KR100889434B1

KR100889434B1 - 메티오닌 생산 방법

Info

Publication number: KR100889434B1
Application number: KR1020067012011A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 보이; 다니엘라 클라인; 하트비크 슈뢰더
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2009-03-23
Also published as: BRPI0417720A; RU2006125496A; HUE027979T2; EP1713924A2; US20070122888A1; RU2376378C2; DE10359668A1; KR20060103337A; TW200533755A; WO2005059155A2; AR047333A1; CA2548964A1; TWI329131B; CN1894417A; ES2572165T3; ZA200605864B; PL1713924T3; CA2548964C; BRPI0417720B1; CN1894417B

Abstract

본 발명은 발효에 의해 메티오닌을 생산하는 방법, 형성된 메티오닌을 단리하는 방법, 단리 중에 생산된 메티오닌-함유 바이오매스, 사료 또는 사료 보충물을 제조하기 위한 그의 용도, 및 음식물 또는 사료 또는 음식물 보충물 또는 사료 보충물을 제조하기 위한, 단리된 메티오닌의 용도에 관한 것이다.

메티오닌, 사료, 음식물

Description

메티오닌 생산 방법 {METHOD FOR THE PRODUCTION OF METHIONINE}

본 발명은 발효에 의해 메티오닌을 생산하는 방법, 형성된 메티오닌을 단리하는 방법, 단리 중에 얻어진 메티오닌-함유 바이오매스, 사료 또는 사료 보충물을 제조하기 위한 그의 용도, 및 음식물 또는 사료 또는 음식물 보충물 또는 사료 보충물을 제조하기 위한, 단리된 메티오닌의 용도에 관한 것이다.

메티오닌은 음식물, 사료, 화장품 및 제약 산업을 포함한, 매우 다양한 분야에서 사용된다.

종래에는, D,L-메티오닌의 화학적 생산 방법만이 산업상 중요했다. 이 합성을 위한 출발 물질들은 황화수소, 메틸메르캅탄, 아크롤레인, 청산 또는 메틸메르캅토프로피온알데히드이다([Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1985), Vol A2, page 71]).

메티오닌은 또한, 천연 세포성 대사 과정에 의해 생산된다. 산업적 규모의 생산은, 많은 양의 원하는 물질을 생산하고 분비하도록 개발된 박테리아 배양물을 이용함으로써 가장 용이하게 수행될 것이다. 이러한 목적에 특히 적합한 생물체는 비병원성 코리네포름(coryneform) 박테리아이다.

메티오닌은 코리네포름 박테리아, 특히 코리네박테리움 클루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주를 발효시킴으로써 생산될 수 있다. 매우 중요하기 때문에, 생산 방법을 개선하는 작업이 계속해서 수행되고 있다. 방법의 개선은 예를 들어, 발효 조치, 영양 배지 조성, 또는 미생물 자체의 내재된 수행능력 특성에 관련될 수 있다.

정해진 분자의 생산에 관한, 이들 미생물들의 수행능력 특성을 개선시키기 위해, 돌연변이 유발, 선별 및 돌연변이 선별 방법 또는, 개개의 아미노산 생합성 유전자를 증폭하거나 불활성화시킴에 따라 아미노산 생산의 개선을 유도함으로써, 아미노산-생산 균주, 예를 들어 코리네박테리움의 균주를 개선시키는 재조합 DNA 기술 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, WO-A-02/10209 및 DE-A-101 36986은 L-메티오닌을 생산하는, 유전적으로 변형된 코리네포름 박테리아를 사용한, 발효에 의한 L-메티오닌 생산 방법을 기재하고 있다. 거기에는, 무엇보다도, 박테리아 발효, 배지 또는 박테리아 중의 아미노산 농축 및 아미노산 단리를 포함하는 L-메티오닌 생산 방법이 기재되어 있다. 나아가, 다음의 단계, 즉 a) L-메티오닌을 생산하는 미생물 발효; b) 예를 들어, 증발에 의한 발효 브로쓰 농축; c) 예를 들어, 원심분리에 의한 바이오매스 분리(0-100%); 및 d) 건조, 예를 들어, 동결 건조 또는 분무 건조, 분무 과립화 단계들을 포함하는, 발효 브로쓰로부터 L-메티오닌 함유 동물 사료 첨가물을 제조하는 방법이 기재되어 있다.

문헌 [Swapan et al., J. Microbial Biotechnology, 4 (1), 35-41 (1989)]에는 발효 브로쓰로부터의 세포 분리, pH의 5로의 조정, 활성 탄소 처리 및 이온-교 환 크로마토그래피에 의한, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) 돌연변이를 이용한, 메티오닌의 미생물성 생산이 기재되어 있다.

DE-A-35 33 198은 특별한 호열성 박테리아를 이용한 발효에 의한 L-류신 생산을 개시하고 있다. 발효는 60℃에서, 연속적으로, 바이오매스 보유, 생성물-함유 소모된 배지의 분리, 결정화기에서의 냉각(+2℃로), 결정화된 아미노산 생산 및 반응기로의 모액 재순환에 의해 수행된다. 발효에 의한 메티오닌 생산은 거기에 기재되어 있지 않다.

메티오닌의 미생물성 생산에 대해 종래에 기재된 방법들은, 산업적 규모로 생산하기 위한 요구조건들을 아직 만족시키지 못하고 있다. 그 원인은, 먼저, 높은 생합성 산출시, 메티오닌이 발효 브로쓰 중에서 침전되고, 그에 따라 정제를 어렵게 만드는 결과를 낳는, 수성 발효 배지 중의 메티오닌의 제한된 용해도이다. 추가적인 이유는, 선행기술에 따른 작업의 경우, 상당한 폐기물 스트림이 생성되고, 이들을 처리하는데 많은 비용이 든다는 것이다.

발명의 간단한 설명

그러므로, 본 발명의 목적은, 특히, 부분적으로 메티오닌을 결정성 형태로 포함하는 발효 브로쓰에 적용가능한 발효에 의해 생산되는 메티오닌을 단리하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다. 추가적인 목적은, 실제로 폐기물 스트림을 전혀 생성하지 않고, 그에 따라 특히 경제적으로 수행될 수 있는, 메티오닌 함유 발효 브로쓰에 대한 후처리 공정을 제공하는 것이다.

우리는 상기 목적이, 놀랍게도 바이오매스 분리를 위한 메티오닌의 용해도 특성을 구체적으로 활용하는 후처리 공정을 제공함에 의해 달성된다는 것을 발견하였다. 공정은, 발효에 의해 생산되는 L-메티오닌 정제 방법으로서의 결정화를 이용한다. 이는 사료 첨가물로서 사용될 2개의 상이한 생성물을 제공한다(저-농도 및 고-농도 생성물). 바람직한 변형법에서, 실제로 폐기물 스트림이 전혀 생성되지 않고, 그에 따라 산업상 규모의 특히 경제적인 메티오닌 생산이 허용된다.

A) 일반적 정의

본 발명의 목적에 있어, “메티오닌”은 원칙적으로 L- 또는 D-메티오닌, 이들 이성질체들의 혼합물, 예를 들어 라세미체이지만, 바람직하게는 L-메티오닌을 포함한다.

물 중의 메티오닌의 용해도는 20℃에서 약 30 g/l이고, 70℃에서는 90 g/l보다 높다. 이들 조건 하에서의 발효 브로쓰 중에서, 비교가능한 자릿수의 용해도들이 관찰된다.

