KR20100117084A

KR20100117084A - 발효에 의한 1,5-디아미노펜탄의 제조 방법

Info

Publication number: KR20100117084A
Application number: KR1020107018517A
Authority: KR
Inventors: 마틴 ?O케르트; 오스카르 첼더; 부르크하르트 에른스트; 월규 정
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2010-11-02
Also published as: JP5646345B2; WO2009092793A2; US20100292429A1; JP2011509679A; EP2235194A2; CN101981202B; CN101981202A; EP2235194B1; WO2009092793A3; PL2235194T3; ATE517190T1; KR101579994B1; US8906653B2

Abstract

본 발명은 1,5-디아미노펜탄 (DAP)-포함 발효 배양액으로부터 DAP를 단리하는 방법, 이러한 단리 방법을 사용하는, 발효에 의한 DAP의 제조 방법, 및 상기 방법에 따라 단리되거나 발효에 의해 제조된 DAP를 사용하여 DAP-포함 중합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 1,5-디아미노펜탄의 제조 방법 {METHOD FOR FERMENTATIVELY PRODUCING 1,5-DIAMINOPENTANE}

본 발명은 1,5-디아미노펜탄 (DAP)-포함 발효 배양액으로부터 DAP를 단리하는 방법, 이러한 단리 방법을 사용하는, 발효에 의한 DAP의 제조 방법 및 이러한 방식으로 단리되고 발효에 의해 제조된 DAP를 사용하여 DAP-포함 중합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

1,5-디아미노펜탄 (펜타메틸렌디아민 또는 카다베린으로 또한 빈번하게 지칭됨, 이하 DAP로 지칭함)은 화학산업에서 중요한 원료이다. 예를 들어, DAP는 폴리아미드, 폴리우레아 또는 폴리우레탄 및 이들의 공중합체의 제조에 사용된다.

게다가, 리신 탈카르복실화를 통해 발효 또는 효소에 의한 DAP의 제조는 이전에 공지되었다. 이와 관련하여 발효 배양액으로부터 목적 생성물을 단리하는 다양한 방법들이 기재되었다.

예를 들어, EP-A-1 482 055에는 반응 동안 pH를 조정하기 위한 디카르복실산의 존재 하에서의 효소에 의한 리신의 탈카르복실화가 기재되어 있다. 이러한 방법으로 제조된 DAP 디카르복실레이트는 먼저 목적 생성물을 포함하는 용액을 탈색하고 농축한 후에 DAP 디카르복실레이트를 냉각 결정화 방법으로 결정화하여 단리한다.

WO-A-2006/123778에는 이산화탄소의 존재 하에서의 효소에 의한 리신의 탈카르복실화를 통한 DAP 카보네이트의 제조가 기재되어 있다. DAP는 반응 용액을 농축시키고 이산화탄소를 제거함으로써 형성된다.

JP 2004-208 646에는 효소에 의한 L-리신 디카르복실레이트 포함 용액의 탈카르복실화 및 알코올, 케톤 및 니트릴로부터 선택된 유기 용매의 첨가로 DAP 디카르복실레이트의 침전에 의한 DAP 디카르복실레이트의 제조가 기재되어 있다.

JP 2004-222 569에는 L-리신 데카르복실라제를 발현하는 코리네형 박테리아 (coryneform bacterium)을 사용하고, 배양 상청액을 pH 12로 조정하고, 극성 유기 용매로 DAP를 추출하는 것에 의한 DAP의 제조가 기재되어 있다.

마지막으로, JP 2004-000 114에는 L-리신 데카르복실라제를 발현하는 대장균 (E. coli ) 세포를 사용하여 고농축의 L-리신 모노히드로클로라이드를 전환하고, 반응 용액의 pH를 13 이상으로 조정하고, 극성 유기 용매로 반응 생성물을 추출하고 이어서 증류하는 것에 의한 DAP의 제조가 기재되어 있다.

그러나, 유기 용매의 도움으로 DAP를 추출하는 것을 기초로 하는 종래 기술 방법은 목적 생성물의 수율이 최적 미만이고 특히 추출 단계가 매우 느리고 전체 공정이 시간-소모적인 점에서 특히 불리하며, 이러한 방법을 산업적 규모의 제조에 적용하는 것은 매우 불리하다.

따라서 본 발명의 목적은 발효 배양액으로부터 DAP (카다베린)의 단리를 더욱 개선하는 것이다. 더 구체적으로는, 목적 생성물의 수율을 더욱 증가시키고 단리에 필요한 시간, 특히 용매-기재 추출에 필요한 시간을 더욱 개선하는 것을 의도한다.

놀랍게도, 이러한 목적은 a) 먼저 발효 배양액을 알칼리 pH로 조정하고, 이어서 열처리하고, 그 후 적합한 유기 추출액으로 추출하는 방법을 제공함으로써 달성되었다. 여기서, 발효의 DAP-포함 부산물, 특히 아세틸-DAP는 놀랍게도 가수분해로 인해 절단되면서 목적 생성물이 유리됨을 발견하였다. 또한, 추출 단계에서 상 분리 속도가 상당하게 증가할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 이러한 증가된 상 분리 속도는 특히, 예를 들어 효모 추출물과 같은 복합 영양소 배지의 존재 하의 미생물의 발효로부터 발효 배양액을 후처리하는 경우에 분명하다.

도 1은 발효 배양액으로부터 DAP를 단리하는 전체 공정의 본 발명의 한 특정 실시양태에 대한 순서도이다.
도 2는 pH 13.7에서 환류하여 발효 배양액을 5 시간 열처리하는 동안 DAP (다이아몬드)가 형성되면서 아세틸-DAP (삼각형)가 가수분해 절단되는 것을 나타낸다. 잔류 리신 함량 (사각형)은 열처리 동안 변하지 않은 채로 유지된다.
도 3은 발효 배양액의 가열 공정 및 후속 환류 동안 암모니아의 배출을 나타낸다. 하부 곡선 - 기체의 양, 상부 곡선 - 내부 온도 프로파일.

1. 바람직한 실시양태

본 발명은 a) 발효 배양액을 알칼리화하고, b) 발효 배양액을 열처리하고, c) 유기 추출액으로 1,5-디아미노펜탄 (DAP)을 추출하고, d) 제거된 유기 상으로부터 DAP를 단리하는, DAP-포함 발효 배양액으로부터 DAP를 단리하는 방법에 관한 것이다.

