CA3179318A1

CA3179318A1 - Procede d'evolution adaptative de cellules vivantes par culture cellulaire en continu

Info

Publication number: CA3179318A1
Application number: CA3179318A
Authority: CA
Inventors: Philippe Marliere; Julien PATROUIX; Simon TRANCART
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2021-11-25
Also published as: JP2023526117A; FR3110596A1; EP4153716A1; WO2021234033A1; US20230183630A1

Abstract

La présente demande concerne un procédé d'évolution adaptative de cellules vivantes par culture en continu desdites cellules vivantes.

Description

DESCRIPTION
PROCEDE D'EVOLUTION ADAPTATIVE DE CELLULES VIVANTES PAR
CULTURE CELLULAIRE EN CONTINU.
DOMAINE TECHNIQUE
La présente demande concerne un procédé d'évolution adaptative de cellules vivantes par culture en continu desdites cellules vivantes.
ART ANTERIEUR
Les cellules vivantes sont souvent utilisées pour produire par exemple des denrées alimentaires, des aliments pour animaux, des arômes, des cosmétiques, des carburants, des produits chimiques et des produits de santé. Les cellules vivantes telles que les microalgues, les champignons, les levures et les bactéries présentent plusieurs avantages, notamment de petites tailles de cellules, des temps de génération courts et des coûts de culture relativement faibles. Cependant, les conditions requises pour une production efficace du produit diffèrent souvent des conditions optimales pour la croissance et la survie de ladite cellule utilisée dans le procédé industriel.
La fabrication, la dégradation ou le recyclage des produits nécessite des cellules vivantes à hautes performances obtenues dans des conditions artificielles, qui représentent un compromis entre les besoins de la cellule vivante et les conditions requises pour produire le produit. Pour améliorer la performance souhaitée des cellules vivantes, différentes approches existent, y compris des approches impliquant une modification génétique.
Cependant, plusieurs objections ont été soulevées concernant les cellules vivantes génétiquement modifiées et leurs utilisations, y compris en termes de sécurité
et d'impact sur les autres organismes, y compris les humains. D'autre part, il n'existe pas aujourd'hui de modèle permettant de prédire de manière complète quelles modifications génétiques appliquer pour obtenir une cellule vivante ayant le phénotype souhaité.
Ainsi, les approches alternatives présentent un intérêt croissant. De telles approches alternatives sont par exemple basées sur l'amélioration des cellules vivantes non génétiquement modifiés en exploitant le potentiel de variation génétique survenant naturellement dans une population de micro-organismes de manière à générer des mutants d'intérêt industriel sans connaissance des mutations requises pour atteindre le phénotype souhaité, tout en respectant les réglementations interdisant l'utilisation d'organismes modifiés génétiquement.
La variation génétique est constamment générée, par exemple par mutation aléatoire et reproduction sexuelle. Par conséquent, les cellules vivantes d'une population varient dans leur niveau d'adaptation à un environnement donné qui constitue la base de la sélection. La sélection fait référence à la tendance des traits phénotypiques bénéfiques à

augmenter dans une population de cellules donnée au fil du temps, car les traits phénotypiques bénéfiques améliorent les chances de survie, d'accouplement et/ou de reproduction desdites cellules. Dans le même temps, les traits phénotypiques qui réduisent les chances de survie, d'accouplement et / ou de reproduction desdites cellules sont diminués en fréquence, voire éliminés de la population. Ainsi, même en cas de changement des environnements, les populations peuvent s'adapter à l'environnement respectif en fonction de la variation génétique présente dans la population par accumulation de traits phénotypiques favorables, c'est-à-dire bénéfiques, et élimination des traits phénotypiques délétères, c'est-à-dire des traits phénotypiques ayant des effets négatifs, au fil du temps.
Le potentiel de variation génétique est par exemple utilisé dans le contexte de la sélection artificielle en sélectionnant des traits phénotypiques souhaitables pour l'utilisation prévue telle que la production efficace et commercialement viable d'un produit.
Cependant, une sélection artificielle efficace est difficile à mettre en uvre.
La sélection artificielle est confrontée au défi majeur du choix du ou des meilleurs paramètres relatifs à la pression de sélection permettant d'atteindre efficacement un phénotype cible, en raison notamment du fait qu'une pression de sélection trop élevée risque de limiter la diversité génétique capable d'émerger par mutations spontanées. De plus, dans la plupart des cas, une sélection de plusieurs traits phénotypiques est nécessaire, tels que les traits phénotypiques impliqués dans l'amélioration de la vitesse de croissance, l'adaptation à un milieu de croissance de composition différente en comparaison à un milieu de référence, l'adaptation à la température, l'adaptation un inhibiteur présent en une certaine concentration et/ou la teneur en nutriments. La sélection de plusieurs traits phénotypiques de manière séquentielle, c'est-à-dire l'amélioration des traits phénotypiques les uns après les autres, impose de passer par des intermédiaires spécialisés sur certains traits phénotypiques à partir desquels la sélection artificielle aux autres caractères est difficile, fastidieuse, voire impossible.
L'amélioration, par sélection artificielle, de plusieurs traits phénotypiques en parallèle, c'est-à-dire de manière simultanée, permet de surmonter cet obstacle.
Il existe un besoin de disposer de solutions alternatives permettant de sélectionner efficacement et automatiquement des cellules vivantes en suspension ayant acquis un phénotype d'intérêt, c'est-à-dire plusieurs caractères de manière simultanée, dans des conditions optimisées pour une production industrielle à faible coût et/ou à
haut rendement.
La demande de brevet US 2012/0263690 décrit un procédé permettant la sélection artificielle de microorganismes ayant acquis un seul et unique trait phénotypique choisi notamment parmi la tolérance à la température, la tolérance à un agent chimique et la tolérance aux rayons ultraviolets.