본 발명의 목적에 있어, “농축”, “분리”, “세정”, “건조”와 같은 공정 조치들은, 전문가 기술 분야에서 존재하는 모든 공정들을 포함한다. 예를 들어, “농축”은 대기압 하 또는 진공 인가에 의한 액체 상을 증발시키는 것을 의미할 수 있다. “농축”은, 예를 들어 역삼투 또는 나노여과와 같은 친숙한 기법 또는 통상적인 장치, 예를 들어, 강하 경막 증발기, 박막 증발기 또는 회전형 증발기, 또는 이들의 조합을 이용하여 수행될 수 있다. “분리”는, 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리, 또는 이들 공정의 조합을 포함할 수 있다. “세정”은, 적당하다면, 필터 잔류물을 현탁시킨 후에, 예를 들어 고체를 여과시키고, 한 번 또는 여러 번 세정하는 것을 포함할 수 있다. “건조”는, 예를 들어 동결 건조, 분무 건조, 분무 과립화, 유동상 건조 또는 이들 공정들의 조합을 포함할 수 있다.

B) 본 발명의 바람직한 실시태양

본 발명은 먼저

a) 메티오닌을 생산하는 미생물의 발효 중에 생산된, 특히 메티오닌을 부분적으로 용해되지 않은 형태로 포함하는 메티오닌 함유 액체 분획을, 액체 상 중 메티오닌의 용해도를 증가시키기에, 바람직하게는 메티오닌을 본질적으로 완전히 용해시키기에 충분한 온도로 가열시키는 단계,

b) 그로부터 메티오닌 강화된 액체 상을 얻는 단계 및

c) 적당하다면, 강화된 액체 상을 농축시킨 후, 메티오닌을 결정화시키는 단계를 포함하는, 발효에 의해 생산된 메티오닌을 단리하는 방법에 관한 것이다.

메티오닌은, 예를 들어 액체 상 중의 전체 메티오닌 함량을 기준으로 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 특히 100%가 용해된 경우라면, “본질적으로” 완전히 용해된 것이다.

메티오닌 함유 “액체 분획”은 전형적으로, 발효 공정으로부터 얻어지고, 특히 메티오닌을 부분적으로 용해되지 않은 형태로 포함하는 브로쓰이고, 적당하다면, 발효 브로쓰 중에 통상적으로 존재할 수 있는 다른 고체 구성성분; 또는 예를 들어 적합한 예비처리에 의해 얻어지는, 그로부터 유도된 액체 구성성분을 가질 수 있다. “예비처리”는, 예를 들어 증발에 의한 농축, 또는 물질 부가일 수 있다. 예를 들어, 메티오닌 함유 분획은 이전의 후처리 배치로부터의 브로쓰, 또는 이후의 가공 단계를 촉진하거나, 지정된 바와 같은 생성물(예를 들어, 사료 첨가물)의 사용을 촉진하는 부가물(이하 참조)에 부가될 수 있다.

적당하다면, 강화된 발효 브로쓰 중의 용해되지 않은 메티오닌의 함량은, 발효 브로쓰의 전체 중량을 기준으로, 약 1 내지 10 중량%, 바람직하게는 약 3 내지 8 중량% 범위이거나, 전체 고체 함량을 기준으로, 약 30 내지 80 중량%, 바람직하게는 약 50 내지 57 중량% 범위이다.

예를 들어, 본 발명의 발효는 약 96 g/l의 메티오닌 함량을 제공하며, 그 중 약 46 g/l은 전형적인 발효 온도에서, 용해되어 있고, 약 50 g/l은 용해되어 있지 않다.

강화된 액체 상의 메티오닌 함량은, 그의 건조 잔류물을 기준으로, 약 60 내지 100 중량% 또는 약 90 내지 100 중량% 범위, 예를 들어 약 75 내지 85 중량% 또는 약 95 내지 100 중량% 범위이며, 각각은 건조 질량 기준이다.

메티오닌을 본질적으로 용해시키기 위해, a) 단계에서 액체는 용해될 생성물의 양에 따라, 약 60 내지 120℃, 바람직하게는 약 70 내지 100℃ 범위의 온도로 가열된다. 적당하다면, 약간 상승된 압력, 예를 들어 1 내지 5 atm 하에서 작동될 필요가 있을 수 있다.

바람직하게는, a) 단계에서 사용된 액체 분획은 추가적인 예비처리를 거치지 않은, 바이오매스 함유 발효 브로쓰이다.

b) 단계의 메티오닌 강화된 액체 상은, 바람직하게는, 용해된 메티오닌으로 농축된, 가열된 발효 브로쓰로부터 바이오매스를 분리함으로서 얻어진다. 메티오닌의 조기 결정화를 방지하기 위해, 마찬가지로 상승된 온도, 바람직하게는 상기에서 구체화된 범위의 온도가 바이오매스 분리 동안 사용된다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서,

d) 결정화된 메티오닌이 분리되고,

e) 분리된 고체, 바람직하게는 결정성 메티오닌이, 적당하다면, 세정되며,

f) 적당하다면, 건조된다.

더욱 바람직한 공정 변형법에 따르면, b) 단계에서 분리된 바이오매스는,

g1) 적당하다면, 세정되며(세정에 사용되는 액체는, 적당하다면, 가열됨),

g3) 건조된다.

예를 들어, 고체 메티오닌이 분리된 바이오매스 분획 중에 존재하고, 가능한 바이오매스로부터 메티오닌을 생산하는 것이 바람직하다면, 세정액을 가열하는 것이 필요하게 될 수 있다.

폐기물 스트림을 피하기 위해, 바람직하게는

g2) g1) 단계에서 생성된 세정액은 b) 단계로부터의 메티오닌 농축된 액체 상과 합해진다.

그리고 나서, 상기 절차에 따라 얻어진 b) 단계의 메티오닌 함유 액체 상은, 예를 들어 가열 및 적당하다면, 진공 인가에 의한 증발에 의해 추가로 농축된다. 얻어진 농축물 중의 메티오닌 함량은 농축물의 전체 중량을 기준으로, 약 10 내지 40 중량% 범위 내이다. 메티오닌은 바람직하게는, 냉각 결정화에 의해 분리된다. 이를 위해, 용액은 0 내지 20℃ 범위의 온도로 냉각된다. 결정화가 완료된 후, 고체 메티오닌은 차가운 세정액, 예를 들어 물로 세정되고, 적당하다면 온화한 가열에 의해 건조된다.

추가적인 공정 변형법에 따르면, d) 단계에서 생성된 모액은

d1) 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한 다른 발효 배치로부터의 메티오닌 함유 액체 분획과 합해지거나;

d2) g3) 단계에 따른 건조 전에, 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한, 동일하거나 다른 발효 배치로부터 분리된 바이오매스에 부가된다.

추가적인 공정 변형법에 따르면, e) 단계에서 생성된 세정액은

e1) 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한 다른 발효 배치로부터의 메티오닌 함유 액체 분획과 합해지거나;

e2) g3) 단계에 따른 건조 전에, 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한 동일하거나 다른 발효 배치로부터 분리된 바이오매스에 부가된다.

재순환하는 모액 및 세정액은 추가로 폐기물 스트림의 생성을 방지한다.

추가적으로, 본 발명에 따라, 바람직하게는 g3) 단계에 따른 건조는 분무 건조 단계를 포함한다.

본 발명은 나아가, 천연 또는 재조합 미생물이 그 자체로 공지된 방식으로 발효되고, 형성된 메티오닌이 상기 정의에 따른 방법에 의해 단리되는, 발효에 의한 메티오닌 생산 방법에 관한 것이다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 코리네박테리움 속의 천연 또는 재조합 박테리아로부터 선택된 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용하여 수행된다.

본 발명은 나아가, 사료 또는 사료 보충물(사료 첨가물)을 제조하기 위한, 상기 g3) 단계에 따라 얻을 수 있는 건조 물질의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 음식물 또는 사료 또는 음식물 보충물 또는 사료 보충물을 제조하기 위한, 본 발명에 의해 단리된 메티오닌의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 마지막으로, 상기 정의에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 메티오닌을 함유하는 건조된 바이오매스; 이러한 유형의 바이오매스를 포함하는 사료 첨가물; 및 통상적인 사료 구성성분 외에 그러한 사료 첨가물을 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.

