WO2009112739A1 - Procédé et dispositif de culture cellulaire en mode continu ouvert - Google Patents

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WO2009112739A1
WO2009112739A1 PCT/FR2009/050275 FR2009050275W WO2009112739A1 WO 2009112739 A1 WO2009112739 A1 WO 2009112739A1 FR 2009050275 W FR2009050275 W FR 2009050275W WO 2009112739 A1 WO2009112739 A1 WO 2009112739A1
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WO
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culture
vessel
cells
cell
medium
Prior art date
Application number
PCT/FR2009/050275
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English (en)
Inventor
Bernard Kudla
Pierre-Yves Chesneau
Yann Beaujouan
Original Assignee
Eco Solution
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Publication date
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Priority to EP09719279A priority patent/EP2247712A1/fr
Priority to US12/918,987 priority patent/US9018007B2/en
Priority to CN200980105991.7A priority patent/CN101965394B/zh
Priority to CA2714186A priority patent/CA2714186A1/fr
Priority to JP2010547230A priority patent/JP5620278B2/ja
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Priority to IL207653A priority patent/IL207653A/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Definitions

  • the present application relates to the implementation of cell cultures in open continuous mode.
  • This reproducibility can be further enhanced by the use of automated incubators allowing, for example, to seed synchronously cultures using a robotic arm.
  • This type of incubator can take the form of a closed chamber within which the temperature and the pressure are finely regulated. Once the seeded containers are sealed and cultured for a specified period.
  • the culture benefits from a regular supply of fresh culture medium or a diluent, that is to say a component of said culture medium, so as to maintain the cell growth for a prolonged period.
  • the dilution of the medium is generally carried out according to a preselected regime, which may be periodic or continuous.
  • the main methods of continuous cultivation are a mode where the fresh medium is added so as to keep the cell density constant around a mean value (turbidostat mode) and a mode where the fresh medium, or a diluent, is introduced from to maintain a physicochemical parameter (pH, C / N ratio ...) around a defined value (chemostat mode).
  • continuous culture techniques are now experiencing an unexpected revival of interest precisely because they make it possible to promote the emergence and selection of cell variants with differentiated growth. It may thus be desired to obtain proliferating cell variants in suspension or, conversely, static cell variants. These are particularly useful for studying, for example, the biology of biofilms.
  • the principle of this selection is to take advantage of the spontaneous evolutions favored by the cultures in continuous mode, to select, in the long term, cell variants which evolve preferentially in suspension, or on the contrary mainly in static forms.
  • suspension-proliferating variants generally tend to divide more actively than other cells present in the medium, or to make better use of the resources of the medium. If the culture is maintained over a long period, the frequency of these variants within the population increases over time, making it easier to isolate them. Suspended growth variants selected according to this principle generally have a competitive advantage over other cells from the same line. They are therefore useful for improving, for example, the yield of existing industrial fermentation processes, such as those practiced in batch culture mode.
  • the international application WO 00/34433 describes a device for the implementation of continuous cultures allowing the selection of proliferating variants in suspension.
  • This device is provided with two culture vessels interconnected by a pipe, which allows to transfer at will a culture contained in a first container to a second and vice versa.
  • This pipe is equipped with a valve which is operated at will to make pass the culture from one container to another.
  • Each of the two culture vessels is fed by an independent fluidic network allowing a constant renewal of medium and gas inside each of the containers.
  • a second fluidic network connects to clean and sterilize each of the two culture vessels, independently, using sterilization fluids.
  • Said device is thus designed to be able to transfer a culture in liquid medium from a first container to a second one. When one container contains the culture, the other can be cleaned and sterilized and vice versa.
  • the static variants attached to the walls of the container are removed, while the proliferating cells in suspension are maintained in continuous culture in the other container.
  • the device is designed to repeat the operation as many times as necessary. It is thus theoretically possible to maintain a continuous culture for an unlimited duration while avoiding the accumulation of static variants.
  • this device has several major drawbacks, including the following:
  • the cleaning and sterilization of the containers within the device require a complex fluidic network.
  • This fluidic network must be perfectly sealed to maintain an adequate level of sterility.
  • it is difficult to reproduce such a fluidic network on an industrial scale because when the volume of the culture vessels is increased, the volume of sterilization and washing liquids necessary for the operation of the system becomes too great.
  • These fluids must be stoked while waiting to be decontaminated, which leads to high maintenance costs.
  • the operation of the system requires the mobilization of two tanks for an effective selective culture. These elements limit the number of crops that can be implemented on the same technical platform.
  • the pressure between the different compartments of the device is difficult to regulate, making it virtually impossible to maintain a constant and homogeneous pressure within the system. Under these conditions, the reproducibility of the crops is affected. Moreover, overpressures in the fluidic network can occur and thus disrupt or interrupt the operation of the device;
  • International application WO 2005/083052 describes another device for the selection of proliferating variants in suspension in continuous culture.
  • This device takes the form of a flexible tube, inside which the culture is produced between two clamping points located upstream and downstream of the tube.
  • the renewal of the culture medium is carried out by adding fresh medium and the elimination in the same volume of the spent medium by moving the tube between the clamping points.
  • the opening and closing of the clamping points creates a peristaltic effect.
  • the new tube segments introduced between the clamping points bring the medium fresh and participate in the dilution, while the static mutants, which are fixed on the walls, are eliminated as the tube is displaced at the level of the used segments. of it.
  • This device has the same limitations as the previous one with regard to the volume and confinement of the culture. In addition, it seems difficult to ensure proper gas exchange by diffusion through the single wall of the tube.
  • the method and apparatus of the present invention are intended to overcome the limitations of the above-described culture devices.
  • One of the objectives of this invention is to allow continuous culturing of cell cultures in order, in particular, to practice the selection of variants having a determined growth stage. According to the invention, these cultures are carried out in culture supports and culture vessels in open mode, placed in a closed enclosure.
  • culture vessel or culture vessel is meant according to the invention a container of the culture medium, generally intended to be brought into direct contact with the culture medium.
  • culture support is meant according to the invention an assembly comprising a culture vessel and a support of the culture vessel.
  • the culture support described hereinafter according to the invention is itself a particular culture support.
  • culture media according to the invention placed inside the enclosure of the device according to the invention, allows easy access to the cultures produced in continuous mode.
  • These culture supports are designed so that the culture vessels they comprise can be replaced at will, for example according to a preferred aspect of the invention when the cultures accumulate too many static variants.
  • other culture media and / or culture vessels may also be considered in the context of the present invention, and used in the method according to the invention.
  • Manipulations inside the closed chamber can be performed using robotic manipulator arms, which also considerably reduces the risk of contamination.
  • the number of culture supports and / or culture vessels present in the device can be adapted by simple dimensioning of the closed enclosure where they are placed. It is therefore possible to implement several crops at once, in series or in parallel.
  • the present invention relates to a generally open continuous mode cell culture method, in particular allowing the selection of proliferating cell variants in suspension or in a static manner.
  • culture in continuous mode denotes according to the invention a culture carried out in a liquid medium and a fraction of said culture medium is renewed in order to maintain the cells growing in a prolonged manner.
  • the cells are maintained for a large number of generations which is not defined in advance, preferably greater than 100 generations, more preferably 200, even more preferably 1000 generations.
  • the renewal of the culture medium, or a component thereof (diluent), can be carried out permanently, regularly or periodically.
  • the culture medium can be renewed for one or more of the ingredients in its composition, or for the entire mixture of these ingredients.
  • the culture medium is generally renewed so that at least a majority of cells, preferably at least 50% of the cells in culture, more preferably at least 80% of them are kept in suspension.
  • the culture medium is more generally a liquid culture medium.
  • the terms "culture medium” and "culture” are used interchangeably.
  • a "cell” is defined here as a small biological entity comprising a cytoplasm delimited by a membrane and having the capacity to reproduce autonomously.
  • the cell may be eukaryotic or prokaryotic, animal or plant. Microorganisms are considered cells.
  • Bacteria, yeast and unicellular algae are preferred cells for carrying out the present invention.
  • liquid culture medium a liquid mixture comprising nutritive substances, as well as optionally other components such as selection agents (antibiotics), in which cells can multiply.
  • a cell variant is defined as a daughter cell that does not have the same physiological characteristics as its parent cell grown under the same conditions.
  • Physiological changes of which the variant is the subject may occur due to genetic modification (point mutation, loss or acquisition of genetic material), but may also result from stress or other factors that may have a lasting impact on the behavior of the cells in culture. It is not required according to the invention that these physiological modifications are predefined.
  • the object of the invention is to promote the emergence of cellular variants from spontaneous modifications, then to select among these variants those having acquired properties conferring on them a competitive advantage over the other cells in culture. In general, these new properties allow them to multiply more quickly or to better exploit the culture medium.
  • the cellular variants according to the invention can be selected according to two main modes: suspension variants: variants which are more competitive in a planktonic development in liquid culture are selected. In this case, it is the static variants that one seeks to eliminate. Static variants: Variants that bind, aggregate, encyst, or take any other form of dilution resistance, for example in the form of biofilms, are selected. In this case, it is the variants that develop in suspension that one seeks to eliminate.
  • the continuous cell culture method allowing the selection of static cell variants or proliferating in suspension according to the invention is characterized in that it comprises one or more of the following steps, more generally the following steps, by which: a) is seeded with the aid of one or more living cells, a liquid culture medium contained in a first culture vessel kept open in a closed chamber, b) feeding said cells, in said culture medium, to a determined growth stage, corresponding to a given cell density or to a physico-chemical parameter measured in the culture medium, c) the cell density in the culture medium, or the value of said physico-chemical parameter, which is reached in step b) is kept substantially constant by adding fresh culture medium or at least one diluent to said culture vessel, d) pipetting a portion of ie the culture medium obtained in c) containing the cells in suspension so as to maintain the volume of the culture; e) transferring a fraction of the culture medium obtained in d) into a second culture vessel, which generally replaces the first culture vessel;
  • step c) according to the invention, whether for the process according to the invention above or for one of the processes according to the invention described above. after, it is not excluded that the addition of fresh culture medium or at least one diluent in said culture vessel is also a simultaneous supply of fresh culture medium and at least one diluent.
  • a (single) diluent is preferred, but it is possible to use several diluents without departing from the scope of the invention.
  • all the culture vessels present in the closed chamber are generally identical, but it is possible that the culture vessels are different from each other, or are of several different types within the same enclosure. According to this method, it is possible to select, separately or simultaneously, suspension-proliferating cell variants as well as static variants.
  • a method according to the invention of continuous cell culture for the selection of cell variants proliferating in suspension can be characterized in that it comprises the following steps: a) one or more living cells are seeded with liquid culture medium contained in a first culture vessel kept open in a closed chamber, b) said cells are brought into said culture medium at a determined growth stage, corresponding to a given cell density or to a physiological parameter.
  • the cell density of the culture, or the value of said physico-chemical parameter, reached in step b), is kept substantially constant by a supply of fresh culture medium or at least a diluent in said culture vessel; d) pipetting a portion of the culture medium containing the cells in suspension to maintain the volume of e culture; e) transferring a fraction of the culture obtained in d) in which the cells are suspended, in a second culture vessel replacing the first; f) removing said first culture vessel with the remaining culture fraction contained therein; g) after several generations of culture in the second container, the cells proliferating in suspension are selected.
  • the fraction of the culture removed with the container in step f) is generally comprised of static variants.
  • Step f) is a removal step, or an elimination step, or a withdrawal or removal step.
  • the fraction of the culture removed with the container in step f) most often corresponds to a liquid fraction in which most of the proliferating cells are present in suspension.
  • Step f) is a removal step, or an elimination step, or a withdrawal or removal step.
  • Solid surfaces provide the opportunity for static cell variants to bind during the selection process.
  • Solid surfaces can take different forms such as plates, beads or particles. They can be made of different materials (plastics, metals, glasses, minerals, composites), inorganic or organic. Plastic materials such as polystyrene, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyurethane and their derivatives are preferred. Surfaces can be treated physically or chemically. They can be suspended in the culture medium, hooked or placed at the bottom of the culture vessel. Preferably, the solid surfaces are designed to be removable through the opening of the culture vessel, and placed in a new culture vessel including, for example, fresh medium.
  • said solid surface is made of a material treated to prevent the adhesion of the cells.
  • the method may include a step in which different surfaces are tested to determine which of these surfaces provides better or lesser adhesion of the static variants.
  • the method may be particularly useful for the selection of cell adhesion limiting materials for the purpose of, for example, developing surgical equipment such as catheters limiting contaminations.
  • this method can be useful for selecting materials promoting the installation of cells (biogenic surfaces) sought in the development of prostheses or medical implants.
  • the method according to the invention advantageously allows the selection of cell variants at a predefined growth stage.
  • the cells are preferably brought into the culture medium at a growth stage, which is determined or linked to the cell density or to a measurable physicochemical parameter in the culture medium.
  • a growth stage which is determined or linked to the cell density or to a measurable physicochemical parameter in the culture medium.
  • a measurable physicochemical parameter in the culture medium such as pH, amount of dissolved oxygen, available carbon or nitrogen, etc.
  • typical growth curves established at in advance, experimentally or from literature data. These curves are generally established on the basis of cultures carried out in batch mode. They make it possible to relate the cell density or a physico-chemical parameter of the culture medium to the physiological state in which most of the cells in culture are found at a given moment.
  • a particular value of a measurable physico-chemical parameter is set, for example, a cell density value known to be a parameter determining the secretion of an enzyme of interest.
  • the method provides that after inoculation of the culture medium, the cells grow to reach the set value.
  • the continuous culture is started so as, for example, to keep the cell density constant. It is thus possible to keep the cells as long as possible in the desired physiological state, which makes it possible, for example, to prolong the period during which the cell will secrete the product of interest.
  • the cell cultures are generally carried out in an open mode, which facilitates the interventions and the samplings required to maintain the physicochemical parameters chosen at a constant value.
  • the culture vessels chosen to implement the method usually have a sufficiently wide and practical opening, preferably oriented upwards or vertically, to be able to advantageously introduce the material necessary to carry out samples of culture medium. by pipetting or direct measurements using probes.
  • vertex is generally meant the highest point of the culture vessel, relative to a horizontal base which may be the ground.
  • the method is characterized in that said culture vessels are kept open at their top, and that a gaseous flow, such as sterile air, is applied in such a way that continues, on the outskirts of their opening.
  • a gaseous flow such as sterile air
  • the present process is distinguished from the continuous or semi-continuous culture processes described in the prior art, which are carried out in closed containers, which do not allow to establish a real-time monitoring of crops.
  • the method according to the invention therefore makes it possible to carry out a selection of cell variants maintained, or even synchronized, at a predefined growth stage. This is particularly useful for selecting, for example, variants of cells that synthesize products of interest transiently, such as enzymes or antibiotics. The selection of cell variants can thus be implemented by reproducing the conditions in which the cells synthesize the product of interest.
  • the process according to the invention is therefore particularly suitable for the improvement of industrial strains used in fermentation processes, in particular those used in semi-continuous mode (that is to say those during which the culture medium is renewed on a continuous basis. fixed duration).
  • a particular aspect of the invention consists, independently of the selection of suspended variants or of static variants, in the implementation of process of the method described above to synthesize a product of interest for an unlimited period, maintaining the cells at an optimal growth stage for the synthesis of said product.
  • the method according to the invention is generally implemented in a closed chamber, the size of which may vary according to the needs of the users, the number and the volume of the crops.
  • the various steps a) to f) are performed in a closed enclosure.
  • the pressure and the temperature can be kept constant in the enclosure at the desired values. Since the culture vessels are open, the cultures are generally at the same pressure as that applied in the enclosure. The risks of local overpressure encountered in the confined systems of the prior art are thus generally eliminated.
  • Said enclosure also makes it possible to control the gaseous environment of the cultures, which is particularly useful in the case of culture carried out under anaerobic conditions.
  • the culture method most often provides that sterile gas, such as sterile air, is injected under pressure into the cell culture medium by means of a bubbling device, for example in the form of aeration rods. introduced into the culture vessel generally through the opening of said container.
  • a bubbling device for example in the form of aeration rods.
  • This gas injection aeration the culture medium, the homogenization of said medium by air lift (agitation bubbling) and helps maintain a certain gas pressure inside the chamber.
  • the enclosure is preferably traversed by a sterile gaseous flow.
  • This stream may consist of a gas, such as nitrogen or a mixture of gases such as air, depending on the chosen culture conditions.
  • the sterile gaseous flow is applied at the periphery of the opening of the open culture vessels to remove contaminants from this zone and thus reduce the risk of contamination. This flow also makes it possible to balance the pressure inside the enclosure.
  • the circulation conditions of the sterile gaseous flow are most often the same for all the containers of the closed chamber.
