BRPI0417720B1 - Processos para isolar a metionina produzida por fermentação, e para produzir metionina por fermentação de um microorganismo natural ou recombinante, usos do material seco, e da metionina isolada - Google Patents

Description

“PROCESSOS PARA ISOLAR A METIONINA PRODUZIDA POR

FERMENTAÇÃO, E PARA PRODUZIR METIONINA POR

FERMENTAÇÃO DE UM MICROORGANISMO NATURAL OU

RECOMBINANTE, USOS DO MATERIAL SECO, E DA METIONINA ISOLADA.” [0001] A presente invenção diz respeito a um processo para produzir metionina pela fermentação, a um processo para isolar a metionina formada, a biomassa contendo metionina obtida no isolamento, seu uso para produzir uma ração ou suplemento de ração, e também ao uso da metionina isolada para produzir alimento ou ração ou suplementos de alimento ou ração. Técnica anterior [0002] A metionina é usada nos mais variados setores, incluindo os das indústrias de alimento, ração, cosméticos e farmacêutica. [0003] Até agora, apenas os processos de produção química para D,L- metionina foram de importância industrial. Os materiais de partida para esta síntese são sulfeto de hidrogênio, metilmercaptano, acroleína, ácido prússico ou metilmercaptopropionaldeído (ver Ullmanris Encyclopedia of Industrial Chemistry (1985), Vol. A2, página 71). [0004] A metionina também é produzida por processos metabólicos celulares naturais. A sua produção em uma escala industrial pode ser mais convenientemente realizada por meio de culturas bacterianas que foram desenvolvidas para produzir e secretar grandes quantidades da substância desejada. Os organismos que são particularmente apropriados para este propósito são as bactérias corineiformes não patogênicas. [0005] É conhecido que a metionina pode ser produzida fermentando- se cepas de bactérias corineiformes, em particular, Corynebacterium glutamicum. Por causa da grande importância, o trabalho está sendo continuamente realizado na melhora do processo de produção. As melhoras no processo podem dizer respeito a, por exemplo, medidas de fermentação, a composição do meio do nutriente, ou as propriedades de desempenho intrínsecas do microrganismo por si mesmo. [0006] Para melhorar as propriedades de performance destes microrganismos com respeito a produzir uma molécula definida, uso pode ser feito de métodos de mutagênese, seleção e seleção mutante ou métodos de tecnologia de DNA recombinante para a melhora da cepa das cepas produtoras de aminoácido, por exemplo de Corynebacterium, amplificando-se ou desligando-se os genes de biossíntese de aminoácido individuais e deste modo induzindo uma melhora da produção de aminoácido. [0007] Por exemplo, a WO-A-02/10209 e DE-A-101 36 986 descrevem um processo para produzir L-metionina por fermentação, usando as bactérias corineiformes geneticamente modificadas produtoras de L- metionina. Nestas, uma descrição é dada, entre outras coisas, de um processo para produzir L-metionina que compreende a fermentação das bactérias, o enriquecimento do aminoácido no meio ou nas bactérias e o isolamento do aminoácido. Além disso, um processo é descrito para produzir aditivo de ração animal contendo L-metionina a partir de um caldo de fermentação que compreende as seguintes etapas: a) fermentar os microorganismos produtores de L-metionina; b) concentrar o caldo de fermentação, por exemplo por evaporação; c) retirar por separação a biomassa (0 a 100 %), por exemplo por centrifugação; e d) secar, por exemplo por secagem por congelamento, secagem de pulverização, ou granulação de pulverização. [0008] Swapan et al. descrevem, na J. Microbial Biotechnology, 4 (1), 35-41 (1989), a produção microbiana de metionina por meio de um Bacillus megaterium mutante retirando-se por separação as células do caldo de fermentação, ajustando o pH a 5, o tratamento com carbono ativado e cromatografia de troca de íon. [0009] A DE-A-35 33 198 divulga a produção de L-leucina pela fermentação usando bactérias termofílicas especiais. A fermentação é realizada a + 60° C continuamente com retenção da biomassa, separação do meio gasto contendo o produto, esfriando (abaixo de + 2o C) em um cristalizador, produção do aminoácido que cristalizou e recirculação do liquido mãe ao reator. A produção de metionina por fermentação não é neste descrita. f00010] Os processos que foram descritos até agora para a produção microbiana de metionina ainda não satisfazem as necessidades de produção cm nina escala industrial. Uma razão para isto é, primeiramente, a solubilidade limitada de metionina no meio de fermentação aquoso, que tem o efeito que, em alto rendimento de biossíntese, a metionina precipita no caldo de fermentação e deste modo dificulta a purificação. Uma outra razão é que no caso de trabalho de acordo com a técnica anterior, correntes residuais consideráveis são produzidas, o descarte das quais está associado com o alto custo.

Descrição resumida da invenção [00011] É uni objetivo da presente invenção, portanto, fornecer um processo melhorado para isolar a metionina produzida por fermentação que seja aplicável, em particular, àqueles caldos de fermentação que compreendem metionina em parte, na forma cristalina. Um outro objetivo é fornecer um processo de trabalho para caldos de fermentação contendo metionina que não produzem virtual mente nenhuma corrente residual e deste modo pode ser realizado particularmente com economia. [00012] Nós descobrimos que o objetivo acima é surpreendentemente alcançado fornecendo-se um processo de trabalho que especificamente aproveita-sc das propriedades de solubílidadc da metionina para retirar por separação a b to massa. O processo utiliza a cristalização como um método de purificação para a L-metionina produzida pela fermentação. Isto dá dois produtos diferentes para o uso como aditivo de ração (produtos de baixa concentração e de alta concentração). Em variantes preferidas, virtualmente nenhuma corrente residual é produzida e deste modo a produção de metionina particularmente econômica em uma escala industrial é permitida.

Descrição detalhada da invenção A) Definições gerais [00013j “Metionina”, para os propósitos da invenção, a princípio abrange L- ou D-metionina ou misturas destes isômeros, por exemplo racematos, mais preferível mente L-metionina. 100014] A solubíl idade de metionina em água é de cerca de 30 g/I a 20° C, e a 70° C e é maior do que 90 g/1. No caldo de fermentação sob estas condições, as solubilidades de ordem comparável em magnitude são observadas, [00015] As medidas de processo tais como “concentração”, “separação” “lavagem”, “secagem”, para os propósitos da presente invenção, abrangem todos os processos presentes no campo do especialista habilitado.