이하 부분에서, 본 발명의 추가적인 개발이 기재된다.

c) 본 발명에 따라 사용된 숙주 세포

본 발명의 방법에 있어, 바람직하게는 코리네포름 박테리아가 사용된다. 바람직하게는, 이들은 코리네박테리움 속의 박테리아이다. 공지된 코리네박테리움 속 중, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종이, L-아미노산을 생산하는 능력에 대해 특별히 언급될 것이다.

언급될 수 있는 적합한 균주의 예는 하기와 같다:

코리네박테리움 속 중:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토악시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965; 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10065; 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608

또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 중:

브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067; 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869 및 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020이 언급될 것이다;

(KFCC = 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collection); ATCC = 미국표준균주(American Type Culture Collection); FERM BP = 생물과학 및 인간 기술 국립 연구소 콜렉션(Collection of the National Institute of Bioscience and Human-Technology), 일본 산업과학기술청)

박테리아 균주는 비변형되거나, 적합한 방식으로 유전적 변형되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 메티오닌 생합성 경로의 유전자가 증폭되어, 더 많은 메티오닌이 세포 내에 존재하는 미생물이 사용될 수 있음을 예로 들 수 있다. 달리, 또는 부가적으로, 메티오닌 분해 대사 경로에 관여하는 유전자들을 불활성화하거나 감쇠시킬 수 있다. 메티오닌 생산을 개선시킬 적합한 전략들이 선행기술로부터 공지되어 있으며, 예를 들어, 참고문헌으로서 본원에 의해 명확히 인용되고 있는 WO-A-02/10209, DE-A-102 170 58, DE-A-102 393 08, DE-A-102 390 73, DE-A-102 390 82 및 DE-A-102 228 58에 기재되어 있다.

메티오닌 함량을 낮출 수 있는 효소의 활성 또는 양을 감소시키기 위해, 당업자들은 다른 조치들을 개별적으로 또는 조합하여 수행할 수 있다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 빈도를 감소시킴에 의해, 관련 단백질의 농도가 낮아질 수 있다. 이는 코딩 유전자의 프로모터 또는 조절 영역 및 리보솜 결합 부위를 변형 또는 교환시킴으로써 당업자에 의해 달성될 수 있다. 코딩 영역의 하류에서, 당업자는 터미네이터를 변형시키거나, 전사체의 안정성을 감소시키는 서열을 도입시킬 수 있다. mRNA의 수명을 감소시키는 이들 조치들은 연관 단백질의 발현을 낮출 수 있고, 그에 따라 그 농도를 낮출 수 있다.

발현된 효소의 수준에서, 융합 서열은 붕괴 속도를 증가시킬 수 있고, 그에 따라, 마찬가지로 단백질의 농도를 낮출 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자들은, 코딩 유전자의 표적화 또는 비표적화된 돌연변이 유발을 이용하여, 활성, 기질 친화성 및 기질 특이성을 변화시킬 수 있다. 효소 활성은, 효소 반응의 반응 속도가 부분적으로 또는 완전히 감소되는 방식으로, 상응하는 유전자 내 돌연변이에 의해 영향받을 수 있다. 그러한 돌연변이의 예는 당업자들에게 공지되어 있다([Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001], [Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek. 64: 145-63, 1993-94]). 단백질의 돌연변이는 또한, 효소 복합체의 동종- 또는 이종다량체화를 감소시키거나 억제시킬 수 있고, 그에 따라, 마찬가지로 효소 특성을 손상시킬 수 있다.

이러한 방식으로 변형된 유전자들은 플라스미드 내에 존재하거나, 바람직하게는 염색체 내에 통합될 수 있다. 이 경우, 이 방식으로 변형되지 않은 본래 유전자는 여전히 부가적으로 존재할 수 있지만, 바람직하게는 변형된 유전자로 교환될 수 있다.

코리네포름 박테리움 내에서 조치된 효소의 활성을 감소시키기 위해, 인공적으로 제작된 돌연변이 또는 다른 생물체로부터의 천연 상동체와 같은, 기능적 동등물을 코딩하는 유전자를 발현시키는 것으로 충분할 수 있다. 이 경우, 본래 유전자는 여전히 부가적으로 존재할 수 있지만, 바람직하게는 변형된 또는 상동 유전자로 교환될 수 있다.

뿐만 아니라, 메티오닌의 박테리아성 생산을 위해, 메티오닌 생합성 경로, 시스테인 대사 경로, 아스파르테이트 세미알데히드 합성, 해당과정, 아나플레로시스, 펜토스 인산 대사, 시트르산 회로 또는 아미노산 방출 중의 하나 이상의 효소를 증폭하는 것이 유리할 수 있다.

예를 들어, 메티오닌 생산을 위해, 이하의 유전자들 중 하나 이상이 증폭될 수 있다:

- 아스파르테이트 키나아제를 코딩하는 유전자 lysC(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281),

- 아스파르테이트 세미알데히드를 코딩하는 유전자 asd(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 282),

- 글리세르알데히드-3-인산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자 gap(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

- 3-포스포글리세레이트 키나아제를 코딩하는 유전자 pgk(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

- 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자 pyc(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

- 트리오스-인산 이소머라제를 코딩하는 유전자 tpi(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

- 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 metA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 725),

- 시스타티오닌감마-신타제를 코딩하는 유전자 metB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3491),

- 시스타티오닌감마-분해효소를 코딩하는 유전자 metC(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061),

- 시스타티온신타제를 코딩하는 유전자 metH(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),

- 세린히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 glyA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1110),

- O-아세틸호모세린술프히드릴라제를 코딩하는 유전자 metY(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),

- 메틸렌테트라히드로폴레이트리덕타제를 코딩하는 유전자 metF(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),

- 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 serC(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 928)

- 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 유전자 serB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEa NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)

- 세린 아세틸-트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 cysE(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)

- 시스테인 신타제를 코딩하는 유전자 cysK(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817),

- 호모세린 탈수소화효소를 코딩하는 유전자 hom(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1306)

뿐만 아니라, 본 발명의 메티오닌 생산을 위해서, 변이되지 않은 단백질에 비해, 상응하는 단백질의 활성이 대사물에 의해 적은 정도로 영향받거나 영향받지 않는, 또는 이들의 특이적 활성이 증가되는 방식으로 이하의 유전자들 중 하나 이상을 동시에 변이시키는 것이 바람직할 수 있다:

- 시스타티오닌 감마-신타제를 코딩하는 유전자 metB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3491),

- 시스타티오닌 감마-분해효소를 코딩하는 유전자 metC(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061),

- 메티오닌 신타제를 코딩하는 유전자 metH(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),

- 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 glyA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1110),

- O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 유전자 metY(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),

- 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 metF(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),

- 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 유전자 serB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)

- 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 cysE(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)

뿐만 아니라, 메티오닌 생산을 위해, 이하의 유전자들 중 하나 이상을 감쇠, 특히 그들의 발현을 감소 또는 불활성화시키는 것이 유리할 수 있다:

- S-아데노실메티오닌 신타제를 코딩하는 유전자 metK(E.C.2.5.1.6)

- 호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자 thrB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)

- 트레오닌 데히드라타제를 코딩하는 유전자 ilvA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)

- 트레오닌 신타제를 코딩하는 유전자 thrC(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486)

- 메소-디아미노피멜레이트 D-탈수소화효소를 코딩하는 유전자 ddh(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)

- 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자 pck(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)

- 글루코스-6-인산 6-이소머라제를 코딩하는 유전자 pgi(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 950)

- 피루베이트 산화효소를 코딩하는 유전자 poxB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)

- 디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자 dapA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)

- 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 dapB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3477)

- 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 lysA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3451)

뿐만 아니라, 메티오닌 생산을 위해, 상기에서 언급된 유전자 metK, thrB, ilvA, thrC, ddh, pck, pgi, poxB, dapA, dapB, lysA 중 하나 이상을, 상응하는 단백질의 효소 활성이 부분적으로 또는 완전히 줄어드는 방식으로 변이시키는 것이 유리할 수 있다.