2

3 PCT/EP2021/063352 La demande internationale W02009/112739 décrit un procédé permettant de sélectionner des cellules proliférant en suspension et sécrétant des enzymes d'intérêt de manière transitoire, lesdites cellules étant maintenue à une valeur de densité
cellulaire connue pour être un paramètre déterminant de la sécrétion de l'enzyme d'intérêt.
Le brevet EP1135460 décrit un procédé dans lequel les cellules sont cultivées dans un seul régime sélectif, le chemostat ou le turbidostat.
La publication de Mans et al. (Mans et al, Current Opinion in Biotechnology ,2018, vol 50, pages 47-56) décrit différents procédés pour l'évolution adaptative de souches de levures en vue d'augmenter leurs productions de carburants et d'agents chimiques. Les procédés mis en uvre consistent soit à transférer de manière séquentielle les levures d'un récipient à l'autre, soit à cultiver les levures en continu dans le même récipient. Par ailleurs, cette publication relève que l'évolution adaptative s'opère généralement via un compromis entre le trait phénotypique sélectionné et d'autres aspects physiologiques de l'organisme ;
tandis que persiste le risque de sélectionner un trait phénotypique non constitutif, c'est-à-dire induit par la pression sélective mais cessant d'être exprimé lorsque cette dernière cesse d'être appliquée. Pour contourner ces difficultés, la publication de Mans et al insiste sur la nécessité de recourir à des procédés évolutifs dynamiques exposant les organismes à différents régimes sélectifs. Il y est notamment décrit une stratégie visant à alterner les milieux de culture lors du transfert d'un récipient à l'autre. Toutefois, cette stratégie consiste à explorer un seul chemin évolutif en alternant les régimes sélectifs de manière séquentielle.
La demande internationale VVO 2018/152442 décrit une méthode d'évolution adaptative de cultures liquides de microorganismes dans un système de culture en continu programmable selon laquelle on soumet une culture microbiologique a un environnement dynamique, ladite culture étant exposée à une fonction de rampe de stress qui est superposée à une fonction d'aptitude à la culture, puis on augmente la quantité de stress appliquée à la culture microbiologique en réponse à l'aptitude accrue de la culture mi crobiolog iq ue.
Cependant, les méthodes proposées dans l'art antérieur sont longues et fastidieuses à mettre en uvre et surtout aucune d'entre elles ne permet d'accéder rapidement et efficacement à des populations de microorganismes ayant un phénotype recherché, notamment un phénotype complexe nécessitant l'amélioration de plusieurs traits phénotypiques simultanément.
Par conséquent, il apparaît nécessaire de mettre au point un nouveau procédé
d'évolution adaptative de cellules vivantes permettant d'obtenir de manière rapide et efficace des cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt.

EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention a donc pour objet un procédé d'évolution adaptative de cellules vivantes à l'exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, par culture en continu desdites cellules vivantes dans n récipients de culture (RCi), i allant de 1 à
n, avec n k 2, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes consistant à:
a) introduire au moins un milieu de culture liquide et des cellules vivantes dans chacun des n récipients de culture, b) dans chacun des n récipients de culture, cultiver lesdites cellules vivantes selon un régime sélectif donné, en utilisant des paramètres de culture prédéfinis, jusqu'à atteindre un stade de croissance déterminé dans au moins un des n récipients de culture, de manière à obtenir, dans chacun des n récipients de culture, une suspension de cellules vivantes dans ledit milieu de culture liquide, c) réunir ensemble au moins une partie des suspensions de cellules vivantes d'au moins deux récipients de culture (RCi) obtenues à l'étape b) pour obtenir une suspension de cellules vivantes mélangées, d) homogénéiser la suspension de cellules vivantes mélangées obtenue à l'étape c), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, e) répartir, dans au moins deux récipients de culture (RCi), au moins une partie de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées obtenue à l'étape d), f) répéter l'enchainement des étapes b) à e), g) collecter après plusieurs cycles de culture des cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt dans au moins un des récipients de culture.
Les inventeurs ont montré de manière surprenante que le procédé selon l'invention permet, par l'application parallèle et multiplexée de régimes sélectifs, de sélectionner et collecter des cellules vivantes ayant des phénotypes d'intérêt.
Avantageusement, le procédé objet de l'invention permet un gain de temps par rapport l'utilisation simple ou séquentielle de ces régimes sélectifs. En particulier, la réitération des étapes b) à e), permettant le mélange successif des suspensions de cellules vivantes issues d'au moins deux récipients de culture différents, puis leur redistribution dans de nouveaux récipients de culture, facilite la sélection progressive des cellules vivantes réagissant le mieux au régime sélectif qui leur est appliqué au fil des cycles de culture, et accélère ainsi l'obtention d'une population de cellules vivantes ayant acquis le phénotype d'intérêt.
Cette méthode permet ainsi d'augmenter le nombre de parcours évolutifs que peut parcourir une suspension de cellules vivantes, augmentant la probabilité et la vitesse d'apparition du phénotype d'intérêt.