  • the gas flow which is preferably a laminar flow, is generally applied either from top to bottom of the culture vessels or from the bottom to the top of the culture vessels, generally outside said containers. of culture.
  • the device according to the invention described below is a device in which is applied (or directs) the sterile gaseous flow from top to bottom of the culture vessels.
  • the gas flow is activated at the periphery of the culture vessels, in particular around the opening of said containers, creating a depression at the bottom of the culture vessels.
  • the culture vessel may be placed in an upwardly open confinement tank provided with suction and evacuation means for the gas flow at its base.
  • a depression can then be obtained locally in the volume located between the culture vessel and the internal walls of said containment tank.
  • the sterile air travels the volume between the inner walls of the containment vessel and the culture vessel from top to bottom, and is evacuated from the enclosure at the base of the culture vessels. In this way the contaminants are trapped in said volume and driven to the lower part of the containment tank. Thus, they do not penetrate inside the culture vessel, which is slightly overpressurized, especially because of the supply of gas produced by bubbling in the culture medium.
  • Another embodiment would include the activation of the sterile gaseous flow from bottom to top of the culture vessels.
  • several cultures are carried out simultaneously in several culture media placed in the same enclosure.
  • several culture media placed in the same enclosure.
  • the sterile gas stream is particularly useful for avoiding cross-contamination when different crops are grown simultaneously in the same enclosure.
  • steps a) to f) above are repeated one or more times before proceeding to step g).
  • the maintenance of a substantially constant cell density in the culture in step c) is carried out by dilution of the culture with fresh medium while maintaining a constant volume of culture medium. in the culture vessel.
  • the transfer of the culture medium containing the cells in suspension into the second culture vessel can be performed by pipetting with a sterile pipette. The pipetting operation is preferably carried out using a robotic arm located inside the closed chamber.
  • the first culture container used is generally removed from the culture medium to which it can belong. In all cases, this first culture vessel is evacuated outside the closed chamber with the aid of an airlock. This airlock keeps pressure and sterility stable inside the enclosure. The evacuated container is usually removed.
  • the culture vessel in operation can be placed in a thermostated cell, that is to say in an open chamber whose walls are maintained at the desired temperature, allowing the regulation of the temperature of the cell culture.
  • the containment tank is itself thermostated and serves as a cell.
  • One of the walls of the tank may, in fact, comprise a heating means for regulating the temperature of the objects placed in the interior volume of said tank.
  • the space between the culture vessel and the inner walls of the containment tank must of course be understood as the space between the thermostated case and the tank confinement.
  • the culture supports and / or the culture vessels according to the invention are preferably disposable and compatible with robotic manipulation inside the enclosure.
  • the invention preferably provides that at least some, that is to say several, process steps are performed using one or more automated arms allowing movement within the pregnant.
  • the enclosure remains closed during the various steps of the process.
  • the cells are generally cultured continuously over a number of generations greater than 10 2 , preferably greater than 10 4 , more preferably greater than 10 6 , and still more preferably greater than 10 generations, without opening (direct ) of the enclosure on the outside environment.
  • the culture method according to the invention in open continuous mode is implemented using a culture device particularly suitable for this purpose.
  • the invention also relates to a culture support for performing an open continuous cell culture, characterized in that it comprises: at least one culture vessel open at its top suitable for containing a liquid culture medium; at least one upwardly open containment tank in which said culture vessel is housed; a space between said culture vessel and said containment tank, adapted to circulate a gas flow at the periphery of the container opening, from top to bottom, between the culture vessel and the inner walls of the containment tank; and a means for extracting said gaseous flow, located in the lower part of the containment tank.
  • the means for extracting the gas flow consists of one or more orifices allowing the gas flow to pass, for example air.
  • the culture support is in the form of a removable block in which several of said containment bins are grouped and in which are housed at least one of said culture vessels.
  • said lower portion of the containment tank is flush with a base provided with complementary extraction means of said gas flow flowing between the culture vessels and the walls of the containment tanks, such as a pipe connected to a pump empty, or one or more gas distribution means.
  • the culture support according to the invention may comprise at least one means for regulating the temperature of the internal volume of said containment tank, said means for regulating the temperature of the internal volume of said containment tank preferably consisting of a heating resistor included in at least one of the walls of said containment tank.
  • the culture support according to the invention may comprise at least at least one means for injecting air into the medium (s) of culture, contained in the said container (s). ), such as one or more aeration rods.
  • the culture support according to the invention may comprise at least one means for optical measurement of the density of the cells present in the culture medium contained in the culture vessel.
  • the culture support according to the invention may comprise at least one means for producing light for the cultivation of microorganisms in autotrophic mode, located in the space between the culture vessel and the internal walls of said containment tank, or included in one of the walls of said containment tank.
  • the invention finally relates to a cell culture device for continuous growth of cells in open mode, characterized in that it comprises: - an enclosure; means for generating a sterile gaseous flow flowing through said enclosure;
  • the cell culture device may comprise at least one means of renewal of the culture medium placed inside said chamber.
  • the cell culture device may comprise at least one culture vessel adapted to replace that contained in the culture support.
  • the cell culture device can be characterized in that the means for generating the sterile gaseous flow is placed in the part upper chamber so that said sterile gas stream is directed from the top to the bottom of the culture support.
  • the cell culture device may further comprise at least one means for extracting the sterile gaseous flow at the base of said culture vessel, said means for extracting the sterile gaseous flow preferably creating a vacuum in the space between the culture vessel and the containment vessel of the culture support.
  • Said extraction means may be associated with at least one air suction means adapted to suck the air surrounding the periphery of the opening of the culture vessel.
  • the cell culture device may be characterized in that the culture medium renewal means comprises means for transferring part of the contents of the culture vessel to an evacuation zone.
  • the cell culture device may be characterized in that the culture medium renewal means comprises means for transferring fresh medium from a reserve located inside the chamber to the culture vessel.
  • the decanting means preferably comprises a pipette and a suction means of fresh or used medium in said pipette.
  • the cell culture device may further comprise at least one outlet means to the outside of the enclosure of the transfer means and / or at least one culture vessel, said outlet means preferably comprising an airlock .
  • the cell culture device may be characterized in that it comprises at least one means for injecting air into the culture.
  • the cell culture device may be characterized in that it comprises at least one automated arm adapted to make displacements within the enclosure.
  • the cell culture device may be characterized in that the enclosure is closed.
  • the cell culture device may comprise a plurality of culture supports positioned in said chamber, to perform in parallel several open-mode cell cultures.
  • the cell culture device may be characterized in that it allows the implementation of the method according to the invention.
  • Figure 1 schematically shows a first culture support according to the invention, in perspective
  • Figure 2 shows schematically a second culture medium according to the invention, in perspective
  • Figure 3 shows schematically a removable block having cells for culture media as shown in Figure 2, in section III - III with respect to Figure 4;
  • Figure 4 shows a removable block having cells of Figure 3, in plan view
  • Figure 5 shows schematically and partially a cell culture device according to the invention, in perspective;
  • Figures 6 to 10 each schematically represent an operating plan of a continuous cell culture method according to the invention, in a closed chamber (not shown) using any culture medium, each corresponding Figure specific steps of the Figure 7 showing initial steps of a cell culture;
  • FIG. 1 shows schematically a first culture support 1 according to the invention, open upwards, suitable for containing a liquid culture medium.
  • the support 1 comprises a culture vessel 6 housed in an upwardly open confinement tank 2 in which the said culture vessel is housed.
  • the culture vessel is placed in a thermostated case 3, which is optional according to the invention.
  • the culture medium (shown in fill - dashed lines - in FIG. 1) is capable of being fed with gas, for example air, most often under pressure, by a bubbling device constituted in this case by a ventilation rod. 4 in the form for example of a bubbling cane.
  • This rod 4 held by means of an arm 5, is immersed vertically in the culture vessel 6, where the culture medium is located, by the opening of the culture vessel 6.
  • the arm 5 can carry out a vertical movement to position the lower end of the rod 4 at the desired location in the culture vessel 6.
  • the hollow arrows pointing downwards in FIG. 1 symbolize the sterile gaseous flow, which is for example sterile air, which flows from top to bottom and which passes through the space, or volume, 7 situated between the inner wall of the containment tank 2 and thermostatic case 3.
  • the sterile gaseous stream is discharged through several discharge openings 8.
  • the discharge openings 8 represent a means of extracting the gas stream, and are located in the lower part, of Preferably the base of the container containment 2.
  • the culture vessel 6 may consist of any type of upwardly open container, such as vial, bottle or Erlen. It is preferable that the culture vessel 6 can be easily positioned and withdrawn from the containment vessel 2. As shown in FIG. 1, it is advantageous to choose a culture vessel 6 which does not exceed the height of the walls of the vessel. containment tank 2.
  • the sterile gaseous flow whose flow can be organized from the top to the bottom of the culture support 1, is designed to create a barrier aseptically around the opening of the culture vessel 6, delimited by the internal walls of the containment tank 2.
  • This gas flow can be activated by creating a depression in the lower part of the containment tank 2, for example by connecting the discharge ports 8 to a suction means.
  • the lower part of the containment tank 2 is preferably designed to fit on a base provided with complementary extraction means of said sterile gas stream, such as a pipe connected to a vacuum pump.
  • said base may be provided with one or more gas stream collection or distribution means, useful for implementing the continuous mode culture method.
  • FIG. 2 schematically shows a second culture support according to the invention, 1 ', in perspective.
  • the culture support 1 ' comprises a culture vessel 6' which is present in a containment tank 2 ', represented here in transparency.
  • the culture vessel 6 'and the containment vessel 2' are both open upwards.
  • the culture vessel 6 ' is able to easily position and withdraw from the containment tank 2', because it does not exceed the height of the walls of the containment tank 2 '.
  • the culture vessel 6 ' comprises a culture medium 11.
  • a space T is defined between the culture vessel 6 'and the internal walls of the containment tank 2', said volume 7'apte to be traversed by a gaseous flow from bottom to top.
  • the discharge means of said sterile gas stream are not shown here, but they consist of several orifices located in the base of the containment tank 2 '.
  • FIGS. 3 and 4 show a preferred culture support 1 "according to the invention in the form of a removable block 12, comprising six cells, or compartments, 24, 25, 26, 27, 28 and 29, in which are inserted
  • Figure 4 shows the block 12 in top view
  • Figure 3 shows the block 12 in cross section III - IM (see Figure 4).
  • the block 12 comprises four culture vessels 6 ', themselves having walls 10, and each housed in a cell 25, 26, 28 and 29 of the block 12. Each culture vessel 6' can be placed manually in a cell.
  • Block 12 is preferably made of a part. Block 12 is in fact as if several culture supports 1 'as shown in Figure 2, and described above, were contiguous to the outer wall of their containment bins 2'.
  • the cells are provided with walls at their periphery forming containment tanks 16. Gas distribution means, collector and filter contained in a ventilation module 13 are extended by individual aeration rods 4 to reach each of the culture vessels 6 '.
  • the sterile gaseous flow through the culture support 1 "from top to bottom is symbolized by hollow arrows, while the path of the gas supplying the culture media is represented by solid arrows and gas bubbles.
  • sterile preferably permanent, ensures the confinement of each culture vessel 6 'when the block 12 is placed in a closed enclosure.
  • This culture block 12 can be thermostatically controlled by the presence of heating resistors incorporated in its mass. is evacuated at the base of each of the cells having a culture vessel 6 'by means of evacuation 14 in the form of pipes intended to be connected to an air suction means such as a vacuum pump.
  • the block 12 preferably comprises a collector and distributing ramp of the aeration gas or gases.
  • gases are conveyed inside each culture vessel 6 'by means of a detachable bent tubing 4, terminated in a rod 4 at the end which is immersed in the culture vessel 6 ', and which can be manually positioned on the distributor rail at connectors, after the installation of the culture vessels 6'.
  • bent pipes bring the gases into each culture vessel 6 'in the lower position to cause an "air lift" for ensuring the supply of oxygen, carbon dioxide or other gas (s) in the culture medium and to ensure a homogeneous mixture of the culture medium.
  • Bright side panels, or illuminating plates, 15 are arranged in two cells 25 and 26, laterally, to allow the culture of photosynthetic microorganisms.
  • the plates 15 are preferably removable and are light production panels for the culture of photosynthetic microorganisms, and are located in the space between the culture vessel 6 'and the inner walls of the containment tank 16, or included in one of the walls of the containment tank 16.
  • the light is produced using LEDs, the wavelength of which is chosen according to the photosynthetic pigments of the microorganisms concerned.
  • the light emitted may correspond to white light or to lights of different wavelengths depending on the type of LED used.
  • a stroboscopic lighting regime is achievable depending on the mode of operation of the LEDs.
  • autotrophic mode is meant a culture in which the cells produce organic matter by carrying out the reduction of inorganic material, for example in the form of carbon dioxide, and by removal of inorganic salts in the medium.
  • the energy required for this synthesis comes from light, as in the case of photosynthesis for example.
  • the culture support according to the invention thus makes it possible, if necessary, to illuminate the cells continuously at each of the steps of the process according to the invention.
  • the light generating means may also take the form of a panel forming all or part of one of the walls of the containment tank.
  • the means for producing light consist of lamps or UV diodes whose function is either to decontaminate the interior volume of the confinement tank by irradiation before or after use, or to generate mutations on the cells in culture during the selection process.
  • Optical measurement means 9 which are measuring forks of the turbidity of the culture medium, are inserted, in pairs, in the lower part of each of the cells 24, 25, 26, 27, 28 and 29 to follow the evolution. the cell density of the culture media present in these cells.
  • the culture supports in the form of blocks 12 described above have the advantage of facilitating the implementation of the continuous culture method according to the invention. Indeed, several culture vessels 6 'can be prepared and placed in a sterile chamber before the start of operations.
  • the connection of the distributor ramp to the system for supplying gases inside the enclosure is done by a quick coupling when a block is positioned on a specific base of the culture device according to the invention, which can besides hosting several of these blocks.
  • it is expected that the necessary electrical connections (heating, detectors, lighting) are made when placing a block on a base by simple connection.
  • Such a block facilitates pre-operative handling and, subsequently, reduces the automated movements that take place inside the closed enclosure during the implementation of the culture method.
  • the device can then operate autonomously over a longer period.
  • the culture device is an automaton that can comprise a number of removable blocks 12 to six tanks which can vary from one to 100.
  • Each of the blocks 12 is manually conditioned, sterilized and introduced into the controller on a base provided for this purpose.
  • the selective culture process can start by filling a culture vessel, its inoculation, and then producing a continuous culture at a constant volume according to the method already described. It is thus possible to produce in parallel a large number of continuous cultures, each block 12 being the place of an independent experiment.
  • a culture volume of a first culture vessel of the block 12 is pipetted and transferred to a second culture vessel of the same block.
  • the culture can be transferred to a culture vessel of another available block 12, while the fully used block can be replaced by a new conditioned block provided with six new sterile culture vessels.
  • a device according to the invention can carry out the selective cultivation of a single microbial species or of a given microbial consortium in ten, twenty or at least forty blocks, ie 60, 120 or at least 240 tanks simultaneously in order to reach a total volume. cultivation up to 1200, 2400 or at least 4800 mL. In this way, the probability of obtaining a given mutant increases accordingly. This increase is particularly interesting for cells with a complex genome or for those of slow-growing species.
  • Figure 5 shows a continuous culture device 100 according to the invention.
  • An enclosure 17, which is closed when the device 100 is in operation, is suggested but not shown completely.
  • the device 100 comprises several culture supports 1, as represented in FIG. 1, the enclosure 17 and a stream generation means. gaseous sterile 23 passing through said enclosure 17.
  • the culture media 1 operate in parallel in the enclosure 17.
  • the enclosure 17 is traversed by a robotic arm 19 mounted on a rail, capable of moving in the three dimensions of space .
  • This robotic arm 19 is equipped with a transfer pipette 20 for the renewal of the culture medium, a dilution pipette 21 and a handling clamp 22.
  • the size of the chamber 17 is not limited, which allows several cultures to be carried out simultaneously in several culture media, identical or different, placed in the same chamber 17.
  • the sterile gas flow through the chamber 17 is represented by hollow arrows from the means 23 located in height of the enclosure 17 so that said sterile gaseous flow is directed from the top to the bottom of the culture support 1.
  • the sterile gaseous flow which passes through the enclosure 17 is evacuated outside the enclosure 17 through orifices 8 situated at the base of the culture supports 1.
  • the means for extracting the sterile gaseous flow is designed so as to create a negative pressure in the space situated between the culture vessel 1 and the containment tank 2 of the same culture support 18. It is generally associated with a gas flow suction means adapted to suck up the gaseous flow surrounding the periphery of the opening of the container. culture, such as a vacuum pump (not shown) located, for example, under the floor of the enclosure 17.