뿐만 아니라, 메티오닌 생산을 위해, 추가적인 원치 않는 부반응을 제거하는 것이 유리할 수 있다([Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982]).

과발현을 달성하기 위해, 당업자들은 다른 조치들을 개별적으로 또는 조합하여 취할 수 있다. 따라서, 상응하는 유전자의 카피 수가 증가될 수 있거나, 구조 유전자의 상류인 프로모터 및 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위가 변이될 수 있다. 구조 유전자의 상류에 혼입되는 발현 카세트들은 같은 방식으로 작용한다. 유도가능한 프로모터를 이용함으로써, 발효에 의한 L-메티오닌 생산 과정에서 발현을 증가시키는 것이 부가적으로 가능하다. mRNA의 수명을 연장시키는 조치들은 마찬가지로 발현을 개선시킨다. 나아가, 효소 단백질의 붕괴를 억제함으로써, 효소 활성은 마찬가지로 증가한다. 유전자 또는 유전자 구조물은 다른 카피 수로 플라스미드 내에 존재하거나 염색체 내에 통합되고 증폭될 수 있다. 달리, 관련 유전자의 과발현은 나아가, 배지 조성 및 배양 조건을 변화시킴에 의해 달성될 수 있다.

당업자들은, 무엇보다도 문헌 [Martin et al., Biotechnology 5, 137-146 (1987)], [Guerrero et al. Gene 138, 35-41 (1994)], [Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988)], [Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)], EP 0472869, US 4,601,893, [Schwarzer and Puhler, Biotechnology 9, 84-87 (1991)], [Remscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)], [LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)], WO 96/15246, [Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993)], JP-A10-229891, [Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58,191-195 (1998)], [Makrides, Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 이와 관련한 지침을 발견한다.

D) 본 발명 발효의 수행

본 발명에 따라 생산된 미생물들은 메티오닌 생산을 위해, 배치 공정(배치 배양) 또는 공급형 배치 공정, 또는 반복 공급형 배치 공정 중 연속적으로 또는 배치별로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법들의 요약을 문헌 [Chmiel, Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Process Biotechnology 1. Introduction to process biotechnology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 [Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripherals] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden. 1994)]에서 발견할 수 있다.

사용될 배양 배지는 적합한 방식으로 각각의 균주의 요구조건을 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배양 배지는 안내서인 문헌 [Manual of Methods fur General Bacteriology, American Society fur Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)]에 설명되어 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 보통, 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염, 비타민 및(또는) 미량원소를 포함한다.

바람직한 탄소 공급원은 단-, 이- 또는 다당류와 같은 당이다. 매우 좋은 탄소 공급원은, 예를 들어, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 녹말 또는 셀룰로스이다. 당은 또한, 당밀과 같은 복합체 화합물, 또는 당 정제의 다른 부산물을 통해 배지에 부가될 수 있다. 또한, 다양한 탄소 공급원들의 혼합물을 부가하는 것이 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 오일 및 지방, 예를 들어 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방; 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산; 알코올, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올; 및 유기산, 예를 들어 아세트산 또는 락트산이다.

질소 공급원은 보통, 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 이들 화합물들을 함유하는 물질이다. 질소 공급원의 예는 암모니아 기체 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄과 같은 암모늄 염, 질산염, 요소, 아미노산 또는 옥수수 침유, 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등과 같은 복합체 질소 공급원을 포함한다. 질소 공급원들은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지 중에 존재할 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드, 포스포러스 또는 술페이트 염을 포함한다.

메티오닌의 생산에 사용될 수 있는 황 공급원은 무기 황 화합물, 예를 들어 술페이트, 술파이트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술피드이지만, 또한 메르캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물이기도 하다.

인 공급원으로서, 인산, 인산 이수소 칼륨 또는 인산 수소 이칼륨 또는 상응하는 나트륨 염이 사용될 수 있다.

킬레이팅제가, 용액 중에 금속 이온을 보유시키기 위해 배지에 부가될 수 있다. 특히 적합한 킬레이팅제는 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트와 같은 디히드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 포함한다.

보통, 본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 또한, 예를 들어, 바이오틴, 리보플라빈, 티아민, 폴산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함하는, 비타민 또는 성장 촉진제와 같은 다른 성장 인자들을 포함한다. 성장 인자 및 염은 흔히, 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침유 등과 같은 복합체 배지 성분으로부터 유래한다. 뿐만 아니라, 적합한 전구체는 배양 배지에 부가될 수 있다. 배지 화합물의 정확한 조성은 각각의 실험에 크게 영향받고, 각각의 특이적인 경우에 따라 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 문헌 [P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3]으로부터 얻을 수 있다. 성장 배지는 또한, 스탠다드 1(Standard 1)(머크(Merck)사) 또는 BHI(뇌심심출, 디프코(DIFCO)사) 등과 같은 상업적인 공급원으로부터 얻을 수 있다.

모든 배지 성분들은 가열(1.5 바 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 여과된다. 성분들은 함께 또는, 필요하다면 분리되어 멸균될 수 있다. 모든 배지 성분들은 배양 개시시에 존재하거나, 임의적으로 연속적으로 또는 배치별로 부가될 수 있다.

배양 온도는 보통, 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이며, 실험 동안 일정하게 유지되거나 변화될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5 범위, 바람직하게는 7.0 근처이어야 한다. 배양물의 pH는, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 부가함에 의해, 배양 동안 조절될 수 있다. 거품 발생을 제어하기 위해, 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르가 사용될 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 적합한 선택성 물질, 예를 들어 항생제가 배지에 부가될 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어 주위 공기가 배양물 내로 도입된다. 배양은 원하는 생성물이 최대한 형성될 때까지 계속된다. 이 목적은 보통 10시간 내지 160시간 내에 달성된다.

얻어지는 메티오닌-함유 발효 브로쓰는 보통, 7.5 내지 25 중량%의 건조 질량을 갖는다.

발효가, 적어도 종결시에, 다만 특히 발효 시간 중 30% 이상 동안 당-제한 조건 하에서 수행된다면, 더욱 유리하다. 즉, 이 시간 동안, 발효 배지 중 이용가능한 당의 농도는 0 내지 3 g/l로 유지되거나, 감소된다.

E) 메티오닌 정제

본 발명에 따라 결정화 후에 얻어진 메티오닌이 원하는 순도를 아직 갖고 있지 않다면, 추가적으로 정제될 수 있다. 이를 위해, 생성물을 적합한 수지를 사용한 크로마토그래피에 용해된 형태로 적용하며, 원하는 생성물 또는 불순물은 전체적으로 또는 부분적으로 크로마토그래피 수지 상에 체류된다. 이들 크로마토그래피 단계들은 필요하다면, 반복될 수 있으며, 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지들이 사용된다. 당업자들은 적합한 크로마토그래피 수지 및 이들의 가장 효과적인 적용을 선택하는데 있어 정통하다. 정제된 생성물은 여과 또는 초미세여과에 의해 농축되고, 생성물의 안정성이 최대가 되는 온도에서 보관될 수 있다.

단리된 화합물의 정체 및 순도는 공지된 기법에 의해 결정될 수 있다. 이들은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 분광학적 방법, 색상법, 박층 크로마토그래피, NIRS, 효소 시험 또는 미생물학적 시험을 포함한다. 이들 분석적 방법들은 이하에 요약되어 있다: [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbicl. 60:133-140]; [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32]; [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70]; [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27. VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587]; [Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons]; [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17].

