CN101965394A

CN101965394A - 开放连续模式的细胞培养的方法和装置

Info

Publication number: CN101965394A
Application number: CN200980105991.7A
Authority: CN
Inventors: B·库德拉; P-Y·柴斯纳奥; Y·比奥尤安
Original assignee: Eco Solution
Current assignee: Eco Solution
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2029-02-20
Also published as: FR2927906A1; AU2009224507B2; EP2247712A1; JP5620278B2; JP2011512148A; US9018007B2; CN101965394B; IL207653A; IL207653A0; NZ587479A; WO2009112739A1; US20110003390A1; FR2927906B1; AU2009224507A1; CA2714186A1

Abstract

本发明涉及开放连续模式的细胞培养的应用，使得能够选择静止的或在悬浮状态下增殖的细胞变体的方法，培养支持物，以及适于实施该方法的装置。

Description

开放连续模式的细胞培养的方法和装置

本申请涉及实施开放连续模式的细胞培养。

在细胞培养的教导中，传统上区分为不连续培养方法和连续培养方法。

在不连续培养技术中，用在母培养物中事先形成的培养物的一部分接种包含无菌的生长培养基的培养容器。为了能够重现相同的特征，通常将子培养物以给定的稀释度进行接种，随后使它们完成与母培养物的生长周期相似的生长周期。在工业发酵的情况下，在每个所涉及的循环中重现相同的培养条件是有用的，因为这使得能够提前预测培养物到达其终点的时刻，或者达到有利于回收由细胞合成或转化的目的产物的生长阶段的时刻。

在研究领域中，子培养物之间的重现性是获得可靠的和代表性的实验数据所必需的。为了获得该重现性，通常使用合成培养基、相同的培养支持物和标准化的培养条件。因此，在其中主要保持恒定的温度和压力的培养箱中，将培养物置于处于无菌条件下的封闭容器中。

还可以通过使用自动化培养箱来增加该重现性，所述自动化培养箱使得能够例如借助于机器人化臂来同步地接种培养物。该类型的培养箱可以采取在其内部温度和压力受到精细调控的封闭的围壳形式。一旦容器被接种，就将容器密封并在确定的持续时间期间进行培养。

在处于液体培养基中的不连续培养周期之中，已知细胞通过经历不同的相继生长阶段而演变。这些不同的生长阶段相应于不同的生理学状态，其随着在时间过程中培养基组分的演变而变化。通常，只要细胞在培养基中数目少，它们就利用最易同化的含碳底物，并且优先进行使得它们活跃地分裂的生长代谢。当所述底物耗尽时，细胞开始借助于更特异的酶来水解更复杂的底物，并开始激活使得能够同化这些底物的更复杂的代谢途径。从而，细胞进入生存策略之中。通常，细胞合成储备产物、酶和抗生素(其中某些具有工业价值)正是在这一阶段。在培养周期结束时，当培养基耗尽时，许多细胞死亡，而另一些细胞则以生物膜、孢子或者适合于所涉及的细胞类别的任何其他休眠形式进行抵抗。

在不连续模式中，对于给定的培养基和细胞类型，可能的是，由基本的物理化学参数(例如细胞密度，pH，氧、碳或氮的比率)或者任何其他指示细胞生长阶段的参数来确定出在给定的时刻大多数细胞所处的生长阶段。这是因为，如果培养基是均质的，全体细胞的成长就是相对同步的。因而，可能的是，例如将细胞密度值与或多或少快的细胞生长期相联系，尤其是通过使用典型生长曲线。还可能的是，在显微镜下进行直接观察以便由形态学标准来确定生长阶段。

在文献中已描述了这样的实验，所述实验在于非常多次地相继重现相同的不连续模式的培养周期。这些实验显示，可以在非常长的时期内重现细胞而不改变细胞的特征，也不改变细胞的特性(Lenski，R.E.和Travisano，M.(1994)：Dynamics of adaption and diversification：A 10000-generation experimentwith bacterial populations，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6808-6814)。

在连续培养技术中，相反地，培养物享有新鲜培养基或稀释剂(即所述培养基的组分)的有规律的供应，以便持久地维持细胞的生长。通常，培养基的稀释根据预先选择的制度来进行，所述制度可以是定期的或连续的。

将主要的连续培养制度区分为：其中添加新鲜培养基以便将细胞密度维持恒定在平均值附近的模式(恒浊器模式)，以及其中引入新鲜培养基或稀释剂以便将物理化学参数(pH，C/N比例...)维持在确定值附近的模式(恒化器模式)。

自相矛盾地，文献中所描述的在非常长的时期内维持连续培养的尝试并不允许与使用不连续培养技术一样长期地维持细胞系(Dijkuizen，D.E.(1993)：Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution.Meth.Enzymol.224，613-631)。这一状况可以由下述事实来解释：在连续模式中，细胞相当快地达到不同的生理学阶段，并且不是全都处于相同的生长阶段。毫无疑问，新鲜培养基的有规律的供应更加扰乱了细胞的微环境并且不允许获得完全均质的培养基。因此，在一定数目的代结束时，系统地看到所谓的“稀释抗性”静止细胞变体的出现。这些变体表现为生物膜、丝状体或休眠形式(孢子、壳等等...)的形式。它们形成逃避开适应负荷和有时逃避开在培养基中所使用的选择试剂(抗生素或其他)的亚群。所有所描述的连续模式培养装置都有利于静止变体的出现。这些变体占据了设备的内表面并且限制了其效率(Chao，L.和Ramsdell，G.(1985)：The effects of wall populat ions oncoexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures.J.Gen，Microbiol.131，1229-1236)。具有恒定细胞浓度的连续培养物(恒浊器模式)对于稀释抗性变体的侵袭是特别敏感的。因此，在通常允许少于200代的相对较短的时期内才可以对它们进行操纵。

此外，在细胞生长速度升高的条件下进行的连续模式的培养有利于更大数目的自发突变。

这些条件显示为对于形成对稀释不敏感的、以生物膜形式进行成长的粘附变体来说是特别有利的。

鉴于这些各种各样的困难，文献中所公开的连续培养的方法和装置很少用于工业目的甚至科学目的。

然而，很早就已认识到其潜力(Monod，J.(1950)：La technique de laculture continue.Théorie et applications，Ann.Ins t.Pasteur 79，390-410；Novick，A.和Szilard，L.(1950)：description of the chemostat，science 112，715-716)。

然而，现今，连续培养技术有了出乎意料的兴趣恢复，这恰恰是因为，它们使得能够促进具有差异化生长的细胞变体的出现和选择。因此，可以希望获得在悬浮状态下增殖的细胞变体，或者相反地，获得静止的细胞变体。后者对于研究例如生物膜的生物学来说是特别有用的。

该选择的原理是利用由连续模式的培养所促进的自发演变，以便在长期时间内选择优选地在悬浮状态下演变的细胞变体，或者相反地，基本止处于静止形式的细胞变体。

不论它们是否是由于遗传突变而产生的，在悬浮状态下增殖的变体通常倾向于比在培养基中存在的其他细胞更活跃地进行分裂，或者更好地利用培养基的资源。如果在长时期内维持培养物，那么该群体内这些变体的频率随时间而增加，这使得能够更容易地分离出它们。

根据该原则所选择出的在悬浮状态下增殖的变体通常对于来源于同一系的其他细胞而言具有竞争优势。因此，有用的是，例如改善现有的工业发酵方法(例如，以不连续培养模式进行的那些方法)的产率。

国际申请WO 00/34433描述了一种装置，其用于实施使得能够选择在悬浮状态下增殖的变体的连续培养。该装置装配有两个相互之间通过导管相连的培养容器，所述导管使得能够随意地将第一个容器中所包含的培养物转移至第二个容器，反之亦然。该导管装配有随意开启的阀门以便将培养物从一个容器转入到另一个容器中。这两个培养容器中的每一个都通过独立的流体管路来进料，该流体管路使得能够不断地更新每个容器内的培养基和气体。在该相当复杂的流体管路上，联接有第二流体管路，其使得能够借助于灭菌流体来独立地对这两个培养容器中的每一个进行清洁和灭菌。因此，所述装置被设计成能够将液体培养基中的培养物从第一个容器转移到第二个容器中。当所述容器之一包含培养物时，可以对另一个容器进行清洁和灭菌，反之亦然。在灭菌和清洁的过程中，挂在容器壁上的静止变体被去除，而在另一个容器中在悬浮状态下增殖的细胞以连续培养方式进行维持。该装置被设计成以所需次数重复该操作。因此，理论上可能的是，通过避免静止变体的积累而在无限制的持续时间内保持连续培养。