  • Figures 6 to 10 each schematically represent an operating plan of a continuous cell culture method according to the invention, in a closed chamber (not shown) using any culture support, each Figure corresponding to a functional diagram explaining specific stages of the operation,
  • FIG. 7 showing initial steps of a cell culture
  • - Figure 8 showing steps of changing the culture vessel
  • - Figure 9 showing steps of harvesting culture medium
  • BED automatic culture device
  • the operating plan of a continuous cell culture method according to the invention uses any culture support, rather of the culture support type each Figure corresponding to a functional diagram explaining specific steps of operating a continuous culture device according to the invention, in a version comprising:
  • Each culture support is equipped with a bubbler arm 5i, 5 2 , 5 3 and 5 4 , intended to be bonded to a sterile aerating rod (or bubbling nozzle), a stock of ventilation rods 4i. , 4 2 , 4 3 and 4 4 (not shown), and an ejection lock of the culture vessel 18 1 , 18 2 , 18 3 and 18 4 ,
  • references 11, 12, 13 and 14 represent removable block type culture blocks 12 comprising several (for example two, four, six ...) culture vessels.
  • a stock (or stock) of SR sterile culture vessels
  • the transfer pipettes generally have a volume approaching the volume of a culture vessel, i.e. most often 20 to 30 ml, and are intended to carry most of the culture medium from a container of culture to another. Dilution pipettes, they generally have a much lower volume, for example most often from 2 to 3 m L.
  • the arrows and references of the type T xy indicate the path of the articulated arm at the beginning of the culture ( Figure 6), during an operation. dilution method (FIG. 7), during a change operation of a culture vessel (FIG. 8), during a crop sampling operation (FIG. 9), and during an operation for taking a culture sample for analysis inside the closed chamber (FIG. 10).
  • the operator installs in the enclosure of the device, in the respective storage areas, the following chargers / racks: - Sterile culture vats (or culture vessels),
  • Bubble ducts or aeration rods, sterile intended to be linked to the bubbler arms 5i, 5 2 , 5 3 and 5 4 ,
  • the operator installs in the cell culture device, in the respective storage areas, closed sterile reservoirs containing the different diluents.
  • the operator opens the tanks containing the different diluents.
  • the operator installs in the robot at the dedicated location the closed sterile culture container containing pure culture No. 1.
  • the operator opens said culture vessel.
  • the multi-function automated articulated arm captures a tank on its rack in the tank SR (FIG. 6, path 1 T 6 i), and transports it to the culture support dedicated to this culture (FIG. 6, path 2 T 62 ).
  • the first culture support 1 i is filled by the pure culture No. 1 in a culture vessel or container 6 'i, then successively, as explained hereinafter, the other three supports of Culture 1 2 , 13 and 1 4 are filled with a culture medium, by transfer through a transfer pipette from a culture medium into a corresponding culture vessel or vessel 6 ' 2 , 6' 3 and 6 ' 4 .
  • the multi-function automated articulated arm pierces the protective film of the culture vessel (sterile vessels).
  • the multi-function automated articulated arm draws a transfer pipette onto its rack in the SPT reservoir ( Figure 6, path 3 T 6 3).
  • the multi-function automated articulated arm equipped with a transfer pipette, picks up the culture in the tube containing the culture ( Figure 6, path 4 T 64 ).
  • the multi-function automated articulated arm transports the culture to the corresponding support and empties the transfer pipette into the culture vessel ( Figure 6, path 5 T 6 s).
  • the automated robotic arm draws a sterile bubbling cane, then positions the sterile bubbling cane in the culture vessel ( Figure 6, path 6 T 6 6).
  • the automated articulated bubbler arm opens the gas supply.
  • the automatic device receives the trigger signal given by the detector located in the culture medium. This one is programmed to follow a physicochemical parameter and to emit a signal when one reaches a critical value of this parameter.
  • the automated articulated arm then draws a sterile dilution pipette into the corresponding SPD reservoir (FIG. 7, path 1 T 71 ).
  • the automated articulated arm draws a determined volume of a No. 1 diluent and then draws a sterile air bubble to maintain sterilization during transport (Figure 7, path 2 T 72 ).
  • the automated articulated arm repeats this operation n times to take the desired volume of n diluents.
  • the multi-function automated articulated arm transports the dilution pipette to the corresponding support and empties the dilution pipette into the culture vessel ( Figure 7, path 3 T 73 ).
  • the multi-function automated articulated arm positions the dilution pipette for evacuation of excess volume.
  • the multi-function automated articulated arm evacuates the surplus volume, two evacuation modes are possible: a) the multi-function automated articulated arm positions the dilution pipette in the culture and takes a determined volume of culture then sucks a bubble of air, or b) the multi-function automated articulated arm positions the dilution pipette at a specific height in the culture vessel (corresponding to to the desired culture volume) and draws all the excess culture volume then sucks an air bubble.
  • the multi-function automated articulated arm transports the dilution pipette containing the surplus culture to the top of the ejection chamber, which acts as the nearest liquid / waste disposal station (to maintain sterilization) and empties the contents.
  • the dilution pipette in said ejection chamber 18i, I 82, 183 or 18 4 (FIG. 7, path 4 T 74 )
  • the multi-function automated articulated arm transports the empty dilution pipette over the ejection chamber, which acts as the nearest solids / bin disposal station (to maintain sterilization) and ejects the pipette from the container. dilution in said ejection chamber 181, 18 2 , 18 3 or I 84 (FIG. 7, path 4 T 74 )
  • the automatic device detects the trigger signal of a culture container change either at the end of a given time cycle or following the detection of a biofilm.
  • the multi-function automated articulated arm grabs a tank on its rack in the SR tank and transports it to the transient position dedicated to this culture ( Figure 8, paths 1 and 2 T 8 i and T 82 ).
  • the automated articulated arm draws a sterile transfer pipette into the SPT reservoir ( Figure 8, path 3 T 8 3)
  • the automated articulated bubbler arm closes the gas supply and releases the used bubbling cane from the culture.
  • the automated bubbler arm ejects the used bubbling nozzle into the ejection chamber which acts as the nearest solids / bin disposal station (to maintain sterilization) and ejects the used cane into said chamber.
  • the automated articulated arm picks up the culture.
  • the multi-function automated articulated arm transports the transfer pipette containing the culture to the new tank in the position transient dedicated to this culture and empties the transfer pipette into the new culture vessel ( Figure 8, path 4 T 84 ).
  • the multi-function automated articulated arm transports the empty transfer pipette over the ejection chamber which acts as the nearest solids / bin disposal station (to maintain sterilization) and ejects the transfer pipette into said ejection chamber 18i, I 82,
  • the automated articulated bubbler arm draws a sterile bubbling cane ( Figure 8, path 6 T 86 ).
  • the automated articulated bubbler arm positions the sterile bubbling cane in the culture vessel.
  • the automated articulated arm bubbler opens the gas supply
  • the culture vessel is ejected via the ejection lock ( Figure 8, path 7 T 87 ).
  • the cultures are made in a culture vessel (disposable plastic tanks) in a culture support as shown in FIG.
  • This disposable culture container can be regularly replaced, when necessary (biofilm development) by a new sterile container via the action of a robotic arm, as described above.
  • FIG. 5 An overview of the culture device is for example given in FIG. 5.
  • the arm ensures the pumping of the medium in a sterile pipette during the exchange of the culture tanks, then places the culture medium in the new sterile tank (exchange function of the container).
  • This robotic arm also ensures the pipetting functions of a portion of the culture and the replacement of the volume taken up by the same volume of fresh medium (dilution function), the dilution frequency can be fixed by the experimenter (chemostat) or driven by the cell density of the culture (turbidostat).
  • This case is equipped with one or more forks (transmitter / receiver at different wavelengths) to measure the cell density (visible, IR) in the tank, as well as the concentration of some absorbing molecules.
  • the culture vessel and the thermostated case are located in a confinement tank inside which a sterile gaseous flow, for example sterile air, flows continuously around the case and the tank. to achieve a constant sterile containment of the latter (see Figure 1).
  • a sterile gaseous flow for example sterile air
  • the system makes it possible to control the culture either with constant degree of dilution and with constant volume with compensation of the evaporation, either with variable degree of dilution without compensation of the evaporation, or still with degree of variable dilution with compensation of evaporation.
  • the system makes it possible to envisage the addition of solid particles such as cells immobilized in alginate beads, water-immiscible liquids and various additives that are virtually impossible to convey in the aqueous phase in a complex fluidic network.
  • small volumes of aliquots can be collected via the robotic arm in a sterile manner at any point in the culture to be transferred to any type of analytical equipment.
  • the system makes it possible to use different forms of culture vats according to the needs of the culture requirements of the microorganisms.
  • the device described above allows the addition of plates of different materials in the culture vessel via the robotic arm for the selection of cells developing in the form of biofilms.
  • the fraction of the culture which, fixed on these plates, can be preserved while the culture medium containing the cells in suspension removed and replaced by fresh medium.
  • plates covered with biofilms can be moved using the robotic arm into a new sterile culture vessel.
  • reagents can be considered in this context for example chemicals biochemical products (proteins, DNA etc.), biological (cell suspensions) etc.
  • the robot detects the trigger signal of adding a reagent.
  • the automated articulated arm takes a micropipette of sterile reagent.
  • the automated articulated arm transports the micropipette of sterile reagent to the reservoir containing the desired reagent.
  • the automated articulated arm takes up a negligible volume in front of the total volume of determined culture of the reagent (for example 25 ⁇ L of reagent) then takes a bubble of sterile air.
  • the multi-function automated articulated arm transports the micropipette containing the reagent to the corresponding incubator and empties the dilution pipette into the culture vessel.
  • the multi-function automated articulated arm rinses the wall of the micropipette through a cycle of aspirations. repressions in the micropipette
  • the multi-function automated articulated arm transports the reagent micropipette over the solid element / waste disposal station and ejects the reagent micropipette into the solid element evacuation station
  • the operator installs a sterile tube in the sampling station or SE aliquot.
  • the operator opens the sterile tube in the sampling station or aliquot SE.
  • the robot detects the trigger signal of a dilution and the trigger signal of a sample.
  • the robot performs a dilution as described in the previous section in paragraph 2) with one step: the automated articulated multi-function arm carries the dilution pipette containing the surplus culture above the SE station and depositing the contents of the dilution pipette into the open sterile tube ( Figure 9, path 3 T 94 ).
  • the operator rebases the sterile tube in the SE station.
  • the operator closes the sampling tube and retrieves the culture medium via the sampling chamber SE.
  • the operator opens the sterile tube in the sampling station SE.
  • the robot detects the trigger signal of a sample.
  • the automated articulated arm draws a sterile dilution pipette into the SPD reservoir ( Figure 9, path 1 T 91 ).
  • the automated articulated arm transports the sterile dilution pipette to the culture in question (FIG. 9, path 2 T 92 ).
  • the automated articulated arm takes a determined volume (for example 2 mL) of culture and then an air bubble
  • the multi-function automated articulated arm transports the dilution pipette containing the culture sample over the sampling station and deposits the contents of the dilution pipette into the open sterile tube ( Figure 9, path 3 T 93 ).
  • the multi-function automated articulated arm transports the used dilution pipette over the solid waste / waste disposal station and ejects the dilution pipette into the solid element discharge station ( Figure 9, path 4 T 94 ).
  • the operator rebases the sterile tube into the sampling station.
  • the robot detects the trigger signal of a micro sample sample for analysis.
  • the automated articulated arm draws a sterile micropipette into the SEPD reservoir ( Figure 10, path 1 T101).
  • the automated articulated arm transports the sterile micropipette to the culture in question ( Figure 10, path 2 Tw 2 ).
  • the automated articulated arm takes a determined micro volume (for example 10 ⁇ L) of culture and then an air bubble.
  • the multi-function automated articulated arm transports the micropipette containing the culture sample above the analysis station SE and deposits the contents of the micropipette in the position assigned to this sample in the analytical platform ( Figure 10, path 3 T103 ).
  • the multi-function automated articulated arm transports the used micropipette over the pipette ejection port and contaminated material SEPM acting as a solid waste / bin disposal station and ejects the micropipette into said SEPM chamber (FIG. journey 4 Ti 04) -

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Abstract

La présente invention concerne la mise en œuvre de cultures cellulaires en mode continu ouvert, un procédé permettant de sélectionner des variants cellulaires statiques ou proliférant en suspension, un support de culture et un dispositif adaptés à la mise en œuvre de ce procédé.

Description

Procédé et dispositif de culture cellulaire en mode continu ouvert
La présente demande concerne la mise en œuvre de cultures cellulaires en mode continu ouvert.
Dans la conduite de cultures cellulaires, on distingue traditionnellement les méthodes de culture discontinue et les méthodes de culture continue. Dans les techniques de culture discontinue, on ensemence des récipients de culture contenant un milieu de croissance stérile avec une fraction d'une culture qui s'est développée précédemment dans une culture mère. Afin de pouvoir reproduire les mêmes caractéristiques, la culture fille est généralement ensemencée à une dilution donnée, puis elle est amenée à accomplir un cycle de croissance similaire à celui de la culture mère. Dans le cas des fermentations industrielles, il est utile de reproduire les mêmes conditions de culture à chaque cycle engagé car cela permet de prévoir à l'avance le moment où les cultures arrivent à leur terme, ou bien parviennent à un stade de croissance favorable à la récupération d'un produit d'intérêt synthétisé ou transformé par les cellules.
Dans le domaine de la recherche, la reproductibilité entre cultures filles est nécessaire pour obtenir des données expérimentales fiables et représentatives. Pour obtenir cette reproductibilité, on utilise de manière courante un milieu de culture synthétique, des supports de culture identiques et des conditions de culture standardisées. Les cultures sont alors placées dans des récipients fermés en condition stérile, dans un incubateur où règne température et pression constantes.
Cette reproductibilité peut être encore accrue par l'utilisation d'incubateurs automatisés permettant, par exemple, d'ensemencer de manière synchrone les cultures à l'aide d'un bras robotisé. Ce type d'incubateur peut prendre la forme d'une enceinte fermée à l'intérieur de laquelle la température et la pression sont finement régulées. Une fois les récipients ensemencés ceux-ci sont scellés et mis en culture pendant une durée déterminée.
Dans un cycle de culture discontinue en milieu liquide, il est connu que les cellules évoluent en passant par différents stades de croissance successifs. Ces différents stades de croissance correspondent à des états physiologiques distincts, qui sont fonction de l'évolution de la composition du milieu de culture au cours du temps. En général, tant que les cellules sont peu nombreuses dans le milieu de culture, celles-ci exploitent les substrats carbonés les plus faciles à assimiler et privilégient un métabolisme de croissance les amenant à se diviser activement. Lorsque lesdits substrats sont épuisés, les cellules se mettent à hydrolyser des substrats plus complexes à l'aide d'enzymes plus spécifiques, et à activer des voies métaboliques plus complexes permettant de les assimiler. Elles entrent alors dans une stratégie de subsistance. C'est souvent à ce stade que les cellules synthétisent des produits de réserve, des enzymes et des antibiotiques, dont certains sont d'intérêt industriel. Au terme du cycle de culture, lorsque le milieu est épuisé, beaucoup de cellules meurent tandis que d'autres résistent sous forme de biofilms, de spores, ou de toute autre forme quiescente propre à l'espèce cellulaire concernée.
En mode discontinu, il est possible, pour un milieu de culture et un type cellulaire donnés, de définir à partir de paramètres physico-chimiques fondamentaux tels que la densité cellulaire, le pH, le taux d'oxygène, de carbone ou d'azote, ou tout autre paramètre indicatif du stade de croissance des cellules, le stade de croissance auquel la grande majorité des cellules se trouve à un moment donné. En effet, si le milieu de culture est homogène, le développement de l'ensemble des cellules est relativement synchrone. Il est alors possible d'associer, par exemple, une valeur de densité cellulaire, à une phase de croissance plus ou moins rapide des cellules, notamment via l'utilisation d'une courbe de croissance type. Il est également possible d'effectuer des observations directes au microscope pour déterminer le stade de croissance à partir de critères morphologiques.
Des expériences consistant à reproduire un très grand nombre de fois successivement un même cycle de culture en mode discontinu, ont été décrites dans la littérature. Ces expériences montrent que l'on peut reproduire des cellules sur des périodes très longues sans altérer les caractéristiques, ni les propriétés des cellules (Lenski, R. E. et Travisano, M.
(1994) : Dynamics of adaption and diversification : A 10 000-generation experiment with bacterial populations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 , 6808-
6814).