4 La présente invention, entre autres, répond aux besoins d'évolution efficace des cellules vivantes, qui sont particulièrement bien adaptés aux conditions de la culture en suspension et optimisés pour la fabrication, la dégradation ou le recyclage de produits.
La présente invention est notamment basée sur l'obtention de cellules vivantes bien adaptées à des conditions cibles, en mélangeant fréquemment des fractions de suspensions de cellules vivantes issues de récipients de culture différents et qui sont cultivées en parallèle sous une pression sélective augmentant progressivement selon les différents régimes sélectifs et/ou les paramètres de culture.
Au sens de la présente invention, on entend par culture en continu , la culture de cellules vivantes réalisée dans au moins un milieu de culture liquide et dont une fraction dudit milieu de culture est renouvelée en vue de maintenir les cellules vivantes en croissance de manière prolongée. Avantageusement, les cellules vivantes sont maintenues pendant un grand nombre de générations qui n'est pas défini à l'avance, avantageusement supérieur à 2 générations, avantageusement supérieur à 3 générations, avantageusement supérieur à 4 générations, avantageusement supérieur à 5 générations, avantageusement supérieur à 6 générations, avantageusement supérieur à 7 générations, avantageusement supérieur à 8 générations, avantageusement supérieur à 9 générations, avantageusement supérieur à 10 générations, avantageusement supérieur à 20 générations, avantageusement supérieur à 30 générations, avantageusement supérieur à 40 générations, avantageusement supérieur à 50 générations, avantageusement supérieur à
60 générations, avantageusement supérieur à 70 générations, avantageusement supérieur à 80 générations, avantageusement supérieur à 90 générations, avantageusement supérieur à 100 générations, avantageusement supérieur à 150 générations, avantageusement supérieur à 200 générations, avantageusement supérieur à 250 générations, avantageusement supérieur à 300 générations, avantageusement supérieur à 130 générations, avantageusement supérieur à 400 générations, avantageusement supérieur à 450 générations, avantageusement supérieur à 500 générations, avantageusement supérieur à 550 générations, avantageusement supérieur à 600 générations, avantageusement supérieur à 650 générations, avantageusement supérieur à 700 générations, avantageusement supérieur à 750 générations, avantageusement supérieur à 800 générations, avantageusement supérieur à 850 générations, avantageusement supérieur à 900 générations, avantageusement supérieur à 950 générations, avantageusement supérieur à 1000 générations, avantageusement supérieur à 5 000 générations, avantageusement supérieur à 10 000 générations, avantageusement supérieur à 15 000 générations, avantageusement supérieur à 20 000 générations, avantageusement supérieur à 25 000 générations, avantageusement supérieur à 30

5 générations, avantageusement supérieur à 35 000 générations, avantageusement supérieur à 40 000 générations, avantageusement supérieur à 45 000 générations, avantageusement supérieur à 50 000 générations de cellules vivantes.
Le renouvellement du milieu de culture, ou d'un composant de celui-ci (diluant), peut s'effectuer de manière permanente, régulière ou périodique. Le milieu peut être renouvelé
pour un ou plusieurs des ingrédients entrant dans sa composition, ou bien pour l'ensemble du mélange de ces ingrédients. Le milieu est renouvelé de sorte à ce qu'au moins 0,01%
des cellules en culture soient conservés. Avantageusement, le milieu est renouvelé de sorte à ce qu'au moins 0,1% des cellules en culture soient en suspension, avantageusement au moins 1%, avantageusement au moins 2%, avantageusement au moins 3%, avantageusement au moins 4%, avantageusement au moins 5%, avantageusement au moins 6%, avantageusement au moins 7%, avantageusement au moins 8%, avantageusement au moins 9%, avantageusement au moins 10%, avantageusement au moins 11%, avantageusement au moins 12%, avantageusement au moins 13%, avantageusement au moins 14%, avantageusement au moins 15%, avantageusement au moins 16%, avantageusement au moins 17%, avantageusement au moins 18%, avantageusement au moins 19%, avantageusement au moins 20%, avantageusement au moins 21%, avantageusement au moins 22%, avantageusement au moins 23%, avantageusement au moins 24%, avantageusement au moins 25%, avantageusement au moins 26%, avantageusement au moins 27%, avantageusement au moins 28%, avantageusement au moins 29%, avantageusement au moins 30%, avantageusement au moins 31%, avantageusement au moins 32%, avantageusement au moins 33%, avantageusement au moins 34%, avantageusement au moins 35%, avantageusement au moins 36%, avantageusement au moins 37%, avantageusement au moins 38%, avantageusement au moins 39%, avantageusement au moins 40%, avantageusement au moins 41%, avantageusement au moins 42%, avantageusement au moins 43%, avantageusement au moins 44%, avantageusement au moins 45%, avantageusement au moins 46%, avantageusement au moins 47%, avantageusement au moins 48%, avantageusement au moins 49%, avantageusement au moins 50 %, avantageusement au moins 51%, avantageusement au moins 52%, avantageusement au moins 53%, avantageusement au moins 54%, avantageusement au moins 55%, avantageusement au moins 56%, avantageusement au moins 57%, avantageusement au moins 58%, avantageusement au moins 59%, avantageusement au moins 60%, avantageusement au moins 61%, avantageusement au moins 62%, avantageusement au moins 63%, avantageusement au moins 64%, avantageusement au moins 65%, avantageusement au moins 66%, avantageusement au moins 67%, avantageusement au moins 68%,

