。因此可增加相应基因的拷贝数，或使启动子和调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以相同的方式起作用。另外，诱导型启动子能够提高发酵生产L-赖氨酸过程中的表达。延长mRNA寿命的方法同样提高表达。此外，阻止酶蛋白降解同样提高酶活性。基因或基因构建体可在一种或多种具有不同拷贝数的质粒中存在或在染色体中整合和扩增。或者，该基因可进一步通过改变培养基组成和培养程序而超表达。
技术人员将找到这方面说明，尤其是在Martin等(Biotechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等(Gene 138，35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等(Gene 102，93-98(1991))、欧洲专利0472869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991))、Remscheid等(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994))、LaBarre等(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))、专利申请WO 96/15246、Malumbres等(Gene 134，15-24(1993))、日本公开文本JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60：512-538(1996))以及已知的遗传学和分子生物学教科书中。
通过使用包含编码所需酶活性的核酸序列的表达构建体或载体在调节核酸序列的遗传控制下制备合适的生产者菌株。该构建体优选包含特定编码序列上游的启动子5’和下游的终止子序列3’以及如果合适，其他常规调控元件，其在每种情况下与编码序列操作性连接。“操作性连接”是指启动子、编码序列、终止子以及如果合适，其他常规调控元件的顺序排列，以使所述调控元件各自能完成其在表达编码序列中所需的功能。操作性连接序列的实例是激活序列以及增强子等等。其他调控元件包含选择标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调节序列例如描述在Goedde，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。
除了人工调节序列，在实际结构基因的上游仍可能存在天然调节序列。如果合适，遗传修饰能够关闭该天然调节，并使基因表达增加或减少。然而，基因构建体也可具有更简单的结构，就是说结构基因上游未插入额外的调节信号，并且具有其调节的天然启动子不被剔除。相反，天然调节序列以不再发生调节以及增强或减小基因表达的方式突变。核酸序列可能存在于基因构建体中的一种或多个拷贝中。
可用的启动子实例是：谷氨酸棒状杆菌启动子ddh、amy、lysC、dapA、lysA以及如在Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives，Sonenshein，Abraham L.，Hoch，James A.，Losick，Richard；ASM Press，District ofColumbia，Washington和Patek M.Eikmanns BJ.Patek J.Sahm H.Microbiology.1421297-309，1996中所述的革兰氏阳性启动子SPO2，或者有利地用于革兰氏阴性细菌的启动子cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL。还优选使用诱导型启动子如光诱导型以及尤其是温度诱导型启动子如PrPl启动子。原则上可能使用所有具有调节序列的天然启动子。此外，可有利地使用如复启动子的合成启动子(例如参见WO2006/069711)。
所述调控元件旨在使核酸序列的特定表达成为可能。例如取决于宿主有机体，这可能意味着基因只在诱导后才被表达或超表达或直接被表达和/或超表达。
调节序列或因子此外可能优选正面地影响并因此增加或减少表达。所以，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子可在转录水平下有利地发生调控元件增强。然而通过如提高mRNA的稳定性也可能增强翻译。