방법의 제 1 특정 전개에서, 발효 배양액의 pH를 11을 초과하도록, 예컨대 특히 11.5 이상 또는 12 이상으로, 예컨대 특히 12 이상 내지 14, 또는 12.5 내지 13.8, 또는 13 내지 13.8, 또는 13.5 내지 13.7로 조정한다. 이를 위해서, 특히 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물, 예컨대 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 수산화물을 첨가하여 pH를 조정한다.

물질의 분포는 pH를 조정함으로써 추가로 최적화될 수 있으며, 최적의 물질 전달 조건을 대략 12.5 초과의 pH에서 설정하는 것이 가능하다.

pH를 조정함으로써 임의로 존재하는 아세틸-DAP의 절단을 추가로 최적화하는 것 또한 가능하며, 최적의 절단 조건 (절단 키네틱)을, 존재하는 아세틸-DAP의 양에 따라, 대략 13 초과의 pH에서 설정하는 것이 가능하다.

적절한 경우, 알칼리화 이전에 발효 배양액으로부터 세포 성분을 제거할 수 있다. 세포 성분을 제거하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 분리기, 경사분리기 (decanter), 응결, 여과 방법 또는 복수의 이러한 공정 단계의 조합).

방법의 또 다른 전개에서, 예를 들어 회분식 또는 연속식으로, 환류 온도로, 예를 들어 대기압에서 90-110℃의 온도, 또는 과압에서 더 높은 온도로 가열함으로써 알칼리화된 발효 배양액을 열처리한다. 임의로 존재하는 아세틸-DAP가, 바람직하게는 본질적으로 정량적인 방식으로, 가수분해 절단되는 조건 하에서 열처리를 수행한다. 이를 위해, 당업자는 필요한 중요한 공정 매개변수, 예컨대 압력, 온도 및 체류 시간을 조정할 수 있다. 용어 "아세틸-DAP"는 모노아세틸-DAP 및 디아세틸-DAP를 포함하지만, 모노-아세틸 형태가 통상적으로 우세하다. 또 다른 실시양태에서, 상기 가열은 여러 단계로 수행할 수 있으며, 예를 들어 또한 배출된 암모니아를 중간에 팽창에 의해 회수할 수 있다.

본 발명의 방법의 또 다른 전개에서, 물과 혼합도 격차 (miscibility gap)를 가지며 가급적 극성이고 알칼리 pH에서 안정한 유기 용매, 예컨대 특히 극성, 보다 특히 쌍극성 양성자성 유기 용매로 DAP를 추출한다. 적합한 용매는 본원 하기에 기재될 것이다.

한 바람직한 실시양태에서, DAP 추출 및/또는 후속 상 분리를 승온에서 회분식으로 수행한다. 또한 추출 및 DAP-포함 추출액 후처리의 전개는 본원 하기에 기재될 것이다.

본 발명의 방법은 복합 배양 배지, 예를 들어 효모 추출물을 포함하는 복합 배양 배지 중 미생물의 발효로부터 발효 배양액을 후처리하는데 적합하다.

본 발명은 또한 리신-생성 미생물을 리신-생성 및, 적절한 경우, DAP-생성 조건 하에서 배양하고, 상기 규정된 DAP 단리 방법을 적용함으로써 형성된 DAP를 단리하는, 발효에 의한 DAP의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 발효는 특히 복합 배지 성분을 포함하는 배양 배지 중에서 수행할 수 있다. 이는 예를 들어, 이종 리신 데카르복실라제 (LDC), 즉 상이한 유기체로부터 유도된 리신 데카르복실라제와 같은 리신 데카르복실라제 활성을 추가적으로 발현하는 리신-생성 미생물을 사용하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라, "복합 영양소 또는 배양 배지" 또는 "복합 배지"는 물질 혼합물의 복합 조성물, 예컨대 옥수수 침지액 (corn steep liquor), 트립톤, 박톤, 콩 가수분해물 및 특히 효모 추출물을 포함하는 그 자체로 공지된 배지이다.

반면, 리신을 탈카르복실화하여 DAP를 제공하기 위해, 리신-포함 발효 배양액을 정제된, 임의로는 고정된, 리신 데카르복실라제와 접촉시키거나, 또한 임의로 고정된 추가 LDC-발현 미생물을 배양액으로 첨가하거나 임의로 고정된 추가 LDC-발현 미생물을 배양액과 접촉시키는 것 또한 가능하다. 이와 관련하여 적합한 방법은 명백하게 본원에 참고로 인용되는 종래 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, JP 2002-223771 참조).

여기서, 원칙적으로 상기 기재된 전체 단리 방법, 또는 상기 기재된 발효에 의한 제조 방법, 또는 그들의 각각의 단계를 배치 또는 세미배치 또는 패드 배치 (fed batch) 또는 반복 (패드) 배치 방법과 같이 회분식으로, 또는 연속식으로 수행하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한, DAP 단량체가 먼저 상기 규정된 방법에 의해 발효에 의해 제조되고 단리되고 그 후에 1종 이상의 추가의 공단량체와 함께 중합되는 DAP-포함 중합체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 공단량체는 특히 폴리카르복실산, 예컨대 특히 4 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 디카르복실산, 이들의 에스테르 및 무수물, 및 또한 폴리이소시아네이트, 예컨대 특히 C₂-C₁₀-알킬렌 연결기 또는 시클릭 연결기를 갖는 디이소시아네이트로부터 선택될 수 있다. 적합한 디카르복실산의 비제한적인 예는 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베릭산, 아젤라산, 세바크산 등이 있다. 적합한 디이소시아네이트의 비제한적인 예는 메틸렌 디페닐 디이소시아네이트 (MDI), 톨루엔 디이소시아네이트 (TDI), 헥사메틸렌 디이소시아네이트 (HDI) 및 이소포론 디이소시아네이트가 있다. 이들로부터 특히 예를 들어 폴리아미드, 폴리우레아 또는 폴리우레탄 유형, 예컨대 폴리아미드 5,10 또는 폴리아미드 5,6의 중합체가 형성된다.