6 avantageusement au moins 69%, avantageusement au moins 70%, avantageusement au moins 71%, avantageusement au moins 72%, avantageusement au moins 73%, avantageusement au moins 74%, avantageusement au moins 75%, avantageusement au moins 76%, avantageusement au moins 77%, avantageusement au moins 78%, avantageusement au moins 79%, avantageusement au moins 80%, avantageusement au moins 81%, avantageusement au moins 82%, avantageusement au moins 83%, avantageusement au moins 84%, avantageusement au moins 85%, avantageusement au moins 86%, avantageusement au moins 87%, avantageusement au moins 88%, avantageusement au moins 89%, avantageusement au moins 90%, avantageusement au moins 91%, avantageusement au moins 92%, avantageusement au moins 93%, avantageusement au moins 94%, avantageusement au moins 95%, avantageusement au moins 96%, avantageusement au moins 97%, avantageusement au moins 98%, avantageusement au moins 99% des cellules en culture soient conservées.
Au sens de la présente invention, on entend par cellule vivante ayant acquis un phénotype d'intérêt ou variant cellulaire , une cellule fille n'ayant pas les mêmes caractéristiques physiologiques que sa cellule parentale cultivée dans les mêmes conditions.
Au sens de la présente invention, on entend par procédé d'évolution adaptative , un processus au cours duquel une population de cellules vivantes est exposée à
un régime sélectif favorisant l'acquisition d'un phénotype d'intérêt par accumulation de modifications physiologiques avantageuses. Les modifications physiologiques peuvent survenir en raison d'une modification génétique (mutation ponctuelle, perte ou acquisition de matériel génétique) ou d'une modification épigénétique, et peuvent résulter d'un stress ou de tout autre facteur pouvant avoir une incidence durable sur le comportement des cellules vivantes en culture.
Il n'est pas requis selon l'invention que ces modifications physiologiques soient prédéfinies. Au contraire, l'invention a pour objectif de favoriser l'émergence de cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt, sans connaissance au préalable des modifications génétiques et physiologiques conduisant audit phénotype, puis de collecter les cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt, ledit phénotype leur conférant un avantage compétitif sur les autres cellules, comme notamment de survivre à un stress, de croitre dans des conditions données, éventuellement de croitre plus rapidement dans des conditions données, de mieux exploiter le milieu de culture, ou de tout autre caractéristique satisfaisant aux critères industriels.
Au sens de la présente invention, on entend par pressions sélectives , un stress provenant d'un composé chimique toxique solubilisé ou gazeux, d'un composé
chimique

7 essentiel solubilisé ou gazeux en carence, d'une élévation de la température, d'un abaissement de la température, d'une élévation du pH, d'une diminution du pH, une exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde particulière, en particulier une exposition aux rayons ultraviolets, une exposition aux rayons infrarouges, ou encore une exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde létale pour la cellule, une exposition à un agent mutagène, ou une combinaison de ces stress, l'ensemble de ces stress ayant pour conséquence d'entrainer soit une diminution de la productivité, en augmentant par exemple le temps de doublement des cellules vivantes, soit une diminution du rendement, en diminuant la quantité de cellules vivantes produites, soit l'extinction des cellules vivantes.
Au sens de la présente invention, on entend par cellule ou cellules ou cellule vivante ou cellules vivantes ou population de cellules vivantes , une ou plusieurs entités biologiques de petite taille comprenant un cytoplasme délimité par une membrane et ayant la capacité de se reproduire de manière autonome. Avantageusement, les cellules vivantes peuvent être eucaryotes ou procaryotes, humaine, animale ou végétale, à
l'exception des cellules souches embryonnaires humaines. Les microorganismes sont considérés comme des cellules. Avantageusement, les cellules vivantes sont choisies parmi les cellules de mammifères, les cellules d'insectes, les bactéries, les levures, les microalgues, les cellules végétales, les fungi et les microbes. Au sens de la présente invention, on entend par microalgues , des algues unicellulaires.
Avantageusement, par cellules vivantes, on entend également les cellules eucaryotes ou procaryotes, humaine, animale ou végétale, à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines, éventuellement infectées par un virus, un phage ou un parasite et/ou ayant intégré un ou plusieurs plasmides d'intérêt.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient de culture ou chambre de culture ou cuve de culture , un contenant dans lequel on cultive des cellules vivantes dans un milieu de culture, selon un régime sélectif donné, établissant les modalités sous lesquelles les conditions de culture sont établies selon des règles opératoires reposant notamment sur des paramètres de culture prédéfinis, jusqu'à atteindre un stade de croissance déterminé. Dans un mode de réalisation particulier, le récipient de culture est recyclable. Dans un mode de réalisation particulier, le récipient de culture est jetable.
Au sens de la présente invention, on entend par suspension , un milieu de culture liquide contenant des cellules vivantes.
Selon l'invention, l'étape c) consistant à réunir ensemble au moins une partie des suspensions de cellules vivantes d'au moins deux récipients de culture (Ri) obtenues à
l'étape b) peut être réalisée soit en utilisant l'un desdits au moins deux récipients de culture