通过将合适的启动子、合适的SD序列融合到赖氨酸生物合成核苷酸序列以及合适的终止子信号上来制备表达盒。为此，使用如在CurrentProtocols in Molecular Biology，1993，John Wiley&Sons，Incorporated，New York New York，PCR Methods，Gelfand，David H.，Innis，MichaelA.，Sninsky，John J.1999，Academic Press，Incorporated，California，San Diego，PCR Cloning Protocols，Methods in Molecular Biology Ser.，第192卷，第二版，Humana Press，New Jersey，Totowa.T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所述的传统重组和克隆技术。
为了在合适宿主有机体中表达，有利地将重组核酸构建体或基因构建体插入宿主特异性载体中，其能够使基因在宿主中最佳表达。技术人员熟知载体并例如可在“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。载体不但指质粒而且指技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体、转位子、插入序列、噬菌粒、粘粒以及线性或环状DNA。这些载体可在宿主有机体中经历自主复制或经历染色体复制。
合适的质粒在棒状细菌中复制的那些。众多已知的质粒载体如pZ1(Menkel等，Applied and Environmental Microbiology(1989)64：549-554)、pEKEx1(Eikmanns等，Gene 102：93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，Gene 107：69-74(1991))基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。其他质粒载体如pCLiK5MCS或基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A 5,158,891)的那些可以相同的方式使用。
合适的质粒载体此外也是帮助使通过整合到染色体中的基因扩增过程能够应用的那些，例如如Remscheid等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994))就hom-thrB操纵子的复制和扩增所述。该方法包括全基因克隆到质粒载体，该质粒载体能够在宿主(典型为大肠杆菌)中而不在谷氨酸棒状杆菌中复制。合适的载体实例是pSUP301(Sirnon等，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob和pK19mob((Schf
Figure BPA00001230999900101
er等，Gene 145，69-73(1994)，Bernard等，Journal of Molecular Biology，234：534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等，1991，Journal of Bacteriology173：4510-4516)以及pBGS8(Spratt等，1986，Gene 41：337-342)。含待扩增基因的质粒载体然后通过转化为所需谷氨酸棒状杆菌菌株的方式转移。例如在Thierbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))以及Tauch等(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中描述了转化方法。
相应基因中突变可能以酶催反应速率部分或完全降低的方式影响酶活性。技术人员已知该突变的实例(Motoyama H.Yano H.Terasaki Y.Anazawa H.Applied&Environmental Microbiology.67：3064-70，2001，Eikmanns BJ.Eggeling L.Sahm H.Antonie van Leeuwenhoek.64：145-63，1993-94.)。该方法可用于例如消除或减慢本发明赖氨酸生物合成的竞争反应(Nakayama：“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，Academic Press，London，UK，1982)。
此外，除了赖氨酸生物合成基因的表达和增强以外，增强上游生物合成途径如戊糖磷酸代谢、柠檬酸酯循环或氨基酸输出的一种或多种酶可能有利于L-赖氨酸的生产。