중합 방법은 단리된 DAP에 1종 이상의 공단량체를 첨가하거나 또는 DAP 침전으로부터의 1종 이상의 공단량체와 DAP의 혼합물을 사용하는 것을 포함한다. 적합한 DAP/공단량체 혼합물은, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 증류로 후처리된 DAP 추출물로부터의 DAP의 염 침전으로부터 제조될 수 있다. 상기 공단량체는 바람직하게는 폴리카르복실산, 예를 들어 세바크산이다.

2. 발효에 의한 리신 또는 DAP의 제조에 대한 일반적인 정보

2.1 미생물

본 발명은 원칙적으로 임의의 DAP-포함 발효 배양액의 후처리에 적용될 수 있다. 또한 원칙적으로 발효에서 사용되는 미생물에 관해서 어떠한 제한도 없다. 미생물은 천연적으로 발생하는 미생물, 돌연변이 및 선별을 통해 개선된 미생물, 그러나 특히 재조합하여 생성된 미생물, 예컨대 진균, 그러나 특히 박테리아일 수 있다. 이러한 미생물은 DAP 및/또는 DAP 유도체, 예컨대 아세틸-DAP를 직접적으로 생성할 수 있거나 또는 적어도 발효로 리신, 특히 L-리신을 생성할 수 있다. 보다 특히, 사용되는 재조합 박테리아는 디아미노피멜레이트 경로 ("DAP 경로"), 숙시닐라제 경로 또는 데히드로게나제 경로를 통해 리신을 생합성할 수 있다.

이러한 미생물은 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스 또는 글리세롤, 지방산 또는 식물성 오일 또는 에탄올로부터 리신, 특히 L-리신을 생성할 수 있고, 바람직하게는 생성된 리신의 적어도 일부분을 세포외 공간으로 배출할 수 있다. 상기 미생물은 바람직하게는 특히 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속의 또는 브레비박테리움 (Brevibacterium ) 속의 코리네형 박테리아이다. 코리네박테리움 속 중에서, L-아미노산을 생산하는 능력이 당업계에 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ) 종을 특히 언급할 수 있다.

언급할 수 있는 코리네형 박테리아의 적합한 균주의 예는 코리네박테리움 속의 것들, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (씨. 글루타미쿰) 종의 것들, 예를 들어

코리네박테리움 글루타미쿰 ( Corynebacterium glutamicum ) ATCC 13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ( Corynebacterium acetoglutamicum ) ATCC 15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸 ( Corynebacterium acetoacidophilum ) ATCC 13870,

코리네박테리움 서모아미노제네스 ( Corynebacterium thermoaminogenes ) FERM BP-1539,

코리네박테리움 멜라세콜라 ( Corynebacterium melassecola ) ATCC 17965, 또는

브레비박테리움 속의 것들, 예컨대

브레비박테리움 플라붐 ( Brevibacterium flavum ) ATCC 14067,

브레비박테리움 락토퍼멘툼 ( Brevibacterium lactofermentum ) ATCC 13869 및

브레비박테리움 디바리카툼 ( Brevibacterium divaricatum ) ATCC 14020,

또는 그로부터 유도된 균주, 예컨대

코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10065

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21608이다.

약어 KFCC는 한국 종균 협회 (Korean Federation of Culture Collection)를 의미하고, 약어 ATCC는 아메리칸 타입 스트레인 컬쳐 콜렉션 (American Type Strain Culture Collection)을 의미하고, 약어 FERM BP는 일본 생명공학 공업 기술 국립 연구소 콜렉션 (collection of the National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan)을 나타낸다.

2.2 발효 과정

본 발명에 따라 후처리되는 발효 배양액은 예를 들어, 리신 생합성을 촉진하고 하나 이상의 리신 생합성 유전자에 영향을 미치는 탈조절 중재를 통해, 리신, 특히 L-리신 또는 리신-포함 혼합물의 생성을 증가시키고/거나 추가적으로 리신 데카르복실라제 활성을 갖는 효소를 과발현하고 DAP 및/또는 아세틸-DAP를 축적하는, 재조합 코리네형 박테리아의 배양으로부터 유도된다. 따라서 후자는 DAP를 직접 생성할 수 있다.

리신 생합성과 관련되고 리신 생합성을 촉진하는 탈조절 중재와 관련된 유전자들을 하기 표 1에 요약하였다.

예를 들어 리신 생합성과 관련된, 탈조절된 리신 데카르복실라제 유전자 및 하나 이상의 추가의 탈조절된 유전자를 가지는 재조합 미생물을 사용하는 DAP의 제조 방법이 WO 2007/113127에 개시되어 있으며, 이는 본원에 명백하게 참고로 인용된다.

명백하듯이 "탈조절"은, 가장 폭넓은 의미로 이해되어야 하고, 예를 들어 미생물에서 효소 분자의 카피 수의 증가 또는 감소를 통해 또는 리신 생합성을 감소시키는 또 다른 특성의 변형을 통해 다수의 상이한 방식으로, 효소 활성을 증가 또는 감소 또는 제거하는 것을 포함한다.

효소 리신 데카르복실라제 (E.C. 4.1.1.18.)는 L-리신의 DAP로의 탈카르복실화를 촉진시킨다. 상기 효소의 한 예는 cadA 유전자 생성물 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry b4131) 또는 ldcC 유전자 생성물 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry JW0181)이다. 카다베린의 제조를 위한 재조합 미생물의 생성에 상기 유전자 생성물을 사용하는 것은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, EP-A-1 482 055 참조).

당업자는 개별적으로 또는 조합으로 상이한 수단을 수행함으로써 과발현/탈조정을 달성할 수 있다. 따라서, 상응하는 유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있거나, 구조 유전자의 상류에 위치한 리보솜 결합 부위 또는 프로모터 영역 및 조절 영역을 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 도입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 또한, 유도성 프로모터는 발효에 의한 L-리신의 제조 동안 발현이 증가될 수 있게 한다. 발현은 또한 mRNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 개선된다. 또한, 효소 활성은 또한 효소 단백질의 변성을 방지함으로써 증가된다. 유전자 또는 유전자 작제물은 상이한 카피 수를 갖는 하나 이상의 플라스미드에 존재하거나 또는 염색체에 통합되고 증폭될 수 있다. 별법으로서, 더욱이 배지 조성 및 배양 절차를 변경함으로써 관련 유전자가 과발현될 수 있다.