8 comme récipient de mélange, soit dans un récipient de mélange indépendant des au moins deux récipients de culture et permettant d'accueillir tout ou partie du contenu desdits au moins deux récipients de culture.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient de mélange ou cuve de mélange , un contenant dans lequel on procède au mélange du contenu d'au moins deux récipients de culture. Ainsi, dans un récipient de mélange se trouve au moins la suspension issue d'un premier récipient de culture et la suspension issue d'un second récipient de culture. Avantageusement, le procédé selon l'invention peut comprendre autant de récipients de mélange que de récipients de culture. Avantageusement, le nombre de récipients de mélange peut varier de 1 à n. Dans un mode de réalisation particulier, le nombre de récipients de mélange est au moins égal à 2. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 3. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 4. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 5. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 6. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 7. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 8. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 9. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, le nombre de récipients de mélange est égal à 10.
Dans un mode de réalisation particulier, le récipient de mélange est recyclable. Dans un mode de réalisation particulier, le récipient de mélange est jetable.
Lors de l'étape a), sont introduits dans chacun des n récipients de culture, au moins un volume de milieu de culture liquide et une quantité déterminée de cellules vivantes.
Avantageusement, par quantité déterminée de cellules vivantes, on entend au moins une cellule vivante, au moins 10 cellules vivantes, avantageusement au moins 20 cellules vivantes, avantageusement au moins 30 cellules vivantes, avantageusement au moins 40 cellules vivantes, avantageusement au moins 50 cellules vivantes, avantageusement au moins 60 cellules vivantes, avantageusement au moins 70 cellules vivantes, avantageusement au moins 80 cellules vivantes, avantageusement au moins 90 cellules vivantes, avantageusement au moins 100 cellules vivantes, avantageusement au moins 200 cellules vivantes, avantageusement au moins 300 cellules vivantes, avantageusement au moins 400 cellules vivantes, avantageusement au moins 500 cellules vivantes, avantageusement au moins 600 cellules vivantes, avantageusement au moins 700 cellules