然而，从实践上说，该装置具有几个主要缺点，其中尤其包括下列缺点：

-该装置内容器的清洁和灭菌需要复杂的流体管路。该流体管路应当是完全密封的以便维持适当的无菌水平。然而，在工业规模上重现这样的流体管路是困难的，因为当增加培养容器的体积时，系统运行所需的灭菌和洗涤液体的体积变得极其重要。由于等待去污染，应当贮存这些流体，这造成升高的维护成本。此外，该系统的运行需要动用两个贮槽以用于有效的选择性培养。这些因素限制了可以在相同的技术平台上实施的培养的数目。

-接近处于培养中的细胞是困难的，因为培养物维持在封闭的容器中。因为必须注意流体管路的无菌，更加减少这种接近。因此，对培养物进行监测，特别是实时监测是困难的。

-由于需要借用流体管路和保持培养物的密闭，在培养物中引入不溶的、与所使用的培养基不可混溶的或者与所使用的培养基难以混溶的物质也变得复杂。

-难以调节该装置的不同区室的压力，这使得实际上不可能获得该系统内恒定且均匀的压力。在这些条件下，培养的重现性受到影响。此外，可能突然发生流体管路中的过压，并因此干扰或中断该装置的运行。

-培养物从一个培养容器向另一个培养容器中的转入不允许进行静止模式的培养，因为这必然涉及悬浮细胞的重新接纳和静止变体的去除。

国际申请W02005/083052描述了另一种装置，其用于选择在连续培养中在悬浮状态下增殖的变体。该装置采取挠性管的形式，在该挠性管内部，在位于该管的上游和下游的两个紧固点之间生产培养物。培养基的更新通过提供新鲜培养基来进行，而相同体积的用过的培养基的去除通过在紧固点之间管的移动来进行。紧固点的打开和关闭产生了蠕动效应。在紧固点之间所引入的该管的新节段给予新鲜培养基并参与稀释，而固着在壁上的静止突变体随着在该管的用过的节段范围内该管的移动而被去除。

就培养物的体积和密闭而言，该装置具有与前述的相同的限制。此外，看来难以通过经该管的唯一的壁进行扩散来合适地确保气体交换。

根据本发明的方法和装置是为了补救上面所描述的培养装置的限制。

本发明的目标是使得能够连续培养细胞培养物，以便尤其是施行具有确定的生长阶段的变体的选择。根据本发明，这些培养在置于封闭的围壳中的培养支持物和开放模式的培养容器之中进行。

根据本发明，“培养容器”或“培养槽”是指培养基的容器，其通常用于与培养基直接进行接触。根据本发明，“培养支持物”是指包含培养容器和培养容器的支持物的全体。根据本发明，下面所描述的培养支持物是特定的培养支持物。

无论在该方法中使用的封闭的围壳之内所使用和放置的培养容器是什么样的，下面所描述的连续细胞培养方法的特殊构造使得能够容易接近以连续模式实现的培养物。

下面所描述的根据本发明的培养支持物(置于根据本发明的装置的围壳内部)的特殊构造使得能够容易接近以连续模式实现的培养物。如此设计这些培养支持物，以便其所包含的培养容器能够随意地替换，例如根据本发明的一个优选方面，当培养物聚积了太多数目的静止变体时。但是，在本发明的范围内还可以考虑其他培养支持物和/或培养容器，并且在根据本发明的方法中进行使用。

在封闭的围壳内的操作可以借助于机器人化操作臂来进行，这另外还大大地降低了污染风险。

根据本发明，存在于该装置中的培养支持物和/或培养容器的数目可以通过简单地调整其中放置有它们的封闭的围壳的尺寸来进行调配。因此，接连地或平行地一齐进行数个培养是可能的。

在本申请中所描述的方法和装置以及使用该装置的方法具有许多优点，其中可以提及：

-这样的可能性，即在无菌条件下，在液相中，在均匀的温度和压力下，悬浮培养单细胞或寡细胞生物(需氧的或厌氧的，根据在封闭的围壳内所存在的气体混合物)。特别是，在无搅拌下培养需要恒定照明和悬浮培养模式的光合作用微生物的可能性。

-这样的可能性，即以根据在培养物中直接测量的预先确定的物理化学参数(细胞密度，pH，产物浓度...)而确定的细胞生长阶段，在恒定的体积下，进行连续培养经过数目众多的代(并且在可以非常长的持续时间内)。

-这样的可能性，即测量对于在线检查或监测培养物而言必需的各种参数(pH，p02，底物，产物...)。

-这样的可能性，即对培养物应用产生选择压力和能够被调节的物理化学参数(分子的供给，T℃，pH，...)。

-这样的可能性，即通过将培养物吸移和转移到新的无菌培养容器中和/或替换培养支持物，来以所需频率将处于悬浮生长的生物量(屈从于稀释)与固定化在培养系统的任何壁上的生物量(对稀释不敏感)相分开。

-这样的可能性，即通过排出在培养容器和/或支持物处存在的液相并用新鲜培养基替换该液相，来选择静止变体(而不是在悬浮状态下增殖的变体)，其中例如使固着在支持物上的静止变体重新悬浮。

-这样的可能性，即采用一次性使用或可循环使用的、用于单一用途的培养支持物和/或培养容器和/或吸移材料。

本发明的目标在于连续模式(通常开放的)的细胞培养的方法，其尤其使得能够选择在悬浮状态下增殖的细胞变体或以静止方式的细胞变体。

根据本发明，“连续模式的培养”或“连续培养”是指在液体培养基中进行的培养，其中更新所述培养基的一部分以便持久地将细胞维持于生长状态。优选地，以未事先确定的大的代数目，优选地超过100代，更优选地200代，更加优选地1000代，维持细胞。

培养基或者其组分(稀释剂)的更新可以持久地、有规律地或定期地进行。可以就培养基的组成中所涉及的一种或数种成分，或者就这些成分的混合物的整体，来更新培养基。一般地，更新培养基以使得至少大多数细胞，优选地至少50％的培养细胞，更优选地其中的至少80％维持在悬浮状态。根据本发明，更一般地，培养基为液体培养基。

在下文中，不加区别地使用术语“培养基”和“培养物”。

“细胞”在本文中定义为小尺寸的生物实体，其包含由膜界定的细胞质并具有自主繁殖的能力。细胞可以是真核细胞或原核细胞(动物的或植物的)。将微生物视为细胞。

细菌、酵母和单细胞藻类是用于实施该发明的优选的细胞。

“液体培养基”是指包含营养物质以及任选地其他组分例如选择试剂(抗生素)的液体混合物，在其中细胞可以进行增殖。

“细胞变体”定义为不具有与在相同条件下培养的其母细胞相同的生理学特征的子细胞。

其中变体作为目标的生理学改变可以随着遗传修饰(点突变，遗传物质的丢失或获得)而突然出现，但也可以由于压力或者由于对培养细胞的行为可能具有持久影响的任何其他因素而产生。

根据本发明，不需要预先确定这些生理学改变。相反地，本发明的目标在于促进从自发改变开始的细胞变体的出现，然后从这些变体中选择已获得了这样的特性的那些，所述特性赋予它们以相对于其他培养细胞而言的竞争优势。通常，这些新的特性使得它们能够更快地增殖或者更好地利用培养基。