Por exemplo, “concentração” pode ser considerado como a evaporação da fase líquida sob pressão atmosférica ou com a aplicação de um vácuo. A “concentração” pode ser realizada, por exemplo, usando-se técnicas familiares, tais como osmose reversa, nanofiltração ou dispositivos habituais, por exemplo um evaporador de película em queda, evaporador de película fina ou evaporador rotatório, ou combinações destes. A “separação” pode abranger, por exemplo, centrifugar, filtrar, decantar, ou combinações destes processos. A “lavagem” pode abranger, por exemplo, retirar um sólido por fíltração e lavagem simples ou repetida, se apropriado após colocar em suspensão o resíduo do filtro. A “Secagem” pode abranger, por exemplo, secagem por congelamento, secagem de pulverização, granulação de pulverização, secagem de leito fluidizado ou combinações destes processos. B) Formas de realização preferidas da invenção [00016] A presente invenção printeiramente diz respeito a um processo para isolar metionina produzida por fermentação, que compreende a) aquecer uma fração líquida contendo metionina produzida na fermentação de um microorganismo que produz metionina, fração líquida esta que compreende, em particular, metionina na forma parcialmente não dissolvida, a uma temperatura que é suficiente para aumentar a solubilidade de metionina na fase líquida, preferivelmente para levar a metionina essencial e completamente em solução, b) obter desta uma fase líquida enriquecida de metionina e c) cristalizar a metionina, se apropriado, após concentrar a fase líquida enriquecida. [00017] A metionina é “essencial” e completamente em solução se esta está, por exemplo, mais do que 95 % dissolvida, preferivelmente mais do que 98 % dissolvida, em particular 100 % dissolvida, com base no teor de metionina total na fase líquida. [00018] Uma “fração líquida” contendo metionina é tipicamente o caldo que é obtido a partir do processo de fermentação e compreende, em particular, a metionina na forma parcialmente não dissolvida e se apropriado pode ter outros constituintes sólidos que podem estar habitualmente presentes nos caldos de fermentação; ou um líquido derivado destes, obtido por exemplo por um pré-tratamento apropriado. Um “pré-tratamento” pode consistir, por exemplo, na concentração por evaporação, ou na adição de substâncias. Por exemplo, as frações contendo metionina podem ser adicionadas ao caldo de lotes de trabalho anterior, ou adjuntos (ver abaixo) que promovem as seguintes etapas de processo ou que promovem o uso do produto (por exemplo um aditivo de ração) como direcionado. [00019] O teor de metionina não dissolvida, se apropriado, no caldo de fermentação fortificado está, com base no peso total do caldo de fermentação, na faixa de cerca de 1 a 10 % em peso, preferivelmente de cerca de 3 a 8 % em peso, ou, com base no teor de sólidos totais, na faixa de cerca de 30 a 80 % em peso, preferivelmente de cerca de 50 a 57 % em peso. [00020] Por exemplo, uma fermentação inventiva pode dar um teor de metionina de cerca de 96 g/1, de que, a uma temperatura de fermentação típica, cerca de 46 g/1 estão na solução e cerca de 50 g/1 não são dissolvidos. [00021] O teor de metionina da fase líquida enriquecida está, com base nos resíduos secos desta, na faixa de cerca de 60 a 100 % em peso ou cerca de 90 a 100 % em peso, como por exemplo de cerca de 75 a 85 % em peso, ou cerca de 95 a 100% em peso, cada um com base na massa seca. [00022] Para levar a metionina essencialmente em solução, na etapa a), o líquido é aquecido a uma temperatura na faixa de cerca de 60 a 120° C, preferivelmente de cerca de 70 a 100° C, dependendo da quantidade do produto a ser dissolvido. Se apropriado, pode ser necessário operar sob uma pressão pouco elevada, por exemplo de 1 a 5 atm. [00023] Preferivelmente, a fração líquida usada na etapa a) é o caldo de fermentação contendo a biomassa sem pré-tratamento adicional. [00024] A fase líquida enriquecida de metionina da etapa b) é preferivelmente obtida retirando-se por separação a biomassa a partir do caldo de fermentação aquecido que é enriquecido com a metionina dissolvida. [00025] Para prevenir a cristalização prematura da metionina, do mesmo modo temperatura elevada é utilizada durante a separação da biomassa, preferivelmente uma temperatura na faixa especificada acima. [00026] Em uma forma de realização preferida da invenção d) a metionina cristalizada é retirada por separação, e) a metionina sólida, preferivelmente cristalina, que foi retirada por separação é lavada se apropriado e f) se apropriado secada. [00027] De acordo com uma outra variante do processo preferido, a biomassa retirada por separação na etapa b) é gl) se apropriado lavada, o líquido usado para a lavagem sendo se apropriado aquecido, e g3)secado. [00028] Pode vir a ser necessário aquecer o líquido de lavagem se, por exemplo, a metionina sólida deve estar presente na fração de biomassa retirada por separação, e é desejado produzir metionina a partir da fração de biomassa o tanto quanto possível. [00029] Para evitar correntes residuais, preferivelmente g2) o líquido de lavagem produzido na etapa gl) é combinado com a fase líquida enriquecida de metionina da etapa b). [00030] As fases líquidas contendo metionina da etapa b) obtidas de acordo com os procedimentos acima são então mais concentradas, por exemplo evaporando-se com aquecimento e se apropriado aplicando-se um vácuo. O teor de metionina no concentrado resultante está na faixa de cerca de 10 a 40 % em peso, com base no peso total do concentrado. A metionina é preferivelmente retirada por separação por cristalização de resfriamento. Para isto, a solução é resfriada a temperaturas na faixa de 0 a 20° C. Após a cristalização estar completa, a metionina sólida é lavada com banho líquido gelado, por exemplo água, e secado, se apropriado com aquecimento moderado. [00031] De acordo com uma outra variante do processo, o líquido mãe produzido na etapa d) é dl) combinada com a fração líquida contendo metionina a partir de outro lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina; ou d2) adicionada a biomassa retirada por separação a partir do mesmo ou outro lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina antes de secar de acordo com a etapa g3). [00032] De acordo com uma outra variante do processo, o líquido de lavagem produzido no estágio e) é el) combinado com a fração líquida contendo metionina a partir de outro lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina; ou dl) adicionado à biomassa retirada por separação a partir do mesmo ou outro lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina antes da secagem de acordo com a etapa g3). [00033] Recircular o líquido mãe e a lavagem líquida previne a produção de correntes residuais. [00034] De acordo com a invenção, além disso, preferivelmente, a secagem de acordo com a etapa g3) compreende um uma etapa de secagem de pulverização. [00035] A presente invenção ainda diz respeito a um processo para produzir metionina por fermentação, um microorganismo natural ou recombinante sendo fermentado de uma maneira conhecida por si e a metionina formada sendo isolada por um processo de acordo com a definição acima. [00036] Em uma forma de realização preferida, os processos inventivos são realizados usando um microorganismo produtor de metionina selecionado a partir de bactérias naturais ou recombinantes do gênero Corynebacterium. [00037] A invenção ainda diz respeito ao uso do material seco obtenível de acordo com a etapa g3) acima para produzir uma ração ou um suplemento de ração (aditivo de ração). [00038] A presente invenção também diz respeito ao uso da metionina inventivamente isolada para produzir um gênero alimentício ou ração ou suplemento de alimento ou suplemento de ração. [00039] A invenção finalmente diz respeito a biomassas secadas contendo metionina obteníveis por um processo de acordo com a definição acima; aditivos de ração, que compreendem uma biomassa deste tipo; e também composições de ração que compreendem um aditivo de ração além de constituintes de ração habituais. 100040J Nas seções abaixo, outros desenvolvimentos da invenção são descritos. C) Células hospedeiras usadas de acordo com a invenção [00041] Para o processo inventivo, uso é preferivelmente feito de bactérias corineiformes. Preferivelmente, estas são bactérias do gênero Corynebacteríum. Do gênero Corynebacteríum, em particular a espécie Cmynehocíeríum gíutamicum, deve ser mencionado que é conhecido na especialidade por sua capacidade de produzir L-aminoacidos. [00042] Os exemplos de cepas apropriadas que podem ser mencionadas são: do gênero Corynebacterium: Cotynebacterium gíutamicum ATCC 13032, Corynebacterium avetogliiíamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Coryn eha cte rí um th e rmoami no genes FER Μ BP-1539, Corynebacterium melassecoki ATCC 17965; Corynebacterium gíutamicum KFCC10065; ou Corynebacterium gíutamicum ATCC21608 ou do gênero Brevibacterium: Brevibacteríum fiavam ATCC 14067; Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e Brevibacterium divarícatum ATCC 14020 devem ser mencionados; (KFCC = Korean Federatíon of Culture Collection; ATCC = American Type Culture Collection; FERM BP = Collection of the National Institute of Bioscience e Human Technology, Agency of Industrial Science e Technology, Japão) [00043J As cepas de bactérias podem ser usadas não modificadas ou geneticamente modificadas de uma maneira apropriada. Por exemplo, microorganismos podem ser usados, por exemplo, em que os genes do caminho de bi