당업자는 이에 대한 지침을 특히 문헌 [Martin et al., Biotechnology 5, 137-146 (1987)], [Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994)], [Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988)], [Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)], 유럽 특허 제0472869호, 미국 특허 제4,601,893호, [Schwarzer and Puehler, Biotechnology 9, 84-87 (1991)], [Remscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)], [LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)], WO 96/15246호, [Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993)], 일본 공개 공보 JP-A-10-229891호, [Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)], [Makrides, Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재에서 발견할 수 있다.

적합한 생산자 균주는 조절 핵산 서열의 유전적 조절 하에서 목적하는 효소 활성을 위한 핵산 서열 코딩을 포함하는 발현 작제물 또는 벡터를 사용함으로써 제조된다. 바람직하게는, 이러한 작제물은 각각의 경우에 코딩 서열과 작동적 결합된 특정 코딩 서열의 프로모터 5'-상류, 및 3'-하류의 종결 서열 및 경우에 따라 추가의 통상의 조절 요소를 포함한다. "작동적 결합"은 코딩 서열의 발현시 각각의 조절 요소가 그의 기능을 적당하게 수행할 수 있는 방식으로 프로모터, 코딩 서열, 종결자 및 경우에 따라 추가의 통상적 조절 요소의 서열적 배열을 의미한다. 작동적 결합 가능한 서열의 예는 활성화 서열 및 또한 인핸서 등이다. 추가의 조절 요소는 선택적 마커, 증폭 시그날, 복제 기점 등을 포함한다. 적합한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.

인공 조절 서열 이외에, 천연 조절 서열은 실제 구조 유전자의 상류에 여전히 존재할 수 있다. 경우에 따라, 유전적 변형은 상기 천연 조절을 스위치 오프 (switch-off)시킬 수 있으며, 유전자 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 그러나, 유전자 작제물은 또한 보다 단순한 구조일 수 있다. 즉, 추가의 조절 시그날이 구조 유전자 상류에 삽입되지 않고, 그의 조절을 갖는 천연 프로모터가 제거되지 않는다. 대신, 천연 조절 서열은 조절이 더이상 일어나지 않는 방식으로 돌연변이되고, 유전자 발현은 증가되거나 감소된다. 유전자 작제물은 핵산 서열의 하나 이상의 카피를 함유할 수 있다.

유용한 프로모터의 예는, 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 ddh, amy, lysC, dapA, lysA 뿐만 아니라, 문헌 [Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives, Sonenshein, Abraham L., Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington and Patek M. Eikmanns BJ. Patek J. Sahm H. Microbiology. 142 1297-309, 1996]에 기재된 것과 같은 그램-양성 프로모터 SPO2, 또는 그램-음성 박테리아에 유리하게 사용되는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR 및 λ-PL 프로모터이다. 예를 들어 광-유도성 프로모터, 특히 P_rP_l 프로모터와 같은 온도-유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 원칙적으로, 모든 천연 프로모터는 그의 조절 서열과 함께 사용될 수 있다. 또한, 다중 프로모터와 같은 합성 프로모터도 또한 유리하게 사용될 수 있다 (예를 들어, WO 2006/069711 참조).

언급된 조절 서열은 핵산 서열의 특정된 발현을 가능하게 하고자 하는 것이다. 숙주 유기체에 따라, 이는 예를 들어 유전자가 유도 후에만 발현되거나 과발현되는 것, 또는 즉시 발현되고/거나 과발현되는 것을 의미할 수 있다.

더욱이, 조절 서열 또는 인자는 바람직하게는 발현에 유익한 효과를 가지므로 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 따라서, 조절 요소의 증강은 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 강한 전사 시그날을 이용함으로써 전사적 수준에서 유리하게 일어날 수 있다. 그러나, 또한 예를 들어 mRNA 안정성을 증가시킴으로써 전사를 증강시킬 수 있다.

발현 카세트는 리신 생합성 뉴클레오티드 서열 및 적합한 종결 시그날에 적합한 프로모터인 적합한 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열을 융합시킴으로써 제작된다. 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York, New York], [PCR Methods, Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sninsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego], [PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser., Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey], [Totowa. T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], [T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재된 것과 같은 통상의 재조합 및 클로닝 기술이 상기 목적을 위해 사용된다.

적합한 숙주 유기체에서의 발현을 위해, 재조합 핵산 작제물 또는 유전자 작제물은 유리하게는 숙주에서 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 숙주-특이적 벡터 내로 삽입된다. 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 ["Cloning Vectors", Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985]에서 발견될 수 있다. 벡터는 플라스미드 뿐만 아니라 또한 예를 들어 파지, 트랜스포존, IS 요소, 파지미드, 코스미드, 및 선형 또는 원형 DNA와 같은 당업자에게 공지된 모든 기타 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 복제되거나, 염색체적으로 복제될 수 있다.

적합한 플라스미드는 코리네형 박테리아에서 복제되는 것이다. 예를 들어 pZ1 (문헌 [Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]), pEKEx1 (문헌 [Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)]) 또는 pHS2-1 (문헌 [Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)])과 같은 다수의 공지된 플라스미드 벡터는 잠재 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기재로 한다. 예를 들어 pCLiK5MCS, 또는 pCG4 (US-A 4,489,160호) 또는 pNG2 (문헌 [Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)]) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891호)을 기재로 한 것들과 같은 다른 플라스미드가 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

또한, 적합한 플라스미드 벡터는 예를 들어 hom-thrB 오페론의 중복 및 증폭에 대한 문헌 [Remscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기재된 것과 같이 염색체 내로의 통합에 의한 유전자 증폭의 방법을 적용할 수 있게 보조하는 것들이다. 상기 방법에서, 완전 유전자는 숙주 (전형적으로 대장균)에서 복제될 수 있으나 씨. 글루타미쿰에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 적합한 벡터는 예를 들어 pSUP301 (문헌 [Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)]), pK18mob 또는 pK19mob (문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]), [Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)]), pEM1 (문헌 [Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516]) 또는 pBGS8 (문헌 [Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342])이다. 이어서, 증폭될 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터는 형질전환에 의해 목적하는 씨. 글루타미쿰 균주 내로 전달된다. 형질전환 방법은 예를 들어 문헌 [Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)], [Dunican and Shivnan, Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)] 및 [Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기재되어 있다.