本发明所用微生物可以连续或以分批或补料分批或重复补料分批法分批培养以生产L-赖氨酸。已知培养方法的概述可在Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocesstechnology 1.Introduction to bioprocess technology](Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991))或在Storhas的教科书(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheral equipment](ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中找到。
待用培养基必须以合适方式满足各个菌株的要求。各种微生物的培养基的描述可在American Society for Bacteriology的“Manual of Methodsfor General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)中找到。
本发明可利用的这些培养基通常包括一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。
优选的碳源是糖类如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖类也可通过复合化合物如糖蜜或糖精制的其他副产物加入培养基中。加入各种碳源的混合物也可能是有利的。其他可能的碳源是油类和脂肪类如大豆油、葵花油、花生油和椰子脂，脂肪酸如棕榈酸、硬酯酸或亚油酸，醇类如甘油、甲醇或乙醇以及有机酸如乙酸或乳酸。
氮源通常是氮的有机或无机化合物或包含这些化合物的材料。氮源的实例包括液体或气体形式的氨或铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、氨基甲酸铵或硝酸铵，硝酸盐，尿素，氨基酸或复合氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其他。氮源可单独或作为混合物使用。
培养基中可能存在的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐、碳酸盐或硫酸盐以及硼酸。
可作为硫源使用的是无机含硫化合物如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物或有机硫化合物如硫醇和硫羟化合物。
作为磷源可使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。
为了保持金属离子在溶液中，可向培养基中加入螯合剂。尤其合适的螯合剂包括二羟基酚如儿茶酚或原儿茶酸盐或有机酸如柠檬酸。
根据本发明所用培养基通常还包含其他生长因子如维生素或生长促进剂，其例如包括生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐以及吡哆醇。生长因子和盐类通常来源于复合培养基组分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等等。此外可将合适的前体加入培养基。培养基组合物的精确组成主要取决于特定实验并对每种特定情形单独选择。关于培养基优化的信息可从教科书“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(编委P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，ISBN 0199635773)中得到。生长培养基也可从商业供应商处购买，例如Standard1(Merck)或BHI(Brain heartinfusion，DIFCO)等等。
所有培养基组分通过加热杀菌(如过压1巴(总共2巴)和121℃下20分钟)或通过杀菌过滤而杀菌。各组分可一起杀菌或如果需要，单独杀菌。所有培养基组分可以在培养开始时存在或任选连续或分批地加入。
培养温度通常为15-45℃，优选25-40℃，并在实验期间可保持不变或变化。培养基的pH应为5-8.5，优选7左右。发酵pH在发酵期间可通过加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、氨或氨水或酸性化合物如磷酸、盐酸或硫酸进行控制。发泡可通过使用防沫剂如脂肪酸聚乙二醇酯、聚亚烷基二醇、聚硅氧烷和其他控制(例如参见Biotechnol.Progr.2007，23，767-784)。质粒的稳定性可通过将具有选择性效果的合适物质如抗生素加入培养基中维持。需氧条件通过将氧气或含氧气体混合物如环境空气引入培养物中维持。培养温度通常为20-45℃。培养持续到所需产物的形成达到最大为止。通常在10-160小时内达到该目标。
以该方式得到的发酵液尤其包含L-赖氨酸或DAP，其通常具有3-20重量％的干物质含量。
糖限制的发酵至少在结束时，但尤其占发酵时间的至少30％是额外有利的。这意味着在此期间发酵培养基中可用糖的浓度保持在或降低到≥0-3g/l。