F) 바이오매스 건조

발효가 완료된 후, 메티오닌 함유 발효 브로쓰는 직접 가공되어 완성된 건조 사료 첨가물을 제공한다. 하지만, 본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 먼저 바이오매스 함량은 전체적으로 또는 부분적으로, 바람직하게는 완전히, 예를 들어 원심분리에 의해, 발효 브로쓰로부터 제거되고, 가공되어 본 발명의 사료 첨가물을 형성한다. 얻어지는 바이오매스는 여전히, 필요하다면 세정 단계의 중간 설비에 의해 감소될 수 있는, 메티오닌의 특정 분획을 함유한다.

본 발명의 바이오매스는 그 자체가 공지된 선행 기술로부터의 다양한 공정에 의해 적합한 건조 생성물을 제공하도록 후처리될 수 있다. 특히, 생성에 적합한 공정은 분무 건조, 분무 과립화, 접촉 건조, 유동상 건조 또는 동결 건조와 같은 건조 공정들이다. 적합한 공정들은 예를 들어 하기 문헌들에 기재되어 있다: [O. Krischer, W. Kast, Trocknungslechnik [Drying technology] first volume, "Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik" [The scientific bases of drying technology], Springer-Verlag 1978]; [Krischer/Kroll, Trocknungstechnik [Drying technology] second volume, "Trockner und Trocknungsverfahren" [Dryers and drying methods], Springer-Verlag 1959]; [K. Kroll, W. Kast, Trocknungstechnik third volume, "Trocknen und Trockner in der Produktion" [Drying and dryers in production], Springer-Verlag 1989]; [K. Masters, "Spray Drying Handbook", Longman Scientific & Technical 1991, 725 pages]; [H. Uhlemann, L. Morl, "Wirbelschicht - Spruhgranulation" [Fluidized-bed spray granulation], Springer-Verlag 2000]; [Freeze drying: Georg-Wilhelm Oetjen, "Gefriertrocknen" [Freeze drying], VCH 1997]; 및 EP-A-O 809 940. 상기 기재된 간행물들의 개시물은 참고문헌으로써 본원에 의해 명확히 인용되고 있다.

특히 바람직하게는, 본 발명의 건조 단계는 분무 건조, 예를 들어, 통합된 유동상 분무 건조, 또는 분무 과립화에 의해 수행된다.

필요하다면, 건조는 사료 용도로 적합한, 적합한 지지체 물질의 존재 하에 수행될 수 있으며, 그 결과로서, 특히 자유 유동 능력 및 그에 따른 생성물 질이 개선될 수 있다.

사료 용도로 적합하고 사용될 수 있는 지지체 물질은 통상적인 불활성 지지체이다. “불활성” 지지체는 첨가물 중에 존재하는 음식물 부가물과의 임의의 불리한 상호작용을 보이지 않아야 하며, 사료 첨가물 중에서 보조제로서 사용되기에 안전해야 한다. 언급될 수 있는 적합한 지지체 물질의 예는 천연 또는 합성 유래의 무기 또는 유기 화합물이다. 적합한 저분자량 무기 지지체의 예는 염화나트륨, 탄산칼슘, 황산나트륨 및 황산마그네슘과 같은 염, 또는 규산이다. 적합한 유기 지지체의 예는, 특히 당, 예를 들어 글루코스, 프럭토스, 수크로스 및 덱스트린 및 녹말 생성물이다. 언급될 수 있는 고분자량 유기 지지체의 예는, 특히 옥수수 녹말, 곡분, 예를 들어 밀, 호밀, 보리 및 귀리분, 또는 이들의 혼합물, 또는 밀 세몰리나 겨와 같은 녹말 및 셀룰로스 제제이다. 지지체 물질은 제제 중에서, 건조량을 기준으로, 약 5 내지 85 중량 %, 예를 들어 약 10 내지 30 중량%, 20 내지 40 중량% 또는 50 내지 85 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

이하에서, 일부 바람직한 건조 기법들은 일반적인 형태로 간략하게 다루어질 것이다.

분무 건조는, 먼저 분무 타워 내 분무기로 여전히 습한 바이오매스를 펌핑함에 의해 수행될 수 있다. 분무화는, 예를 들어 압력 노즐(단일-성분 노즐), 이성분 노즐 또는 원심 분무기를 이용하여 수행된다. 액적은 분무 건조기 내로 통과하는 열풍 스트림에 의해 건조된다. 원심 분무기가 사용되는 경우, 건조는 바람직하게는, 동방향 유동으로 수행된다. 노즐이 사용되는 경우, 건조는 또한, 역방향 유동 또는 교차유동으로 수행될 수 있다. 건조된 분말은 타워에서 배출될 수 있거나, 공기 스트림과 함께 운반되고 사이클론 및(또는) 필터에서 분리된다. 생성물 및 절차에 따라, 분무 건조기에 플랜지된 내부 유동상 또는 외부 유동상에서 수행될 수 있는, 건조후 단계가 요구될 수 있다.

본 발명의 건조 공정의 변형법에서, 연속 또는 배치별 유동상 응집이 건조 단계, 특히 분무 건조의 하류에서 제공된다. 이를 위해, 유동상 건조기가, 공정 개시시에, 미세분말 물질, 예를 들어 분무 건조에 의해 얻어진 미세분말 첨가물로 충진된다. 물질은, 예를 들어 예비가열된 공기를 공급함으로써 유동화된다. 액체 상, 예를 들어 추가적인 바이오매스 또는 결합제 함유 용액은 유동상 상으로 분무되고, 결과적으로 충진된 분말은 이 용액으로 습해지고, 그 접착 특성에 의해, 더욱 응집된다. 연속적 또는 반연속적으로, 주기 중 간격을 두고 동시에, 응집체의 일부량이 유동상으로부터 배출된다. 배출물은, 예를 들어 스크린을 사용하여 분류된다. 이 절차에서 생성된 거친 물질은 분쇄되고, 유동상으로 연속적으로 재순환될 수 있다. 예를 들어 배기 필터 시스템으로부터의 미세물질은, 마찬가지로 연속적으로 재순환될 수 있다.

더욱 바람직한 공정 변형법은, 이어지는 분무 건조된 분말 응집과 연결된, 분말을 제공하는, 바이오매스의 분무 건조를 포함한다. 이는 배치별로 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 연속적인 절차가 바람직하다. 이러한 유형의 공정들은 통상적인 분무 건조 설비를 사용하여 수행될 수 있다. 하지만, 유리하게는, 본 절차는 FSD(유동화된 분무 건조기), SBD(분무 층 건조기) 또는 MSD(다단계 건조기)로 알려진 장치에서 수행된다.

본 발명의 건조 생성물의 연속적인 생산을 위한 건조 설비인 유동화된 분무 건조기(FSD)는 특히 이하의 경로에 따라 작동될 수 있다: 습한 바이오매스는 FSD 건조기의 상부로, 공급선을 통해 도입되고, 분무기를 사용하여 분무화된다. 건조는 동방향 유동의 공기 도입에 의해 수행된다. 공기는 가열기를 통해 예비가열된다. 분무 건조된 분말은 FSD 건조기 하부의 통합된 유동상에 수집되고, 거기서 압축 공기를 사용한 분무 장치를 사용하여, 예를 들어 결합제 용액과 함께 분무된며, 도입된 공기를 사용하여 유동화된다. 이를 위해, 공기는 예비가열되고, 통합된 유동상의 기체 분배자 아래에서, 공급선을 통해 공급된다. 얻어지는 예비응집체는 그리고 나서, 하류의 외부 유동상 내로 통과한다. 예비가열된 공기는, 추가적인 공급선을 통해 아래로부터 이 외부 유동상 내로 도입된다. 유동상에 충진된 예비응집체는 다시, 압축 공기를 사용한 추가적인 분무 장치를 사용하여 분무되고(예를 들어, 결합제 용액으로), 응집되어 최종 생성물을 형성한다. 최종 응집체는 유동상으로부터 배출되고, 상기에서 기재된 바와 같이 추가적으로 후처리될 수 있다.