可以根据两种主要方式来选择根据本发明的细胞变体：

-悬浮变体：选择出在液体培养物中的浮游生物式成长之中更具竞争力的变体。在这种情况下，寻求去除的是静止变体。

-静止变体：选择出这样的变体，其固着、聚集、形成包囊或采取任何其他抵抗稀释的形式，例如以生物膜的形式。在这种情况下，寻求去除的是悬浮成长的变体。

根据本发明的连续细胞培养的方法(其使得能够选择静止的或在悬浮状态下增殖的细胞变体)的特征在于，所述方法包括一个或数个下列步骤，更通常地，下列步骤，通过其：

a)用一种或数种活细胞接种包含在第一培养容器中的液体培养基，所述第一培养容器在封闭的围壳中维持开放；

b)在所述培养基中，将所述细胞带至确定的生长阶段，该确定的生长阶段相应于给定的细胞密度或者相应于在培养基中所测量的物理化学参数；

c)通过在所述培养容器中提供新鲜培养基或至少一种稀释剂，使在步骤b)中所达到的在培养基中的细胞密度或者所述物理化学参数的值维持明显恒定；

d)通过吸移从在c)中所获得的培养物中抽取包含悬浮细胞的一部分培养基，以便维持培养物的体积；

e)将在d)中所获得的培养基的一部分转移到第二培养容器中，所述第二培养容器通常替换第一培养容器；

f)取出，甚至除去具有其所包含的剩余培养物级分的所述第一培养容器；

g)在该第二容器中进行数代培养之后，选择在悬浮状态下增殖的细胞和/或静止的细胞变体。

对于上面的根据本发明的方法或者对于下面所描述的根据本发明的方法，在根据本发明的步骤c)中，不排除，在所述培养容器中提供新鲜培养基或至少一种稀释剂也可以是同时提供新鲜培养基和至少一种稀释剂。通常，关于“至少一种稀释剂”，一种(单一的)稀释剂是优选的，但是也可能使用数种稀释剂而不偏离本发明的范围。

根据本发明，在封闭的围壳中的所有培养容器通常是相同的，但也可能的是，在同一围壳内培养容器是彼此不同的或者属于数种不同的类型。

根据该方法，可能分开地或同时地选择在悬浮状态下增殖的细胞变体以及静止的变体。

当更特别地希望选择在悬浮状态下增殖的变体时，可以更具体地以下面的方式来进行。根据本发明的连续细胞培养的方法(其使得能够选择在悬浮状态下增殖的细胞变体)的特征可以在于，所述方法包括下列步骤：

c)通过在所述培养容器中提供新鲜培养基或至少一种稀释剂，使在步骤b)中所达到的培养物的细胞密度或者所述物理化学参数的值维持明显恒定；

d)通过吸移抽取包含悬浮细胞的一部分培养基，以便维持培养物的体积；

e)将其中细胞处于悬浮状态的在d)中所获得的培养物的一部分转移到替换第一培养容器的第二培养容器中；

f)取出具有其所包含的剩余培养物级分的所述第一培养容器；

g)在该第二容器中进行数代培养之后，选择在悬浮状态下增殖的细胞。

根据该方面，在步骤f)中与容器一起被除去的培养物级分通常由静止变体组成。步骤f)是取出步骤，或者除去步骤，或者取出或除去步骤。

当更特别地希望选择静止变体时，可以以下面的方式来进行：

a)用一种或数种活细胞接种包含在第一培养容器中的液体培养基，在所述第一培养容器中放置有至少一种固体表面，优选地板，所述第一培养容器在封闭的围壳中维持开放；

b)在该经接种的培养基中，将所述细胞带至确定的生长阶段，该确定的生长阶段相应于给定的细胞密度或者相应于在培养物中所测量的物理化学参数；

e)将在其上沉积有在d)中所获得的培养物的一部分的所述固体表面转移到替换第一培养容器的第二培养容器中；

g)在数代培养之后，选择固着在所述固体表面上的静止的细胞变体。

根据本发明的该方面，在步骤f)中与容器一起除去的培养物级分最经常地相应于其中存在有大部分的在悬浮状态下增殖的细胞的液体级分。步骤f)是取出步骤，或者除去步骤，或者取出或除去步骤。

更特别地，本发明的该实施方式涉及固体表面。这些固体表面向静止的细胞变体提供了在选择过程中进行固着的可能性。固体表面可以具有各种不同形式，例如板、珠或颗粒。它们可以由无机的或有机的各种不同材料(塑料的、金属的、玻璃的、矿物的、复合的)构成。塑料材料例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯及其衍生物是优选的。所述表面可以经物理或化学处理。可以将它们悬浮在培养基中，钩挂或放置在培养容器的底部。优选地，固体表面被设计成能够通过培养容器的开口而取出，并置于包含例如新鲜培养基的新的培养容器中。

根据该方法的一个优选实施方案，所述固体表面由经处理以避免细胞粘附的材料构成。这是因为，该方法可以包括这样的步骤，在该步骤中测试各种不同的表面以便确定这些表面中的哪个允许静止变体的更好的或更少的粘附。在这方面，该方法对于选择限制细胞粘附的材料以调制出例如限制污染的外科手术材料如导管可以是特别有用的。相反地，该方法对于选择这样的材料可以是有用的，所述材料有利于在假体或医学植入物的调制中所寻求的细胞定居(生物发生表面)。

有利地，根据本发明的方法使得能够选择出处于预先确定的生长阶段的细胞变体。

这是因为，根据所述方法的步骤b)，优先地在培养基中将细胞带至这样的生长阶段，所述生长阶段由细胞密度或在培养基中可测量的物理化学参数(例如pH、溶解氧的量、有效碳或有效氮等)来确定或者与之相关联。

为了达到该“确定的”生长阶段，可以利用以实验方式或由文献数据开始事先建立的典型生长曲线。通常在以不连续模式进行的培养的基础上建立这些曲线。它们使得能够将细胞密度或培养基的物理化学参数与在给定的时刻大多数培养细胞所处的生理学状态联系起来。

本领域技术人员已知，细胞在培养周期过程中经过不同的生理学状态，这些生理学状态尤其与培养基在某些底物方面的耗尽相关，特别是当不更新培养基时。这些生理学状态通常表示细胞对于其环境的适应。

根据本发明的一个优选方面，可测量的物理化学参数的特定值是固定的，例如细胞密度值，其已知作为确定目的酶分泌的参数。该方法规定，在培养基接种后，细胞进行成长直至达到该固定值。当达到该临界值时，开始进行连续模式的培养，以便例如保持恒定的细胞密度。因此，可能的是，尽可能长时间地将细胞维持在所希望的生理学状态下，这使得能够例如延长其间细胞将会分泌目的产物的时期。

根据本发明，细胞培养通常以开放模式来进行，这有利于进行干预和抽取，其是维持于恒定的所选物理化学参数的值所要求的。这意味着，被选择用于实施该方法的培养容器最经常地具有足够宽和使用方便的开口，优选地朝上或朝向顶部，以便能够有利地引入对于实施通过吸移来抽取培养基或者实施借助于探针的直接测量而言所必需的材料。“顶部”通常是指相对于水平基面(可以是地面)而言的培养容器的最高点。

因此，根据本发明的一个优选实施方案，该方法的特征在于，所述培养容器在其顶部维持开放，并且在其开口周围连续地施加气流，例如无菌空气气流。

在这方面，本方法区别于现有技术中所描述的连续或半连续模式的培养方法，现有技术中所描述的那些方法在封闭的容器中进行，这不允许建立培养基的实时监测。

因此，根据本发明的方法使得能够选择出在预先确定的生长阶段处维持的，甚至同步化的细胞变体。这对于选择例如短暂地合成目的产物(例如酶或抗生素)的细胞变体是特别有用的。因此，细胞变体的选择可以通过重现其中细胞合成目的产物的条件来实现。因此，根据本发明的方法特别适于改善在发酵方法中所使用的工业株，尤其是在半连续模式(即其间培养基以固定的持续时间进行更新的模式)下所使用的那些。

不管是选择悬浮变体还是选择静止变体，本发明的一个特别的方面在于，实施前面所描述的方法以在无限制的持续时间内合成目的产物，其中将细胞维持在对于合成所述产物来说最佳的生长阶段。

通常，在封闭的围壳中实施根据本发明的方法，所述封闭的围壳的尺寸可以根据使用者的需要、培养物的数目和体积而变化。

更特别地，根据本发明的一个实施方案，a)至f)这些不同的步骤在封闭的围壳中进行。

在围壳中，压力和温度可以维持恒定在所希望的值。在培养容器是开放的情况下，培养物通常处于与在围壳中所施加的压力同样的压力下。因此，通常消除了在现有技术的密闭的系统中所遇的局部过压的风险。

所述围壳还使得能够检查培养物的气体环境，这在于厌氧条件下进行培养的情况下是特别有用的。

该培养方法最经常地规定，借助于鼓泡装置(例如以导入到培养容器中的通气杆形式，其通常通过所述容器的开口)在加压下将无菌气体(例如无菌空气)注入到细胞的培养基中。该气体注入使得能够进行培养基的通气、通过气升(通过鼓泡而实现的搅动)而进行的所述培养基的均质化，并且有助于在围壳内部维持一定的气体压力。