os síntese de metionina são aumentados, de modo que mais metionina esteja presente na célula. Alternativa, ou adicional mente, também é possível desligar ou atenuar os genes que estão envolvidos nos caminhos metabólicos que degradam a metionina. As estratégias apropriadas para aperfeiçoar a produção de metionina são conhecidas da técnica anterior e são descritas, por exemplo, na WO-A-02/10209, DE-A-102 170 58, DE-A-102 393 08, DE-A-102 390 73, DE-A-102 390 82 e DE-A-102 228 58 que são expressamente aqui incorporadas por referência. [00044] De modo a reduzir a atividade ou quantidade de uma enzima que pode diminuir o teor de metionina, aqueles habilitados na técnica podem realizar medições diferentes individualmente ou em combinações. Reduzindo- se a freqüência de transcrição do gene que codifica a proteína inventiva, a concentração da proteína relevante pode ser diminuída. Isto pode ser realizado por aqueles habilitados na técnica modificando-se ou trocando-se a região do promotora ou de regulagem e também o sítio de ligação de ribossomo do gene codificador. A jusante da região codificadora, aqueles habilitados na técnica podem modificar os terminadores ou introduzir seqüências que levam a uma estabilidade reduzida do transcrito. Estas medidas que reduzem a vida do mRNA toma possível diminuir a expressão da proteína associada e deste modo, sua concentração. [00045] Ao nível da enzima expressada, as seqüências fundidas podem levar a uma taxa de mptura aumentada e deste modo também a uma diminuição da concentração da proteína. Além disso, aqueles habilitados na técnica, por meios de mutagênese alvejada ou não alvejada do gene codificador podem mudar a atividade, a afinidade do substrato e a especificidade do substrato. A atividade das enzimas pode ser afetada por mutações nos genes correspondentes de uma tal maneira que a redução parcial ou completa da velocidade de reação da reação enzimática ocorra. Os exemplos de tais mutações são conhecidos àqueles habilitados na técnica (Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001, Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94). Os mutantes da proteína também podem levar à homo ou heteromultimerização reduzidas ou inibidas dos complexos enzimáticos e deste modo também a uma deterioração das propriedades enzimáticas. [00046] Os genes modificados desta maneira podem estar presentes em plasmídeos, ou preferivelmente integrados no cromossomo. Neste caso, o gene original que não foi modificado desta maneira pode ainda adicionalmente estar presente, mas preferivelmente pode ser trocado pelo gene modificado. [00047] Para reduzir a atividade de uma enzima medida em uma bactéria corineiforme, pode ser suficiente expressar genes que codificam equivalentes funcionais, tal como mutantes fabricados artificialmente ou homólogos naturais de outros organismos. Neste caso, o gene original pode ainda adicionalmente estar presente, mas preferivelmente pode ser trocado pelo gene modificado ou homólogo. [00048] Além disso, pode ser vantajoso para a produção bacteriana de metionina amplificar uma ou mais enzimas do caminho de biossíntese da metionina, do caminho metabólico da cisteína, da síntese de semialdeído aspartato, da glicólise, da anaplerose, do metabolismo de fosfato pentose, do ciclo de ácido cítrico ou da exportação de aminoácido. [00049] Por exemplo, para a produção de metionina, um ou mais dos seguintes genes podem ser amplificados: - o gene lysC que codifica uma aspartato cinase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281), - o gene asd que codifica um aspartato semialdeído (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 282), - o gene gap que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - o gene pgk que codifica 3-fosfoglicerato cinase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - o gene pyc que codifica piruvato carboxilase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - o gene tpi que codifica triose-fosfato isomerase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - o gene metA que codifica homosserina O-acetiltransferase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 725), - o gene metB que codifica cistationina gama-sintase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 3491), - o gene metC que codifica cistationina gama-liase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061), - o gene metH que codifica cistationina sintase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663), - o gene glyA que codifica serina-hidroximetiltransferase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 1110), - o gene metY que codifica O-acetil-homosserina sulfidrilase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 726), - o gene metF que codifica metilenotetraidrofoliato reductase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379), - o gene serC que codifica fosfoserina aminotransferase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 928) - um gene serB que codifica fosfoserina fosfatase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767) - o gene cysE que codifica serina acetil-transferase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818) - o gene cysK que codifica cisteína sintase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817), - o gene hom que codifica uma homosserina desidrogenase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1306) [00050] Além disso, pode ser vantajoso para a produção inventiva de metionina inutar simultaneamente pelo menos um dos seguintes genes de uma tal maneira que a atividade das proteínas correspondentes, comparado com as proteínas não mutadas, é afetada em um menor grau, ou não é afetada, por um metabólito, ou que sua atividade específica é aumentada: - o gene lysC que codifica um aspartato cinase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281), - o gene pyc que codifica piruvato carboxilase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - o gene metA que codifica homosserina O-acetiltransferase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 725), - o gene metB que codifica cistationina gama-sintase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 3491), - o gene metC que codifica cistationina gama-liase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061), - o gene metH que codifica metionina sintase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663), - o gene glyA que codifica serina hidroximetil transferase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 1110), - o gene metY que codifica O-acetilomosserina sulfidrilase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 726), - o gene metF que codifica metilenotetraidrofoliato redutase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379), - o gene serC que codifica fosfoserina aminotransferase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 928) - um gene serB que codifica fosfoserina fosfatase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767) - o gene cysE que codifica serina acetiltransferase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818) - o gene cysK que codifica cisteína sintase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817), - o gene hom que codifica uma homosserina desidrogenase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1306) [00051] Além disso, pode ser vantajoso para a produção de metionina atenuar um ou mais dos seguintes genes, em particular para reduzir ou desligar suas expressões: - o gene metK que codifica S-adenosilmetionina sintase (E.C.2.5.1.6) - o gene thrB que codifica homosserina cinase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453) - o gene ilvA que codifica treonina desidratase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328) - o gene thrC que codifica treonina sintase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486) - o gene ddh que codifica meso-diaminopimelato D- desidrogenase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494) - o gene pck que codifica fosfoenolpiruvato carboxicinase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157) - o gene pgi que codifica glicose-6-fosfato 6-isomerase (EP 1 108 790 A2; DNASEQ NO. 950) - o gene poxB que codifica piruvato oxidase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873) - o gene dapA que codifica diidrodipicolinato sintase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476) - o gene dapB que codifica diidrodipicolinato redutase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3477) - gene lysA que codifica diaminopicolinato descarboxilase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3451) [00052] Além disso, pode ser vantajoso para a produção de metionina mutar pelo menos um dos genes acima mencionados metK, thrB, ilvA, thrC, ddh, pck, pgi, poxB, dapA, dapB, lysA de uma tal maneira que a atividade enzimática da proteína correspondente seja parcial ou completamente reduzida. [00053] Além disso, pode ser vantajoso para a produção de metionina eliminar outras reações colaterais não desejadas (Nakayama: “Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”, em: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982). [00054] Para se obter a super expressão, aqueles habilitados na técnica podem tomar diferentes medidas individualmente ou em combinação. Deste modo, o número de cópias dos genes correspondentes pode ser aumentado, ou a região promotora ou de regulagem ou o sítio de ligação de ribossomo que está a montante do gene estrutural pode ser mutado. Os cassetes de expressão agem da mesma maneira que são incorporados a montante do gene estrutural.