然后进一步处理发酵液。取决于要求，生物质可通过分离方法如离心分离、过滤、倾析、絮凝或这些方法的组合从发酵液中完全或部分去除或完全留在其中。优选去除生物质。
2.3含DAP的发酵液的后处理
然后通过已知的方法如借助旋转蒸发器、薄膜式蒸发器、降膜蒸发器，通过反渗透或通过纳米过滤可将发酵液增稠或浓缩。如果需要，可能因浓缩程序而沉淀的盐类例如可通过过滤或离心分离而去除。然后该浓缩的发酵液可以以本发明方式进行后处理得到DAP。对于本发明后处理，该浓缩程序是可行的，但不是绝对必须的。
根据本发明，DAP借助有机萃取剂从发酵液中萃取出来。更特定地，这里使用和水具有混溶性区的有机溶剂，其尽可能呈极性并在碱性pH下稳定，例如尤其是极性、偶极质子性有机溶剂。合适的溶剂尤其是具有3-8个碳原子的环状或开链、任选支化的烷醇，尤其是正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇或环己醇，以及正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、2-辛醇及其单支化或多支化异构体形式。这里特别提及正丁醇。
在优选的实施方案中，萃取和/或随后的相分离在升高温度下分批进行，该温度受到水的沸点和萃取剂的沸点或可能形成的共沸物的沸点限制。使用萃取剂正丁醇时，萃取和相分离例如可在大约25-90℃或优选40-70℃下进行。为了萃取，搅拌两相直到例如在10秒到2个小时，优选5-15分钟内达到分配平衡。然后沉降各相直到它们完全分开；这需要优选10秒到5小时，例如15-120或30-90分钟，尤其也在正丁醇的情况下大约25-90℃或40-70℃的温度下。
进一步优选的实施方案中，在多级方法中(如在混合器-沉降器组合中)或在萃取塔中将DAP连续地从发酵液中萃取出来。
技术人员可确定萃取塔的构型，其可根据本发明在每种情况下作为优化途径的一部分用于待分离的各相。原则上合适的萃取塔是无功率输入的那些或有功率输入的那些，例如脉冲塔或带旋转内件的塔。作为常规工作的一部分，技术人员也可以合适方式选择内件类型和材料如筛板和塔板，从而优化相分离。小分子的液液萃取基础理论是熟知的(例如参见H.-J.Rehm和G.Reed编辑(1993)，Biotechology，第3卷Bioprocessing，第21章，VCH，Weinheim)。如在Lo等编辑(1983)Handbook of SolventExtraction，JohnWiley&Sons，New York中描述了工业上可用的萃取塔构型。明确地参考上述教科书的公开。
相分离后，DAP以本身已知的方式从含DAP的萃取相中分离和提纯。回收DAP的可能方法尤其是但不限于蒸馏、作为与合适有机酸或无机酸的盐沉淀或这些合适方法的组合。
蒸馏可连续或分批地进行。可使用单个蒸馏塔或相互连接的多个蒸馏塔。构造蒸馏塔设备以及确定操作参数是技术人员的责任。每种情况下所用蒸馏塔可根据本身已知的方式设计(例如参见Sattler，ThermischeTrennverfahren[热分离方法]，1995，第2版，Weinheim，第135页及随后各页；Perry’s Chemical Engineers Handbook，1997，第7版，New York，第13部分)。因此，所用蒸馏塔可包括分离有效内件，例如分离塔盘如多孔塔盘、泡罩塔盘或浮阀塔板，排列的填料如片状金属或织物填料或不规则填料床。所用塔需要的塔板数和回流比主要取决于纯度要求和待分离液体的相对沸腾位置，技术人员通过已知的方法能够确定特殊设计和操作数据。
通过加入合适的有机酸或无机酸如硫酸、盐酸、磷酸、乙酸、甲酸、碳酸、草酸等可得到盐沉淀。在另外的优选实施方案中，使用有机二羧酸，形成可直接或在提纯(例如通过再结晶)后在随后的缩聚得到聚酰胺中使用的盐。更具体而言，该二羧酸是C4-C12二羧酸。
在萃取程序中产生的有机DAP相也可用层析法后处理。为了层析，将DAP相施加到合适的树脂如强或弱酸性离子交换剂(如Lewatit 1468S、Dowex Marathon C、Amberlyst 119Wet或其他)上，所需产物或污染物部分或完全保留在层析树脂上。这些层析步骤可重复，如果需要，使用相同的或其他层析树脂。技术人员熟悉选择合适的层析树脂及其最有效的应用。提纯后的产物可通过过滤或超滤浓缩并在合适温度下储存。