根据该方法，所述围壳优选地由无菌气流经过。根据所选择的培养条件，该气流可以由气体(例如氮气)或者气体混合物(例如空气)构成。优选地，在打开的培养容器开口的周围施加无菌气流，以便使污染物远离该区域并因此降低污染的风险。该气流还使得能够平衡围壳内的压力。

对于封闭的围壳的所有容器，无菌气流的流通条件最经常地是相同的。

为了系统的更大效率，通常如此地施加气流(其优选地是层流)：要么从培养容器的上端至下端，要么从培养容器的下端至上端，通常在所述培养容器的外部。下面所描述的根据本发明的装置是其中从培养容器的上端至下端施加(或引导)无菌气流的装置。

更优选地，在培养容器的周围，特别是在所述容器的开口周围加快气流，从而在培养容器的低处部分处产生压降。为了局部地获得该压降，可以将培养容器置于在其底部配备有气流的抽吸和排出工具的朝上开放的密闭箱中。因而，可以在位于培养容器和所述密闭箱的内壁之间的体积中局部地获得压降。

优选地，无菌空气从上至下经过位于密闭箱的内壁和培养容器之间的体积，并且它在培养容器的底部排出到围壳外。如此，污染物在所述体积中被捕获并被带向密闭箱的低处部分。因此，它们不进入培养容器的内部，该培养容器稍微处于过压状态，这尤其是因为在培养基中通过鼓泡来进行气体的供给。

另一个实施方案包括加快从培养容器的下端至上端的无菌气流。

根据本发明的一个优选实施方案，在置于同一个围壳中的数个培养支持物中同时进行数个培养。“数个”是指至少两个。

当在同一个围壳中同时进行不同的培养时，无菌气流对于避免交叉污染来说是特别有用的。

根据上面所描述的方法的一个优选的方面，在进行步骤g)之前，重复上面的步骤a)至f)一次或数次。

根据本发明的一个实施方案，在步骤c)中在培养物中的明显恒定的细胞密度的维持通过下述方式来实现：用新鲜培养基稀释培养物，从而在培养容器中保持恒定的培养基体积。

在选择悬浮变体的情况下，可以通过用无菌移液管进行吸移来实现将包含悬浮细胞的培养基移注到第二培养容器中。吸移操作优选地借助于位于封闭的围壳内的机器人化臂来进行。

通常，将用过的第一培养容器从它可能所属的培养支持物上取下。在所有情况下，借助于闸来将该第一培养容器撤出到封闭的围壳之外。该闸使得能够将围壳内部的压力和无菌状态维持稳定。通常，除去撤出的容器。

可以将处于操作运行中的培养容器置于恒温隔间(alvéole)中，即置于其壁维持在所希望的温度下的开放的围壳中，它们使得能够调节细胞培养物的温度。根据一个优选的方面，密闭箱本身是恒温的并且充当隔间。这是因为，该箱的壁之一可以包含加热工具，从而使得能够调节放置在所述箱的内部体积中的物品的温度。在培养容器周围存在有恒温隔间的情况下，当然应当包含有在培养容器和密闭箱内壁之间的空间，就像在恒温罩和密闭箱之间的空间一样。

优选地，根据本发明的培养支持物和/或培养容器是用于单一用途的，并且与围壳内部的机器人化操作相容。这是因为，本发明优选地规定，该方法的至少某些(即数个)步骤借助于一个或数个使得能够在围壳内部进行移动的自动化臂来进行。优选地，所述围壳在该方法的各个不同步骤过程中保持封闭。

根据本发明，通常以超过10²的代数目，优选地超过10⁴的代数目，更优选地超过10⁶的代数目，和更加优选地超过10¹⁰的代数目，将细胞连续地进行培养，而无需朝向外部环境(直接)打开围壳。

优选地，开放连续模式的根据本发明的培养方法借助于特别适于此的培养装置来实施。

本发明还涉及使得能够施行开放连续模式的细胞培养的培养支持物，其特征在于，所述培养支持物包含：

-至少一个在其顶部开放的培养容器，其适合于包含液体培养基；

-至少一个朝上开放的密闭箱，其中容纳所述培养容器；

-所述培养容器和所述密闭箱之间的空间，其适合于让气流在容器的开口周围，在培养容器和密闭箱内壁之间从上至下地流通；和

-抽出所述气流的工具，其位于密闭箱的下部部分处。

优选地，所述抽出气流的工具是让气流例如空气通过的一个或数个孔。

在一个实施方案中，培养支持物呈现为可拆卸的组件的形式，其中数个所述密闭箱集合在一起，在这些密闭箱中容纳至少一个所述培养容器。

优选地，密闭箱的所述下部部分镶嵌在基座上，所述基座装配有抽出在培养容器和密闭箱壁之间流通的所述气流的补充工具，例如与真空泵相连的管子，或者一个或数个气体分配工具。

根据本发明的培养支持物可以包含至少一个调节所述密闭箱的内部体积的温度的工具，所述调节所述密闭箱的内部体积的温度的工具优选地是包括在所述密闭箱的至少一个壁中的加热电阻。

根据本发明的培养支持物包含至少一个将空气注入到包含在所述容器中的培养基之中的工具，例如一个或数个通气杆。

根据本发明的培养支持物包含至少一个光学测量存在于培养容器所包含的培养基中的细胞的密度的工具。

根据本发明的培养支持物可以包含至少一个为自养模式的微生物培养产生光的工具，其位于所述培养容器和所述密闭箱的内壁之间的空间中，或者包括在所述密闭箱的壁中。

最后，本发明涉及使得能够进行开放模式的连续细胞生长的细胞培养装置，其特征在于，所述装置包含：

-围壳；

-产生经过所述围壳的无菌气流的工具；

-一个或数个如前面所描述的根据本发明的培养支持物，其安放在所述围壳中，并且使得能够施行开放模式的细胞培养。

所述细胞培养装置可以包含至少一个更新培养基的工具，其置于所述围壳内部。

所述细胞培养装置可以包含至少一个适于替换包含在培养支持物中的培养容器的培养容器。

所述细胞培养装置的特征可以在于：将该产生无菌气流的工具置于围壳的上部部分处，以便所述无菌气流从培养支持物的上端流向下端。

所述细胞培养装置还可以包含至少一个在所述培养容器底部的抽出无菌气流的工具，所述抽出无菌气流的工具优选地在位于培养支持物的培养容器和密闭箱之间的空间中产生压降。所述抽出工具可以与至少一个适于抽吸环绕在培养容器开口周围的空气的空气抽吸工具相联合。

所述细胞培养装置的特征可以在于：该更新培养基的工具包含将培养容器的一部分内容物移注至排出区的工具。

所述细胞培养装置的特征可以在于：该更新培养基的工具包含将新鲜培养基从位于围壳内部的储库移注至培养容器的工具。

该移注工具优选地包含移液管和抽吸在所述移液管中的新鲜或用过的培养基的工具。

所述细胞培养装置还可以包含至少一个向围壳外部输出该移注工具和/或至少一个培养容器的工具，所述输出工具优选地包含闸。

所述细胞培养装置的特征可以在于：它包含至少一个将空气注入到培养物中的工具。

所述细胞培养装置的特征可以在于：它包含至少一个适于在围壳内部施行移动的自动化臂。

所述细胞培养装置的特征可以在于：该围壳是封闭的。

所述细胞培养装置可以包含数个安放在所述围壳中的培养支持物，以便平行地施行数个开放模式的细胞培养。

所述细胞培养装置的特征可以在于：它使得能够实施根据本发明的方法。

通过阅读下列附图，将会更好地理解本发明，其中：

图1示意性地显示了第一种根据本发明的培养支持物，以透视形式；

图2示意性地显示了第二种根据本发明的培养支持物，以透视形式；

图3示意性地显示了用于如图2中所显示的培养支持物的包含隔间的可拆卸的组件，以相关于图4而言的III-III切面形式；

图4显示了图3的包含隔间的可拆卸的组件，以俯视形式；

图5示意性地和部分地显示了根据本发明的细胞培养装置，以透视形式；

图6至10各自示意性地显示了在封闭的围壳(未显示)中根据本发明的连续细胞培养方法的运作规划，其使用任一种培养支持物，每个图相应于该运作的特定步骤，

-图7显示了细胞培养的初始步骤；

-图8显示了培养容器的更换步骤；和

-图9显示了培养基的抽取步骤；和

-图10显示了用于分析的微量样品的抽取步骤。

图1示意性地显示了第一种根据本发明的培养支持物。其朝上开放，适合于包含液体培养基。

支持物1包含容纳于朝上开放的密闭箱2中的培养容器6，在所述密闭箱中容纳所述培养容器。将培养容器置于恒温罩3中，该恒温罩根据本发明是任选的。

可以给培养基(以装满形式显示，点绘，在图1中)供给气体，例如空气，最经常地在加压下，通过在此由通气杆4(以例如鼓泡棒(canne de bullage)的形式)构成的鼓泡装置。借助于臂5而得到支承的该杆4，通过培养容器6的开口而垂直伸入到其中存在有培养基的培养容器6之中。臂5可以进行垂直运动以将杆4的下部末端定位在培养容器6中的所希望的地方。