Dans les techniques de culture continue, au contraire, la culture bénéficie d'un apport régulier de milieu de culture frais ou d'un diluant, c'est- à-dire d'un composant dudit milieu de culture, de sorte à maintenir la croissance des cellules de manière prolongée. La dilution du milieu s'effectue généralement selon un régime présélectionné, qui peut être périodique ou continu.
On distingue comme principaux régimes de culture continue, un mode où le milieu frais est ajoutée de sorte à maintenir constante la densité cellulaire autour d'une valeur moyenne (mode turbidostat) et un mode où le milieu frais, ou un diluant, est introduit de sorte à maintenir un paramètre physico-chimique (pH, rapport C/N ...) autour d'une valeur définie (mode chemostat).
De manière paradoxale, les tentatives décrites dans la littérature de maintenir les cultures en continu sur de très longues périodes, n'ont pas permis de maintenir des lignées cellulaires aussi longtemps qu'en utilisant les techniques de cultures discontinues (Dijkuizen, D. E. (1993 : Chemostats used for studying natural sélection and adaptive évolution. Meth. Enzymol.
224, 613-631 ). Ce constat peut s'expliquer par le fait, qu'en mode continu, les cellules atteignent assez rapidement des stades physiologiques différents et ne sont pas toutes au même stade de croissance. Sans doute, l'apport régulier de milieu frais perturbe davantage le micro-environnement des cellules et ne permet pas d'obtenir un milieu de culture parfaitement homogène. Ainsi, on assiste systématiquement, au bout d'un certain nombre de générations, à l'apparition de variants cellulaires statiques dits de « résistance à la dilution ». Ces variants se manifestent sous la forme de biofilms, de filaments ou de formes quiescentes (spores, coques etc.). Ils forment une sous-population qui échappe aux contraintes d'adaptation et parfois aux agents de sélection (antibiotiques ou autres) utilisés dans le milieu de culture. Tous les appareils de culture en mode continu décrits favorisent l'apparition de variants statiques. Ces variants occupent les surfaces intérieures de l'appareillage et en limitent l'efficacité (Chao, L. et Ramsdell, G. (1985) : The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures. J. Gen, Microbiol. 131 , 1229-1236). Les cultures continues à concentration de cellules constante (mode turbidostat), sont particulièrement sensibles à une invasion de la part de variantes résistantes à la dilution. De ce fait elles ne peuvent être conduites que sur des périodes relativement courtes permettant généralement moins de 200 générations. Par ailleurs, les cultures en mode continu réalisées dans les conditions où la vitesse de croissance cellulaire est élevée favorisent des mutations spontanées en plus grand nombre.
Ces conditions se révèlent particulièrement propices au développement de variants adhérents se développant en biofilms, insensibles à la dilution.
En raison de ces diverses difficultés, les procédés et dispositifs de culture en continu divulgués dans la littérature sont peu utilisés à des fins industriels et même scientifiques.
Leur potentiel a pourtant été reconnu très tôt (Monod, J. (1950) : La technique de la culture continue. Théorie et applications, Ann. Inst. Pasteur 79, 390-410 ; Novick, A. et Szilard, L. (1950) : description of the chemostat, science 112, 715-716).
Cependant, les techniques de culture en continu connaissent aujourd'hui un regain d'intérêt inattendu du fait, justement, qu'ils permettent de favoriser l'émergence et la sélection de variants cellulaires ayant une croissance différenciée. On peut ainsi souhaiter obtenir des variants cellulaires proliférant en suspension ou bien, au contraire, des variants cellulaires statiques. Ces derniers sont particulièrement utiles pour étudier, par exemple, la biologie des biofilms. Le principe de cette sélection est de tirer parti des évolutions spontanées favorisées par les cultures en mode continu, pour sélectionner, sur le long terme, des variants cellulaires qui évoluent préférentiellement en suspension, ou bien au contraire essentiellement dans des formes statiques.
Qu'ils résultent ou non de mutations génétiques, les variants proliférant en suspension ont généralement tendance à se diviser plus activement que les autres cellules présentes dans le milieu, ou bien à tirer un meilleur parti des ressources du milieu. Si la culture est maintenue sur une longue période, la fréquence de ces variants au sein de la population augmente au cours du temps, ce qui permet de les isoler plus facilement. Les variants proliférant en suspension sélectionnés selon ce principe, présentent généralement un avantage compétitif sur les autres cellules issues de la même lignée. Ils sont donc utiles pour améliorer, par exemple, le rendement de procédés de fermentation industriels existants, tels que ceux qui se pratiquent en mode de culture discontinu. La demande internationale WO 00/34433 décrit un dispositif pour la mise en œuvre de cultures continues permettant la sélection de variants proliférant en suspension. Ce dispositif est muni de deux récipients de culture reliés entre eux par une conduite, qui permet de transférer à volonté une culture contenue dans un premier récipient vers un second et vice-versa. Cette conduite est munie d'une vanne que l'on actionne à volonté pour faire passer la culture d'un récipient dans l'autre. Chacun des deux récipients de culture est alimenté par un réseau fluidique indépendant permettant un renouvellement constant de milieu et de gaz à l'intérieur de chacun des récipients. Sur ce réseau fluidique assez complexe, se branche un second réseau fluidique permettant de nettoyer et stériliser chacun des deux récipients de culture, indépendamment, à l'aide de fluides de stérilisation. Ledit dispositif est ainsi conçu pour pouvoir transférer une culture en milieu liquide d'un premier récipient dans un second. Lorsqu'un des récipients contient la culture, l'autre peut être nettoyé et stérilisé et vice-versa. Au cours de la stérilisation et du nettoyage, les variants statiques accrochés aux parois du récipient sont éliminés, tandis que les cellules proliférant en suspension sont maintenues en culture continue dans l'autre récipient. Le dispositif est conçu pour répéter l'opération autant de fois que nécessaire. Il est ainsi théoriquement possible d'entretenir une culture continue sur une durée illimitée en évitant l'accumulation de variants statiques.
Cependant, sur le plan pratique, ce dispositif connaît plusieurs inconvénients majeurs, dont notamment les suivants :
Le nettoyage et la stérilisation des récipients au sein du dispositif, nécessitent un réseau fluidique complexe. Ce réseau fluidique doit être parfaitement étanche pour maintenir un niveau de stérilité adéquat. Or, il est difficile de reproduire à l'échelle industrielle un tel réseau fluidique, car lorsqu'on augmente le volume des récipients de culture, le volume de liquides de stérilisation et de lavage nécessaires au fonctionnement du système devient trop important. Ces fluides doivent être stokes en attendant d'être décontaminés, ce qui induit des coûts d'entretien élevés. Par ailleurs, le fonctionnement du système requiert la mobilisation de deux cuves pour une culture sélective effective. Ces éléments limitent le nombre de cultures pouvant être mises en œuvre sur une même plateforme technique.
L'accès aux cellules en culture est difficile, en raison du fait que les cultures sont maintenues dans un récipient fermé. Cet accès est d'autant plus réduit, qu'il faut veiller à la stérilité du réseau fluidique. Il est donc difficile de procéder en un suivi des cultures, en particulier, un suivi en temps réel.
L'introduction dans la culture de substances non solubles, non miscibles ou difficilement miscibles avec le milieu utilisé, est également compliquée par la nécessité d'emprunter le réseau fluidique et de respecter le confinement des cultures.
La pression entre les différents compartiments du dispositif est difficile à réguler, ce qui rend pratiquement impossible une pression constante et homogène au sein du système. Dans ces conditions la reproductibilité des cultures est affectée. Par ailleurs, des surpressions dans le réseau fluidique peuvent survenir et ainsi perturber ou interrompre le fonctionnement du dispositif ;
Le passage de la culture d'un récipient de culture dans l'autre ne permet pas de réaliser des cultures en mode statique car il implique nécessairement une reprise des cellules en suspension et l'élimination des variants statiques.
La demande internationale WO 2005/083052 décrit un autre dispositif pour la sélection de variants proliférant en suspension en culture continue. Ce dispositif prend la forme d'un tube flexible, à l'intérieur duquel la culture est produite entre deux points de serrage situés en amont et en aval du tube. Le renouvellement du milieu de culture est effectué par apport de milieu frais et l'élimination dans un même volume du milieu usagé par déplacement du tube entre les points de serrage. L'ouverture et la fermeture des points de serrage créent un effet péristaltique. Les nouveaux segments de tube introduits entre les points de serrage apportent le milieu frais et participent à la dilution, tandis que les mutants statiques, qui se fixent sur les parois, sont éliminés au fur et à mesure du déplacement du tube au niveau des segments usagés de celui-ci.
Ce dispositif présente les mêmes limitations que le précédent quant au volume et au confinement de la culture. En outre, il parait difficile d'assurer convenablement des échanges gazeux par diffusion au travers de la seule paroi du tube.
Le procédé et le dispositif selon la présente invention ont pour objectif de remédier aux limitations des dispositifs de cultures décrits ci- dessus.
L'un des objectifs de cette invention est de permettre de cultiver en continu des cultures cellulaires afin, notamment, de pratiquer la sélection de variants ayant un stade de croissance déterminé. Selon l'invention, ces cultures s'effectuent dans des supports de culture et récipients de culture en mode ouvert, placés dans une enceinte fermée.
Par récipient de culture, ou cuve de culture, on entend selon l'invention un contenant du milieu de culture, généralement destiné à être mis en contact direct avec le milieu de culture. Par support de culture on entend selon l'invention un ensemble comportant un récipient de culture et un support du récipient de culture. Le support de culture décrit ci-après selon l'invention, est, lui, un support de culture particulier.
La structure particulière du procédé de culture cellulaire en continu décrit ci-après, quelque soit le ou les récipients de culture utilisés et placés à l'intérieur de l'enceinte fermée utilisée dans ce procédé, permet un accès facilité aux cultures réalisées en mode continu.
La structure particulière des supports de culture selon l'invention décrits ci-après, placés à l'intérieur de l'enceinte du dispositif selon l'invention, permet un accès facilité aux cultures réalisées en mode continu. Ces supports de culture sont conçus de manière à ce que les récipients de culture qu'ils comprennent puissent être remplacés à volonté, par exemple selon un aspect préféré de l'invention lorsque les cultures cumulent un nombre trop important de variants statiques. Mais d'autres supports de culture et/ou récipients de culture peuvent aussi être envisagés dans le cadre de la présente invention, et utilisés au sein du procédé selon l'invention. Les manipulations à l'intérieur de l'enceinte fermée peuvent être réalisées à l'aide de bras manipulateurs robotisés, ce qui diminue, par ailleurs, considérablement les risques de contaminations.
Selon l'invention, le nombre des supports de culture et/ou récipients de culture présents dans le dispositif peut être adapté par simple dimensionnement de l'enceinte fermée où ils sont placés. Il est donc possible de mettre en œuvre plusieurs cultures à la fois, en série ou en parallèle.
Le procédé et le dispositif, ainsi que le procédé de mise en œuvre de ce dispositif, décrits dans la présente demande, présentent de nombreux avantages, parmi lesquels on peut mentionner :
La possibilité de cultiver des organismes uni ou oligo-cellulaires en suspension (aérobies ou anaérobies selon le mélange de gaz présent à l'intérieur de l'enceinte fermée), à température et pression homogène, dans une phase liquide, en conditions stériles. En particulier celle de cultiver des microorganismes photosynthétiques qui nécessitent un éclairage constant et un mode de culture en suspension, sans agitation ;
La possibilité de réaliser des cultures continues sur un grand nombre de génération à volume constant, à un stade de croissance des cellules défini en fonction d'un paramètre physico-chimique prédéfini mesuré en direct dans la culture (densité cellulaire, pH, concentration d'un produit...) et ce, sur une durée qui peut être très longue.
La possibilité de mesurer les différents paramètres nécessaires au contrôle ou au suivi en ligne de la culture (pH, pO2, substrats, produits...).
La possibilité d'appliquer à la culture des paramètres physico- chimiques créant une pression de sélection et pouvant être modulés (apports de molécules, T0C, pH, ...)
La possibilité de séparer aussi fréquemment que nécessaire, la biomasse en croissance suspensive (soumise à dilution) de la biomasse immobilisée sur toute paroi du système de culture (insensible à la dilution), par pipetage et transfert de la culture dans une nouveau récipient de culture stérile et/ou remplacement du support de culture. La possibilité de procéder à une sélection des variants statiques (au lieu des variants proliférant en suspension) par évacuation de la phase liquide présente au niveau des récipients et/ou supports de culture et remplacement de cette phase liquide par un milieu frais en procédant, par exemple, à une remise en suspension des variants statiques fixés sur le support.
La possibilité d'avoir recours à des supports de culture et/ou récipients de culture et/ou de matériels de pipetage à usage unique, jetables ou recyclables.
La présente invention a pour objet un procédé de culture cellulaire en mode continu généralement ouvert, permettant notamment la sélection de variants cellulaires proliférant en suspension ou de manière statique.
Par culture en mode continu, ou culture en continu, on désigne selon l'invention une culture réalisée dans un milieu liquide et dont une fraction dudit milieu de culture est renouvelée en vue de maintenir les cellules en croissance de manière prolongée. De préférence, les cellules sont maintenues pendant un grand nombre de générations qui n'est pas défini à l'avance, de préférence supérieur à 100 générations, plus préférentiellement 200, encore plus préférentiellement 1000 générations.
Le renouvellement du milieu de culture, ou d'un composant de celui- ci (diluant), peut s'effectuer de manière permanente, régulière ou périodique. Le milieu de culture peut être renouvelé pour un ou plusieurs des ingrédients entrant dans sa composition, ou bien pour l'ensemble du mélange de ces ingrédients. Le milieu de culture est généralement renouvelé de sorte à ce qu'au moins une majorité de cellules, de préférence au moins 50 % des cellules en culture, plus préférentiellement au moins 80% d'entre-elles sont maintenues en suspension. Selon l'invention, le milieu de culture est plus généralement un milieu de culture liquide. Par la suite on utilise indifféremment les termes « milieu de culture » et « culture ». Une « cellule » est ici définie comme une entité biologique de petite taille comprenant un cytoplasme délimité par une membrane et ayant la capacité de se reproduire de manière autonome. La cellule peut être eucaryote ou procaryote, animale ou végétale. Les microorganismes sont considérés comme des cellules.
Les bactéries, les levures et les algues unicellulaires, sont des cellules préférées pour la mise en œuvre de la présente invention.
Par milieu de culture liquide, on entend un mélange liquide comprenant des substances nutritives, ainsi qu'éventuellement d'autres composants tels que des agents de sélection (antibiotiques), dans lequel des cellules peuvent se multiplier.
Un variant cellulaire se définit comme une cellule fille n'ayant pas les mêmes caractéristiques physiologiques que sa cellule mère cultivée dans les mêmes conditions. Les modifications physiologiques dont le variant est l'objet peuvent survenir en raison d'une modification génétique (mutation ponctuelle, perte ou acquisition de matériel génétique), mais peuvent également résulter d'un stress ou de tout autre facteur pouvant avoir une incidence durable sur le comportement des cellules en culture. II n'est pas requis selon l'invention que ces modifications physiologiques soient prédéfinies. Au contraire, l'invention a pour objectif de favoriser l'émergence de variants cellulaires à partir de modifications spontanées, puis de sélectionner parmi ces variants ceux ayant acquis des propriétés leur conférant un avantage compétitif sur les autres cellules en culture. En général, ces nouvelles propriétés leur permettent de se multiplier plus rapidement ou de mieux exploiter le milieu de culture.
Les variants cellulaires selon l'invention peuvent être sélectionnés selon deux modes principaux : variants en suspension : on sélectionne les variants qui sont plus compétitifs dans un développement planctonique en culture liquide. Dans ce cas, ce sont les variants statiques que l'on cherche à éliminer. variants statiques : on sélectionne les variants qui se fixent, s'agrègent, s'enkystent ou prennent tout autre forme de résistance à la dilution, par exemple sous la forme de biofilms. Dans ce cas, ce sont les variants qui se développent en suspension que l'on cherche à éliminer. Le procédé de culture cellulaire en continu permettant la sélection de variants cellulaires statiques ou proliférant en suspension selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des étapes suivantes , plus généralement les étapes suivantes, par lesquelles : a) on ensemence à l'aide d'une ou plusieurs cellules vivantes un milieu de culture liquide contenu dans un premier récipient de culture maintenu ouvert dans une enceinte fermée, b) on amène lesdites cellules, dans ledit milieu de culture, à un stade de croissance déterminé, correspondant à une densité cellulaire donnée ou bien à un paramètre physico chimique mesuré dans le milieu de culture, c) on maintient sensiblement constante la densité cellulaire dans le milieu de culture, ou la valeur dudit paramètre physico chimique, atteinte à l'étape b), par un apport de milieu de culture frais ou d'au moins un diluant dans ledit récipient de culture, d) on prélève par pipetage une partie du milieu de culture obtenue en c) contenant les cellules en suspension de sorte à maintenir le volume de la culture; e) on transfère une fraction du milieu de culture obtenue en d) dans un second récipient de culture, lequel remplace généralement le premier récipient de culture ; f) on retire, voire élimine, ledit premier récipient de culture avec la fraction de culture restante qu'il contient ; g) on sélectionne après plusieurs générations de culture dans le second récipient, les cellules proliférant en suspension et/ou les variants cellulaires statiques.