分离的化合物的特性和纯度可通过现有技术测定。这些包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、分光镜法、染色法、薄层层析、NIRS、酶分析或微生物学分析。这些分析方法概述于Patek等(1994)Appl.Environ.Microbi01.60：133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；和Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.19：67-70.Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCH：Weinheim，第89-90页，第521-540页，第540-547页，第559-566页，第575-581页和第581-587页；Michal，G(1999)Biochemical Pathways：An Atlas ofBiochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等(1987)Applications of HPLC in Biochemistry，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第17卷中。
本发明现在基于下列非限制性实施例并参考附图更详细地描述。
实验部分
发酵实施例1：
从本身已知的生产DAP的菌株(参见本文明确参考的WO 2007/113127实施例2，第14页)的储用培养物(在-80℃下存储)中取出等分实验细胞，在培养皿(培养1)中的固体培养基(特定培养基组成，参见表2)上划线并然后在30℃下温育72小时。用浓度为0.9％的NaCl溶液溶解以该方式得到的细胞，再在培养皿(培养2)中的固体培养基上划线并然后在30℃下再温育24小时。然后通过使用接种环将细胞从培养皿(培养2)中取出以在具有两块挡板的2L摇瓶中接种200ml(组成类似于平板和分批培养基)并在定轨摇床上以250rpm于30℃下温育24小时。
摇瓶的内容物作为接种填充体积为50L的75L发酵罐的预培养物。借助氨气将pH调节为pH 6.8。通气速率大约0.33vvm。
主培养在填充体积为700L的5m3罐中以分批相进行。为此，另外24小时后将培养物从75L发酵罐转移到该5m3罐中。用氨将pH调节为pH 6.8。通过调节通气速率和搅拌器转速将溶解氧调节为20-30％(空气饱和度)。
约24小时后分批培养基的葡萄糖浓度降到低于1g/l并开始计量进料。约80小时后获得约3200L的最终发酵量。发酵中的最终浓度如下：OD610：140，1，5-二氨基戊烷：72g/l，赖氨酸×HCl：15g/l，乙酰基-二氨基戊烷：10g/l。
使用实心壁离心机去除细胞，并在混浊液中浓缩3.3倍，而浊度在透明液中约为OD6105。透明液用浓度为50％的NaOH调节到pH 13.5。
表2：培养基的组成
  预培养   主培养   主培养
  平板   烧瓶   分批   分批   进料
  琼脂   20.00g/l
  单水合葡萄糖   62.48g/l   62.48g/l   18.76g/l   62.50g/l   431.79g/l
  硫酸铵   24.29g/l   24.29g/l   24.29g/l   130.00g/l
  喷雾干燥的酵母提取物   15.16g/l   15.16g/l   18.94g/l   19.00g/l   17.40g/l
  尿素   13.79g/l
  单水合柠檬酸   2.04g/l   2.04g/l   2.04g/l   2.04g/l   1.55g/l
  磷酸氢二钠   1.24g/l   1.24g/l
  七水合硫酸镁   1.25g/l   1.25g/l   1.25g/l   1.25g/l   1.13g/l
  磷酸二氢钾   1.24g/l   1.24g/l   2.44g/l   2.48g/l   2.24g/l
  二水合硫酸钙   168.00mg/l   168.00mg/l   0.17g/l   0.17g/l   0.13g/l
  七水合硫酸铁   70.48mg/l   70.48mg/l   0.07g/l   0.07g/l   0.06g/l
  七水合硫酸锌   28.00mg/l   28.00mg/l   28.00mg/l   28.00mg/l   25.21mg/l
  一水合硫酸锰   14.35mg/l   14.35mg/l   14.00mg/l   14.00mg/l   12.90mg/l
  硼酸   428.70μg/l   428.70μg/l   038mg/l   038mg/l   038mg/l
  五水合硫酸铜   417.27μg/l   417.27μg/l   0.36mg/l   036mg/l   037mg/l
  七水合硫酸钴   337.24μg/l   337.24μg/l   0.30mg/l   0.30mg/l   0.30mg/l
  六水合硫酸镍   284.37μg/l   284.37μg/l   0.24mg/l   0.24mg/l   0.25mg/l