图1中指向下端的空心箭头象征着无菌气流，例如无菌空气，其从上至下地流通并且穿过位于密闭箱2的内壁和恒温罩3之间的空间或体积7。无菌气流通过数个排出孔8而排出。排出孔8代表了抽出气流的工具，并且位于密闭箱2的下部部分处，优选地在底部。

培养容器6可以是小玻璃瓶(fiole)、细颈瓶(bouteille)或锥形瓶(Erlen)型的任何类型的朝上开放的容器。优选的是，培养容器6可以自定位并且容易地从密闭箱2中撤出。如在图1中所显示的，选择在高度上不超出密闭箱2的壁的培养容器6是有利的。

设计了其流通可以被组织成从培养支持物1的上端至下端的无菌气流，以便在由密闭箱2的内壁所界定的培养容器6的开口周围产生无菌屏障。

可以通过在密闭箱2的下部部分处产生压降来加快该气流，例如通过将排出孔8与抽吸工具相连。

优选地，密闭箱2的下部部分被设计成镶嵌在基座上，所述基座装配有抽出所述无菌气流的补充工具，例如与真空泵相连的管子。在需要的情况下，所述基座可以装配有一个或数个对于实施连续模式的培养方法来说有用的收集或分配气流的工具。

图2示意性地显示了第二种根据本发明的培养支持物1′，以透视形式。

培养支持物1′包含存在于密闭箱2′(在此以透明形式显示)中的培养容器6′。培养容器6′和密闭箱2′两者都朝上开放。培养容器6′能够自定位并且容易地从密闭箱2′中撤出，因为它在高度上不超出密闭箱2′的壁。培养容器6′包含培养基11。

在培养容器6′和密闭箱2′的内壁之间确定出了空间7′，所述体积7′能够由气流从下至上地穿过。在此没有显示排出所述无菌气流的工具，但它们是数个位于密闭箱2′的底部中的孔。

将两个光学测量存在于培养基中的细胞的密度的工具9与透明的培养容器6′彼此布置在一起，并且在空间7′中。

在培养容器6′的内部，存在有垂直的内壁10。它使得通过通气杆4以“气升”方式注入到培养基11中的气体能够更好地进行流通。

图3和4显示了根据本发明的优选的培养支持物1″，其采取可拆卸的组件12的形式，所述可拆卸的组件包含六个隔间或区室，24、25、26、27、28和29，其中插入有密闭箱16。图4以俯视形式显示了组件12，和图3以III-III横切面(参见图4)形式显示了组件12。

组件12包含四个自身包含壁10的培养容器6′，每个所述培养容器容纳于组件12的隔间25、26、28和29中。可以将每个培养容器6′手工放置在隔间中。组件12优选地由一整块材料制成。实际上，组件12呈现为这样的形式，就好像数个在图2中所显示的并在前面所描述的培养支持物1′处于通过其密闭箱2′的外壁而连结在一起的状态。隔间在其周围装配有壁，从而形成密闭箱16。

气体分配工具，即包含在通气构件13中的收集器和过滤器，通过各通气杆4进行延伸，以达到每个培养容器6′。从上至下经过培养支持物1″的无菌气流由空心箭头来象征，而向培养基进行供给的气体的路径由实心箭头和气泡来表示。当将组件12置于封闭的围壳中时，无菌气流的该流通(优选地，持久的)确保了每个培养容器6′的密闭。该培养组件12可以通过在其整体中所整合入的加热电阻的存在来保持恒温。

通过排出工具14在每个包含培养容器6′的隔间的底部排出无菌气流，所述排出工具采取用于与空气抽吸工具例如真空泵相连接的管子的形式。

在其低处中心部分处，组件12优选地包含收集和分配通气用气体的主管(rampe)。这些气体通过可拆卸的弯管4而被送往每个培养容器6′的内部，所述可拆卸的弯管在末端处终止于伸入到培养容器6′中的通气杆4，并且可以在安装培养容器6′之后，在连接器位置处手工安置在分配主管上。这些弯管于低处位置处将气体带入到每个培养容器6′中，以便造成“气升”，其用于确保培养基中氧、二氧化碳或其他气体的供应以及确保培养基的均匀混合。

发光侧板或照明板15在侧面布置在两个隔间25和26中，以使得能够培养光合作用微生物。优选地，板15是可拆卸的和是使得能够培养光合作用微生物的产生光的板，并且位于培养容器6′和密闭箱16的内壁之间的空间中，或者包括在密闭箱16的壁中。优选地，借助于发光二极管(LED)来产生光，其波长根据所涉及的微生物的光合色素来进行选择。

根据所使用的LED的类型，发射出的光可以相应于白光或各种不同波长的光。此外，根据LED的运行模式，可实现频闪照明制度。这种照明可能性使得能够培养诸如原核或真核微观藻类的光合作用微生物，更特别地以自养模式，尤其是通过将照明与在引入到培养物中的通气和混合用气体之中使用CO₂相联合。

“自养模式”是指这样的培养，其中细胞通过进行无机物质(例如以二氧化碳的形式)的还原以及通过吸取培养基中的无机盐而产生有机物质。对于该合成来说所必需的能量来自光，正如在例如光合作用的情况下一样。

因此，根据本发明的培养支持物使得能够在需要的情况下，在根据本发明的方法的每个步骤中连续地对细胞进行照明。

根据一个非代表性的变化形式，产生光的工具还可以采取板的形式，所述板形成密闭箱的壁的全部或部分。

根据本发明的一个特别的方面，产生光的工具是具有下列功能的UV灯或二极管：要么通过在使用之前或之后进行照射来使密闭箱的内部体积去污染，要么在选择方法过程中在培养细胞上产生突变。

将光学测量工具9(其为测量培养基的浊度的叉形物)成对插入到隔间24、25、26、27、28和29中每一个隔间的低处部分，以便监测存在于这些隔间中的培养基的细胞密度的演变。

以前面所描述的组件12形式的培养支持物具有有利于实施根据本发明的连续培养方法的益处。这是因为，在开始操作运行之前，可以在无菌的围壳中准备和放置数个培养容器6′。在围壳内部分配主管与气体供应系统的衔接通过在将组件安放在根据本发明的培养装置的特殊底座上时进行快速连接来实现，所述培养装置此外可以容纳数个这些组件。同样地，规定，所必需的电连接(加热，检测器，照明)在将组件放置到底座上时通过简单的接通来进行。这样的组件有利于操作运行前的装卸，并且后来使得能够减少在实施该培养方法过程中在封闭的围壳内部进行的自动化移动。因而，该装置可以在更长的持续时间内自动运转。

根据本发明的一个优选实施方案，所述培养装置是自动装置，其可以包含许多具有六个槽的可拆卸的组件12(可以从1至100个进行变动)。每个组件12可以进行手工包装，灭菌，然后引入到在为此准备的底座上的自动装置中。当安装组件12时，选择性培养方法可以如此而开始，即填充培养容器，对其进行接种，然后根据已经描述的方法以恒定体积进行连续培养。因此，可能的是，平行地进行大量的连续培养，其中每个组件12可以是一个独立实验的场所。

当培养物需要转移(例如因为静止变体的积累变得太多)时，将组件12的第一培养容器的培养物体积吸移和转移至同一个组件的第二培养容器。当组件12的所有培养容器都已被使用时，可以将培养物转移到可用的另一个组件12的培养容器中，而完全使用过的组件可以用新的经包装的组件进行替换，所述新的组件装配有六个新的无菌培养容器。