Dans l'étape c) selon l'invention, que ce soit pour le procédé selon l'invention ci-dessus ou pour l'un des procédés selon l'invention décrits ci- après, il n'est pas exclu que l'apport de milieu de culture frais ou d'au moins un diluant dans ledit récipient de culture soit aussi un apport simultané de milieu de culture frais et d'au moins un diluant. En général, par au moins un diluant, on préfère un (seul) diluant, mais il est possible d'utiliser plusieurs diluants sans sortir du cadre de l'invention.
Selon l'invention, tous les récipients de culture présents dans l'enceinte fermée sont généralement identiques, mais il est possible que les récipients de culture soient différents les uns des autres, ou soient de plusieurs types différents au sein d'une même enceinte. Selon ce procédé, il est possible de sélectionner, séparément ou simultanément, des variants cellulaires proliférant en suspension aussi bien que des variants statiques.
Lorsqu'on souhaite plus particulièrement sélectionner des variants proliférant en suspension, on peut procéder plus particulièrement de la manière suivante. Un procédé selon l'invention de culture cellulaire en continu permettant la sélection de variants cellulaires proliférant en suspension, peut être caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on ensemence à l'aide d'une ou plusieurs cellules vivantes un milieu de culture liquide contenu dans un premier récipient de culture maintenu ouvert dans une enceinte fermée, b) on amène lesdites cellules, dans ledit milieu de culture, à un stade de croissance déterminé, correspondant à une densité cellulaire donnée ou bien à un paramètre physico chimique mesuré dans le milieu de culture, c) on maintient sensiblement constante la densité cellulaire de la culture, ou la valeur dudit paramètre physico chimique, atteinte à l'étape b), par un apport de milieu de culture frais ou d'au moins un diluant dans ledit récipient de culture, d) on prélève par pipetage une partie du milieu de culture contenant les cellules en suspension de sorte à maintenir le volume de la culture; e) on transfère une fraction de la culture obtenue en d) dans laquelle les cellules sont en suspension, dans un second récipient de culture remplaçant le premier ; f) on retire ledit premier récipient de culture avec la fraction de culture restante qu'il contient ; g) on sélectionne après plusieurs générations de culture dans le second récipient les cellules proliférant en suspension.
Selon cet aspect, la fraction de la culture éliminée avec le récipient à l'étape f) est généralement constituée de variants statiques. L'étape f) est une étape de retrait, ou une étape d'élimination, ou une étape de retrait ou élimination.
Lorsqu'on souhaite plus particulièrement sélectionner des variants statiques, on peut procéder de la manière suivante: a) on ensemence à l'aide d'une ou plusieurs cellules vivantes un milieu de culture liquide contenu dans un premier récipient de culture dans lequel est placé au moins une surface solide, de préférence une plaque, ledit récipient étant maintenu ouvert dans une enceinte fermée, b) on amène les cellules, dans le milieu de culture ensemencé, à un stade de croissance déterminé, correspondant à une densité cellulaire donnée ou bien à un paramètre physico chimique mesuré dans la culture, c) on maintient sensiblement constante la densité cellulaire de la culture, ou la valeur dudit paramètre physico chimique, atteinte à l'étape b), par un apport de milieu de culture frais ou d'au moins un diluant dans ledit récipient de culture, d) on prélève par pipetage une partie du milieu de culture obtenue en c) contenant les cellules en suspension de sorte à maintenir le volume de la culture; e) on transfère ladite surface solide sur laquelle une fraction de la culture obtenue en d) s'est déposée, dans un second récipient de culture remplaçant le premier ; f) on retire ledit premier récipient de culture avec la fraction de culture restante qu'il contient ; g) on sélectionne après plusieurs générations de culture les variants cellulaires statiques fixés sur ladite surface solide.
Selon cet aspect de l'invention, la fraction de la culture éliminée avec le récipient à l'étape f) correspond le plus souvent à une fraction liquide dans laquelle sont présentes la plupart des cellules proliférant en suspension.
L'étape f) est une étape de retrait, ou une étape d'élimination, ou une étape de retrait ou élimination.
Ce mode de réalisation de l'invention fait intervenir plus particulièrement des surfaces solides. Ces surfaces solides offrent la possibilité aux variants cellulaires statiques de se fixer au cours du processus de sélection. Les surfaces solides peuvent revêtir différentes formes telles que des plaques, des billes ou des particules. Elles peuvent être constituées de différents matériaux (plastiques, métaux, verres, minéraux, composites), inorganiques ou organiques. Les matériaux plastiques comme le polystyrène, le polycarbonate, le polyéthylène, le polypropylène, le polyuréthane et leurs dérivés sont préférés. Les surfaces peuvent être traitées physiquement ou chimiquement. Elles peuvent être mises en suspension dans le milieu de culture, accrochées ou posées au fond du récipient de culture. De préférence, les surfaces solides sont conçues pour pouvoir être retirées par l'ouverture du récipient de culture, et placées dans un nouveau récipient de culture comprenant, par exemple, du milieu frais.
Selon un mode préféré du procédé, ladite surface solide est constituée d'un matériau traité pour éviter l'adhérence des cellules. En effet, le procédé peut comprendre une étape au cours de laquelle différentes surfaces sont testées afin de déterminer laquelle de ces surfaces permet une meilleure ou une moindre adhérence des variants statiques. En cela, le procédé peut être particulièrement utile pour la sélection de matériaux limitant l'adhésion des cellules en vue de mettre au point, par exemple, des matériels de chirurgie comme des cathéters limitant les contaminations.
Inversement, ce procédé peut être utile pour sélectionner des matériaux favorisant l'installation des cellules (surfaces biogènes) recherchés dans la mise au point de prothèses ou d'implants médicaux.
Le procédé selon l'invention permet avantageusement la sélection de variants cellulaires à un stade de croissance prédéfini. En effet, selon l'étape b) dudit procédé, on amène préférentiellement les cellules dans le milieu de culture à un stade de croissance, lequel est déterminé ou lié à la densité cellulaire ou à un paramètre physico-chimique mesurable dans le milieu de culture tel que le pH, la quantité d'oxygène dissout, de carbone ou d'azote disponible, etc.. Pour parvenir à ce stade de croissance « déterminé », on peut s'appuyer sur des courbes de croissance types, établies à l'avance, de manière expérimentale ou à partir de données de la littérature. Ces courbes sont généralement établies sur la base de cultures effectuées en mode discontinu. Elles permettent de relier la densité cellulaire ou un paramètre physico-chimique du milieu de culture à l'état physiologique dans lesquelles se trouvent la majorité des cellules en culture à un moment donné.
Il est connu de l'homme du métier que les cellules, au cours d'un cycle de culture passent par différents états physiologiques liés notamment à l'épuisement du milieu de culture en certains substrats, en particulier lorsqu'on ne renouvelle pas le milieu de culture. Ces états physiologiques traduisent généralement une adaptation des cellules vis-à-vis de leur environnement.
Selon un aspect préféré de l'invention, une valeur particulière d'un paramètre physico chimique mesurable est fixée, par exemple, une valeur de densité cellulaire connue pour être un paramètre déterminant de la sécrétion d'une enzyme d'intérêt. Le procédé prévoit qu'après ensemencement du milieu de culture, les cellules se développent jusqu'à atteindre la valeur fixée. Lorsque cette valeur critique est atteinte, la culture en mode continu est mise en route de sorte, par exemple, à conserver la densité cellulaire constante. Il est ainsi possible de maintenir le plus longtemps possible les cellules dans l'état physiologique désiré, ce qui permet, par exemple, de prolonger la période durant laquelle la cellule va sécréter le produit d'intérêt. Selon l'invention, les cultures de cellules sont généralement réalisées en mode ouvert, ce qui facilite les interventions et les prélèvements qu'exige le maintien à une valeur constante des paramètres physico-chimiques choisis. Cela signifie que les récipients de culture choisis pour mettre en œuvre le procédé présentent le plus souvent une ouverture suffisamment large et pratique, de préférence orientée vers le haut ou le sommet, pour pouvoir avantageusement introduire le matériel nécessaire pour effectuer des prélèvements de milieu de culture par pipetage ou effectuer des mesures directes à l'aide de sondes. Par sommet, on entend généralement le point le plus haut du récipient de culture, par rapport à une base horizontale qui peut être le sol.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que lesdits récipients de culture sont maintenus ouverts à leur sommet, et qu'on applique un flux gazeux, tel que de l'air stérile, de manière continue, en périphérie de leur ouverture.
En cela, le présent procédé se distingue des procédés de culture en mode continu ou semi continus décrits dans l'art antérieur, lesquels sont réalisés dans des récipients fermés, qui ne permettent pas d'établir un suivi en temps réel des cultures. Le procédé selon l'invention permet donc de réaliser une sélection de variants de cellules maintenues, voire synchronisées, à un stade de croissance prédéfini. Ceci est particulièrement utile pour sélectionner, par exemple, des variants de cellules qui synthétisent des produits d'intérêt de manière transitoire, comme des enzymes ou des antibiotiques. La sélection des variants cellulaires peut être ainsi mise en œuvre en reproduisant les conditions dans lesquelles les cellules synthétisent le produit d'intérêt. Le procédé selon l'invention est donc particulièrement adapté à l'amélioration de souches industrielles utilisées dans des procédés de fermentation, notamment celles utilisées en mode semi continu (c'est-à-dire ceux durant lesquels le milieu de culture est renouvelé sur une durée fixe).
Un aspect particulier de l'invention consiste, indépendamment de la sélection de variants en suspension ou de variants statiques, en la mise en oeuvre du procédé décrit précédemment pour synthétiser un produit d'intérêt sur une durée illimitée, en maintenant les cellules à un stade de croissance optimal pour la synthèse dudit produit.
Le procédé selon l'invention est généralement mis en œuvre dans une enceinte fermée, dont la dimension peut varier selon les besoins des utilisateurs, le nombre et le volume des cultures.
Plus particulièrement, selon un mode de réalisation de l'invention, les différentes étapes a) à f) sont effectuées dans une enceinte fermée.
La pression et la température peuvent être maintenues constantes dans l'enceinte aux valeurs que l'on souhaite. Les récipients de culture étant ouverts, les cultures se trouvent généralement à la même pression que celle appliquée dans l'enceinte. Les risques de surpression locale rencontrés dans les systèmes confinés de l'art antérieur sont ainsi généralement éliminés.
Ladite enceinte permet également de contrôler l'environnement gazeux des cultures, ce qui est particulièrement utile en cas de culture effectuée en anaérobiose.
Le procédé de culture prévoit le plus souvent que du gaz stérile, tel que de l'air stérile, est injecté sous pression dans le milieu de culture des cellules au moyen d'un dispositif de bullage, par exemple sous forme de tiges d'aération introduites dans le récipient de culture généralement par l'ouverture dudit récipient. Cette injection de gaz permet l'aération le milieu de culture, l'homogénéisation dudit milieu par air lift (agitation par bullage) et contribue à maintenir une certaine pression en gaz à l'intérieur de l'enceinte.
Selon le procédé, l'enceinte est préférentiellement parcourue par un flux gazeux stérile. Ce flux peut être constitué d'un gaz, tel que de l'azote ou d'un mélange de gaz tel que de l'air, en fonction des conditions de cultures choisies. De préférence, le flux gazeux stérile est appliqué en périphérie de l'ouverture des récipients de culture ouverts pour éloigner les contaminants de cette zone et donc diminuer les risques de contamination. Ce flux permet également d'équilibrer la pression à l'intérieur de l'enceinte.
Les conditions de circulation du flux gazeux stérile sont le plus souvent identiques pour tous les récipients de l'enceinte fermée. Pour une plus grande efficacité du système, le flux gazeux, qui est de préférence un flux laminaire, est généralement appliqué soit de haut en bas des récipients de culture, soit de bas en haut des récipients de culture, généralement à l'extérieur desdits récipients de culture. Le dispositif selon l'invention décrit ci-après est un dispositif dans lequel on applique (ou dirige) le flux gazeux stérile du haut vers le bas des récipients de culture.
Plus préférentiellement, le flux gazeux est activé en périphérie des récipients de culture, en particulier autour de l'ouverture desdits récipients, en créant une dépression en partie basse des récipients de culture. Pour obtenir localement cette dépression le récipient de culture peut être placé dans un bac de confinement ouvert vers le haut doté à sa base de moyens d'aspiration et d'évacuation du flux gazeux. Une dépression peut être alors obtenue localement dans le volume situé entre le récipient de culture et les parois internes dudit bac de confinement. De préférence, l'air stérile parcourt le volume situé entre les parois internes du bac de confinement et le récipient de culture de haut en bas, et il est évacué hors de l'enceinte en base des récipients de culture. De cette manière les contaminants sont piégés dans ledit volume et entraînés vers la partie basse du bac de confinement. Ainsi, ils ne pénètrent pas à l'intérieur du récipient de culture, lequel est légèrement en surpression, du fait notamment de l'apport de gaz réalisé par bullage dans le milieu de culture.
Un autre mode de réalisation comprendrait l'activation du flux gazeux stérile de bas en haut des récipients de cultures.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, plusieurs cultures sont effectuées simultanément dans plusieurs supports de culture placés dans la même enceinte. Par plusieurs, on entend au moins deux.
Le flux gazeux stérile est particulièrement utile pour éviter les contaminations croisées lorsque différentes cultures sont effectuées simultanément dans la même enceinte. Selon un aspect préféré du procédé décrit ci-dessus, on réitère les étapes a) à f) ci-dessus une ou plusieurs fois avant de procéder à l'étape g). Selon un mode de réalisation de l'invention, le maintien d'une densité sensiblement constante de cellule dans la culture à l'étape c) s'opère par dilution de la culture avec du milieu frais en conservant un volume constant de milieu de culture dans le récipient de culture. Dans le cas d'une sélection de variants en suspension, le transvasement du milieu de culture contenant les cellules en suspension dans le second récipient de culture peut être opéré par pipetage à l'aide d'une pipette stérile. L'opération de pipetage est de préférence effectuée à l'aide d'un bras robotisé situé à l'intérieur de l'enceinte fermée. Le premier récipient de culture usagé, est généralement retiré du support de culture auquel il peut appartenir. Dans tous les cas, ce premier récipient de culture est évacué en dehors de l'enceinte fermée à l'aide d'un sas. Ce sas permet de maintenir stable la pression et la stérilité à l'intérieur de l'enceinte. Le récipient évacué est généralement éliminé. Le récipient de culture en opération peut être placé dans une alvéole thermostatée, c'est-à-dire dans une enceinte ouverte dont les parois sont maintenues à la température souhaitée, permettant la régulation de la température de la culture cellulaire. Selon un aspect préféré, le bac de confinement est lui-même thermostaté et sert d'alvéole. Une des parois du bac peut, en effet, comprendre un moyen de chauffage permettant la régulation de la température des objets placés dans le volume intérieur dudit bac. Dans le cas de la présence d'une alvéole thermostatée autour du récipient de culture, l'espace entre le récipient de culture et les parois internes du bac de confinement doit bien sûr être compris comme l'espace entre l'étui thermostaté et le bac de confinement.
Les supports de culture et/ou les récipients de culture selon l'invention sont préférentiellement à usage unique et compatibles avec une manipulation robotisée à l'intérieur de l'enceinte. En effet, l'invention prévoit de préférence qu'au moins certaines, c'est-à-dire plusieurs, étapes du procédé soient effectuées à l'aide d'un ou plusieurs bras automatisés permettant des déplacements à l'intérieur de l'enceinte. De préférence l'enceinte reste fermée au cours des différentes étapes du procédé. Selon l'invention les cellules sont généralement cultivées de manière continue sur un nombre de générations supérieur à 102, de préférence supérieur à 104, plus préférentiellement supérieur à 106, et encore plus préférentiellement supérieur à 1010 générations, sans ouverture (directe) de l'enceinte sur le milieu extérieur.
De préférence, le procédé de culture selon l'invention en mode continu ouvert est mis en œuvre à l'aide d'un dispositif de culture particulièrement adapté à cet effet.