  二水合钼酸钠   71.45μg/l   71.45μg/l   0.08mg/l   0.08mg/l   0.06mg/l
  泛酸   28.00mg/l   28.00mg/l   28.00mg/l   28.00mg/l   25.20mg/l
  烟酰胺   8.40mg/l   8.40mg/l   8.40mg/l   8.40mg/l   7.56mg/l
  盐酸硫胺素   7.00mg/l   7.00mg/l   7.00mg/l   7.00mg/l   6.30mg/l
  生物素   4.20mg/l   4.20mg/l   4.20mg/l   4.20mg/l   3.78mg/l
除了维生素用0.2μm过滤器过滤杀菌外，所有培养基组分在121℃下杀菌30分钟。
示例性实施方案1：从产生赖氨酸和DAP的微生物发酵液中回收DAP
a)热处理和萃取程序(单批)
将用NaOH调整到pH 13.5的750kg(670L)无细胞发酵液装入1m3不锈钢罐中。将反应器内容物加热到回流温度(约103℃)并回流5小时。该方法产生的含氨废气通过湿煤气净化器(水作为洗涤液)收集。冷却到60℃后，加入140kg正丁醇，随后在60℃下搅拌15分钟，并且将该混合物沉降2小时。相分离后，下面的水相被排入1m3容器中。有机相收集在另一容器中。每种情况下加入35L去离子水后，每种情况下用140kg正丁醇在60℃进一步萃取两次水相。
总共得到590kg有机萃取相，其包含44.2kg DAP(含量约7.5％)。
b)蒸馏程序
起初将来自萃取(子步骤a)的900kg合并有机相装入安装有塔(4块理论塔板)的1m3不锈钢罐。另外1400kg萃取溶液以恒定体积进料，蒸除水/正丁醇。压力然后降到200毫巴并蒸馏该混合物直到剩余360kg底部产物。
该底部产物在40毫巴下在体积为400L并安装有具有8块理论塔板的塔的另一不锈钢罐中进一步蒸馏。在正丁醇初馏物和混合馏分之后，共蒸出155.4kg平均纯度为99.6重量％的DAP。在任何一种馏分中发现不超过0.4％(GC面积)的次级组分四氢吡啶。
实验实施例1：萃取中传质速率的研究
本发明制备的有机DAP萃取液建立的分配平衡通过在各时间点经底部阀排出两相样本并在分层后立即分离各相而在60℃下在2.5L反应器中于强烈搅拌下研究。尽管由于所需样本的沉降时间而有些不准确，但仍可以推断出很快-15秒后发生分配，5分钟后发现样本具有98.5％的DAP。因此再搅拌15分钟可以认为已经足够。
实验实施例2：相分离速率的研究
相分离速率在具有3级臂式搅拌器和4块挡板的2.5L双壁夹套反应器中研究。
有与无热处理的混合物的实验结果(每种情况下连续萃取4次)总结于表3和4中。
表3：无热处理下萃取含酵母提取物的培养液的相分离时间
Figure BPA00001230999900171
1)乳液作为中间相
表4：热处理(4h，104℃)后萃取含酵母提取物的培养液的相分离时间
Figure BPA00001230999900172
实验实施例3：煮浓和乙酰基-DAP的裂解
观察到生产者有机体额外使部分形成的DAP在两个氨基中的任一个上乙酰化。
乙酰基-二氨基戊烷通过回流发酵液显示是可水解的，设定到13以上的碱性pH，释放出二氨基戊烷(见图2)。这能够使产量增加。相反，在酸性条件(pH 1，用硫酸)下水解非常缓慢。
回流时，回流甚至在约95℃时开始，随后约103-105℃的回流温度在底部产生。水解中氨的释放尤其是在加热程序中观察到(见图3)。
至少13.5的pH尤其有利于成功煮浓。
实验实施例4：作为热处理的时间函数的相分离速率
在每种情况下将300ml本发明制备的pH 13.0的发酵液在每种情况下在100ml正丁醇(水饱和)中以350rpm搅拌后，经过3次60℃的热处理，在具有叶轮搅拌器的0.75L双壁夹套反应器中萃取。其结果总结于表5。
表5：热处理不同时间后的沉降时间
  热处理时间[h]   萃取1/2/3中在反应器中的沉降时间
  无   4/3(Mulm)/3(Mulm)
  0.5   3/4/5
  1   2/3/3
  2   2/3/3
  4   2/2/3
实验实施例5：分配系数的DH依赖性
每种情况下将DAP加入本发明制备的2kg发酵液中，从而使DAP的含量提高到10％，并通过加入NaOH将pH调整到11.0、12.0或13.5。分配系数通过在每种情况下用150g水饱和正丁醇在60℃下萃取5次测定。分析测定的水相和有机相的DAP含量以及分配系数列于表6。
表6：各种pH值下DAP在水和正丁醇间的分配
  pH   13.5
  萃取   1   2   3   4   5
  水相   [％]   10.19％   7.42％   4.85％   3.05％   1.86％
  有机相   [％]   11.12％   19.08％   17.85％   14.35％   10.92％