此外，使用装配有以组件的形式的培养支持物的装置还使得能够简化移液、稀释和转移的机器人化操作。

根据本发明的装置可以在10个、20个或至少40个组件，即60个、120个或至少240个槽中，同时进行单一微生物物种或给定的微生物聚生体的选择性培养，以达到可达1200、2400或至少4800mL的总培养体积。如此，同样多地增加了获得给定的突变体的概率。该增加对于具有复杂基因组的细胞或者对于缓慢生长的物种的细胞而言是特别令人感兴趣的。

图5显示了根据本发明的连续培养装置100。围壳17(其当装置100处于操作运行中时是封闭的)是建议的，但没有完全显示。

装置100包含数个如图1中所显示的培养支持物1、围壳17和产生经过所述围壳17的无菌气流的工具23。培养支持物1在围壳17中平行地运转。围壳17由能够在该空间的三维尺度中移动、安装在轨道上的机器人化臂19走过。该机器人化臂19配备有使得能够更新培养基的转移移液管20、稀释移液管21和操作钳22。

围壳17的大小并不是限定的，这使得能够在置于同一个围壳17中的相同或不同的数个培养支持物1中同时进行数个培养。

穿过围壳17的无菌气流用从工具23而来的空心箭头来表示，所述工具23位于围壳17的高处，以使得所述无菌气流从培养支持物1的上端流向下端。经过围壳17的无菌气流通过位于培养支持物1的底部处的孔8而排出到围壳17外。

优选地，设计了抽出气流的工具，以便在位于同一个培养支持物18的培养容器1和密闭箱2之间的空间中产生负压。通常，将其与适于抽吸环绕在培养容器开口周围的气流的气流抽吸工具(例如真空泵(未显示)，其例如位于围壳17的底之下)相联合。

图6至10各自示意性地显示了在封闭的围壳(未显示)中根据本发明的连续细胞培养方法的运作规划，其使用任一种培养支持物，每个图相应于阐明了该运作的特定步骤的功能示意图，

-图7显示了细胞培养的初始步骤；

-图8显示了培养容器的更换步骤；和

-图9显示了培养基的抽取步骤；和

-图10显示了用于分析的微量样品的抽取步骤。

图6至10在下面的实施例中进行描述。

下面的实施例的目的在于描述根据本发明的自动培养装置(称为“BED”)的运转。所述装置是根据本发明的优选的装置，其对于在本申请中所要求保护的发明不产生任何限制。

实施例

在封闭的围壳(未显示)中根据本发明的连续细胞培养方法的运作规划使用任一种培养支持物，更确切地说，培养支持物类型，每个图相应于阐明了根据本发明的连续培养装置的运作的特定步骤的功能示意图，所述根据本发明的连续培养装置以这样的形式，其包含：

-四个培养支持物1₁、1₂、1₃和1₄，每个培养支持物包含单个密闭箱2₁、2₂、2₃和2₄以及单个培养容器6′₁、6′₂、6′₃和6′₄。每个培养支持物配备有用于与无菌通气杆(或鼓泡棒)相连接的鼓泡用臂5₁、5₂、5₃和5₄，，通气杆(未显示)的贮存库4₁、4₂、4₃和4₄，以及弃出培养容器的闸18₁、18₂、18₃和18₄。可能的是，在一个变化形式中考虑，图注1₁、1₂、1₃和1₄代表可拆卸的组件12类型的培养组件，其包含数个(例如2个、4个、6个...)培养容器。

-无菌培养容器的储库(或贮存库)SR。

-转移移液管的储库(或贮存库)SPT。

-用于添加新鲜培养基的稀释移液管的储库(或贮存库)SPD。

-无菌的稀释剂或培养基的贮存库SMCD。

-用于向围壳外输出样品的取样闸SE。

-弃出移液管和被污染的材料的闸SEPM。

-分析站的闸SA，其使得能够引入材料或试剂或者其他以便进行测量。

-在长度方向上走过围壳的多功能铰接臂，其中该臂在三维尺度上移动的区域由区域D₁₉来标明。

转移移液管通常具有接近培养容器容积的容积，即最经常地20至30mL，并且用于将大部分培养基从一个培养容器转运到另一个培养容器中。稀释移液管则通常具有小得多的容积，例如最经常地2至3mL。

箭头和T_xy类型(其中x为图的编号，和y为关于所述图的路径的编号)的图注指明了在培养开始时(图6)、在稀释的操作过程中(图7)、在更换培养容器的操作过程中(图8)、在抽取培养物样品的操作过程中(图9)以及在抽取用于在封闭的围壳内进行分析的培养物样品的操作过程中(图10)铰接臂的行程。

装置BED的运转

基础运转周期

1°)培养的初始步骤

操作者在该装置的围壳内将下列装载器(chargeur)/承载器(portoir)安装在各自的贮存区中：

-无菌的培养槽(或培养容器)，

-无菌的转移移液管，

-无菌的稀释移液管，

-无菌的鼓泡棒或通气杆，其用于与鼓泡用臂5₁、5₂、5₃和5₄相连接。

操作者在该细胞培养装置中将包含不同稀释剂的封闭的无菌储器安装在各自的贮存区中。

操作者打开包含不同稀释剂的储器。

操作者在自动机器中在专用位置处安装包含纯培养物n°1的封闭的无菌培养容器。

操作者打开所述培养容器。

多功能自动化铰接臂在储器SR中抓住在其承载器上的槽(图6，路径1；T₆₁)，并将它转运至专用于该培养的培养支持物(图6，路径2；T₆₂)。在图6中所显示的情况下，第一个培养支持物1₁在培养槽或容器6′₁中用纯培养物n°1来进行填充，随后相继地，如下面所说明的，从一个培养支持物开始，通过借助于转移移液管进行转移，其他三个培养支持物1₂、1₃和1₄在相应的培养槽或容器6′₂、6′₃和6′₄中用培养基来进行填充。

多功能自动化铰接臂刺穿培养容器(无菌的槽)的保护膜。

多功能自动化铰接臂在储器SPT中抽取在其承载器上的转移移液管(图6，路径3；T₆₃)。

配备有转移移液管的多功能自动化铰接臂抽取在包含培养物的管中的培养物(图6，路径4；T₆₄)。

多功能自动化铰接臂将培养物转运至相应的支持物并在培养容器中清空转移移液管(图6，路径5；T₆₅)。

鼓泡用自动化铰接臂抽取无菌鼓泡棒，随后将该无菌鼓泡棒安放在培养容器中(图6，路径6；T₆₆)。鼓泡用自动化铰接臂开启气体供给。

2°)连续制度的培养

自动装置收到由位于培养支持物中的检测器给出的起动信号。所述检测器是经程序化的，以便监测物理化学参数并且当达到该参数的临界值时发出信号。

从而，自动化铰接臂在相应的储器SPD中抽取无菌的稀释移液管(图7，路径1；T₇₁)。

自动化铰接臂抽取确定体积的稀释剂n°1，随后抽取无菌空气气泡以在转运过程中维持无菌状态(图7，路径2；T₇₂)。

自动化铰接臂重复该操作n次，以抽取所希望的体积的n个稀释剂。

多功能自动化铰接臂将稀释移液管转运至相应的支持物并在培养槽中清空稀释移液管(图7，路径3；T₇₃)。

多功能自动化铰接臂安放下稀释移液管以便排出多余的体积。

多功能自动化铰接臂排出多余的体积，2种排出模式是可能的：

a)要么，多功能自动化铰接臂将稀释移液管安放在培养物中并抽取确定体积的培养物，随后吸进空气气泡，或者

b)要么，多功能自动化铰接臂将稀释移液管安放于在培养槽中的确定高度处(相应于所希望的培养体积)并吸进所有过量的培养体积，随后吸进空气气泡。

多功能自动化铰接臂将包含多余培养物的稀释移液管转运至起着最近的液体排出站/垃圾箱的作用(以维持无菌状态)的弃出闸上面，并且在所述弃出闸18₁、18₂、18₃或18₄中清空稀释移液管的内容物(图7，路径4；T₇₄)。

同样地，多功能自动化铰接臂将空的稀释移液管转运至起着最近的固体排出站/垃圾箱的作用(以维持无菌状态)的弃出闸上面，并且在所述弃出闸18₁、18₂、18₃或18₄中弃去稀释移液管(图7，路径4；T₇₄)。