L'invention concerne aussi un support de culture permettant d'effectuer une culture cellulaire en mode continu ouvert, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un récipient de culture ouvert à son sommet propre à contenir un milieu de culture liquide ; au moins un bac de confinement ouvert vers le haut, dans lequel est logé ledit récipient de culture ; un espace entre ledit récipient de culture et ledit bac de confinement, propre à laisser circuler un flux gazeux à la périphérie de l'ouverture du récipient, du haut vers le bas, entre le récipient de culture et les parois internes du bac de confinement; et - un moyen d'extraction dudit flux gazeux, situé dans la partie inférieure du bac de confinement.
De préférence, le moyen d'extraction du flux gazeux consiste un ou plusieurs orifices laissant passer le flux gazeux, par exemple l'air.
Dans un mode de réalisation, le support de culture se présente sous la forme d'un bloc amovible dans lequel plusieurs desdits bacs de confinement sont regroupés et dans lesquels sont logés au moins un desdits récipients de culture.
De façon préférée, ladite partie inférieure du bac de confinement s'encastre sur une base munie de moyens complémentaires d'extraction dudit flux gazeux circulant entre les récipients de culture et les parois des bacs de confinement, tel qu'un tuyau relié à une pompe à vide, ou bien un ou plusieurs moyens de distribution de gaz. Le support de culture selon l'invention peut comprendre au moins un moyen de régulation de la température du volume interne dudit bac de confinement, ledit moyen de régulation de la température du volume interne dudit bac de confinement consistant de préférence en une résistance chauffante incluse dans l'une au moins des parois dudit bac de confinement. Le support de culture selon l'invention peut comprendre au moins au moins un moyen d'injection d'air dans le(s) milieu(x) de culture, contenu(s) dans le(s)dit(s) récipient(s), tel qu'une ou plusieurs tige(s) d'aération.
Le support de culture selon l'invention peut comprendre au moins un moyen de mesure optique de la densité des cellules présentes dans le milieu de culture que contient le récipient de culture.
Le support de culture selon l'invention peut comprendre au moins un moyen de production de lumière pour la culture de microorganismes en mode autotrophique, situé dans l'espace entre le récipient de culture et les parois internes dudit bac de confinement, ou bien inclus dans une des parois dudit bac de confinement.
L'invention concerne enfin un dispositif de culture cellulaire permettant une croissance continue des cellules en mode ouvert, caractérisé en ce qu'il comporte : - une enceinte ; un moyen de génération d'un flux gazeux stérile parcourant ladite enceinte ;
- un ou plusieurs supports de culture selon l'invention tel que décrit précédemment, positionné(s) dans ladite enceinte, permettant d'effectuer une culture cellulaire en mode ouvert.
Le dispositif de culture cellulaire peut comprendre au moins un moyen de renouvellement du milieu de culture placé à l'intérieur de ladite enceinte.
Le dispositif de culture cellulaire peut comprendre au moins un récipient de culture adapté pour remplacer celui contenu dans le support de culture.
Le dispositif de culture cellulaire peut être caractérisé en ce que le moyen de génération du flux gazeux stérile est placé dans la partie supérieure de l'enceinte de sorte à ce que ledit flux gazeux stérile se dirige du haut vers le bas du support de culture.
Le dispositif de culture cellulaire peut comprendre, en outre, au moins un moyen d'extraction du flux gazeux stérile en base dudit récipient de culture, ledit moyen d'extraction du flux gazeux stérile créant de préférence une dépression dans l'espace situé entre le récipient de culture et le bac de confinement du support de culture. Ledit moyen d'extraction peut être associé à au moins un moyen d'aspiration de l'air adapté à aspirer l'air entourant la périphérie de l'ouverture du récipient de culture. Le dispositif de culture cellulaire peut être caractérisé en ce que le moyen de renouvellement du milieu de culture comporte un moyen de transvasement d'une partie du contenu du récipient de culture vers une zone d'évacuation.
Le dispositif de culture cellulaire peut être caractérisé en ce que le moyen de renouvellement du milieu de culture comporte un moyen de transvasement de milieu frais depuis une réserve située à l'intérieur de l'enceinte vers le récipient de culture.
Le moyen de transvasement comprend de préférence une pipette et un moyen d'aspiration du milieu frais ou usagé dans ladite pipette. Le dispositif de culture cellulaire peut comporter, en outre, au moins un moyen de sortie vers l'extérieur de l'enceinte du moyen de transvasement et/ou d'au moins un récipient de culture, ledit moyen de sortie comportant de préférence un sas.
Le dispositif de culture cellulaire peut être caractérisé en ce qu'il comporte au moins un moyen d'injection d'air dans la culture.
Le dispositif de culture cellulaire peut être caractérisé en ce qu'il comporte au moins un bras automatisé adapté à effectuer des déplacements à l'intérieur de l'enceinte.
Le dispositif de culture cellulaire peut être caractérisé en ce que l'enceinte est fermée. Le dispositif de culture cellulaire peut comprendre plusieurs supports de culture positionnés dans ladite enceinte, pour effectuer en parallèle plusieurs cultures cellulaires en mode ouvert.
Le dispositif de culture cellulaire peut être caractérisé en ce qu'il permet la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
L'invention sera mieux comprise à la lecture des Figures suivantes, parmi lesquelles :
La Figure 1 représente schématiquement un premier support de culture selon l'invention, en perspective ;
La Figure 2 représente schématiquement un deuxième support de culture selon l'invention, en perspective ;
La Figure 3 représente schématiquement un bloc amovible comportant alvéoles pour des supports de culture tels que présentés sur la Figure 2, en coupe III - III par rapport à la Figure 4 ;
La Figure 4 représente un bloc amovible comportant alvéoles de la Figure 3, en vue de dessus ;
La Figure 5 représente schématiquement et partiellement un dispositif de culture cellulaire selon l'invention, en perspective ; Les Figures 6 à 10 représentent chacune schématiquement un plan d'exploitation d'un procédé de culture cellulaire en continu selon l'invention, dans une enceinte fermée (non représentée) utilisant un support de culture quelconque, chaque Figure correspondant des étapes spécifiques de l'exploitation, - la Figure 7 représentant des étapes initiales d'une culture cellulaire ;
- la Figure 8 représentant des étapes de changement de récipient de culture ; et
- la Figure 9 représentant des étapes de prélèvement de milieu de culture ; et
- la Figure 10 représentant des étapes de prélèvement de micro échantillon pour l'analyse. La Figure 1 représente schématiquement un premier support de culture 1 selon l'invention, ouvert vers le haut, propre à contenir un milieu de culture liquide. Le support 1 comprend un récipient de culture 6 logé dans un bac de confinement 2 ouvert vers le haut, dans lequel est logé ledit récipient de culture. Le récipient de culture est placé dans un étui thermostaté 3, lequel est facultatif selon l'invention.
Le milieu de culture (représenté en remplissage - pointillés - sur la Figure 1 ) est susceptible d'être alimenté en gaz, par exemple en air, le plus souvent sous pression, par un dispositif de bullage constitué ici d'une tige d'aération 4 sous la forme par exemple d'une canne de bullage. Cette tige 4, maintenue à l'aide d'un bras 5 plonge verticalement dans le récipient de culture 6, où se trouve le milieu de culture, par l'ouverture du récipient de culture 6. Le bras 5 peut effectuer un mouvement vertical pour positionner l'extrémité inférieure de la tige 4 à l'endroit désiré dans le récipient de culture 6.
Les flèches creuses dirigées vers le bas sur la Figure 1 symbolisent le flux gazeux stérile, qui est par exemple de l'air stérile, qui circule de haut en bas et qui traverse l'espace, ou volume, 7 situé entre la paroi intérieure du bac de confinement 2 et l'étui thermostaté 3. Le flux gazeux stérile est évacué par plusieurs orifices d'évacuation 8. Les orifices d'évacuation 8 représentent un moyen d'extraction du flux gazeux, et sont situés dans la partie inférieure, de préférence en base, du bac de confinement 2. Le récipient de culture 6 peut consister en tout type de récipient ouvert vers le haut, du type fiole, bouteille ou Erlen. Il est préférable que le récipient de culture 6 puisse se positionner et se retirer facilement du bac de confinement 2. Comme cela est représenté sur la Figure 1 , il est avantageux de choisir un récipient de culture 6 qui ne dépasse pas en hauteur les parois du bac de confinement 2.
Le flux gazeux stérile dont la circulation peut être organisée du haut vers le bas du support de culture 1 , est conçu pour créer une barrière aseptique autour de l'ouverture du récipient de culture 6, délimitée par les parois internes du bac de confinement 2.
Ce flux gazeux peut être activé en créant une dépression dans la partie inférieure du bac de confinement 2, par exemple en reliant les orifices d'évacuation 8 à un moyen d'aspiration.
La partie inférieure du bac de confinement 2 est de préférence conçue pour s'encastrer sur une base munie de moyens complémentaires d'extraction dudit flux gazeux stérile, tel qu'un tuyau relié à une pompe à vide. Le cas échant, ladite base peut être munie d'un ou plusieurs moyens de collecte ou de distribution de flux gazeux, utiles à la mise en œuvre du procédé de culture en mode continu.
La Figure 2 représente schématiquement un deuxième support de culture selon l'invention, 1 ', en perspective. Le support de culture 1 ' comporte un récipient de culture 6' qui est présent dans un bac de confinement 2', représenté ici en transparence. Le récipient de culture 6' et le bac de confinement 2' sont tous deux ouverts vers le haut. Le récipient de culture 6' est apte à se positionner et se retirer facilement du bac de confinement 2', car il ne dépasse pas en hauteur les parois du bac de confinement 2'. Le récipient de culture 6' comporte un milieu de culture 11.
Un espace T est défini entre le récipient de culture 6' et les parois internes du le bac de confinement 2', ledit volume 7'apte à être traversé par un flux gazeux de bas en haut. Les moyens d'évacuation dudit flux gazeux stérile ne sont pas représentés ici, mais ils consistent en plusieurs orifices situés dans la base du bac de confinement 2'.
Deux moyens de mesure optique de la densité 9 des cellules présentes dans le milieu de culture sont disposés de part et d'autre du récipient de culture 6' transparent, et dans l'espace 7'. A l'intérieur du récipient de culture 6', une paroi interne verticale 10 est présente. Elle permet une meilleure circulation du gaz injecté en « air lift » dans le milieu de culture 11 au travers de la tige d'aération 4. Les Figures 3 et 4 représentent un support de culture 1 " préféré selon l'invention prenant la forme d'un bloc amovible 12, comportant six alvéoles, ou compartiments, 24, 25, 26, 27, 28 et 29, dans lesquelles sont insérés des bacs de confinement 16. La Figure 4 représente le bloc 12 en vue de dessus, et la Figure 3 représente le bloc 12 en coupe transversale III - IM (Cf. Figure 4).
Le bloc 12 comporte quatre récipients de cultures 6', comportant eux-mêmes des parois 10, et logés chacun dans une alvéole 25, 26, 28 et 29 du bloc 12. Chaque récipient de culture 6' peut être placé manuellement dans une alvéole. Le bloc 12 est préférentiellement fait d'une pièce. Le bloc 12 se présente en fait comme si plusieurs supports de culture 1 ' tels que représentés sur la Figure 2, et décrits précédemment, se trouvaient accolés par la paroi externe de leurs bacs de confinement 2'. Les alvéoles sont munies de parois à leur périphérie formant bacs de confinement 16. Des moyens de distribution de gaz, collecteur et filtre contenus dans un module d'aération 13 se prolongent par des tiges d'aération individuelles 4 pour atteindre chacun des récipients de culture 6'. Le flux gazeux stérile parcourant le support de culture 1 " de haut en bas est symbolisé par des flèches creuses, tandis que le trajet du gaz alimentant les milieux de culture est représenté par des flèches pleines et des bulles de gaz. Cette circulation de flux gazeux stérile, de préférence permanente, assure le confinement de chaque récipient de culture 6' quand le bloc 12 est placé dans une enceinte fermée. Ce bloc de culture 12 peut être thermostaté par la présence de résistances chauffantes incorporées dans sa masse. Le flux gazeux stérile est évacué en base de chacune des alvéoles comportant un récipient de culture 6' par des moyens d'évacuation 14 prenant la forme de tuyaux destinés à être raccordés à un moyen d'aspiration de l'air telle qu'une pompe à vide.
Dans sa partie centrale basse, le bloc 12 comporte préférentiellement une rampe collectrice et distributrice du ou des gaz d'aération. Ces gaz sont acheminés à l'intérieur de chaque récipient de culture 6' au moyen d'une tubulure coudée amovible 4, terminée en tige d'aération 4 à l'extrémité qui plonge dans le récipient de culture 6', et qui peut être positionnée manuellement sur la rampe distributrice au niveau de connecteurs, après l'installation des récipients de culture 6'. Ces tubulures coudées amènent les gaz dans chaque récipient de culture 6' en position basse afin de provoquer un « air lift » destiné à assurer l'apport d'oxygène, de gaz carbonique ou d'autre(s) gaz dans le milieu de culture et à assurer un mélange homogène du milieu de culture.
Des panneaux latéraux lumineux, ou plaques éclairantes, 15, sont disposés dans deux alvéoles 25 et 26, latéralement, pour permettre la culture de microorganismes photosynthétiques. Les plaques 15 sont de préférence amovibles et sont des panneaux de production de lumière permettant la culture de microorganismes photosynthétiques, et sont situées dans l'espace entre le récipient de culture 6' et les parois internes du bac de confinement 16, ou bien inclus dans une des parois du bac de confinement 16. De préférence, la lumière est produite à l'aide de diodes lumineuses (LED), dont la longueur d'onde est choisie en fonction des pigments photosynthétiques des microorganismes concernés.
La lumière émise peut correspondre à de la lumière blanche ou à des lumières de différentes longueurs d'ondes selon le type de LED utilisées. De plus, un régime d'éclairage stroboscopique est réalisable selon le mode de fonctionnement des LED. Ces possibilité d'éclairage permettent la culture de microorganismes photosynthétiques comme les microalgues prokaryotiques ou eukaryotiques, plus particulièrement en mode autotrophique, notamment en associant l'éclairage et l'utilisation de CO2 dans les gaz d'aération et de mélange introduit dans les cultures.
Par mode autotrophique, on entend une culture dans laquelle les cellules produisent de la matière organique en procédant à la réduction de matière inorganique, par exemple sous forme de dioxyde de carbone, et par prélèvement de sels minéraux dans le milieu. L'énergie nécessaire à cette synthèse provient de la lumière, comme dans le cas par exemple de la photosynthèse. Le support de culture selon l'invention permet donc d'éclairer, le cas échéant, les cellules de manière continue à chacune des étapes du procédé selon l'invention.
Selon une variante non représentée, le moyen de production de lumière peut aussi prendre la forme d'un panneau formant tout ou partie d'une des parois du bac de confinement.
Selon un aspect particulier de l'invention, les moyens de production de lumière consistent en des lampes ou diodes UV ayant pour fonction, soit de décontaminer le volume intérieur du bac de confinement par irradiation avant ou après utilisation, soit de générer des mutations sur les cellules en culture au cours du procédé de sélection.
Des moyens de mesure optique 9, qui sont des fourches de mesure de la turbidité du milieu de culture, sont insérés, par paire, en partie basse de chacune des alvéoles 24, 25, 26, 27, 28 et 29 pour suivre l'évolution de la densité cellulaire des milieux de culture présents dans ces alvéoles.
Les supports de culture sous forme de blocs 12 décrits plus haut présentent l'intérêt de faciliter la mise en œuvre du procédé de culture continue selon l'invention. En effet, plusieurs récipients de culture 6' peuvent être préparés et placés dans une enceinte stérile avant le début des opérations. La connexion de la rampe distributrice au système d'apport des gaz à l'intérieur de l'enceinte se fait par un raccord rapide au moment du positionnement d'un bloc sur une embase spécifique du dispositif de culture selon l'invention, lequel peut d'ailleurs accueillir plusieurs de ces blocs. De même, il est prévu que les raccordements électriques nécessaires (chauffage, détecteurs, éclairage) s'effectuent lors du placement d'un bloc sur une embase par simple branchement. Un tel bloc facilite la manutention pré-opératoire et, par la suite permet de réduire les déplacements automatisés qui s'opèrent à l'intérieur de l'enceinte fermée durant la mise en œuvre du procédé de culture. Le dispositif peut alors fonctionner en autonomie sur une durée plus longue.
Selon un mode préféré de l'invention, le dispositif de culture est un automate pouvant comprendre un nombre de blocs amovibles 12 à six cuves pouvant varier de un à 100. Chacun des blocs 12 est conditionné manuellement, stérilisé puis introduit dans l'automate sur une embase prévue à cet effet. Lorsque les blocs 12 sont installés, le procédé de culture sélective peut démarrer par le remplissage d'un récipient de culture, son inoculation, puis la réalisation d'une culture continue à volume constant selon le procédé déjà décrit. Il est ainsi possible de réaliser en parallèle un grand nombre de cultures continues, chaque bloc 12 pouvant être le lieu d'une expérience indépendante.