분무된 액체의 조성 및 양은 분무된 용액의 접착 특성, 달성될 응집체 크기 및 공정 조건에 의존적이다.

분무된 바이오매스의 접착 특성이, 입자들을 확실히 분무 후에 함께 안정하게 점착시키기에 충분치 않은 경우, 결합제를 추가적으로 사용하는 것이 유리하다. 이는, 응집체가 건조 시에 다시 붕괴되는 것을 방지한다. 그러한 경우, 수성 배지 중의 가용성 또는 분산성 결합제를 유동상 내로 분무하는 것이 바람직하다. 언급될 수 있는 적합한 결합제의 예는 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 덱스트린 등의 용액, 당 알코올, 예를 들어 만니톨, 또는 중합체 용액, 예를 들어 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 에톡시화된 셀룰로스(EC), 에틸셀룰로스 또는 프로필셀룰로스 용액이다. 분무되는 결합제의 양 및 접착 특성을 적합하게 선택한 결과로서, 다른 크기 및 세기의 응집체들이 형성된다.

결합제가 별도의 용액으로서 분무된다면, 용액의 결합제 함량은, 용액의 전체 중량을 기준으로, 약 1 내지 30 중량% 범위 내이다. 결합제는 마찬가지로, 이 경우에는 수성 배지, 바람직하게는 멸균 탈염수 중에 용해되어 존재한다. 통상적인 첨가물, 예를 들어 완충액 또는 가용화제가 마찬가지로 존재할 수 있다.

최종 생성물 중의 결합제 함량은, 본 발명에 따라, 0 내지 약 20 중량%, 예를 들어 약 1 내지 6 중량%이다. 최적량은 또한 선택되는 결합제 유형의 함수이다. 생성물 상의 역효과를 확실히 피하는 것이 필요하다.

G) 제형화

i) 사료 첨가물 및 사료 조성물:

본 발명의 메티오닌 함유 사료 첨가물은 바람직하게는, 미세하게 분할된 자유-유동 분말 형태, 또는 과립화된 형태이다. 입자들은, 예를 들어 5 내지 200 ㎛, 예를 들어 10 내지 150 ㎛, 20 내지 100 ㎛ 또는 30 내지 80 ㎛의 크기 범위 내일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명 첨가물의 용적 밀도는, 예를 들어 약 100 내지 600 g/l, 예를 들어 150 내지 400 g/l, 또는 200 내지 350 g/l 범위 내일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명 첨가물의 메티오닌 함량은 생산 방식에 따라 달라진다.

본 발명에 따라 이용가능한 메티오닌 결정은 60 중량% 초과, 예를 들어 약 70 내지 98 중량%, 바람직하게는 80 내지 95 중량%, 특히 바람직하게는 약 87 내지 95 중량%의 메티오닌 함량을 갖는다. 염 함량(발효 브로쓰로부터의 잔류물)은 약 0 내지 20 중량%, 특히 약 5 내지 15 중량% 범위 내일 수 있다. 다른 발효 소수 구성성분은 약 0 내지 20 중량%, 특히 약 5 내지 15 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 바이오매스 메티오닌은 3 중량% 초과, 예를 들어 약 5 내지 40 중량%, 또는 약 10 내지 35 중량%의 메티오닌 함량을 갖는다. 염 함량은 약 5 내지 25 중량%와 같은 약 0 내지 30 중량% 범위 내일 수 있다. 다른 소수 발효 구성성분은 약 5 내지 15 중량%와 같은 약 0 내지 20 중량%의 함량으로 존재할 수 있다.

완성된 첨가물의 잔류 습기 함량은 바람직하게는, 첨가물의 전체 중량을 기준으로, 약 3-5 중량% 미만 범위 내이다. 상기 중량 퍼센트는 건조 생성물(바람직하게는 잔류 습기 없음)의 전체 중량을 기준으로 하고 있다.

상기 기재된 구성성분들 뿐 아니라, 본 발명의 제제는, 상기에서 이미 언급한 바와 같이, 바이오매스의 후처리 전, 후처리 동안 또는 후처리 후에 부가될 수 있는 추가적인 부가물들을 포함할 수 있다. 언급될 수 있는 예는 방부제, 항생제, 항미생물 첨가물, 항산화제, 킬레이팅제, 생리적으로 무해한 염, 향미제, 착색제 등이다. 영양적으로 관련있는 부가물들, 예를 들어 비타민(예를 들어 비타민 A, B₁, B₂, B₆, B₁₂, C, D₃, 및(또는) E, K₃, 폴산, 니코틴산, 판토텐산); 타우린, 카르복실산 및 이들의 염, 예를 들어 시트레이트, 이소시트레이트, trans-/cis-아코니테이트 및(또는) 호모시트레이트와 같은 트리카르복실산, 효소, 카로티노이드, 무기물, 예를 들어 P, Ca, Mg 및(또는) Fe, 및 Se, Cr, Zn, Mn과 같은 미량 원소, 단백질, 탄수화물, 지방, 아미노산 또한 존재할 수 있다. 뿐만 아니라, 피루브산, L-카르니틴, 리포산, 보조효소 Q10, 아미노카르복실산, 예를 들어 크레아틴, 오로트산, 미오이노시톨, 플라보노이드, 베타인, p-아미노벤조산이 존재할 수 있다.

본 발명의 메티오닌 함유 사료 첨가물은 상업적으로 통상적인 동물 사료 제제 내로 혼입될 수 있고, 그리고 나서 예를 들어, 소, 돼지, 양, 가금류 등에 공급될 수 있다. 이를 위해, 본 발명 첨가물은 통상적인 동물 사료 구성성분들과 혼합되고, 적당하다면, 최종 형태, 예를 들어 정제화된 형태로 가공된다. 통상적인 동물 사료 구성성분은 예를 들어, 옥수수, 보리, 매니옥, 귀리, 대두, 어분, 밀 세몰리나 겨, 대두유, 초크, 무기물, 미량 원소, 아미노산 및 비타민이다.

ii) 음식물 및 사료 보충물

본 발명에 따라 생산된 메티오닌은 음식물 및 사료 중 부가물로서, 또는 음식물 보충물 및 사료 보충물 중 부가물, 예를 들어 다중비타민 제제로서 사용된다. 본 발명에 의해 생산된 생성물은, 이를 위해, 원하는 양 및 그 자체로 공지된 방식으로, 통상적인 음식물 및 사료 또는 음식물 보충물 및 사료 보충물 내로 혼입될 수 있다. 용도에 따라, 다른 간편량의 메티오닌이 이 경우에 존재할 수 있다.

iii) 코팅 제제

상기에서 기재된, 본 발명의 제제는, 적당하다면, 부가적으로 코팅을 가질 수 있다. 이들은 이 경우, 이하로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 코팅 조성물과 함께 공급된다:

- 예를 들어 약 400 내지 15 000, 예를 들어 400 내지 10 000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리(알킬렌 글리콜), 특히 폴리(에틸렌 글리콜);

- 예를 들어 약 4000 내지 20 000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리(알킬렌 옥시드)중합체 또는 공중합체, 특히 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체;

- 치환된 폴리스티렌, 말레산 유도체 및 스티렌-말레산 공중합체;

- 단독의 또는 셀룰로스 에테르 또는 녹말과 같은 다른 화합물과 조합된; 예를 들어 약 7000 내지 1 000 000의 수 평균 분자량을 갖는 비닐 중합체, 특히 폴리비닐피롤리돈;

- 예를 들어 약 30 000 내지 100 000의 수 평균 분자량을 갖는 비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체;