Por meio de promotores indutíveis é adicionalmente possível aumentar a expressão no curso da produção da L-metionina por fermentação. As medidas para prolongar a vida do mRNA do mesmo modo melhoram a expressão.

Além disso, inibindo-se a decomposição da proteína de enzima, a atividade da enzima é do mesmo modo aumentada. Os genes ou construtores de gene podem estar presentes em plasmídeos com números diferentes de cópias ou integrados no cromossomo e aumentados. Altemativamente, a super expressão dos genes relevantes podem ainda ser obtida mudando-se o meio da composição e condições da cultura. [00055] Aqueles habilitados na técnica encontram instruções a este respeito, entre outras coisas, em Martin et al. (Biotechnology 5, 137-146 (1987)), em Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), em Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), na EP 0472869, na US 4.601.893, em Schwarzer and Puhler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), em Remscheid et al. (Applied e Environmental Microbiology 60,126-132 (1994), em LaBarre et al. (Journal of Bacteríology 175, 10011007 (1993)), na WO 96/15246, em Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), na JP-A10-229891, em Jensen and Hammer (Biotechnology e Bioengineering 58,191-195 (1998)), em Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996) e em livros texto conhecidos de biologia genética e molecular. D) Realização da fermentação inventiva [00056] Os microorganismos produzidos de acordo com a invenção podem ser cultivados para a produção de metionina continuamente ou aos lotes no processo de lotes (cultura de lote) ou no processo de lote alimentado, ou processo de lote alimentado repetido. Um sumário dos métodos de cultura conhecidos pode ser encontrado no livro texto por Chmiel (BioprozePtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Process Biotechnology 1.

Introduction to process biotechnology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro-texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripherals] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)). [00057] O meio de cultura a ser usado tem que satisfazer os requerimentos das respectivas cepas de uma maneira apropriada. As descrições do meio de cultura de vários microorganismos são dadas no manual “Manual of Methods for General Bacteríology” da American Society for Bacteríology (Washington D. C., USA, 1981). [00058] O meio que pode ser usado de acordo com a invenção usualmente compreende uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e/ou elementos traço. [00059] As fontes de carbono preferidas são açúcares, tais como mono- , di- ou polissacarídeos. As fontes de carbono muito boas são, por exemplo, glicose, frutose, manose, galactose, ríbose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose. Os açúcares também podem ser adicionados ao meio por intermédio de compostos complexos, tais como melados, ou outros subprodutos do refino de açúcar. Também pode ser vantajoso adicionar misturas de várias fontes de carbono. Outras fontes de carbono possíveis são óleos e gorduras, por exemplo óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco; ácidos graxos, por exemplo ácido palmídico, ácido esteárico ou ácido linoléico; álcoois, por exemplo glicerol, metanol ou etanol; e ácidos orgânicos, por exemplo ácido acético ou ácido lático. [00060] As fontes de nitrogênio são usualmente compostos de nitrogênio orgânicos ou inorgânicos ou materiais que contenham estes compostos. Os exemplos de fontes de nitrogênio compreendem gás de amônia ou sais de amônio tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio ou nitrato de amônio, nitratos, uréia, aminoácidos ou fontes complexas de nitrogênio tais como líquido de maceração do milho, farinha de soja, proteína de soja, extrato de levedura, extrato de carne e outros. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura. [00061] Os compostos de sais inorgânicos que podem estar presentes no meio compreendem os sais de cloreto, fósforo ou sulfato de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro. [00062] As fontes de enxofre que podem ser usadas para a produção de metionina são os compostos de enxofre inorgânicos, por exemplo sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiossulfatos, sulfetos, mas também compostos de enxofre orgânicos, tal como mercaptanos e tióis. [00063] Como fonte de fósforo, uso pode ser feito de ácido fosfórico, diidrogeno fosfato de potássio ou hidrogeno fosfato de dipotássio ou os sais de sódio correspondentes. [00064] Os agentes quelantes podem ser adicionados ao meio para manter os íons metálicos em solução. Os agentes quelantes particularmente apropriados compreendem diidroxifetióis, tais como cateeol ou protocatecuato, ou ácidos orgânicos, tais como ãcído cítrico. [00065] Os meios de fermentação usados de acordo com a invenção usualmente também compreendem outros fatores de crescimento, tais como vitaminas ou promotores de crescimento, que incluem, por exemplo, bíotina, riboflavina, tíamina, ãcído fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina.

Os fatores de crescimento e sais frequentemente originam a partir de componentes de meio complexo, tais como extrato de levedura, melado, líquido de maceraçao do milho e outros. Além disso, precursores apropriados podem ser adicionados ao meio de cultura. A composição exata dos compostos do meio depende principal mente do respectivo experimento e é resolvido individualmente para cada caso específico. A informação na otimização do meio é obtenível a partir de um livro-texto ‘"Applied Microbiol, Physiology, A Practical Approach” (editores P, M. Rhodes, P. R Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). O meio de crescimento também pode ser obtido de fornecedores comerciais, tais como Padrão 1 (Merck) ou BHI (Infusão cérebro coração, DIFCO) e outros. [00066] Todos os componentes do meio são esterilizados por aquecimento (20 minutos a 1,5 bar e 12 Γ C) ou por fil tração estéril. Os componentes também podem ser esterilizados juntos ou se necessário separadamente. Todos os componentes do meio podem estar presentes no início da cultura ou podem opcionalmente ser adicionados continuamente ou aos lotes. [00067] A temperatura da cultura é usualmente de 15° € a 45° €, preferivelmente de 25° C a 40° C, e pode ser mantido constante ou mudada durante o experimento. O pH do meio deve estar na faixa de 5 a 8,5, preferivelmente em tomo de 7,0. O pH para a cultura pode ser regulado durante a cultura adicionando-se compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou água amoniacal, ou compostos ácidos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Para controlar o desenvolvimento de espuma, anti-espumantes podem ser usados, por exemplo ésteres poliglicóis de ácido graxo. Para manter a estabilidade dos plasmídeos, substâncias seletivas apropriadas, por exemplo antibióticos, podem ser adicionados ao meio. Para manter as condições aeróbicas, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, por exemplo ar ambiente, é introduzido na cultura. A cultura é continuada até um máximo do produto desejado ter se formado. Este objetivo é usualmente atingido dentro de 10 horas a 160 horas. [00068] Os caldos de fermentação contendo metionina resultantes usualmente têm uma massa seca de 7,5 a 25 % em peso. [00069] Além disso, é vantajoso se a fermentação for conduzida sob condições limitantes de açúcar pelo menos até o fim, mas em particular em pelo menos 30 % do tempo de fermentação. Isto quer dizer que durante este tempo a concentração de açúcar utilizável no meio de fermentação é mantido de > 0 a 3 g/1, ou é reduzida. E) Purificação da metionina [00070] Se a metionina obtida de acordo com a invenção após a cristalização não tiver ainda a pureza desejada, esta pode ser novamente purificada. Para isto o produto é submetido na forma dissolvida à cromatografia usando uma resina apropriada, o produto desejado ou as impurezas sendo completa ou parcialmente retida na resina cromatográfica.