Lorsqu'une culture nécessite son transfert, par exemple parce que l'accumulation de variants statiques devient trop importante, un volume de culture d'un premier récipient de culture du bloc 12 est pipeté et transféré à un second récipient de culture du même bloc. Lorsque tous les récipients de culture d'un bloc 12 ont été utilisées, la culture peut être transférée dans un récipient de culture d'un autre bloc 12 disponible, tandis que le bloc complètement utilisé peut être remplacé par un nouveau bloc conditionné muni de six nouveaux récipients de culture stériles.
L'utilisation du dispositif muni de supports de culture sous la forme de blocs permet, en outre, de simplifier les fonctions robotisées de pipetages, de dilution, et de transfert. Un dispositif selon l'invention peut mener la culture sélective d'une seule espèce microbienne ou d'un consortium microbien donné dans dix, vingt ou au moins quarante blocs soit 60, 120 ou au moins 240 cuves simultanément afin d'atteindre un volume total de culture pouvant atteindre 1200, 2400 ou au moins 4800 mL. De la sorte, on augmente d'autant la probabilité d'obtenir un mutant donné. Cette augmentation est particulièrement intéressante pour les cellules à génome complexe ou pour celles d'espèces à croissance lente.
La Figure 5 représente un dispositif de culture en continu 100 selon l'invention. Une enceinte 17, qui est fermée lorsque le dispositif 100 est en opération, est suggérée mais non représentée complètement.
Le dispositif 100 comprend plusieurs supports de culture 1 , tels que représentés sur la Figure 1 , l'enceinte 17 et un moyen de génération de flux gazeux stérile 23 parcourant ladite enceinte 17. Les supports de culture 1 fonctionnent en parallèle dans l'enceinte 17. L'enceinte 17 est parcourue par un bras robotisé 19 monté sur un rail, capable de se déplacer dans les trois dimensions de l'espace. Ce bras robotisé 19 est équipé d'une pipette de transfert 20 permettant le renouvellement du milieu de culture, d'une pipette de dilution 21 et d'une pince de manipulation 22.
La taille de l'enceinte 17 n'est pas limitée, ce qui permet que plusieurs cultures soient effectuées simultanément dans plusieurs supports de culture, identiques 1 ou différents, placés dans la même enceinte 17. Le flux gazeux stérile qui traverse l'enceinte 17 est représenté par des flèches creuses depuis le moyen 23 située en hauteur de l'enceinte 17 de sorte que ledit flux gazeux stérile se dirige du haut vers le bas du support de culture 1. Le flux gazeux stérile qui parcourt l'enceinte 17 est évacué hors de l'enceinte 17 par des orifices 8 situés en base des supports de culture 1. De préférence le moyen d'extraction du flux gazeux stérile est conçu de sorte à créer une pression négative dans l'espace situé entre le récipient de culture 1 et le bac de confinement 2 du même support de culture 18. Il est généralement associé à un moyen d'aspiration de flux gazeux adapté à aspirer le flux gazeux entourant la périphérie de l'ouverture du récipient de culture, tel qu'une pompe à vide (non représentée) située, par exemple, sous le plancher de l'enceinte 17.
Les Figures 6 à 10 représentent chacune schématiquement un plan d'exploitation d'un procédé de culture cellulaire en continu selon l'invention, dans une enceinte fermée (non représentée) utilisant un support de culture quelconque, chaque Figure correspondant à un schéma fonctionnel explicitant des étapes spécifiques de l'exploitation,
- la Figure 7 représentant des étapes initiales d'une culture cellulaire ; - la Figure 8 représentant des étapes de changement de récipient de culture ; et - la Figure 9 représentant des étapes de prélèvement de milieu de culture ; et
- la Figure 10 représentant des étapes de prélèvement de micro échantillon pour l'analyse. Les Figures 6 à 10 sont décrites dans les exemples suivants.
Les exemples suivants ont pour but de décrire le fonctionnement d'un dispositif de culture automatique selon l'invention désigné « BED ». Il s'agit d'un dispositif préféré selon l'invention qui n'impose aucune limitation à l'invention revendiquée dans la présente demande.
EXEMPLES
Le plan d'exploitation d'un procédé de culture cellulaire en continu selon l'invention, dans une enceinte fermée (non représentée) utilise un support de culture quelconque, plutôt de type du support de culture chaque Figure correspondant à un schéma fonctionnel explicitant des étapes spécifiques de l'exploitation d'un dispositif de culture en continu selon l'invention, dans une version comprenant :
- quatre supports de cultures 11, I2, 13 et 14 comprenant chacun un seul bac de confinement 2i, 22, 23 et 24 et un seul récipient de culture 6'i, 6'2, 6'3 et 6'4. Chaque support de culture est équipé d'un bras bulleur 5i, 52, 53 et 54, destiné à être lié à une tige d'aération (ou cane de bullage) stérile, d'un stock de tiges d'aération 4i, 42, 43 et 44 (non représentées), et d'un sas d'éjection du récipient de culture 181 , 182, 183 et 184,
II est possible, dans une variante, de considérer que les références 11 , 12, 13 et 14 représentent des blocs de culture de type bloc amovible 12 comportant plusieurs (par exemple deux, quatre, six ...) récipients de culture. - une réserve (ou stock) de récipients de culture stériles SR,
- une réserve (ou stock) de pipettes de transfert SPT, - une réserve (ou stock) de pipettes de dilution SPD pour ajouter du milieu de culture frais,
- un stock de milieu de diluant SMCD ou de milieu de culture stérile,
- un sas d'échantillonnage SE pour sortir les échantillons hors de l'enceinte
- un sas d'éjection des pipettes et de matériel contaminé SEPM,
- Un sas de station d'analyse SA permettant d'introduire du matériel ou des réactifs ou autres pour procéder à des mesures,
- un bras articulé multifonction parcourant l'enceinte dans la longueur, le périmètre de déplacement, en trois dimensions, du bras étant repéré par la zone Di9 ;
Les pipettes de transfert ont généralement un volume approchant du volume d'un récipient de culture, c'est-à-dire le plus souvent 20 à 30 ml_, et sont destinées à transporter la majeure partie du milieu de culture d'un récipient de culture à un autre. Les pipettes de dilution ont, elles, généralement un volume beaucoup plus faible, par exemple le plus souvent de 2 à 3 m L.
Les flèches et les références du type Txy, où x est le numéro de la Figure et y le numéro du trajet pour ladite Figure, indiquent le parcours du bras articulé au début de la culture (Figure 6), au cours d'une opération de dilution (Figure 7), au cours d'une opération de changement d'un récipient de culture (Figure 8), au cours d'une opération de prélèvement d'un échantillon de culture (Figure 9), et au cours d'une opération de prélèvement d'un échantillon de culture pour analyse à l'intérieur de l'enceinte fermée (Figure 10).
Fonctionnement du dispositif BED
Cycle de fonctionnement de base
1 °) Etapes initiales d'une culture
L'opérateur installe dans l'enceinte du dispositif, dans les aires de stockage respectives, les chargeurs/portoirs suivants : - Cuves (ou récipients de culture) stériles de cultures,
- Pipettes de transfert stériles,
- Pipettes de dilutions stériles,
- Les canes de bullages ou tiges d'aération, stériles, destinées à être liées aux bras bulleurs 5i, 52, 53 et 54, ,
L'opérateur installe dans le dispositif de culture cellulaire, dans les aires de stockage respectives, les réservoirs stériles fermés contenant les différents diluants.
L'opérateur ouvre les réservoirs contenant les différents diluants. L'opérateur installe dans le robot à l'emplacement dédié le récipient de culture stérile fermé contenant la culture pure n°1.
L'opérateur ouvre ledit récipient de culture.
Le bras articulé automatisé multi fonctions saisit une cuve sur son portoir dans le réservoir SR (Figure 6, trajet 1 T6i), et la transporte jusqu'au support de culture dédié à cette culture (Figure 6, trajet 2 T62)- Dans le cas représenté à la Figure 6, le premier support de culture 1 i est rempli par la culture pure n°1 dans une cuve ou récipient de culture 6'i, puis successivement, comme expliqué ci-après, les trois autres supports de culture 12, 13 et 14 sont remplis par un milieu de culture, par transfert grâce à une pipette de transfert à partir d'un support de culture dans une la cuve ou récipient de culture correspondant 6'2, 6'3 et 6'4.
Le bras articulé automatisé multi fonctions perce le film protecteur du récipient de culture (cuves stériles).
Le bras articulé automatisé multi fonctions prélève une pipette de transfert sur son portoir dans le réservoir SPT (Figure 6, trajet 3 T63).
Le bras articulé automatisé multi fonctions, équipé d'une pipette de transfert, prélève la culture dans le tube contenant la culture (Figure 6, trajet 4 T64).
Le bras articulé automatisé multi fonctions transporte la culture jusqu'au support correspondant et vide la pipette de transfert dans le récipient de culture (Figure 6, trajet 5 T6s). Le bras articulé automatisé bulleur prélève une cane de bullage stérile, puis positionne la cane de bullage stérile dans le récipient de culture (Figure 6, trajet 6 T66)-Le bras articulé automatisé bulleur ouvre l'alimentation en gaz.
2°) Culture en régime continu
Le dispositif automatique reçoit le signal de déclenchement donné par le détecteur situé dans le support de culture. Celui-ci est programmé pour suivre un paramètre physico chimique et d'émettre un signal quand on atteint une valeur critique de ce paramètre.
Le bras articulé automatisé prélève alors une pipette de dilution stérile dan le réservoir correspondant SPD (Figure 7, trajet 1 T71). Le bras articulé automatisé prélève un volume déterminé d'un diluant n°1 puis prélève une bulle d'air stérile pour maintenir la stérilisation durant le transport (Figure 7, trajet 2 T72).
Le bras articulé automatisé recommence cette opération n fois pour prélever le volume désiré de n diluants. Le bras articulé automatisé multi fonctions transporte la pipette de dilution jusqu'au support correspondant et vide la pipette de dilution dans la cuve de culture (Figure 7, trajet 3 T73).
Le bras articulé automatisé multi fonction positionne la pipette de dilution pour l'évacuation du surplus de volume. Le bras articulé automatisé multi fonction évacue le surplus de volume, 2 modes d'évacuation sont possibles : a) soit le bras articulé automatisé multi fonction positionne la pipette de dilution dans la culture et prélève un volume déterminé de culture puis aspire une bulle d'air, ou b) le bras articulé automatisé multi fonction positionne la pipette de dilution à une hauteur déterminée dans la cuve de culture (correspondant au volume de culture désiré) et aspire le tout le volume de culture en excès puis aspire une bulle d'air.
Le bras articulé automatisé multi fonction transporte la pipette de dilution contenant le surplus de culture au dessus du sas d'éjection qui joue le rôle de la station d'évacuation des liquides / poubelle le plus proche (pour maintenir la stérilisation) et vide le contenu de la pipette de dilution dans ledit sas d'éjection 18i, I 82, 183 ou 184 (Figure 7, trajet 4 T74)
De même, le bras articulé automatisé multi fonction transporte la pipette de dilution vide au dessus du sas d'éjection qui joue le rôle de la station d'évacuation des solides / poubelle le plus proche (pour maintenir la stérilisation) et éjecte la pipette de dilution dans ledit sas d'éjection 181, 182, 183 ou I 84 (Figure 7, trajet 4 T74)
3°) Changement de cuve
Le dispositif automatique détecte le signal de déclenchement d'un changement de récipient de culture soit à la fin d'un cycle de temps déterminé soit suite à la détection d'un biofilm.
Le bras articulé automatisé multi fonctions saisit une cuve sur son portoir dans le réservoir SR et la transporte jusqu'à la position transitoire dédiée à cette culture (Figure 8, trajets 1 et 2 T8i et T82).
Le bras articulé automatisé prélève une pipette de transfert stérile dans le réservoir SPT (Figure 8, trajet 3 T83)
Le bras articulé automatisé bulleur ferme l'alimentation en gaz et sort la cane de bullage usagée de la culture.
Le bras articulé automatisé bulleur éjecte la cane de bullage usagée dans le sas d'éjection qui joue le rôle de la station d'évacuation des solides / poubelle le plus proche (pour maintenir la stérilisation) et éjecte la cane usagée dans ledit sas d'éjection 181, I 82, 183 ou 184. Le bras articulé automatisé prélève la culture.
Le bras articulé automatisé multi fonctions transporte la pipette de transfert contenant la culture jusqu'à la nouvelle cuve dans la position transitoire dédiée à cette culture et vide la pipette de transfert dans la nouvelle cuve de culture (Figure 8, trajet 4 T84).
Le bras articulé automatisé multi fonction transporte la pipette de transfert vide au dessus du sas d'éjection qui joue le rôle de la station d'évacuation des solides / poubelle le plus proche (pour maintenir la stérilisation) et éjecte la pipette de transfert dans ledit sas d'éjection 18i, I 82,
I 83 ou 184 (Figure 7, trajet 4 T74) (Figure 8, trajet 5 T85).
Le bras articulé automatisé bulleur prélève une cane de bullage stérile (Figure 8, trajet 6 T86). Le bras articulé automatisé bulleur positionne la cane de bullage stérile dans la cuve de culture.
Le bras articulé automatisé bulleur ouvre l'alimentation en gaz
Le récipient de culture est éjecté via le sas d'éjection (Figure 8, trajet 7 T87).
4°) Sélection de microorganismes se développant en suspension :
Les cultures sont réalisées dans un récipient de culture (cuves en plastique jetables) dans un support de culture tel que représenté sur la Figure 1.
Ce récipient de culture jetable peut être régulièrement remplacé, lorsque c'est nécessaire (développement de biofilm) par un nouveau récipient stérile via l'action d'un bras robotisé, comme décrit plus haut.
Une vue d'ensemble du dispositif de culture est par exemple donnée sur la Figure 5.
Lors d'un changement de cuve, le bras assure le pompage du milieu dans une pipette stérile pendant l'échange des cuves de culture, puis replace le milieu de culture dans la nouvelle cuve stérile (fonction d'échange du contenant). Ce bras robotisé assure, en outre, les fonctions de pipetage d'une partie de la culture et de remplacement du volume prélevé par le même volume de milieu frais (fonction de dilution), la fréquence de dilution peut être fixée par l'expérimentateur (chemostat) ou pilotée par la densité cellulaire de la culture (turbidostat).
Tout objet physique entrant en contact avec la culture (tube d'aération, pipette de transfert, cônes de dilution) est remplacé après chaque usage par un nouvel objet stérile.
Le contenant (= la cuve de culture) est placée dans un étui métallique thermostaté permettant de garder la culture à une température contrôlée. Cet étui est équipé d'une ou plusieurs fourches (émetteur/récepteur à différentes longueurs d'onde) permettant de mesurer la densité cellulaire (visible, IR) dans la cuve, ainsi que la concentration de certaines molécules absorbantes.
La cuve de culture et l'étui thermostaté sont situés dans un bac de confinement à l'intérieur duquel un flux gazeux stérile, par exemple de l'air stérile, s'écoule en permanence autour de l'étui et de la cuve de manière à réaliser un confinement stérile constant de cette dernière (voir Figure 1 ).
De la sorte, seuls les organismes se développant en mode suspensif (et donc soumis à la dilution) sont maintenus en croissance sur le long terme en conditions sélectives.
Du fait de l'utilisation de cuves et accessoires à usage unique jetables et de l'absence de réseau fluidique complexe, le système ne nécessite pas d'opérations complexes et longues de stérilisation.
Toutes les cuves en place du système sont fonctionnelles et assurent le développement de cultures sélectives.
Par ailleurs, le système permet de piloter la culture soit à degré de dilution constant et à volume constant avec compensation de l'évaporation, soit à degré de dilution variable sans compensation de l'évaporation, soit encore à degré de dilution variable avec compensation de l'évaporation.
La possibilité d'apports moléculaires en phase liquide finement contrôlés via l'action du bras robotisé, permet d'envisager la modulation précise des pressions de sélection appliquées aux cultures pour un nombre important de constituants sans nécessiter la multiplication de branches dédiées du réseau fluidique. Par ailleurs, l'ajout de produits difficiles à manipuler (comme par exemple l'acétaldéhyde qui est volatile et réactif) est possible sans devoir faire transiter ce produit par un réseau fluidique complexe.
De plus, le système permet d'envisager l'ajout de particules solides comme des cellules immobilisées en billes d'alginate, de liquides non miscibles à l'eau et de divers additifs impossibles à véhiculer pratiquement en phase aqueuse dans un réseau fluidique complexe.