효소의 활성은 효소 반응 속도를 부분적으로 또는 완전히 감소시키는 방식으로 상응하는 유전자에서 돌연변이에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 돌연변이의 예는 당업자에게 공지되어 있다 (문헌 [Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001], [Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94]). 예를 들어, 본 발명의 리신 생합성과 경쟁하는 반응을 제거하거나 느리게 하기 위해 상기 수단이 사용될 수 있다 (문헌 [Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982]).

또한, L-리신의 제조를 위해, 리신 생합성 유전자의 발현 및 증진 이외에, 상류의 생합성 경로, 예를 들어, 펜토스 포스페이트 대사, 시트레이트 산 회로 또는 아미노산 수송의 하나 이상의 효소를 증폭시키는 것이 유리할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 미생물은 L-리신의 제조를 위해 배치 또는 패드 방법 또는 반복 패드 배치 방법에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 배양시킬 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 개요는 문헌 [Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 문헌 [Storhas, Bioreaktoren and periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에서 발견할 수 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방식으로 각각의 균주의 요구를 충족해야 한다. 다양한 미생물을 위한 배양 배지의 기재는 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 발견할 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 상기 배지는 통상적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다.

바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 매우 양호한 탄소 공급원의 예는 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스이다. 당은 또한 당밀과 같은 복합 화합물, 또는 당 정제의 다른 부산물을 통해 배지에 첨가될 수 있다. 다양한 탄소 공급원의 혼합물을 첨가하는 것이 또한 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 예를 들어 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방과 같은 오일 및 지방, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올, 및 예를 들어 아세트산 또는 락트산과 같은 유기산이다.

질소 공급원은 통상적으로 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 카르바민산암모늄 및 질산암모늄과 같은 암모늄 염, 및 질산염, 우레아, 아미노산, 및 옥수수 침지액, 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등과 같은 복합 질소 공급원이 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물의 예로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염, 탄산염 또는 황산염 및 또한 붕산이 있다.

예를 들어 술페이트, 술파이트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술파이드와 같은 무기 황-포함 화합물, 또는 메르캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물을 황 공급원으로서 사용할 수 있다.

인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 염을 인 공급원으로서 사용할 수 있다.

킬레이트화제를 용액 중 금속 이온을 유지하기 위해 배지에 첨가할 수 있다. 특히 적합한 킬레이트화제는 카테콜 또는 프로토카테큐에이트와 같은 디히드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 포함한다.

통상적으로, 본 발명에 따라 사용되는 배양 배지는 또한 비타민 또는 성장 촉진제와 같은 다른 성장 인자를 포함하며, 이들의 예로는 예를 들어 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 들 수 있다. 성장 인자 및 염은 대개 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 유도된다. 더욱이, 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 배지 화합물의 정확한 조성은 특정 실험에 크게 의존하며, 각각의 특정 경우에 대해 개별적으로 선택된다. 배지의 최적화에 대한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (editors. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 얻을 수 있다. 성장 배지는 또한 상업적 공급처로부터 구입할 수 있다 (예를 들어 스탠다드 (Standard) 1 (머크 (Merck)) 또는 BHI (뇌 심장 융합 배지, 디프코 (DIFCO)) 등).

모든 배지 성분은 가열 (예를 들어, 1 bar의 과압 (전체로는 2 bar) 및 121℃에서 20 분 동안) 또는 멸균 여과에 의해 멸균된다. 성분들은 함께 또는, 필요한 경우, 별도로 멸균할 수 있다. 모든 배지 성분은 배양의 개시시에 존재할 수 있거나 또는 임의로는 연속식으로 또는 회분식으로 첨가될 수 있다.

배양 온도는 통상적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이며, 실험 동안 일정하게 유지되거나 변화될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 대략 7.0이어야 한다. 발효를 위한 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 중탄산나트륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산, 염산 또는 황산과 같은 산성 화합물의 첨가에 의해 배양 동안 제어될 수 있다. 발포는 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르, 폴리알킬렌 글리콜, 실리콘 등과 같은 발포방지제를 사용함으로써 제어될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Biotechnol. Progr. 2007, 23, 767-784] 참조). 예를 들어 항생제와 같은 선택적 효과를 갖는 적합한 물질을 배지에 첨가함으로써 플라스미드 안정성을 유지할 수 있다. 호기 조건은 산소 또는 산소-포함 기체 혼합물, 예를 들어 주변 공기를 배양물 내로 도입함으로써 유지된다. 배양물의 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 목적하는 생성물이 최대로 형성될 때가지 계속된다. 상기 목표는 통상적으로 10시간 내지 160시간 내에 달성된다.

상기 방식으로 수득한, 특히 L-리신 또는 DAP를 포함하는 발효 배양액은 통상적으로 건조물 함량이 3 내지 20 중량%이다.

적어도 마지막에, 그러나 특히 발효 기간의 30％ 이상을 넘어서 당 제한 조건 하에 발효를 수행하는 것이 추가로 유리하다. 이는 상기 시간 동안 발효 배지에서 이용가능한 당의 농도가 0 이상 내지 3 g/l로 유지되거나 이 범위로 감소되는 것을 의미한다.

그 후, 발효 배양액을 더 가공처리한다. 요건에 따라, 바이오매스의 전부 또는 일부를 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리, 응결과 같은 분리 방법 또는 상기 방법의 조합에 의해 발효 배양액으로부터 제거하거나, 또는 상기 배양액에 완전히 남겨둘 수 있다. 바이오매스를 제거하는 것이 바람직하다.

2.3 DAP-포함 발효 배양액의 후처리

이어서, 공지된 방법으로, 예를 들어 회전 증발기, 박막 증발기, 강하막 증발기를 이용하여, 역삼투압에 의해 또는 나노여과에 의해 발효 배양액을 증점하거나 농축할 수 있다. 필요할 경우, 농축 과정에 의해 침전될 수 있는 염을, 예를 들어 여과 또는 원심 분리로, 제거할 수 있다. 그 후, 상기 농축된 발효 배양액을 본 발명의 방식으로 후처리하여 DAP를 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 후처리에서, 이러한 농축 과정을 수행할 수 있지만, 절대적으로 필요한 것은 아니다.