Estas etapas cromatográficas podem ser repetidas se necessário, as mesmas ou diferentes resinas cromatográficas podem ser usadas. Aqueles habilitados na técnica são familiarizados na seleção de resinas cromatográficas apropriadas e suas aplicações mais eficazes. O produto purificado pode ser concentrado por filtração ou ultrafiltração e estocado a uma temperatura em que a estabilidade do produto seja máxima. [00071] A identidade e pureza do composto isolado podem ser determinadas por técnicas conhecidas. Estas incluem cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), métodos espectroseópieos, métodos de cor, cromatografia de camada fina, NIRS, teste de enzimas ou testes microbiológicos. Estes métodos analíticos estão resumidos em: Patek et aí. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et ai, (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; and Schmidt ei aí. (1998) Bioprocess Engineer, 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheím, pp. 89-90, pp. 521-540, pp, 540-547, pp. 559-566, 575-581 e pp, 581-587; Michal, G (1999) Bíoehemical Pathways: Àn Atlas of Biochemistry and Molecular Bíology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et aí. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology, Vol, 17, F) Secagem da biomassa [00072] Após a fermentação estar completa, o caldo de fermentação contendo metionina pode ser processado diretamente para dar o aditivo de ração seco acabado. De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, contudo, primeiro o teor de biomassa é completa ou pardalmente, preferível completamente, removido, por exemplo por centrifugação, a partir do caldo de fermentação e processado para formar o aditivo de ração inventivo. A biomassa resultante ainda contém uma certa fração de metionina, que se desejado pode ser diminuída por provisão intermediária de uma etapa de lavagem. [()()()73] A biomassa inventiva pode ser trabalhada para dar um produto seco apropriado por vários processos a partir da técnica anterior que são conhecidas por si. Em particular, os processos apropriados para a produção são processos de secagem, tal como secagem de pulverização, granulação de pulverização, secagem de contato, secagem de leito fluidizado ou secagem por congelamento. Os processos apropriados são descritos, por exemplo em: [00074] O. Krischer, W. Kast, Trocknungstechnik [Drying technology] first volume, “Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik” [The scientific bases of drying technology], Springer-Verlag 1978;

Krischer/Kroll, Trocknungstechnik [Drying technology] second volume, “Trockner e Trocknungsverfahren” [Dryers e drying metods], Springer- Verlag 1959; K. Kroll, W. Kast, Trocknungstechnik third volume, “Trocknen e Trockner in der Produktion” [Drying and dryers in production], Springer Verlag 1989; K. Masters, “Spray Drying Handbook”, Longman Scientific &

Technical 1991, 725 páginas; H. Uhlemann, L. Morl, “Wirbelschicht - Spriahgranulation” [Fluidized bed spray granulation], Springer-Verlag 2000;

Freeze drying: Georg-Wilhelm Oetjen, “Gefriertrocknen” [Freeze drying], VCH 1997; e também EP-A-0 809 940. A divulgação das publicações acima descritas é expressamente aqui incorporada por referência. [00075] Particularmente preferível, a etapa de secagem inventiva é realizada por secagem de pulverização, por exemplo secagem de pulverização com um leito fluidizado integrado, ou por granulação de pulverização. [00076] Se desejado, a secagem pode ser realizada na presença de um material de suporte apropriado que é apropriado para o uso como alimento de animal, como um resultado de que, em particular, a capacidade de fluxo livre e deste modo a qualidade do produto pode ser melhorada. [00077] Os materiais de suporte que são apropriados ao uso como alimento de animais e que podem ser usados são suportes inertes habituais.

Um suporte “inerte” não deve exibir nenhuma interação adversa com os adjuntos de alimentos presente nos aditivos e deve ser seguro para o uso como auxílio dos aditivos de ração. Os exemplos de materiais de suporte apropriados que podem ser mencionados são: compostos inorgânicos ou orgânicos de origem sintética ou natural. Os exemplos de suportes inorgânicos de baixo peso molecular apropriados são sais, tais como cloreto de sódio, carbonato de cálcio, sulfato de sódio e sulfato de magnésio, ou ácido silícico. Os exemplos de suportes orgânicos apropriados são, em particular, açúcares, por exemplo produtos de glicose, frutose, sacarose e também dextrinas e amido. Os exemplos de suportes orgânicos de peso molecular mais alto que podem ser mencionados são: preparações de amido e celulose, tais como, em particular, amido de milho, farinhas de cereais, por exemplo trigo, centeio, cevada e farinha de aveia, ou misturas destes, ou farelo da semolina do trigo. O material de suporte pode estar presente na preparação, com base na base seca, em uma quantidade de cerca de 5 a 85 % em peso, por exemplo de cerca de 10 a 30 % em peso, de 20 a 40 % em peso ou de 50 a 85 % em peso. [00078] Em seguida, algumas técnicas de secagem preferidas devem ser tratadas com resumo na forma geral. [00079] A secagem de pulverização pode ser realizada bombeando-se primeiro a biomassa ainda úmida ao atomizador na torre de pulverização. A atomização é realizada, por exemplo, por meio de um bico de pressão (bico de componente único), um bico de dois componentes ou um atomizador de centrífuga. As gotículas são secadas por um fluxo de ar quente que passa dentro do secador de pulverização. Quando os atomizadores de centrífuga são usados, a secagem é preferivelmente realizada em um fluxo concorrente.