Par ailleurs, le prélèvement de parties aliquotes de faible volume peut être réalisée via le bras robotisé de manière stérile à n'importe quel moment de la culture pour être transféré à tout type d'équipement analytique
(HPLC, PCR, ELISA , MS...) externes au système BED et dont les résultats peuvent être intégrés pour le contrôle de la culture en cours.
En outre le système permet d'utiliser différentes formes de cuves de culture selon les besoins des exigences de culture des microorganismes.
5°) Sélection de microorganismes se développant sous forme de biofilms
Le dispositif décrit précédemment permet l'ajout de plaques de différents matériaux dans la cuve de culture via le bras robotisé pour la sélection de cellules se développant sous forme de biofilms.
La fraction de la culture qui, fixée sur ces plaques, peut être conservée tandis que le milieu de culture contenant les cellules en suspension retiré et remplacé par du milieu frais. De même les plaques recouvertes de biofilms peuvent être déplacées à l'aide du bras robotisé dans un nouveau récipient de culture stérile.
De cette manière, il est possible de sélectionner des variants cellulaires qui développent la capacité de se fixer sur un support ou de s'agréger pour former des structures telles que des biofilms.
Actions complémentaires optionnelles
1°) Ajout d'un réactif Tous types de réactifs peuvent être considérés dans ce cadre par exemple des produits chimiques des produits biochimiques (protéines, ADN etc.), biologiques (suspensions cellulaires) etc ..
Le robot détecte le signal de déclenchement de l'ajout d'un réactif. Le bras articulé automatisé prélève une micropipette de réactif stérile.
Le bras articulé automatisé transporte la micropipette de réactif stérile jusqu'au réservoir contenant le réactif désiré.
Le bras articulé automatisé prélève un volume négligeable devant le volume total de culture déterminé du réactif (par exemple 25 μL de réactif) puis prélève une bulle d'air stérile.
Le bras articulé automatisé multi fonctions transporte la micropipette contenant le réactif jusqu'à l'incubateur correspondant et vide la pipette de dilution dans la cuve de culture Le bras articulé automatisé multi fonctions rince le la paroi de la micropipette par un cycle d'aspirations et refoulements dans la micropipette
Le bras articulé automatisé multi fonction transporte la micropipette de réactif au dessus de la station d'évacuation des éléments solides / poubelle et éjecte de la micropipette de réactif dans la station d'évacuation des éléments solides
2°) Prélèvement d'échantillon de routine
L'opérateur installe un tube stérile dans la station d'échantillonnage ou aliquotage SE.
L'opérateur débouche le tube stérile dans la station d'échantillonnage ou aliquotage SE.
Le robot détecte le signal de déclenchement d'une dilution et le signal de déclenchement d'un prélèvement. Le robot effectue une dilution telle que décrite dans la partie précédente au paragraphe 2°) à une étape près : le bras articulé automatisé multi fonction transporte la pipette de dilution contenant le surplus de culture au dessus de la station SE et le dépose le contenu de la pipette de dilution dans le tube stérile ouvert (Figure 9, trajet 3 T94).
L'opérateur rebouche le tube stérile dans la station SE. L'opérateur referme le tube de prélèvement et récupère le milieu de culture via le sas d'échantillonnage SE.
3°) Prélèvement d'échantillon d'urgence L'opérateur installe un tube stérile dans la station d'échantillonnage
SE.
L'opérateur débouche le tube stérile dans la station d'échantillonnage SE.
Le robot détecte le signal de déclenchement d'un prélèvement. Le bras articulé automatisé prélève une pipette de dilution stérile dans le réservoir SPD (Figure 9, trajet 1 T91).
Le bras articulé automatisé transporte la pipette de dilution stérile jusqu'à la culture concernée (Figure 9, trajet 2 T92).
Le bras articulé automatisé prélève un volume déterminé (par exemple 2 mL) de culture puis une bulle d'air
Le bras articulé automatisé multi fonction transporte la pipette de dilution contenant l'échantillon de culture au dessus de la station d'échantillonnage et dépose le contenu de la pipette de dilution dans le tube stérile ouvert (Figure 9, trajet 3 T93). Le bras articulé automatisé multi fonction transporte la pipette de dilution usagée au dessus de la station d'évacuation des éléments solides / poubelle et éjecte la pipette de dilution dans la station d'évacuation des éléments solides (Figure 9, trajet 4 T94).
L'opérateur rebouche le tube stérile dans la station d'échantillonnage.
L'opérateur referme le tube de prélèvement et récupère l'aliquote de la culture. 4°) Prélèvement de micro échantillon pour analyse
Le robot détecte le signal de déclenchement d'un prélèvement de micro échantillon pour analyse. Le bras articulé automatisé prélève une micropipette stérile dans le réservoir SEPD (Figure 10, trajet 1 T101).
Le bras articulé automatisé transporte la micropipette stérile jusqu'à la culture concernée (Figure 10, trajet 2 Tw2).
Le bras articulé automatisé prélève un micro volume déterminé (par exemple 10 μL) de culture puis une bulle d'air.
Le bras articulé automatisé multi fonction transporte la micropipette contenant l'échantillon de culture au dessus de la station d'analyse SE et dépose le contenu de la micropipette dans la position attribuée à cet échantillon dans la plate forme analytique (Figure 10, trajet 3 T103). Le bras articulé automatisé multi fonction transporte la micropipette usagée au dessus du sas d'éjection des pipettes et de matériel contaminé SEPM qui joue le rôle de station d'évacuation des éléments solides / poubelle et éjecte la micropipette dans ledit sas SEPM (Figure 10, trajet 4 Ti 04)-

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de culture cellulaire en continu permettant la sélection de variants cellulaires statiques ou proliférant en suspension, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on ensemence à l'aide d'une ou plusieurs cellules vivantes un milieu de culture liquide contenu dans un premier récipient de culture maintenu ouvert dans une enceinte fermée, b) on amène lesdites cellules, dans ledit milieu de culture, à un stade de croissance déterminé, correspondant à une densité cellulaire donnée ou bien à un paramètre physico chimique mesuré dans le milieu de culture, c) on maintient sensiblement constante la densité cellulaire dans le milieu de culture, ou la valeur dudit paramètre physico chimique, atteinte à l'étape b), par un apport de milieu de culture frais ou d'un diluant dans ledit récipient de culture, d) on prélève par pipetage une partie du milieu de culture de la culture obtenue en c) contenant les cellules en suspension de sorte à maintenir le volume de la culture, e) on transfère une fraction du milieu de culture obtenue en d) dans un second récipient de culture, f) on retire ledit premier récipient de culture avec la fraction de culture restante qu'il contient ; g) on sélectionne après plusieurs générations de culture dans le second récipient, les cellules proliférant en suspension et/ou les variants cellulaires statiques.
2. Procédé de culture cellulaire en continu permettant la sélection de variants cellulaires proliférant en suspension, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on ensemence à l'aide d'une ou plusieurs cellules vivantes un milieu de culture liquide contenu dans un premier récipient de culture maintenu ouvert dans une enceinte fermée, b) on amène les cellules, dans ledit milieu de culture, à un stade de croissance déterminé, correspondant à une densité cellulaire donnée ou bien à un paramètre physico chimique mesuré dans le milieu de culture, c) on maintient sensiblement constante la densité cellulaire de la culture, ou la valeur dudit paramètre physico chimique, atteinte à l'étape b), par un apport de milieu de culture frais ou d'au moins un diluant dans ledit récipient de culture, d) on prélève par pipetage une partie du milieu de culture contenant les cellules en suspension de sorte à maintenir le volume de la culture, e) on transfère une fraction de la culture obtenue en d) dans laquelle les cellules sont en suspension, dans un second récipient de culture remplaçant le premier ; f) on retire ledit premier récipient de culture avec la fraction de culture restante qu'il contient ; g) on sélectionne après plusieurs générations de culture dans le second récipient les cellules proliférant en suspension.
3. Procédé de culture cellulaire en continu permettant la sélection de variants cellulaires statiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on ensemence à l'aide d'une ou plusieurs cellules vivantes un milieu de culture liquide contenu dans un premier récipient de culture dans lequel est placé au moins une surface solide, de préférence une plaque, ledit récipient étant maintenu ouvert dans une enceinte fermée, b) on amène les cellules, dans le milieu de culture ensemencé, à un stade de croissance déterminé, correspondant à une densité cellulaire donnée ou bien à un paramètre physico chimique mesuré dans le milieu de culture, c) on maintient sensiblement constante la densité cellulaire de la culture, ou la valeur dudit paramètre physico chimique, atteinte à l'étape b), par un apport de milieu de culture frais ou d'au moins un diluant dans ledit récipient de culture, d) on prélève par pipetage une partie du milieu de culture obtenue en c) contenant les cellules en suspension de sorte à maintenir le volume de la culture, e) on transfère ladite surface solide sur laquelle une fraction de la culture obtenue en d) s'est déposée, dans un second récipient de culture remplaçant le premier, f) on retire ledit premier récipient de culture avec la fraction de culture restante qu'il contient, g) on sélectionne après plusieurs générations de culture les variants cellulaires statiques fixés sur ladite surface solide.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite surface solide est constituée d'un matériau traité pour éviter l'adhérence des cellules.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits récipients de culture sont maintenus ouverts à leur sommet, et qu'on applique un flux gazeux, tel que de l'air stérile, de manière continue, en périphérie de leur ouverture.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on applique un flux gazeux stérile du haut vers le bas des récipients de culture.
7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'on maintient le flux gazeux stérile du haut vers le bas en créant une dépression à la périphérie du récipient de culture.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le flux gazeux stérile est évacué hors de l'enceinte en base desdits récipients de culture.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'au moins les différentes étapes a) à f) sont effectuées dans une enceinte fermée.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on réitère les étapes a) à f) une ou plusieurs fois avant de procéder à l'étape g).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le maintien d'une densité sensiblement constante de cellule dans la culture à l'étape c) s'opère par dilution de la culture avec du milieu frais en conservant un volume constant de milieu de culture dans le récipient de culture.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que le transvasement du milieu de culture contenant les cellules en suspension dans le second récipient de culture est opéré par pipetage à l'aide d'une pipette stérile.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le premier récipient de culture usagé, est évacué à l'aide d'un sas en dehors de l'enceinte fermée.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le récipient de culture en opération est placé dans une alvéole thermostatée permettant la régulation de la température de la culture cellulaire.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que plusieurs cultures sont effectuées simultanément dans plusieurs supports de culture placés dans la même enceinte.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'un échantillonnage de la culture est effectué régulièrement.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les supports de culture ou les récipients de culture sont à usage unique.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que du gaz est injecté aux cellules en culture au moyen d'un dispositif de bullage introduit dans le récipient de culture.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que plusieurs étapes du procédé sont effectuées à l'aide d'un ou plusieurs bras automatisés permettant des déplacements à l'intérieur de l'enceinte.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que les cellules sont cultivées de manière continue sur un nombre de générations supérieur à 102, de préférence supérieur à 104, plus préférentiellement supérieur à 106, et encore plus préférentiellement supérieur à 1010 générations, sans ouverture de l'enceinte sur le milieu extérieur.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la culture de microorganismes autotrophiques et que ladite culture est éclairée au cours des différentes étapes dudit procédé.
22. Support de culture (18) permettant d'effectuer une culture cellulaire en mode continu ouvert, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un récipient de culture (1 ) ouvert à son sommet (6) propre à contenir un milieu de culture liquide ; au moins un bac de confinement (2) ouvert vers le haut, dans lequel est logé ledit récipient de culture (1 ); un espace (7) entre ledit récipient de culture (1 ) et ledit bac de confinement (2), propre à laisser circuler un flux gazeux à la périphérie de l'ouverture du récipient, du haut vers le bas, entre le récipient de culture (1 ) et les parois internes du bac de confinement (2); et un moyen d'extraction (8) dudit flux gazeux, situé dans la partie inférieure du bac de confinement (2).
23. Support de culture selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit moyen d'extraction du flux gazeux consiste un ou plusieurs orifices (8) laissant passer le flux gazeux.
24. Support de culture selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un bloc amovible (12) dans lequel plusieurs desdits bacs de confinement sont regroupés et dans lesquels sont logés au moins un desdits récipients de culture (1 ).
25. Support de culture selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que ladite partie inférieure du bac de confinement (2) s'encastre sur une base munie de moyens complémentaires (14) d'extraction dudit flux gazeux circulant entre les récipients de culture (1 ) et les parois des bacs de confinement (2), tel qu'un tuyau relié à une pompe à vide, ou bien un ou plusieurs moyens de distribution de gaz.
26. Support de culture selon l'une des revendications 22 à 25, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins un moyen de régulation de la température (3) du volume interne dudit bac de confinement (2).
27. Support selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit moyen de régulation de la température du volume (7) interne dudit bac de confinement consiste en une résistance chauffante incluse dans l'une au moins des parois dudit bac de confinement (2).
28. Support de culture selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins un moyen d'injection d'air dans le(s) milieu(x) de culture, contenu(s) dans le(s)dit(s) récipient(s), tel qu'une ou plusieurs tige(s) d'aération (4).
29. Support de culture selon l'une quelconque des revendications
22 à 28, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins un moyen de mesure optique (9) de la densité des cellules présentes dans le milieu de culture que contient le récipient de culture (1 ).
30. Support de culture selon l'une quelconque des revendications 22 à 29, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins un moyen de production de lumière (15) pour la culture de microorganismes en mode autotrophique, situé dans l'espace entre le récipient de culture et les parois internes dudit bac de confinement (2), ou bien inclus dans une des parois dudit bac de confinement.
31. Dispositif de culture cellulaire permettant une croissance continue des cellules en mode ouvert, caractérisé en ce qu'il comporte : - une enceinte (17) ; un moyen de génération d'un flux gazeux stérile (23) parcourant ladite enceinte ; un ou plusieurs supports de culture (18) selon l'une quelconque des revendications 22 à 30, positionné(s) dans ladite enceinte (17), permettant d'effectuer une culture cellulaire en mode ouvert.
32. Dispositif de culture cellulaire selon la revendication 31 , caractérisé en ce qu'il comprend, en outre : au moins un moyen de renouvellement du milieu de culture placé à l'intérieur de ladite enceinte.
33. Dispositif de culture cellulaire selon la revendication 31 ou 32, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre : au moins un récipient de culture (1 ) adapté pour remplacer celui contenu dans le support de culture (18).
34. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, caractérisé en ce que le moyen de génération du flux gazeux stérile (23) est placé dans la partie supérieure de l'enceinte (17) de sorte à ce que ledit flux gazeux stérile se dirige du haut vers le bas du support de culture (18).
35. Dispositif de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 31 à 34, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, au moins un moyen d'extraction du flux gazeux stérile (8) en base dudit récipient de culture.
36. Dispositif selon la revendication 35, caractérisé en ce que le moyen d'extraction du flux gazeux stérile (8) crée une dépression dans l'espace (7) situé entre le récipient de culture (1 ) et le bac de confinement (2) du support de culture (18).
37. Dispositif selon la revendication 35 ou 36, caractérisé en ce que ledit moyen d'extraction (8) est associé à au moins un moyen d'aspiration de l'air adapté à aspirer l'air entourant la périphérie de l'ouverture (6) du récipient de culture.
38. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 32 à 37, caractérisé en ce que le moyen de renouvellement du milieu de culture comporte un moyen de transvasement (20) d'une partie du contenu du récipient de culture vers une zone d'évacuation.
39. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 32 à 38, caractérisé en ce que le moyen de renouvellement du milieu de culture comporte un moyen de transvasement (20) de milieu frais depuis une réserve située à l'intérieur de l'enceinte (17) vers le récipient de culture.
40. Dispositif selon l'une des revendications 38 ou 39, caractérisé en ce que le moyen de transvasement comprend une pipette (20) et un moyen d'aspiration du milieu frais ou usagé dans ladite pipette.
41. Dispositif selon l'une des revendications 31 à 40, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre - au moins un moyen de sortie vers l'extérieur de l'enceinte du moyen de transvasement (20) et/ou d'au moins un récipient de culture.
42. Dispositif selon la revendication 41 , caractérisé en ce que ledit moyen de sortie comporte un sas.
43. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 31 à 42, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un moyen d'injection d'air (4, 21 ) dans la culture.
44. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 31 à 43, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un bras automatisé (19) adapté à effectuer des déplacements à l'intérieur de l'enceinte.
45. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 31 à 44, caractérisé en ce que l'enceinte (17) est fermée.
46. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 31 à 45, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs supports de culture positionnés dans ladite enceinte, pour effectuer en parallèle plusieurs cultures cellulaires en mode ouvert.
47. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 30 à 46, caractérisé en ce qu'il permet la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21.
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