3°)槽的更换

要么在确定的时间周期结束时，要么在检测出生物膜后，自动装置检测到更换培养容器的起动信号。

多功能自动化铰接臂在储器SR中抓住在其承载器上的槽，并将它转运至专用于该培养的暂时位置(图8，路径1和2；T₈₁和T₈₂)。

自动化铰接臂在储器SPT中抽取无菌的转移移液管(图8，路径3；T₈₃)。

鼓泡用自动化铰接臂关闭气体供给，并从培养物中拿出用过的鼓泡棒。

鼓泡用自动化铰接臂在起着最近的固体排出站/垃圾箱的作用(以维持无菌状态)的弃出闸中弃去用过的鼓泡棒，并且在所述弃出闸18₁、18₂、18₃或18₄中弃去用过的棒。

自动化铰接臂抽取培养物。

多功能自动化铰接臂将包含培养物的转移移液管转运至在专用于该培养的暂时位置中的新的槽，并且在该新的培养槽中清空转移移液管(图8，路径4；T₈₄)。

多功能自动化铰接臂将空的转移移液管转运至起着最近的固体排出站/垃圾箱的作用(以维持无菌状态)的弃出闸上面，并且在所述弃出闸18₁、18₂、18₃或18₄中弃去转移移液管(图7，路径4；T₇₄)(图8，路径5；T₈₅)。

鼓泡用自动化铰接臂抽取无菌的鼓泡棒(图8，路径6；T₈₆)。

鼓泡用自动化铰接臂将该无菌的鼓泡棒安放在培养槽中。

鼓泡用自动化铰接臂开启气体供给。

培养容器经弃出闸而被弃去(图8，路径7；T₈₇)。

4°)悬浮成长的微生物的选择

在如图1中所显示的培养支持物中，在培养容器(一次性使用的塑料槽)中进行培养。

当需要时(形成了生物膜)，该一次性使用的培养容器可以有规律地用新的无菌容器来替换，通过如上面所描述的机器人化臂的动作。

培养装置的全视图例如在图5中给出。

当更换槽时，所述臂确保在培养槽交换期间将培养基泵送到无菌移液管中，随后将该培养基重新置于新的无菌槽中(容器交换功能)。

此外，该机器人化臂还确保吸移一部分培养物和用相同体积的新鲜培养基来替换所抽取的体积的功能(稀释功能)，稀释频率可以由实验者来确定(恒化器)或者通过培养物的细胞密度来指导(恒浊器)。

任何牵涉与培养物接触的有形物品(通气管，转移移液管，稀释用锥形头)在每次使用后都用新的无菌物品进行替换。

将容器(＝培养槽)置于使得能够保持在受控温度下的培养的恒温金属罩中。该罩配备有一个或数个叉形物(不同波长的发射器/接收器)，其使得能够测量槽中的细胞密度(可见的，IR)，以及某些吸收性分子的浓度。

培养槽和恒温罩位于密闭箱中，在所述密闭箱内部，无菌气流(例如无菌空气)在该罩和该槽周围持久地流过，以便实现所述槽的恒定的无菌密闭(参见图1)。

如此，只有那些以悬浮模式成长(并因此经历稀释)的微生物在选择性条件下在长期时间内维持生长。

由于使用了一次性使用的用于单一用途的槽和附属配件并且没有复杂的流体管路，该系统不需要复杂和长时间的灭菌操作。

该系统的所有布置好的槽都是有功能的，并且确保选择性培养物的成长。

此外，该系统使得能够引导培养物，要么以具有蒸发补偿的恒定的且具恒定体积的稀释程度，要么以没有蒸发补偿的可变的稀释程度，要么以具有蒸发补偿的可变的稀释程度。

通过机器人化臂的动作来精细控制液相的分子供应的可能性使得能够设想对于众多数目的组成成分而言精确调节对培养物所施加的选择压力，而无需增加流体管路的专用支管。

此外，添加难以操作的产品(例如乙醛，其是挥发性的和反应性的)也是可能的，而不必须通过复杂的流体管路来运输该产品。

此外，该系统还使得能够设想添加固体颗粒例如固定化在藻酸盐珠上的细胞、与水不可混溶的液体以及各种不可能在复杂的流体管路中在水相中实际运送的添加物。

此外，小体积的等分部分的抽取可以在培养的任何时候以无菌方式通过机器人化臂来进行，以便转移至系统BED外部的任何类型的分析设备(HPLC，PCR，ELISA，MS...)，并且在那里可以对结果进行整合以检查当前的培养。

此外，该系统还使得能够根据微生物培养的需求的需要而使用各种不同形式的培养槽。

5°)以生物膜形式成长的微生物的选择

前面所描述的装置使得能够通过机器人化臂在培养槽中添加各种不同材料的板，以便选择以生物膜形式成长的细胞。

可以保留固着在这些板上的培养物级分，而取出包含悬浮细胞的培养基并用新鲜培养基进行替换。同样地，覆盖有生物膜的板可以借助于机器人化臂而移动到新的无菌培养容器中。

以此方式，可能的是，选择出这样的细胞变体，其发展出固着在支持物上或者聚集从而形成诸如生物膜的结构的能力。

任选的补充动作

1°)添加试剂

在该情形下可以考虑任何类型的试剂，例如化学产品、生物化学产品(蛋白质、DNA等)、生物产品(细胞悬浮液)等等。

自动机器检测到添加试剂的起动信号。

自动化铰接臂抽取无菌试剂的微量移液管。

自动化铰接臂将该无菌试剂的微量移液管转运至包含所希望的试剂的储器。

自动化铰接臂抽取确定的相对于总培养体积而言可忽略的体积的试剂(例如，25μL的试剂)，随后抽取无菌空气气泡。

多功能自动化铰接臂将包含试剂的微量移液管转运至相应的培育箱，并在培养槽中清空稀释移液管。

多功能自动化铰接臂通过在微量移液管中的吸进和推出循环来漂洗微量移液管的壁。

多功能自动化铰接臂将试剂的微量移液管转运至固体成分排出站/垃圾箱上面，并且在所述固体成分排出站中弃去试剂的微量移液管。

2°)常规的样品抽取

操作者在取样站或等分取样站SE中安装无菌管。

操作者拔出在取样站或等分取样站SE中的该无菌管的塞子。

自动机器检测到稀释的起动信号和抽取的起动信号。

以差不多的步骤，自动机器进行如在前面部分中于第2°)节中所描述的稀释：多功能自动化铰接臂将包含多余培养物的稀释移液管转运至站SE上面，并且在开放的无菌管中卸下稀释移液管的内容物(图9，路径3；T₉₄)。

操作者重新塞住在站SE中的该无菌管。

操作者重新关闭该抽取管，并通过取样闸SE来回收培养基。

3°)紧急的样品抽取

操作者在取样站SE中安装无菌管。

操作者拔出在取样站SE中的该无菌管的塞子。

自动机器检测到抽取的起动信号。

自动化铰接臂在储器SPD中抽取无菌的稀释移液管(图9，路径1；T₉₁)。

自动化铰接臂将该无菌的稀释移液管转运至所涉及的培养物(图9，路径2；T₉₂)。

自动化铰接臂抽取确定体积(例如2mL)的培养基，随后抽取空气气泡。

多功能自动化铰接臂将包含培养物样品的稀释移液管转运至取样站上面，并且在开放的无菌管中卸下稀释移液管的内容物(图9，路径3；T₉₃)。

多功能自动化铰接臂将用过的稀释移液管转运至固体成分排出站/垃圾箱上面，并且在所述固体成分排出站中弃去稀释移液管(图9，路径4；T₉₄)。

操作者重新塞住在取样站中的无菌管。

操作者重新关闭该抽取管，并回收培养物的等分试样。

4°)用于分析的微量样品的抽取

自动机器检测到抽取用于分析的微量样品的起动信号。

自动化铰接臂在储器SEPD中抽取无菌的微量移液管(图10，路径1；T₁₀₁)。

自动化铰接臂将该无菌的微量移液管转运至所涉及的培养物(图10，路径2；T₁₀₂)。

自动化铰接臂抽取确定的微量体积(例如10μL)的培养物，随后抽取空气气泡。

多功能自动化铰接臂将包含培养物样品的微量移液管转运至分析站SE上面，并且在分析台中在属于该样品的位置处卸下微量移液管的内容物(图10，路径3；T₁₀₃)。

多功能自动化铰接臂将用过的微量移液管转运至弃出移液管和被污染的材料的闸SEPM(其起着固体成分排出站/垃圾箱的作用)上面，并且在所述闸SEPM中弃去微量移液管(图10，路径4；T₁₀₄)。