Quando os bicos são usados, a secagem também pode ser realizada em fluxo contracorrente ou de fluxo cruzado. O pó seco pode ser descarregado na torre ou é carregado a frente com o fluxo de ar e separado em um ciclone e/ou filtro. Dependendo do produto e procedimento, uma pós secagem pode ser requerida, que pode ser realizada em um leito fluidizado interno flangeado ao secador de pulverização ou em um leito fluidizado externo. [00080] Em uma variante do processo de secagem inventivo, uma aglomeração de leito fluidizado contínuo ou aos lotes é fornecida a jusante da etapa de secagem, em particular a secagem de pulverização. Para isso, um secador de leito fluidizado é carregado no início do processo com um material pulverulento, por exemplo aditivo pulverulento obtido por uma secagem de pulverização. O material é fluidizado, por exemplo, alimentando-se a ar pré- aquecido. Uma fase líquida, por exemplo outra biomassa ou uma solução contendo aglutinante, é pulverizada no leito fluidizado, e como resultado o pó que foi carregado é umedecido com esta solução e, por suas propriedades adesivas, crescentemente aglomerada. A um mesmo tempo, continua ou semicontinuamente, em ciclos a intervalos, uma subquantidade de aglomerado é descarregada a partir do leito fluidizado. A descarga é classificada, por exemplo usando uma peneira. O material grosso produzido neste procedimento pode ser triturado e continuamente recirculado ao leito fluidizado. Os finos, por exemplo, do sistema de filtro do ar de exaustão, podem do mesmo modo ser continuamente recirculados. [00081] Uma outra variante preferida do processo compreende a biomassa de secagem de pulverização para dar um pó, unida com a aglomeração subseqüente do pó secado no pulverizador. Isto pode ser realizado aos lotes ou continuamente. Preferência é dada ao procedimento contínuo. Os processos deste tipo podem ser realizados usando plantas de secagem de pulverização convencionais. Vantajosamente, contudo, o procedimento é realizado em aparelhos que são conhecidos como FSD (secador de pulverizador fluidizado), SBD (secador de leito pulverizado) ou MSD (secador de multi-etapas). [00082] Uma planta de secagem de secador de pulverização fluidizado (FSD) para produção contínua de um produto seco inventivo pode ser operado em particular de acordo com a seguinte trajetória das partículas: a biomassa úmida é introduzida por intermédio de uma linha de alimentação no topo de secador FSD e atomizado usando um atomizador. A secagem é realizada introduzindo-se ar em fluxo concorrente. O ar é pré-aquecido por intermédio de um aquecedor. O pó secado por pulverização é coletado no leito fluidizado integrado no fundo do secador FSD e é lá pulverizado usando um aparelho pulverizador usando ar comprimido, por exemplo, com uma solução aglutinante e fluidizada usando ar introduzido. O ar para isto é pré-aquecido e alimentado por intermédio de uma linha de alimentação abaixo do distribuidor de gás do leito fluidizado integrado. O pré-aglomerado resultante então passa em um leito fluidizado externo a jusante. O ar pré-aquecido é introduzido neste leito fluidizado externo na parte inferior por intermédio de uma outra linha de alimentação. O pré-aglomerado carregado no leito fluidizado é novamente pulverizado usando um outro aparelho de pulverização usando ar comprimido (por exemplo com solução aglutinante) e aglomerado para formar o produto final. O aglomerado acabado é descarregado do leito fluidizado e pode ser ainda trabalhado como descrito acima. [00083] A composição e quantidade dos líquidos pulverizados depende das propriedades adesivas da solução pulverizada, o tamanho do aglomerado a ser obtido e as condições do processo. [00084] No evento em que as propriedades adesivas da biomassa pulverizada não são suficientes para assegurar que as partículas adiram entre si estavelmente depois da pulverização, o uso de um aglutinante além disso, é vantajoso. Isto evita que os aglomerados desintegrem novamente na secagem.

Em tais casos é preferido pulverizar um aglutinante que seja solúvel ou dispersível em um meio aquoso no leito fluidizado. Os exemplos de aglutinantes apropriados que podem ser mencionados são soluções de carboidratos, por exemplo glicose, sacarose, dextrinas etc., álcoois de açúcar, por exemplo manitol, ou soluções de polímero, por exemplo soluções de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), polivinilpirrolidona (PVP), celulose etoxilada (EC), etilcelulose ou propilcelulose. Como um resultado da escolha apropriada das quantidades e propriedades adesivas do aglutinante pulverizado, aglomerados de tamanhos e resistência diferentes são formados. [00085] Se o aglutinante é pulverizado como uma solução separada, o teor do aglutinante da solução é na faixa de cerca de 1 a 30 % em peso, com base no peso total da solução. O aglutinante também está presente neste caso, dissolvido em um meio aquoso, preferivelmente água estéril desmineralizada.

Aditivos habituais, por exemplo tampão ou solubilizador, também podem estar presentes. [00086] O teor do aglutinante no produto final é de acordo com a invenção de 0 a cerca de 20 % em peso, por exemplo de cerca de 1 a 6 % em peso. A quantidade ideal também é uma função do tipo de aglutinante selecionado. É necessário assegurar que efeitos adversos no produto sejam evitados. G) Formulações i) Aditivos de ração e composições de ração: [00087] O aditivo de ração contendo metionina inventivo está preferivelmente na forma de um pó de fluxo livre finamente dividido, ou na forma granulada. As partículas podem estar, por exemplo em uma faixa de tamanho de 5 a 200 μηι, por exemplo de 10 a 150 μηι, de 20 a 100 μηι ou de 30 a 80 μηι, sem estar restrito a estes. [00088] A densidade volumétrica dos aditivos inventivos pode estar, por exemplo, na faixa de cerca de 100 a 600 g/1, por exemplo de 150 a 400 g/1, ou de 200 a 350 g/1, sem estar restrito a estes. [00089] O teor de metionina do aditivo inventivo varia de acordo com a maneira de produção. [00090] Os cristais de metionina disponíveis de acordo com a invenção têm um teor de metionina maior de que 60 % em peso, por exemplo de cerca de 70 a 98 % em peso, preferivelmente de cerca de 80 a 95 % em peso, particularmente preferível de cerca de 87 a 95 % em peso. O teor dos sais (resíduos do caldo de fermentação) pode estar na faixa de cerca de 0 a 20 % em peso, em particular de cerca de 5 a 15 % em peso. Outros constituintes de fermentação menores podem estar presentes em uma quantidade de cerca de 0 a 20 % em peso, em particular de cerca de 5 a 15 % em peso. [00091] A metionina de biomassa da invenção tem um teor de metionina de mais do que 3 % em peso, por exemplo de cerca de 5 a 40 % em peso, ou de cerca de 10 a 35 % em peso. O teor dos sais pode estar na faixa de cerca de 0 a 30 % em peso, tal como de cerca de 5 a 25 % em peso. Outros constituintes de fermentação menores podem estar presentes a um teor de cerca de 0 a 20 % em peso, tal como de cerca de 5 a 15 % em peso. [00092] O teor de umidade residual do aditivo pronto é preferivelmente na faixa de menos do que cerca de 3 a 5 % em peso, com base no peso total do aditivo. As porcentagens acima em peso são fundamentadas no peso total do produto seco (preferivelmente sem umidade residual). [00093] Além disso, os constituintes descritos acima, as formulações inventivas, como já mencionado acima, podem compreender outros adjuntos, que podem ser adicionados antes, durante ou depois do trabalho da biomassa.