본 발명에 따라, 유기 추출액의 도움으로 발효 배양액으로부터 DAP를 추출한다. 더 구체적으로는, 물과 혼합도 격차를 갖고 가급적 극성이고 알칼리 pH에서 안정한 유기 용매, 예를 들어 특히 극성, 쌍극성 양성자성, 유기 용매를 사용한다. 적합한 용매는 특히 3 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 시클릭 또는 개환, 임의로는 분지된 알칸올, 특히 n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올 또는 시클로헥산올, 및 또한 n-펜탄올, n-헥산올, n-헵탄올, n-옥탄올, 2-옥탄올 및 이들의 단일분지 또는 다분지 이성질체 형태이다. 여기서 n-부탄올을 특히 언급할 수 있다.

한 바람직한 실시양태에서, 추출 및/또한 후속 상 분리는 물의 비등점 및 추출액의 비등점 또는 가능하게는 형성된 공비물의 비등점에 의해 제한되는 승온에서 회분식으로 수행된다. 추출액 n-부탄올을 사용할 때, 추출 및 상 분리는, 예를 들어, 약 25 내지 90℃ 또는, 바람직하게는 40 내지 70℃에서 수행될 수 있다. 추출을 위해, 분배 평형에 도달될 때까지, 예를 들어 10 초 내지 2 시간 동안, 바람직하게는 5 내지 15 분 동안 두 상을 교반한다. 그 후 상들이 완전히 분리될 때까지 상들을 방치하여 침강시킨다. n-부탄올의 경우에, 특히 또한 약 25 내지 90℃ 또는, 40 내지 70℃의 온도 범위에서, 바람직하게는 10 초 내지 5 시간, 예를 들어 15 분 내지 120 분, 또는 30 분 내지 90 분이 걸린다.

추가의 바람직한 실시양태에서, DAP는 발효 배양액으로부터 (예를 들어 혼합기-침강기 조합에서) 다단계 공정으로 연속해서 추출되거나 또는 추출 컬럼에서 연속해서 추출된다.

당업자는 각각의 경우에 최적화 경로의 일부로서 상들을 분리하기 위해, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 추출 컬럼의 구성을 설립할 수 있다. 적합한 추출 컬럼은 원칙적으로 전원 투입이 없거나 있는 것, 예를 들어 펄스 컬럼 또는 회전 내부물이 있는 컬럼이다. 당업자는 또한, 일상적인 작업의 일부로서, 상 분리를 최적화하기 위해 체 트레이 및 컬럼 트레이와 같은 내부물의 유형 및 재료를 적합한 방식으로 선택할 수 있다. 소분자의 액체-액체 추출의 기본적 이론은 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [H.-J. Rehm and G. Reed, Eds., (1993), Biotechology, Vol. 3 Bioprocessing, Chapter 21, VCH, Weinheim] 참조). 산업적으로 적용가능한 추출 컬럼의 구성은, 예를 들어, 문헌 [Lo et al., Eds., (1983) Handbook of Solvent Extraction, John Wiley & Sons, New York]에 기재되어 있다. 상기한 문헌은 본원에 명백히 참고로서 인용된다.

상 분리 이후, DAP는 그 자체로 공지된 방식으로 DAP-포함 추출 상으로부터 단리되고 정제된다. DAP를 회수하는 가능한 수단은 특히 증류, 적합한 유기산 또는 무기산과의 염으로서의 침전, 또는 이러한 적합한 수단의 조합이며, 이에 제한되지는 않는다.

증류는 연속식으로 또는 회분식으로 수행될 수 있다. 단일 증류 컬럼 또는 서로 연결된 복수의 증류 컬럼을 사용할 수 있다. 증류 컬럼 장치의 구성 및 작업 매개변수의 설정은 당업자의 책임이다. 사용되는 증류 컬럼은 각각의 경우에 그 자체로 공지된 방식으로 설계될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sattler, Thermische Trennverfahren [Thermal seperation methods], 2nd Edition 1995, Weinheim, p. 135ff] 및 [Perry's Chemical Engineers Handbook, 7th Edition 1997, New York, Section 13] 참조). 따라서, 사용된 증류 컬럼은 분리 트레이, 예를 들어 천공 트레이, 버블캡 트레이 또는 밸브 트레이, 배열된 충전재, 예를 들어 시트 금속 또는 직물 충전재 또는 충전재의 랜덤층과 같은 분리에 효과적인 내부물을 포함할 수 있다. 사용되는 컬럼(들)에서 요구되는 단의 수와 환류 비율은 본질적으로 분리되는 액체의 상대적 비등 위치 및 순도 요건에 의해 좌우되며, 당업자는 공지된 방법으로 특정 디자인 및 작업 데이타를 확인할 수 있다.

적합한 유기산 또는 무기산, 예를 들어 황산, 염산, 인산, 아세트산, 포름산, 탄산, 옥살산 등의 첨가로 염으로서 침전될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 유기 디카르복실산을 사용하여 염을 형성하고, 이 염을 바로 또는 예를 들어, 재결정화에 의한 정제 후에, 후속 중축합에서 사용하여 폴리아미드를 수득할 수 있다. 보다 특히, 이러한 디카르복실산은 C₄-C₁₂-디카르복실산이다.

추출 과정에서 제조된 유기 DAP 상은 또한 크로마토그래피로 후처리될 수 있다. 크로마토그래피를 위해, DAP 상을 적합한 수지, 예를 들어 강산성 또는 약산성 이온 교환제 (예컨대, 레와티트 (Lewatit) 1468 S, 도웩스 마라톤 (Dowex Marathon) C, 암버리스트 (Amberlyst) 119 웨트 (Wet) 등)에 적용하며, 목적하는 생성물 또는 오염물은 크로마토그래피 수지 상에 완전히 또는 부분적으로 보유된다. 상기 크로마토그래피 단계는 필요할 경우 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 이용하여 반복할 수 있다. 당업자는 적합한 크로마토그래피 수지의 선택 및 그의 가장 효과적인 적용에 친숙하다. 정제된 생성물을 여과 또는 한외여과에 의해 농축하고 적절한 온도에서 저장할 수 있다.