Claims

1.连续细胞培养的方法，其使得能够选择静止的或在悬浮状态下增殖的细胞变体，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

c)通过在所述培养容器中提供新鲜培养基或稀释剂，使在步骤b)中所达到的在培养基中的细胞密度或者所述物理化学参数的值维持明显恒定；

e)将在d)中所获得的培养基的一部分转移到第二培养容器中；

2.连续细胞培养的方法，其使得能够选择在悬浮状态下增殖的细胞变体，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

3.连续细胞培养的方法，其使得能够选择静止的细胞变体，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

b)在该经接种的培养基中，将所述细胞带至确定的生长阶段，该确定的生长阶段相应于给定的细胞密度或者相应于在培养基中所测量的物理化学参数；

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述固体表面由经处理以避免细胞粘附的材料构成。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于，所述培养容器在其顶部维持开放，并且在其开口周围连续地施加气流，例如无菌空气气流。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于，从培养容器的上端至下端施加无菌气流。

7.根据前一项权利要求的方法，其特征在于，通过在培养容器周围产生压降来维持从上至下的无菌气流。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于，在所述培养容器的底部将无菌气流排出到围壳外。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于，至少a)至f)这些不同的步骤在封闭的围壳中进行。

10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其特征在于，在进行步骤g)之前，重复步骤a)至f)一次或数次。

11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其特征在于，在步骤c)中在培养物中的明显恒定的细胞密度的维持通过下述方式来实现：用新鲜培养基稀释培养物，从而在培养容器中保持恒定的培养基体积。

12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其特征在于，通过用无菌移液管进行吸移来实现将包含悬浮细胞的培养基移注到第二培养容器中。

13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其特征在于，借助于闸来将用过的第一培养容器撤出到封闭的围壳之外。

14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其特征在于，将处于操作运行中的培养容器置于使得能够调节细胞培养物的温度的恒温隔间中。

15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其特征在于，在置于同一个围壳中的数个培养支持物中同时进行数个培养。

16.根据权利要求1至15中任一项的方法，其特征在于，有规则地进行培养物的取样。

17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其特征在于，所述培养支持物或所述培养容器用于单一用途。

18.根据权利要求1至17中任一项的方法，其特征在于，借助于导入到培养容器中的鼓泡装置向培养中的细胞注入气体。

19.根据权利要求1至18中任一项的方法，其特征在于，该方法的数个步骤借助于一个或数个使得能够在围壳内部进行移动的自动化臂来进行。

20.根据权利要求1至19中任一项的方法，其特征在于，以超过10²的代数目，优选地超过10⁴的代数目，更优选地超过10⁶的代数目，和更加优选地超过10¹⁰的代数目，将细胞连续地进行培养，而无需朝向外部环境打开围壳。

21.根据权利要求1至20中任一项的方法，其特征在于，将所述方法应用于自养微生物的培养，并且所述培养在所述方法的不同步骤期间得到照明。

22.使得能够施行开放连续模式的细胞培养的培养支持物(18)，其特征在于，所述培养支持物包含：

-至少一个在其顶部(6)开放的培养容器(1)，其适合于包含液体培养基；

-至少一个朝上开放的密闭箱(2)，其中容纳所述培养容器(1)；

-所述培养容器(1)和所述密闭箱(2)之间的空间(7)，其适合于让气流在容器的开口周围，在培养容器(1)和密闭箱(2)内壁之间从上至下地流通；和

-抽出所述气流的工具(8)，其位于密闭箱(2)的下部部分处。

23.根据权利要求22的培养支持物，其特征在于，所述抽出气流的工具是让气流通过的一个或数个孔(8)。

24.根据权利要求22或23的培养支持物，其特征在于，所述培养支持物呈现为可拆卸的组件(12)的形式，其中数个所述密闭箱集合在一起，在这些密闭箱中容纳至少一个所述培养容器(1)。

25.根据权利要求22至24之一的培养支持物，其特征在于，密闭箱(2)的所述下部部分镶嵌在基座上，所述基座装配有抽出在培养容器(1)和密闭箱(2)壁之间流通的所述气流的补充工具(14)，例如与真空泵相连的管子，或者一个或数个气体分配工具。

26.根据权利要求22至25之一的培养支持物，其特征在于，所述培养支持物还包含：

-至少一个调节所述密闭箱(2)的内部体积的温度的工具(3)。

27.根据权利要求26的支持物，其特征在于，所述调节所述密闭箱的内部体积(7)的温度的工具是包括在所述密闭箱(2)的至少一个壁中的加热电阻。

28.根据权利要求22至27中任一项的培养支持物，其特征在于，所述培养支持物还包含：

-至少一个将空气注入到包含在所述容器中的培养基之中的工具，例如一个或数个通气杆(4)。

29.根据权利要求22至28中任一项的培养支持物，其特征在于，所述培养支持物还包含：

-至少一个光学测量存在于培养容器(1)所包含的培养基中的细胞的密度的工具(9)。

30.根据权利要求22至29中任一项的培养支持物，其特征在于，所述培养支持物还包含：

-至少一个为自养模式的微生物培养产生光的工具(15)，其位于所述培养容器和所述密闭箱(2)的内壁之间的空间中，或者包括在所述密闭箱的壁中。

31.使得能够进行开放模式的连续细胞生长的细胞培养装置，其特征在于，所述装置包含：

-围壳(17)；

-产生经过所述围壳的无菌气流的工具(23)；

-一个或数个根据权利要求22至30中任一项的培养支持物(18)，其安放在所述围壳(17)中，并且使得能够施行开放模式的细胞培养。

32.根据权利要求31的细胞培养装置，其特征在于，所述装置还包含：

-至少一个更新培养基的工具，其置于所述围壳内部。

33.根据权利要求31或32的细胞培养装置，其特征在于，所述装置还包含：

-至少一个适于替换包含在培养支持物(18)中的培养容器的培养容器(1)。

34.根据权利要求31至33中任一项的装置，其特征在于，将该产生无菌气流的工具(23)置于围壳(17)的上部部分处，以便所述无菌气流从培养支持物(18)的上端流向下端。

35.根据权利要求31至34中任一项的细胞培养装置，其特征在于，所述装置还包含：

-至少一个在所述培养容器底部的抽出无菌气流的工具(8)。

36.根据权利要求35的装置，其特征在于，该抽出无菌气流的工具(8)在位于培养支持物(18)的培养容器(1)和密闭箱(2)之间的空间(7)中产生压降。

37.根据权利要求35或36的装置，其特征在于，所述抽出工具(8)与至少一个适于抽吸环绕在培养容器开口(6)周围的空气的空气抽吸工具相联合。

38.根据权利要求32至37中任一项的装置，其特征在于，该更新培养基的工具包含将培养容器的一部分内容物移注至排出区的工具(20)。

39.根据权利要求32至38中任一项的装置，其特征在于，该更新培养基的工具包含将新鲜培养基从位于围壳(17)内部的储库移注至培养容器的工具(20)。

40.根据权利要求38或39的装置，其特征在于，该移注工具包含移液管(20)和抽吸在所述移液管中的新鲜或用过的培养基的工具。

41.根据权利要求31至40之一的装置，其特征在于，所述装置还包含：

-至少一个向围壳外部输出该移注工具(20)和/或至少一个培养容器的工具。

42.根据权利要求41的装置，其特征在于，所述输出工具包含闸。

43.根据权利要求31至42中任一项的装置，其特征在于，所述装置包含至少一个将空气注入到培养物中的工具(4，21)。

44.根据权利要求31至43中任一项的装置，其特征在于，所述装置包含至少一个适于在围壳内部施行移动的自动化臂(19)。

45.根据权利要求31至44中任一项的装置，其特征在于，该围壳(17)是封闭的。

46.根据权利要求31至45中任一项的装置，其特征在于，所述装置包含数个安放在所述围壳中的培养支持物，以便平行地施行数个开放模式的细胞培养。

47.根据权利要求30至46中任一项的装置，其特征在于，所述装置使得能够实施根据权利要求1至21中任一项的方法。