9 vivantes, avantageusement au moins 800 cellules vivantes, avantageusement au moins 900 cellules vivantes, avantageusement au moins 1000 cellules vivantes, avantageusement au moins 104 cellules vivantes, avantageusement au moins 105 cellules vivantes, avantageusement au moins 106 cellules vivantes, avantageusement au moins 107 cellules vivantes, avantageusement au moins 108 cellules vivantes, avantageusement au moins 109 cellules vivantes, avantageusement au moins 1010 cellules vivantes, avantageusement au moins 1011 cellules vivantes, avantageusement au moins 1012 cellules vivantes.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'au moins un milieu de culture comprend les nutriments essentiels à la croissance des cellules vivantes.
L'homme du métier saura adapter l'au moins un milieu de culture, et en particulier sa composition, en fonction du type de cellules vivantes utilisées. Avantageusement, l'au moins un milieu de culture est un milieu de culture frais et stérile.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'au moins un milieu de culture et les cellules vivantes sont introduits dans chacun des n récipients de culture à l'aide de moyens d'alimentation, par exemple des pompes et des vannes reliées par des conduites, permettant de relier les réservoirs de milieu de culture à chacun des n récipients de culture.
Lors de l'étape b), ledit stade de croissance déterminé peut être atteint au terme d'une période de durée prédéfinie, lié à la densité cellulaire ou à un indicateur physico-chimique mesurable dans le milieu de culture tel que le pH, la fluorescence, la radioactivité, la concentration en une molécule produite, la concentration en une molécule consommée, tel que les nutriments, la présence d'un agent toxique, le taux de dilution, le nombre d'injection de milieu de culture stressant, le temps écoulé entre deux injections de milieu de culture, etc.
Pour définir ce stade de croissance déterminé , on peut s'appuyer sur le phénotype ciblé ou sur des courbes de croissance types, établies à l'avance, de manière expérimentale ou à partir de données de la littérature.
Dans un mode de réalisation particulier, la densité cellulaire peut être mesurée par mesure optique.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, une valeur particulière d'un indicateur physico-chimique mesurable est fixée, par exemple, un seuil de densité
cellulaire, un taux de dilution particulier, un nombre d'injections de milieu de culture stressant, le temps écoulé entre deux injections de milieu de culture, un pH
particulier, une température particulière, une composition de gaz particulière agitant la suspension, une fluorescence particulière, une radioactivité particulière, un rayonnement électromagnétique ou radioactif à une intensité et une fréquence particulières, une concentration en molécule produite particulière, une concentration en un nutriment particulière, une concentration en un facteur de croissance particulière, une concentration en agent toxique particulière.
Le procédé prévoit qu'après ensemencement du milieu de culture, les cellules vivantes se développent jusqu'à atteindre la valeur fixée. Lorsque cette valeur critique est atteinte pour au moins l'un des récipients de culture, on transfère la culture, c'est-à-dire tout ou une partie de la suspension constituée du milieu de culture et des cellules vivantes vers au moins un récipient de mélange.
Dans un autre mode de réalisation particulier, ledit stade de croissance déterminé
peut être lié à une période de durée prédéfinie. Avantageusement, la période de durée .. prédéfinie est fixée peut être de 1 minute, avantageusement 2 minutes, avantageusement 3 minutes, avantageusement 4 minutes, avantageusement 5 minutes, avantageusement 6 minutes, avantageusement 7 minutes, avantageusement 8 minutes, avantageusement minutes, avantageusement 10 minutes, avantageusement 15 minutes, avantageusement minutes, avantageusement 25 minutes, avantageusement 30 minutes, 15 avantageusement 35 minutes, avantageusement 40 minutes, avantageusement minutes, avantageusement 50 minutes, avantageusement 55 minutes, avantageusement 60 minutes, avantageusement 65 minutes, avantageusement 70 minutes, avantageusement 75 minutes, avantageusement 80 minutes, avantageusement 85 minutes, avantageusement 90 minutes, avantageusement 95 minutes, avantageusement 20 100 minutes, avantageusement 105 minutes, avantageusement 110 minutes, avantageusement 115 minutes, avantageusement après 120 minutes, avantageusement 3 heures, avantageusement 4 heures, avantageusement 5 heures, avantageusement 6 heures, avantageusement 7 heures de culture, avantageusement 8 heures, avantageusement 9 heures de culture, avantageusement 10 heures, avantageusement 11 heures de culture, avantageusement 12 heures, avantageusement 13 heures de culture, avantageusement 14 heures, avantageusement 15 heures de culture, avantageusement 16 heures, avantageusement 17 heures de culture, avantageusement 18 heures, avantageusement 19 heures de culture, avantageusement 20 heures, avantageusement 21 heures de culture, avantageusement 22 heures, avantageusement 23 heures de culture, avantageusement 24 heures, la liste n'étant pas limitative.
Avantageusement, ledit stade de de croissance déterminé peut être atteint après 1 minute de culture, avantageusement après 2 minutes, avantageusement après 3 minutes, avantageusement après 4 minutes, avantageusement après 5 minutes, avantageusement après 6 minutes, avantageusement après 7 minutes, avantageusement après 8 minutes, .. avantageusement après 9 minutes, avantageusement après 10 minutes, avantageusement après 15 minutes, avantageusement après 20 minutes, avantageusement après 25 minutes, avantageusement après 30 minutes, avantageusement après 35 minutes, avantageusement après 40 minutes, avantageusement après 45 minutes, avantageusement après 50 minutes, avantageusement après 55 minutes, avantageusement après 60 minutes, avantageusement après 65 minutes, avantageusement après 70 minutes, avantageusement après 75 minutes, avantageusement après 80 minutes, avantageusement après 85 minutes, avantageusement après 90 minutes, avantageusement après 95 minutes, avantageusement après 100 minutes, avantageusement après 105 minutes, avantageusement après 110 minutes, avantageusement après 115 minutes, avantageusement après 120 minutes, avantageusement après 3 heures, avantageusement après 4 heures, avantageusement après 5 heures, avantageusement après 6 heures, avantageusement après 7 heures, avantageusement après 8 heures, avantageusement après 9 heures, avantageusement après 10 heures, avantageusement après 11 heures, avantageusement après 12 heures, avantageusement après 13 heures, avantageusement après 14 heures, avantageusement après 15 heures, avantageusement après 16 heures, avantageusement après 17 heures, avantageusement après 18 heures, avantageusement après 19 heures, avantageusement après 20 heures, avantageusement après 21 heures, avantageusement après 22 heures, avantageusement après 23 heures, avantageusement après 24 heures de culture, la liste n'étant pas limitative.
Dans ce cas, le procédé prévoit qu'après ensemencement du milieu de culture, les cellules vivantes se développent pendant une période de durée prédéfinie fixée. Lorsque cette durée de culture est atteinte, on transfère la culture, c'est-à-dire tout ou une partie de la suspension constituée du milieu de culture et des cellules vivantes vers au moins un récipient de mélange.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, dans l'étape b), les cellules vivantes sont cultivées dans un régime sélectif, ledit régime sélectif étant choisi parmi : le chemostat, le turbidostat, l'échange de milieux de culture (également appelé
medium swap ), et l'itération de culture discontinue (également appelé
iterated batch ).
Au sens de la présente invention, on entend par conditions de chemostat ou chemostat , un type de culture cellulaire dans lequel un seul milieu de culture contenant au moins un nutriment essentiel en teneur limitée, préférentiellement stérile, est utilisé pour diluer les cellules et dans lequel le débit du milieu de culture est constant.