Os exemplos que podem ser mencionados são conservantes, antibióticos, aditivos antimicrobiano, antioxidantes, agentes queladores, sais fisiologicamente inofensivos, agentes de sabor, corantes e outros. Os adjuntos nutricionalmente relevantes também podem estar presentes, por exemplo vitaminas (por exemplo vitaminas A, Bi, B2, Bô, B12, C, D3, e/ou E, K3, ácido fólico, ácido nicotínico, ácido pantotênico); taurina, ácidos carboxílicos e sais destes, por exemplo ácidos tricarboxílicos, tais como citrato, isocitrato, trans- /cisaconitato e/ou homocitrato, enzimas, carotenóides, minerais, por exemplo P, Ca, Mg e/ou Fe, e elementos traço, tais como Se, Cr, Zn, Mn, proteínas, carboidratos, gorduras, aminoácidos. Além de ácido pirúvico, camitina L, ácido lipóico, coenzima Q10, ácidos aminocarboxílicos, por exemplo creatina, ácido orótico, mioinositol, flavonóides, betaína, ácido p-aminobenzóico podem estar presentes. [00094] Os aditivos de ração contendo metionina inventivos podem ser incorporados comercialmente nas formulações de ração animal convencionais, que podem então alimentar, por exemplo, a gado, porcos, ovelhas, aves domésticas e outros. Para este aditivo inventivo é misturado com constituintes de ração animal habituais e se apropriado processado na forma final, por exemplo pelotizado. Os constituintes de ração animal habituais são, por exemplo, milho, cevada, aipim, aveia, soja, farinha de peixe, cereais de semolina de trigo, óleo de soja, giz, minerais, elementos traço, aminoácidos e vitaminas. ii) Suplementos de alimento e ração [00095] A metionina inventivamente produzida é usada como um adjunto em gêneros alimentícios e alimentos animais ou como um adjunto em suplementos de alimento e suplementos de ração, por exemplo preparações multivitamínicas. O produto inventivamente produzido pode ser incorporado para isto na quantidade desejada e de uma maneira conhecida por si nos gêneros alimentícios ou alimentos animais convencionais ou suplementos alimentícios e suplementos de ração. A metionina pode estar presente neste caso, dependendo do uso, em quantidades convenientes diferentes. iii) Formulações revestidas [00096] As formulações inventivas descritas acima podem se apropriado adicionalmente ter um revestimento. Estes são fornecidos neste caso com uma composição de revestimento que compreende pelo menos um composto selecionado de: - poli(alquileno glicol)s, em particular poli(etileno glicol)s, por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 400 a 15.000, por exemplo de 400 a 10.000; - polímeros ou copolímeros de poli(óxido de alquileno), por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 4.000 a 20.000, em particular copolímeros de bloco de polioxietileno e polioxipropileno; - poliestirenos substituídos, derivados de ácido maléico e copolímeros de estireno-ácido maléico; - polímeros de vinila, em particular polivinilpirrolidonas, por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 7.000 a 1.000.000; sozinho ou em combinação com outros compostos, tal como éteres de celulose ou amidos; - copolímeros de vinilpirrolidona/acetato de vinila, por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 30.000 a 100.000; - poli(álcoois de vinila)s, por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 10.000 a 200.000, e poli(éster vinílico do ácido ftálico)s; - hidroxipropilmetilceluloses, por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 6.000 a 80.000; - polímeros e copolímeros de alquil (met)acrilato, por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 100.000 a 1.000.000, em particular copolímeros de acrilato de etila/metacrilato de metila e copolímeros de metacrilato/acrilato de etila; - poli(acetato de vinila)s, por exemplo tendo um peso molecular médio numérico de cerca de 250.000 a 700.000, se apropriado estabilizado com polivinilpirrolidona; - polialquilenos, em particular polietilenos; polímeros aromáticos, por exemplo ligninas; - poli(ácido acrüico)s; poliacrilamidas; policianoacrilatos; - resinas de ácido fenoxiacético-formaldeído; derivados de celulose, tais como etilcelulose, etilmetilcelulose, metil-celulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetil-celulose, acetato ftalato de celulose; - gorduras animal, vegetal ou sintética e gorduras modificadas, por exemplo poliglicóis, álcoois graxos, álcoois graxos etoxilados, ácidos graxos superiores; mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos superiores, por exemplo monoestearato de glicerila, alquilariletoxilados e cocomono- etanolamidas; - ceras animais e vegetais ou ceras animais e vegetais quimicamente modificadas, tais como cera de abelha, cera de candellila, cera de carnaúba, cera de éster montan e cera de óleo de germe de arroz, espermacete, lanolina, cera de jojoba, cera de sasol; - proteínas animal e vegetal, por exemplo gelatina, derivados de gelatina, substitutos de gelatina, caseína, soro de leite, queratina, proteína de soja; zeína e proteína de trigo; - mono- e dissacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, por exemplo ácido hialurônico, pululano, elsinano, amidos, amidos modificados, e também pectinas, alginatos, quitosano, carragenina; - óleos vegetais, por exemplo óleos de girassol, cardo, caroço de algodão, soja, semente de milho, azeitona, semente de colza, linhaça, coco, óleos de dendê; óleos sintéticos ou semi-sintéticos, por exemplo óleos de triglicerídeos de cadeia média ou mineral; óleos animais, por exemplo óleos de arenque, sardinha e baleia; - óleos e gorduras endurecidos (hidrogenados ou parcialmente hidrogenados), por exemplo dos acima mencionados, em particular óleo de palma hidrogenado, óleo de caroço de algodão hidrogenado, óleo de soja hidrogenado; - revestimentos de verniz, por exemplo terpenos, em particular goma laca, balsamo de tolu, bálsamo do peru, sandaraca, e resinas de silicone; - ácidos graxos, ácidos carboxüicos Ce a C24 tanto saturados quanto também monoinsaturados e poliinsaturados; - süicas; e misturas destes. [00097] Adicionar plasticizantes ou emulsificantes às gorduras ou ceras antes do revestimento pode se apropriado ser vantajoso para aumentar a flexibilidade da película. [00098] Os revestimentos são aplicados de uma maneira conhecida por si, se apropriado juntos com aditivos, no geral por intermédio de dispositivos para fazer a adição às gotas ou pulverizando-se no produto de valor que foi descarregado em um misturador. Os exemplos destes são lanças, ponta de irrigador, bicos de fluido único ou de fluidos múltiplos, ou dispositivos de gotejamento rotativo ou atomização. No caso mais simples também é possível fazer a adição localmente como um jato concentrado. Altemativamente, o material de revestimento pode primeiro ser carregado em um misturador, de modo a depois disso adicionar o produto de valor. Outra possibilidade é a adição do material de revestimento inicialmente sólido que, como um resultado do aquecimento da parede, ou devido a entrada de energia mecânica, funde e reveste o produto de valor. [00099] A invenção será agora descrita em mais detalhes com referência as figuras anexas. As figuras de 1 a 4 mostram diferentes desenvolvimentos de um processo inventivo para produzir metionina seca cristalina e biomassa seca contendo metionina (“biomassa de metionina”). [000100] Nas figuras de 1 a 4, os números indicados nos quadros correspondem às seguintes etapas de processo: (1) Aquecimento (2) Separação da biomassa (3) Evaporação (4) Cristalização de resfriamento (5) Filtração (6) Lavagem (7) Secagem (8) Secagem de pulverização (9) Lavagem Exemplo 1: a) Produção de metionina por fermentação [000101] Para produzir um caldo de fermentação representativo para a purificação de metionina, uma fermentação de laboratório foi realizada. A cepa de Corynebacteriuiti gluíamkum ATCC13032 (American Type Culture Collection, Manassas, USA) foi cultivada em uma cultura preliminar de 200 ml do meio BHI (Difco/Bceton Diekinson Franklín Lakes, USA). No fermentador Techfors, a cultura preliminar foi então inoculada em um meio de cultura (aproximadamente 14 litros). [000102] O meio de fermentação da cultura principal teve a seguinte composição 2 g/l de KH2P04 2 g/l de K2HPO4 10 g/l de sulfato de amônio 100 g/l de glicose 5 g/l de extrato de levedura 20 mg/1 de canamicina I g/l de anti-espumante KS911 ASM pH 7,0 completado com água desmineralizada até o volume final desejado Solução salina traço 1 rnl/1 do meio 1 ml/1 de solução de protocatecuato (solução de estoque 300 mg/10 ml) Biotina 1 mg/1 Tiamina 1 mg/1 CaCl2 5 mg/1 [000103] Após o fermentador ser inoculado pela cultura preliminar, o fermentador foi mantido ao pH 7 adicionando-se base (NH4OH a 25 %) e fermentado até o açúcar ser consumido. Isto foi indicado por um aumento no valor p02 por um decréscimo em OTR e CTR. b) Trabalho do caldo de fermentação [000104] O procedimento para o trabalho é resumido diagramaticamente na Figura 1. [000105] O caldo de fermentação produzido de acordo com a seção a) age como um material de partida. Em uma temperatura de fermentação entre 30 e 40° C, aproximadamente 50 % da metionina presente está na forma cristalina. O produto de partida tem um teor de água de aproximadamente 86 %, um teor fortificado de metionina de aproximadamente 9 % e um teor de biomassa de aproximadamente 3 %. Outros subprodutos de fermentação e minerais estão presentes no caldo de fermentação em traços (aproximadamente 2,5 % em peso). [000106] 20 kg deste caldo de fermentação são aquecidos a 70° C por 15 minutos. A metionina passa completamente na solução como um resultado. A