단리된 화합물(들)의 확인 및 순도는 종래 기술에 의해 측정될 수 있다. 이러한 기술로는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피 (GC), 분광학적 방법, 염색 방법, 박막 크로마토그래피, NIRS, 효소 분석 또는 미생물학적 분석을 들 수 있다. 상기 분석 방법은 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140]; [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32]; [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70]; [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587]; [Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons]; [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 17]에 개요되어 있다.

하기 비제한적 실시예 및 첨부한 도면으로 본 발명을 보다 상세히 기재한다

실험 부분

발효 실시예 1:

세포 분취를 그 자체로 공지된 DAP-생성 균주의 원배양물로부터 취하고 (WO 2007/113127, 실시예 2, 14 면 참조, 이 문헌은 본원에 명백히 참조됨) (-80℃에서 저장), 페트리 접시 (배양 1) 중 고체 배지 (특정 배지 조성물, 표 2 참조) 위에 스트리킹하고, 그 후 30℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 이러한 방식으로 얻은 세포를 0.9% 농도 NaCl 용액에 넣고, 다시 페트리 접시 (배양 2) 중 고체 배지 위에 스트리킹하고, 그 후 30℃에서 추가의 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 접종 루프를 사용하여 페트리 접시 (배양 2)로부터 세포를 취하여 2 개의 배플이 있는 2 l 진탕기 플라스크 (플레이트 및 배치 배지와 유사한 조성) 중에서 200 ml를 접종하고 궤도 진탕기에서 250 rpm 및 30℃에서 24 시간 동안 배양하였다.

진탕기 플라스크의 함유물은 75 l 발효통을 50 l의 부피로 채워 배양하기 위한 예비배양물로 작용하였다. pH는 암모니아 기체의 도움으로 pH 6.8로 조절했다. 기체 공급 속도는 대략 0.33 vvm이었다.

주 배양은 배치 상에 700 l의 부피를 채운 5 m³ 탱크에서 수행하였다. 이를 위해, 배양물을 추가의 24 시간 이후에 75 l 배양통에서 5 m³ 탱크로 옮겼다. pH는 암모니아로 pH 6.8로 조정하였다. 기체 공급 속도 및 교반기 회전을 조절하여 20% 내지 30% (공기의 포화)의 범위로 용해된 산소를 조절하였다.

대략 24 시간 후, 배치 배지의 글루코스 농도는 1 g/l 미만으로 감소하였고 공급물의 계량 투여를 다시 시작하였다. 대략 80 시간 후에 최종 발효 부피가 대략 3200 l에 도달하였다. 발효물의 최종 농도는 다음과 같았다: OD₆₁₀: 140, 1,5-디아미노펜탄: 72 g/l, 리신 x HCl: 15 g/l, 아세틸-디아미노펜탄: 10 g/l.

고체 벽 원심분리기를 사용하여 세포를 제거하고, 이를 혼탁액에서 3.3의 인수만큼 농축하였고, 투명한 액체에서 혼탁도가 대략 OD₆₁₀ 5이었다. 투명한 액체를 50% 농도 NaOH로 pH 13.5로 조정하였다.

0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 멸균된 비타민을 제외한 모든 배지 성분은 121℃에서 30 분 동안 멸균하였다.

예시적 실시양태 1: 리신-생성 미생물과 DAP-생성 미생물의 발효 배양액으로부터 DAP의 회수

a) 열처리 및 추출 과정 (단일 배치)

NaOH로 pH를 13.5로 조정한 세포-무함유 발효 배양액 750 kg (670 l)을 1 m³ 스테인리스강 탱크에 충전하였다. 반응기 함유물을 환류 온도 (대략 103℃)로 가열하고 5 시간 동안 환류하였다. 이러한 방법으로 제조된 암모니아-포함 배기 가스를 기체 세척기 (물을 세척액으로 사용함)를 통해 수집하였다. 60℃로 냉각한 후에, 140 kg의 n-부탄올을 공급하였고, 이어서 60℃에서 15 분 동안 교반하고, 혼합물을 2 시간 동안 침강시켰다. 상 분리 이후, 하부 수성 상을 1 m³ 용기로 방출시켰다. 유기 상은 또 다른 용기에 수집하였다. 각각의 경우에 35 l의 탈이온수를 첨가한 후 수성 상을 각각의 경우에 140 kg의 n-부탄올로 60℃에서 2 회 추출하였다.

전체적으로, 44.2 kg (대략 7.5%의 함량)의 DAP가 포함된 590 kg의 유기 추출 상이 수득되었다.

b) 증류 과정:

컬럼 (이론 단수 4)이 장착된 1 m³의스테인리스강 탱크에 먼저 추출 (하위 단계 a)로부터의 합한 유기 상 900 kg을 충전하였다. 또 다른 추출 용액 1400 kg을 일정한 부피로 공급하고, 물/n-BuOH을 증류 제거하였다. 그 후, 압력을 200 mbar로 감소시켰고 360 kg의 저부 생성물이 남을 때까지 혼합물을 증류하였다.

부피가 400 l이고 이론 단수가 8인 컬럼이 장착된 또 다른 스테인레스강 탱크에서 상기 저부 생성물을 40 mbar에서 추가로 증류하였다. BuOH을 앞서 증류한 후에, 평균 순도가 99.6 중량%이고 DAP가 총 155.4 kg인 혼합된 분획을 증류하였다. 제 2 성분 테트라히드로피리딘 0.4% 이하 (GC 면적)가 임의의 한 분획에서 발견되었다.

시험 실시예 1: 추출에서 물질 전달 속도의 조사

2.5 l 반응기에서 60℃에서 격렬하게 교반하여 다양한 시점에 하부 밸브를 통해 2 상 시료를 제거하고 분리 (demixing) 후 상을 즉시 분리함으로써 본 발명에 따라 제조된 유기 DAP 추출액의 분배 평형의 도달을 조사하였다. 요구되는 시료 침강 시간으로 인한 어느 정도의 부정확함에도 불구하고, 분배가 매우 빠르게, 15 초 후에 일어난다는 결론을 내릴 수 있었고, 시료는 5 분 후 발견된 DAP가 98.5%이었다. 따라서, 추가로 15 분 동안 교반하는 것이 충분하다고 간주할 수 있었다.