Avantageusement, du milieu de culture est envoyé à un débit prédéfini de manière continue, c'est-à-dire sans interruption, dans ledit récipient de culture en maintenant constant le volume dudit récipient pour diluer les cellules. De manière alternative, à
intervalles réguliers, un volume de milieu de culture prédéfini est envoyé dans ledit récipient de culture pour diluer les cellules.
Au sens de la présente invention, par intervalles réguliers , on entend toutes les 30 secondes, avantageusement toutes les 35 secondes, avantageusement toutes les secondes, avantageusement toutes les 45 secondes, avantageusement toutes les secondes, avantageusement toutes les 55 secondes, avantageusement toutes les 1 minute, avantageusement toutes les 2 minutes, avantageusement toutes les 3 minutes, avantageusement toutes les 4 minutes, avantageusement toutes les 5 minutes, avantageusement toutes les 10 minutes, avantageusement toutes les 15 minutes, avantageusement toutes les 20 minutes, avantageusement toutes les 25 minutes, avantageusement toutes les 30 minutes.
Au sens de la présente invention, on entend par conditions de turbidostat ou turbidostat , un type de culture cellulaire dans lequel un seul milieu de culture contenant tous les nutriments essentiels en excès, préférentiellement stérile, est utilisé pour diluer les cellules et dans lequel une densité cellulaire constante est maintenue au sein de l'au moins un récipient de culture. Avantageusement, du milieu de culture est envoyé à un débit variable de manière continue, c'est-à-dire sans interruption, dans ledit récipient de culture en maintenant constant le volume dudit récipient pour diluer les cellules de sorte à maintenir une turbidité à ladite valeur seuil. De manière alternative, à intervalles réguliers, la densité
cellulaire de la culture est mesurée dans l'au moins un récipient de culture et comparée à
une valeur seuil. Si la densité cellulaire mesurée est inférieure à la valeur seuil, alors on poursuit la culture jusqu'à la fin de l'intervalle suivant. Si la densité
cellulaire mesurée est supérieure à la valeur seuil, alors un volume de milieu de culture prédéfini est envoyé dans ledit récipient de culture pour diluer les cellules.
Au sens de la présente invention, on entend par échange de milieux de culture ou medium swap , un type de régime de culture cellulaire dans lequel deux milieux de culture différents, préférentiellement stériles, l'un dit milieu de culture relaxant et l'autre dit milieu de culture stressant, sont utilisés pour diluer les cellules par ajout de milieu dans ledit récipient de culture en maintenant constant le volume dudit récipient et ce de manière semi-continue. Dans ce cas, à intervalles réguliers, la densité cellulaire de la culture est mesurée dans l'au moins un récipient de culture et comparée à une valeur seuil. Si la densité
cellulaire mesurée est inférieure à la valeur seuil, alors un volume prédéfini de milieu de culture relaxant est envoyé dans le récipient de culture. Si la densité
cellulaire mesurée est supérieure à la valeur seuil, alors le même volume prédéfini de milieu de culture stressant est envoyé dans ledit récipient de culture. L'échange de milieu de culture peut être réalisé

selon la méthode décrite dans Dôring et al, (ACS Synthetics Biology, 2018, vol 7(9), pages 2029 à 2036).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'au moins un milieu de culture peut être un milieu de culture dit relaxant ou un milieu de culture dit stressant . On entend par milieu de culture relaxant , un milieu de culture parfaitement adapté à la croissance des cellules, comprenant les nutriments et des facteurs de croissances essentiels à la croissance des cellules et dépourvu d'agents toxiques susceptibles d'entrainer la mort des cellules, tels que des inhibiteurs de la croissance cellulaire, ou présents en quantité non létale pour lesdites cellules. On entend par milieu de culture stressant , un milieu de culture comprenant les nutriments essentiels à la croissance des cellules et dans lequel soit un agent toxique est en quantité susceptible d'entrainer la mort des cellules, tels que des inhibiteurs de la croissance cellulaire, soit un facteur de croissance essentiels à la croissance des cellules est absent, soit la quantité en agent toxique est présente en proportion non négligeable et un facteur de croissance essentiels à la croissance des cellules est manquant, soit dans lequel le substrat n'est pas un substrat préféré desdites cellule.
Au sens de la présente invention, on entend par l'itération de culture discontinue ou iterated batch , un type de régime de culture cellulaire dans lequel un milieu de culture, préférentiellement stérile, est utilisé pour diluer les cellules.
Dans ce cas, les cellules se développent dans l'au moins un récipient de culture sans aucune dilution du milieu de culture jusqu'à obtention d'une valeur de densité cellulaire prédéterminée.
Lorsque la valeur de la densité cellulaire est atteinte, on maintient la suspension pendant une durée de culture prédéterminée. Lorsque la durée après atteinte du seuil de densité
cellulaire est atteinte dans ledit récipient de culture, un volume de milieu de culture stérile est envoyé dans ledit récipient de culture à volume constant. Dans un mode de réalisation alternatif, lorsque la durée après atteinte du seuil de densité cellulaire est atteinte dans ledit récipient de culture, une fraction de la suspension dudit récipient de culture est envoyée dans au moins un récipient de culture différent, contenant déjà du milieu de croissance, préférentiellement stérile.
Dans un mode de réalisation particulier, dans l'étape b), les cellules vivantes sont cultivées dans le régime sélectif de chemostat.
Dans un mode de réalisation particulier, dans l'étape b), les cellules vivantes sont cultivées dans le régime sélectif de turbidostat.
Dans un mode de réalisation particulier, dans l'étape b), les cellules vivantes sont cultivées dans le régime sélectif d'échange de milieux de culture ( medium swap ).