  K   1.09   2.57   3.68   4.71   5.87
  pH   12.0
  萃取   1   2   3   4   5
  水相   [％]   7.93％   5.44％   3.76％   2.67％   1.94％
  有机相   [％]   7.40％   14.40％   12.90％   10.20％   7.40％
  K   0.93   2.65   3.43   3.81   3.81
  pH   11.0
  萃取   1   2   3   4   5
  水相   [％]   8.69％   8.12％   7.81％   7.49％   7.29％
  有机相   [％]   7.20％   7％   6.50％   5.10％   4.30％
  K   0.83   0.86   0.83   0.68   0.59
实验实施例6：AcDAP裂解动力学的pH依赖性
在0.75L双壁夹套反应器中，每种情况下通过加入浓度为50％的NaOH将本发明制备的具有高AcDAP含量的500g发酵液调整到所需pH并加热至回流温度。在0.5、1、2和4h之后采集样本并用定量HPLC测定。结果总结于表7。
表7：AcDAP裂解速率的pH依赖性
Figure BPA00001230999900191
实验实施例7：盐沉淀
在25-30℃下将7.2g己二酸在70g水饱和正丁醇中的溶液滴加到本发明制备的DAP含量约为4.1重量％的130g萃取相中。将反应混合物冷却到3℃，滤出固体并在氮气流中过夜干燥。由此产生12.7g白色固体，借助13CNMR表征该白色固体是己二酸和DAP的1：1混合物。
参考这里引用的整个现有技术的公开内容。

Claims (22)

1.一种从含1，5-二氨基戊烷(DAP)的发酵液中分离DAP的方法，其中a)碱化发酵液，b)热处理发酵液，c)使用有机萃取剂萃取DAP，和d)从取出的有机相中分离DAP。
2.根据权利要求1的方法，其中将发酵液调整到pH＞11。
3.根据权利要求2的方法，其中通过加入碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物调整pH。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中碱化的发酵液通过加热到回流温度热处理。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中热处理在引起任选存在的乙酰基-DAP水解裂解的条件下进行。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中用偶极质子性有机溶剂萃取DAP。
7.根据权利要求6的方法，其中萃取剂是链烷醇或环烷醇。
8.根据权利要求6或7的方法，其中萃取和/或随后的相分离在升高的温度下进行。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中在碱化之前从发酵液中去除细胞组分。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中萃取步骤中含DAP的相通过蒸馏提纯或由所述相沉淀DAP。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中发酵液来源于微生物在含复合培养基组分的培养基中的发酵。
12.一种发酵生产DAP的方法，其中产生赖氨酸的微生物在产生赖氨酸以及如果合适产生DAP的条件下培养且形成的DAP通过使用权利要求1-11任一项的方法分离。
13.根据权利要求12的方法，其中发酵在含复合培养基组分的培养基中进行。
14.根据权利要求12或13的方法，其中产生赖氨酸的微生物包含赖氨酸脱羧酶活性。
15.根据权利要求14的方法，其中产生赖氨酸的微生物包含异源赖氨酸脱羧酶。
16.根据权利要求14或15的方法，其中产生赖氨酸的微生物包含异源赖氨酸脱羧酶基因。
17.根据权利要求12或13的方法，其中含赖氨酸的发酵液与任选固定化的赖氨酸脱羧酶接触，从而使赖氨酸脱羧给出DAP。
18.一种制备含DAP的聚合物的方法，其中DAP单体首先发酵产生并通过根据权利要求1-17任一项的方法分离，然后与至少一种其他共聚单体一起聚合。
19.根据权利要求18的方法，其中共聚单体选自多异氰酸酯以及多元羧酸及其盐、酯和酸酐。
20.根据权利要求18或19的方法，其中将至少一种共聚单体加入分离的DAP中，或使用来自DAP沉淀的DAP和至少一种共聚单体的混合物。
21.根据权利要求20的方法，其中DAP/共聚单体混合物由根据权利要求10的盐沉淀产生。
22.根据权利要求21的方法，其中共聚单体是多元羧酸。
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