시험 실시예 2: 상 분리 속도의 조사

3 단계 빔 교반기 및 4 개의 배플이 있는 2.5 l 이중 벽 자켓 반응기에서 상 분리 속도를 조사하였다.

열처리를 수반하거나 수반하지 않는 혼합물에 대한 실험 결과 (각각의 경우에 4 번의 연속적인 추출)를 표 3 및 표 4에 요약하였다.

시험 실시예 3: 졸임과 아세틸-DAP의 절단

생산자 유기체가 두 아미노기에 형성된 DAP의 부분을 추가적으로 아세틸화하는 것이 관찰되었다.

아세틸-디아미노펜탄은 13 초과의 알칼리 pH로 설정한 발효 배양액을 환류함으로써 디아미노펜탄이 유리되면서 가수분해될 수 있다는 것을 보여주었다 (도 2 참조). 이것이 수율의 증가를 가능하게 하였다. 대조적으로, 산성 조건 (pH 1, H₂SO₄) 하에서의 가수분해는 매우 느렸다.

환류 동안, 환류는 심지어 대략 95℃에서 시작하는 것으로 보였고, 나중에 대략 103-105℃의 환류 온도가 저부에서 설정되었다. 암모니아의 배출은 가수분해에서 특히 가열 과정 동안 관찰되었다 (도 3 참조).

13.5 이상의 pH가 성공적인 졸임에 특히 유리하였다.

시험 실시예 4: 열처리 기간에 따른 상 분리 속도

본 발명에 따라 제조된 pH 13.0의 발효 배양액 300 ml를, 각각의 경우에 열처리 후, 350 rpm에서 교반한 후, 임펠러 교반기가 있는 0.75 l 이중 벽 자켓 반응기에서, 각 경우 n-BuOH (물 포화) 100ml로 60℃에서 3 회 추출하였다. 결과는 표 5에 요약하였다.

시험 실시예 5: 분배 계수의 pH 의존도

DAP 함량을 10%로 올리기 위해, 각각의 경우에 본 발명에 따라 제조된 발효 배양액 2 kg에 DAP를 첨가하였고, NaOH의 첨가로 pH를 11.0, 12.0 또는 13.5로 조정하였다. 각각의 경우에 60℃에서 물-포화 n-BuOH 150 g으로 5 회 추출함으로써 분배 계수를 결정하였다. 분석적으로 결정된, 수성 상 및 유기 상의 DAP 함량과 분배 계수를 표 6에 나열하였다.

시험 실시예 6: AcDAP 절단 키네틱의 pH 의존도

0.75 l 이중 벽 자켓 반응기에서, 각각의 경우에, 본 발명에 따라 제조된, AcDAP 함량이 높은 발효 배양액 500 g에 50% 농도 NaOH를 첨가하여 목적하는 pH로 조정하고 환류 온도로 가열하였다. 시료를 0.5, 1, 2 및 4 시간 후에 채취하였고 정량적 HPLC로 측정하였다. 결과를 표 7에 요약하였다.

시험 실시예 7: 염 침전

25 내지 30℃에서 본 발명에 따라 제조되고 DAP 함량이 대략 4.1 중량%인 추출 상 130 g에 물-포화 부탄올 70 g 중 아디프산 7.2 g의 용액을 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 3℃로 냉각하고, 고체를 여과해내고 질소 스트림 하에서 밤새 건조하였다. 이와 같이 제조한 흰색 고체 12.7 g은 ¹³C-NMR에 의해 아디프산과 DAP의 1:1 혼합물로 특성 분석되었다.

본원에서 인용된 모든 종래 문헌의 개시 내용은 참고로서 인용된다.

Claims

a) 발효 배양액을 알칼리화하고, b) 발효 배양액을 열처리하고, c) 유기 추출액으로 1,5-디아미노펜탄 (DAP)를 추출하고, d) 제거된 유기 상으로부터 DAP를 단리하는, DAP-포함 발효 배양액으로부터 DAP를 단리하는 방법.
제1항에 있어서, 발효 배양액의 pH를 11 초과로 조정하는 방법.
제2항에 있어서, 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물을 첨가하여 pH를 조정하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리화된 발효 배양액을 환류 온도로 가열함으로써 열처리하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 존재하는 아세틸-DAP가 가수분해로 절단되게 하는 조건 하에서 열처리를 수행하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 쌍극성 양성자성 유기 용매로 DAP를 추출하는 방법.
제6항에 있어서, 추출액이 알칸올 또는 시클로알칸올인 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 승온에서 추출 및/또는 후속 상 분리를 수행하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리화 이전에 발효 배양액으로부터 세포 성분을 제거하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 단계의 DAP-포함 상을 증류로 정제하거나 그로부터 DAP를 침전시키는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배양액이 복합 배지 성분을 포함하는 배양 배지 중 미생물의 발효로부터 유도되는 것인 방법.
리신-생성 미생물을 리신-생성 및, 적절한 경우, DAP-생성 조건 하에서 배양하고, 형성된 DAP를 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법을 적용하여 단리하는, 발효에 의한 DAP의 제조 방법.
제12항에 있어서, 복합 배지 성분을 포함하는 배양 배지에서 발효를 수행하는 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 리신-생성 미생물이 리신 데카르복실라제 활성을 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 리신-생성 미생물이 이종 리신 데카르복실라제를 포함하는 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 리신-생성 미생물이 이종 리신 데카르복실라제 유전자를 포함하는 것인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 리신을 탈카르복실화하여 DAP를 수득하기 위해서 리신-포함 발효 배양액을 임의로 고정된 리신 데카르복실라제와 접촉시키는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 DAP 단량체를 먼저 발효에 의해 제조하고 단리하고, 그 후에 1종 이상의 추가의 공단량체와 함께 중합하는, DAP-포함 중합체의 제조 방법.
제18항에 있어서, 공단량체가 폴리이소시아네이트, 폴리카르복실산, 및 이들의 염, 에스테르 및 무수물로부터 선택되는 것인 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 1종 이상의 공단량체를 단리된 DAP에 첨가하거나 또는 DAP 침전으로부터의 1종 이상의 공단량체와 DAP의 혼합물을 사용하는 방법.
제20항에 있어서, DAP/공단량체 혼합물을 제10항에 따른 염 침전으로 제조하는 방법.
제21항에 있어서, 공단량체가 폴리카르복실산인 방법.