- 예를 들어 약 10 000 내지 200 000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리(비닐 알코올), 및 폴리(프탈산 비닐 에스테르);

- 예를 들어 약 6000 내지 80 000의 수 평균 분자량을 갖는 히드록시프로필메틸셀룰로스;

- 예를 들어 약 100 000 내지 1 000 000의 수 평균 분자량을 갖는 알킬 (메트)아크릴레이트 중합체 및 공중합체, 특히 에틸 아크릴레이트/메틸 메트아크릴레이트 공중합체 및 메트아크릴레이트/에틸 아크릴레이트 공중합체;

- 예를 들어 약 250 000 내지 700 000의 수 평균 분자량을 갖는, 적당하다면, 폴리비닐피롤리돈으로 안정화된 폴리(비닐 아세테이트);

- 폴리알킬렌, 특히 폴리에틸렌;

- 방향족 중합체, 예를 들어 리그닌;

- 폴리(아크릴산);

- 폴리아크릴아미드;

- 폴리시아노아크릴레이트;

- 페녹시아세트산-포름알데히드 수지;

- 에틸셀룰로스, 에틸메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트와 같은 셀룰로스 유도체;

- 동물성, 식물성 또는 합성 지방 및 변형 지방, 예를 들어 폴리글리콜, 지방 알코올, 에톡시화된 지방 알코올, 고급 지방산; 고급 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세리드, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트, 알킬아릴에톡실레이트 및 코코모노에탄올아미드;

- 동물성 및 식물성 왁스 또는 밀랍, 칸델릴라 왁스, 카르나우바 왁스, 몬탄 에스테르 왁스 및 쌀 배아 오일 왁스, 경랍, 라놀린 왁스, 호호바 왁스, 사솔 왁스와 같은 화학적으로 변형된 동물성 및 식물성 왁스;

- 동물성 및 식물성 단백질, 예를 들어 겔라틴, 겔라틴 유도체, 겔라틴 치환체, 카제인, 유장, 케라틴, 대두 단백질; 제인 및 밀 단백질;

- 단- 및 이당류, 올리고당류, 다당류, 예를 들어 히알루론산, 풀룰란, 엘시난, 녹말, 변형 녹말, 및 펙틴, 알기네이트, 키토산, 카라게닌;

- 식물성 오일, 예를 들어 해바라기유, 엉겅퀴유, 면실유, 대두유, 옥수수 배아유, 올리브유, 포도씨유, 아마씨유, 코코넛유, 팜 커넬유; 합성 또는 반합성유, 예를 들어 중길이 트리글리세리드 또는 광유; 동물성 오일, 예를 들어 청어유, 정어리유 및 고래유;

- 경화(수소화 또는 부분 수소화) 오일/지방, 상기 언급된 중에서 예를 들어, 특히 수소화된 팜유, 수소화된 면실유, 수소화된 대두유;

- 락카 코팅, 예를 들어 테르펜, 특히 셸락, 톨루발삼, 페루발삼, 샌드락, 및 실리콘 수지;

- 포화 및 단일불포화 및 다중불포화된 C₆ 내지 C₂₄-카르복실산인 지방산; ,

- 실리카;

및 이들의 혼합물.

코팅 전에 지방 또는 왁스에 가소제 또는 유화제를 부가하면, 적당하다면, 막의 가요성을 개선시키는데 유리할 수 있다.

코팅은 그 자체로 공지된 방식으로, 적당하다면 첨가물과 함께, 일반적으로 적가하기 위한 장치를 통하거나, 혼합기 내에 충진된 가치있는 생성물 상에 분무함으로써 도포된다. 이러한 예는 란스(lance), 스프링클러 헤드, 단일-유체 또는 다중-유체 노즐, 또는 회전식 적하 또는 분무 장치이다. 가장 단순한 경우에는, 농축 제트로서 국부적으로 부가하는 것 또한 가능하다. 달리, 코팅 물질은 먼저 혼합기 내에 충진되고, 그 후 가치 있는 생성물을 부가할 수 있다. 벽 가열의 결과로서, 또는 기계 에너지 주입으로 인해, 가치 있는 생성물을 녹이고 코팅하는, 고체 코팅 물질을 처음에 부가하는 것 또한 가능하다.

본 발명은 이제, 수반하는 도면들을 참고하여 더욱 상세하게 기재될 것이다. 도 1 내지 4는 결정성 건조 메티오닌 및 건조 메티오닌 함유 바이오매스(“바이오매스 메티오닌”)를 생산하기 위한 본 발명 공정의 상이한 전개를 보여준다.

실시예 1:

a) 발효에 의한 메티오닌 생산

메티오닌 정제를 위한 대표적인 발효 브로쓰를 제조하기 위해, 실험실 발효를 수행하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032 (미국표준균주, 미국 매나사스)를 200 ml의 BHI 배지(디프코/벡톤 디킨슨 프랭클린 레이크스(Becton Dickinson Franklin Lakes, 미국)의 예비 배양물 중에서 성장시켰다. 그리고 나서, 테크포어스(Techfors) 발효기에서, 예비 배양물을 배양 배지 내로 접종하였다(약 14 L).

주 배양 발효 배지는 이하의 조성을 가졌다.

KH₂PO₄ 2 g/l

K₂HPO₄ 2 g/l

황산암모늄 10 g/l

글루코스 100 g/l

효모 추출물 5 g/l

카나마이신 20 mg/l

KS911 ASM 소포제 1 g/l

pH 7.0

탈염수(원하는 최종 부피까지 맞춤)

배지 중 1 ml/l의 미량 염 용액

FeSO₄ _·7 H₂O	10 g/l
MnSO₄ _·4-6 H₂O	10 g/l
ZnSO₄	2 g/l
MgSO₄ _·7 H₂O	250 g/l
HCl을 사용하여 pH 1로 맞춤

프로토카테쿠에이트 용액 1 ml/l (원액 300 mg/10 ml)

바이오틴 1 mg/l

티아민 1 mg/l

CaCl₂ 5 mg/l

발효기에 예비 배양물을 접종한 후, 발효기를, 염기(25% NH₄OH)를 부가함으로써 pH 7로 유지하고, 당이 소모될 때까지 발효시켰다. 이는 pO₂ 값이 증가하고, OTR 및 CTR이 감소됨으로써 표시되었다.

b) 발효 브로쓰 후처리

후처리 절차를 도 1에 도식적으로 나타내었다.

a) 부분에 따라 제조된 발효 브로쓰는 출발물질로서 작용한다. 30 및 40℃ 사이의 발효 온도에서, 약 50%의 메티오닌이 결정성 형태로 존재한다. 출발 생성물은 약 86%의 수분 함량, 약 9%의 강화된 메티오닌 함량 및 약 3%의 바이오매스 함량을 갖는다. 다른 발효 부산물 및 무기물은 발효 브로쓰 중에, 미량으로 존재한다(약 2.5 중량%).

20 kg의 이 발효 브로쓰를 15분 동안 70℃에서 가열하였다. 결과적으로 메티오닌은 용액 내로 완전히 통과되었다. 그리고 나서, 일정한 온도에서, 바이오매스를 원심분리하였다. 그리고 나서, 상등액(약 15 kg)을, 100℃ 및 대기압에서 20%의 메티오닌 함량을 갖도록 농축시켰다. 그리고 나서, 농축물을 5 K/h에서 5℃로 냉각하여, 결과적으로 대부분의 메티오닌을 결정화시켰다. 그리고 나서, 결정을 진공 필터 상에서 결정 마그마(magma)로부터 분리하고, 4 리터의 이전에 5℃에서 평형화된 물로 세정하고 나서, 40℃에서 질소로 송풍 건조시켰다. 이 절차를 이용하여, 1.3 kg의 건조 메티오닌을 약 90%의 순도로 단리하였다.