uma temperatura constante, a biomassa é então retirada por centrifugação. O sobrenadante (aproximadamente 15 kg) é então concentrado a um teor de metionina de 20 % a 100 °C e pressão atmosférica. O concentrado é então resfriado a 5o C a 5 K/h, como resultado de que a maioria da metionina cristalizou. Os cristais são então retirados por separação do magma de cristal em um filtro a vácuo, lavados com 4 litros de água previamente equilibrada a 5o C e então secos por sopro com nitrogênio a 40° C. Por intermédio deste procedimento, 1,3 kg de metionina seca foi isolada a uma pureza de aproximadamente 90 %. [000107] O resíduo da centrifugação (aproximadamente 5 kg), além da biomassa seca, também compreendem aproximadamente metionina a 6 %.

Por secagem de pulverização, este resíduo pode ser convertido em aproximadamente 0,7 kg de pó seco de fluxo livre levemente amarelado tendo uma umidade residual de 3 %, que, além da biomassa seca e outros subprodutos de fermentação e sais minerais, também compreende metionina (aproximadamente 30 %). [000108] A secagem de pulverização foi realizada em uma secador de pulverização de laboratório usando os seguintes ajustes de instrumento: Temperatura de entrada: 200° C, Temperatura de saída: 80 a 82° C. O gás de aquecimento usado foi 60 M3/h de nitrogênio. O gás do bico foi pulverizado a uma pressão de 2 bar através de um bico de 1,2 mm.

Exemplo 2: [000109] Partindo do mesmo material de partida, o processo é modificado na medida em que a biomassa é retirada por separação por meios de centrifugação e a biomassa que é retirada por separação é então lavada com 5 litros de água (Figura 2). Após a centrifugação, o sobrenadante resultante é adicionado ao sobrenadante da primeira separação de biomassa. O sobrenadante inteiro é concentrado a um teor de metionina de 16 % a 100° C e pressão atmosférica. Resfriando-se o concentrado a 5o C a 5 K/h, a metionina é cristalizada. Os cristais são retirados por separação em um filtro a vácuo, lavados com 4,5 litros de água previamente equilibrada a 5o C e então secados com nitrogênio a 40° C. Por meio deste procedimento, a quantidade de metionina seca é aumentada a aproximadamente 1,5 kg. A pureza dos cristais isolados é novamente de aproximadamente 90 %. [000110] O resíduo da biomassa que é retirado por separação e lavado, é convertido em aproximadamente 0,5 kg do produto seco por secagem de pulverização. [000111] O produto deste modo produzido que, além da biomassa seca e outros subprodutos de fermentação e sais minerais, também compreende metionina (aproximadamente 10 %), foi de fluxo livre.

Exemplo 3: [000112] Partindo do mesmo material de partida, o processo do Exemplo 2 foi adicionalmente modificado na medida em que o líquido mãe e a água de lavagem que são produzidos quando a metionina cristalina é retirada por separação são adicionadas em um próximo lote ao caldo de fermentação contendo metionina (Figura 3). [000113] Com um procedimento de outro modo similar ao Exemplo 2, na fermentação aproximadamente 1,5 kg da metionina seca é obtido a partir da cristalização a uma pureza de aproximadamente 90 % e aproximadamente 0,5 kg do produto é obtido a partir da biomassa secada por pulverização tendo um teor de metionina de aproximadamente 10 %.

Exemplo 4: [000114] Partindo do mesmo material de partida, o processo do Exemplo 2 é adicionalmente modificado na medida em que o líquido mãe e a água de lavagem que são produzidos quando a metionina cristalina é retirada por separação são adicionadas ao fluxo de biomassa antes da secagem por pulverização (Figura 4). [000115] Com um procedimento de outro modo similar ao Exemplo 2, aproximadamente 1,1 kg de biomassa contendo metionina é produzido, que, além da biomassa e outros subprodutos de fermentação e sais minerais, também compreende metionina (aproximadamente 30 %). A quantidade de metionina seca é de 1,5 kg com uma pureza de aproximadamente 90 %.

Exemplo 5: [000116] Uma variante do processo também é concebível em que uma porção do líquido mãe e da água de lavagem, após a cristalização da metionina, são adicionadas ao caldo do fermentador antes da separação da biomassa, e a outra sub-corrente é adicionada à corrente da biomassa antes da secagem de pulverização (combinação dos Exemplos 3 e 4).

Claims (15)

1. Processo para isolar a metionina produzida por fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende a) aquecer (1) um caldo de fermentação contendo biomassa contendo metionina produzida na fermentação de um microorganismo que produz metionina a uma temperatura de cerca de 60 a 120° C que é suficiente para aumentar a solubilidade de metionina na fase líquida, b) obter desta uma fase líquida enriquecida de metionina pela separação (2) da biomassa do caldo de fermentação enriquecido.

2. Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente c) cristalizar (4) a metionina, se apropriado, após concentrar (3) a fase líquida enriquecida.

3. Processo de acordo com a reivindicação l ou 2, caracterizado pelo fato de que a biomassa retirada por separação na etapa b) é g 1) se apropriado lavada (9), o líquido usado para a lavagem sendo se apropriado aquecido, e g3) secado (8).

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, na etapa a), as condições são escolhidas que são suficientes para levar a metionina essencial completamente na solução.

5. Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o aquecimento (1) é preferivelmente realizado a uma temperatura de cerca de 70 a 100 °C.

6. Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que d) a metionina cristalizada é retirada por separação (5), e) a metionina sólida que foi retirada por separação é se apropriado lavada (6) e f) se apropriado secada (7).

7. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que g2) o líquido de lavagem produzido na etapa gl) é combinado com a fase líquida enriquecida de metionina da etapa b).

8. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o líquido mãe produzido na etapa d) é dl) combinada com a fração líquida contendo metionina a partir de lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina; ou d2) adicionado à biomassa retirada por separação do mesmo ou outro lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina antes da secagem (8) de acordo com a etapa g3).

9. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o líquido de lavagem produzido na etapa e) é el) combinado com a fração líquida contendo metionina a partir de outro lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina; ou e2) adicionada à biomassa retirada por separação a partir do mesmo ou outro lote de fermentação usando um microorganismo que produz metionina antes da secagem (8) de acordo com a etapa g3).

10. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a secagem como definido na etapa g3) compreende uma etapa de secagem de pulverização (8).

11. Processo para produzir metionina por fermentação de um microorganismo natural ou recombinante, caracterizado pelo fato de que a metionina formada é isolada pelo processo de acordo com uma das reivindicações precedentes.

12. Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microorganismo que produz metionina é selecionado de bactérias naturais ou recombinantes do gênero Corynebacterium.

13. Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a L-metionina é isolada.

14. Uso do material seco da etapa g3) que é obtenível por uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para produzir ração ou suplemento de ração.

15. Uso da metionina isolada como definida em uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para produzir um gênero alimentício ou ração ou suplemento de comida ou suplemento de ração.