건조 바이오매스 뿐 아니라, 원심분리 잔류물(약 5 kg) 또한 약 6%의 메티오닌을 포함한다. 분무 건조에 의해, 이 잔류물은, 건조 바이오매스 및 다른 발효 부산물 및 무기물 염 뿐 아니라, 메티오닌(약 30%)도 포함하는, 3%의 잔류 수분을 갖는 약 0.7 kg의 연노란색 자유 유동 건조 분말로 변환될 수 있다.

분무 건조를, 이하의 기기 세팅을 사용하여 실험실 분무 건조기에서 수행하였다:

유입구 온도: 200℃,

유출구 온도: 80-82℃

사용된 가열 기체는 60 m³/h의 질소이었다. 노즐 기체를 1.2 mm 노즐을 통해 2 바의 압력으로 분무하였다.

실시예 2:

동일한 출발물질로부터 출발하여, 바이오매스가 원심분리를 이용하여 분리되고 나서, 분리된 바이오매스가 5 L의 물로 세정되는 정도로 공정을 변형하였다(도 2). 원심분리 후, 얻어지는 상등액을 첫 번째 바이오매스 분리 단계의 상등액에 부가하였다. 전체 상등액을 100℃ 및 대기압에서 16%의 메티오닌 함량을 갖도록 농축시켰다. 농축물을 5 K/h에서 5℃로 냉각시킴으로써, 메티오닌을 결정화시켰다. 결정을 진공 필터 상에서 분리하고, 4.5 리터의 이전에 5℃에서 평형화된 물로 세정하고 나서, 40℃에서 질소로 건조시켰다. 이 절차를 이용하여, 건조 메티오닌의 양을 약 1.5 kg으로 증가시켰다. 단리된 결정의 순도는 다시 약 90%이었다.

분리되고 세정된 바이오매스의 잔류물을, 분무 건조에 의해 약 0.5 kg의 건조 생성물로 변환시켰다.

건조 바이오매스 및 다른 발효 부산물 및 무기물 염 뿐 아니라, 메티오닌(약 10%)도 포함하는, 그렇게 생성된 생성물은 자유 유동하였다.

실시예 3:

동일한 출발물질로부터 출발하여, 결정성 메티오닌이 분리되었을 때 생성된 모액 및 세정수가 다음 배치 중에서 메티오닌 함유 발효 브로쓰에 부가되는 정도로 실시예 2의 공정을 추가로 변형하였다(도 3).

마찬가지로 실시예 2와 유사한 절차를 이용하여, 발효 중, 약 1.5 kg의 건조 메티오닌을, 약 90%의 순도로 결정화로부터 얻었고, 약 0.5 kg의 생성물을 약 10%의 메티오닌 함량을 갖는 분무 건조된 바이오매스로부터 얻었다.

실시예 4:

동일한 출발물질로부터 출발하여, 결정성 메티오닌이 분리되었을 때 생성된 모액 및 세정수가 분무 건조 전에 바이오매스 스트림에 부가되는 정도로 실시예 2의 공정을 추가로 변형하였다(도 4).

마찬가지로 실시예 2와 유사한 절차를 이용하여, 건조 바이오매스 및 다른 발효 부산물 및 무기물 염 뿐 아니라, 메티오닌(약 30%)도 포함하는 메티오닌 함유 바이오매스 약 1.1 kg을 생성하였다. 건조 메티오닌의 양은 1.5 kg이고, 순도는 약 90%이었다.

실시예 5:

메티오닌 결정화 후, 모액 및 세정수 일부분을, 바이오매스 분리 전에 발효기 브로쓰에 부가하고, 분무 건조 전에 나머지 서브스트림을 바이오매스 스트림에 부가하는 공정 변형법 또한 생각할 수 있다(실시예 3 및 4의 조합).

Claims

a) 메티오닌을 생산하는 미생물의 발효 중에 생산된, 부분적으로 결정성 형태인 메티오닌을 함유하는 바이오매스-함유 발효 브로쓰를 60 내지 120℃의 온도로 가열하는 단계,

b) a) 단계의 발효 브로쓰로부터 바이오매스를 분리하여 메티오닌-함유 액체 상을 얻고, 분리된 바이오매스를 가열된 세정용 액체로 세정하고, 생성된 세정액을 상기 메티오닌-함유 액체 상과 혼합하는 단계, 및

c) 메티오닌을 결정화시키는 단계

를 포함하는, 발효에 의해 생산된 메티오닌의 단리 방법.
제1항에 있어서, a) 단계에서 메티오닌이 액체 상 중의 전체 메티오닌 함량을 기준으로 95% 넘게 용해되는, 메티오닌의 단리 방법.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서,

d) 결정화된 메티오닌을 분리하는 단계

를 포함하는 메티오닌의 단리 방법.
제4항에 있어서,

e) 분리된 고체 메티오닌을 세정하는 단계

를 포함하는 메티오닌의 단리 방법.
제4항에 있어서, d) 단계에서 결정화된 메티오닌을 분리하고 남은 액체를

d1) 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한 다른 발효 배치로부터의 메티오닌-함유 액체 분획과 합하거나;

d2) 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한 동일하거나 다른 발효 배치로부터 분리된 바이오매스에 부가하는 메티오닌의 단리 방법.
제5항에 있어서, e) 단계에서 생성된 세정액을

e1) 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한 다른 발효 배치로부터의 메티오닌-함유 액체 분획과 합하거나;

e2) 메티오닌을 생산하는 미생물을 사용한 동일하거나 다른 발효 배치로부터 분리된 바이오매스에 부가하는 메티오닌의 단리 방법.
삭제
천연 또는 재조합 미생물을 발효하고, 형성된 메티오닌을 제1항에서 청구된 방법에 의해 단리하는, 발효에 의한 메티오닌의 제조 방법.
제1항에 있어서, 메티오닌을 생산하는 미생물이 코리네박테리움 속의 천연 또는 재조합 박테리아로부터 선택되는 것인 메티오닌의 단리 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 메티오닌이 L-메티오닌인 것을 특징으로 하는 메티오닌의 단리 방법.
삭제
삭제
삭제
제1항 또는 제2항에서 청구된 방법을 이용하여 메티오닌을 단리하는 단계; 및

단리된 메티오닌을 사료 첨가물로 제제화하는 단계

를 포함하는, 사료 첨가물의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에서 청구된 방법을 이용하여 메티오닌을 단리하는 단계; 및

단리된 메티오닌을 사료 조성물로 제제화하는 단계

를 포함하는, 사료 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서, a) 단계에서, 가열을 70 내지 100℃의 온도로 수행하는 메티오닌의 단리 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 b) 단계에서 수득한 메티오닌-함유 액체 상을 농축한 후에 상기 c) 단계를 실시하는 메티오닌의 단리 방법.
a) 메티오닌을 생산하는 미생물의 발효 중에 생산된, 부분적으로 결정성 형태인 메티오닌을 함유하는 바이오매스-함유 발효 브로쓰를 60 내지 120℃의 온도로 가열하는 단계,

b) a) 단계의 발효 브로쓰로부터 바이오매스를 분리하여 메티오닌-함유 액체 상을 얻고, 분리된 바이오매스를 가열된 세정용 액체로 세정하는 단계, 및

g3) b) 단계에서 분리된 바이오매스를 건조하는 단계

를 포함하는, 메티오닌-함유 바이오매스의 단리 방법.
제19항에 있어서, g3) 단계에서 청구된 건조 단계가 분무 건조 단계를 포함하는 메티오닌-함유 바이오매스의 단리 방법.
제5항에 있어서,

f) 세정된 고체 메티오닌을 건조하는 단계

를 포함하는 메티오닌의 단리 방법.
제9항에 있어서, 메티오닌을 생산하는 미생물이 코리네박테리움 속의 천연 또는 재조합 박테리아로부터 선택되는 메티오닌의 제조 방법.