Dans un mode de réalisation particulier, dans l'étape b), les cellules vivantes sont cultivées dans le régime sélectif d'itération de culture discontinue ( iterated batch ).
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le régime sélectif utilisé
lors de l'étape b) du procédé selon l'invention peut être identique pour l'ensemble des n récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le régime sélectif utilisé
lors de l'étape b) du procédé selon l'invention peut être différent d'un récipient de culture à
l'autre. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est possible d'utiliser lors de l'étape b) de culture des régimes sélectifs différents entre les n récipients de culture.
Avantageusement, il est possible d'utiliser deux régimes sélectifs différents, avantageusement trois régimes sélectifs différents, avantageusement quatre régimes sélectifs différents, avantageusement cinq régimes sélectifs différents entre les n récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, dans l'étape b), les cellules vivantes sont cultivées dans un régime sélectif tel que défini précédemment, utilisant des paramètres de culture prédéfinis, jusqu'à atteindre un stade de croissance déterminé dans au moins un des n récipients de culture, de manière à obtenir une suspension. Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, les paramètres de culture prédéfinis de l'étape b) sont choisis parmi : le taux de dilution, la température, le pH, la densité cellulaire, la composition du milieu de culture, la composition du flux gazeux, l'exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde particulière, l'exposition à un agent mutagène ou une combinaison de ceux-ci.
Selon l'invention, on entend par régime sélectif différent , soit un régime sélectif de même nature mais d'intensité différente, soit un régime sélectif de nature différente quelle que soit son intensité. Ainsi, et à titre d'exemple, lorsque le régime sélectif est le pH, celui-ci pourra prendre des valeurs différentes d'un récipient de culture donné à l'autre.
Selon un autre exemple, le régime sélectif est également différent lorsque dans un récipient de culture donné on soumet les cellules vivantes à un régime sélectif particulier tel que l'influence du pH et que dans l'autre récipient de culture on soumet les cellules vivantes à
un autre régime sélectif particulier tel que l'influence de la température.
Au sens de la présente invention, on entend par exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde particulière , une exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde du visible, c'est-à-dire une longueur d'onde comprise entre 400 nm et 800 nm, une exposition aux rayons ultraviolets, c'est-à-dire une longueur d'onde inférieure à 400 nm, une exposition aux rayons infrarouges, c'est-à-dire une longueur d'onde supérieure à 800 nm, ou encore une exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde létale pour la cellule.
Au sens de la présente invention, on entend par agent mutagène , un agent chimique entrainant une mutation de type insertion, délétion ou substitution dans le génome de la cellule. Avantageusement, l'agent mutagène peut être choisi parmi les agents alkylants, tels que le N-nitroso-N-éthylurée (également dénommé N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)) ou le méthanesulfonate d'éthyle (également dénommé ethyl methanesulfonate (EMS)), les agents intercalants, tels que la proflavine et l'acridine orange, et les espèces réactives de l'oxygène, notamment les radicaux libres, les ions oxygénés et les peroxydes.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les régimes sélectifs utilisés lors de l'étape b) du procédé selon l'invention peuvent être identiques pour l'ensemble des n récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les régimes sélectifs utilisés lors de l'étape b) du procédé selon l'invention peuvent être différents d'un récipient de culture à l'autre.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les paramètres de culture utilisés lors de l'étape b) du procédé selon l'invention peuvent être identiques pour l'ensemble des n récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les paramètres de culture utilisés lors de l'étape b) du procédé selon l'invention peuvent être différents d'un récipient de culture à l'autre.
Avantageusement, on appellera pour la suite de l'exposé, pour l'ensemble des récipients de culture (RCi), - T0i, la température initiale utilisée lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi, - pH(i,k), le pH initial utilisé lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi, - DO(i,k), la densité cellulaire initial utilisée lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi, - MC(i,k), la composition de l'au moins un milieu de culture initiale utilisée lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi, - G(i,k), la composition du flux gazeux initial utilisée lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi, - A(i,k), l'exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde particulière initiale utilisée lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi, - Td(i,k), le taux de dilution initial utilisé lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi, et - AM(i,k), l'exposition à un agent mutagène initiale utilisée lors de l'étape b) dans le récipient de culture RCi.
Avantageusement, lors de l'étape b), les cellules sont cultivées à la température T0i, à un pH égal à pH(i,k), une densité cellulaire DOk(i,k), dans au moins un milieu de culture de composition MC(i,k), à un taux de dilution Td(i,k) et en présence de gaz de composition G(i,k) pour l'ensemble des n récipients de culture.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de culture peut prévoir qu'un flux gazeux soit injecté sous pression dans la suspension au moyen d'un dispositif d'alimentation en gaz, par exemple sous forme de tiges d'aération introduites dans le récipient de culture. Cette injection de flux gazeux permet l'aération de la suspension, l'homogénéisation de ladite suspension (agitation par bullage) et contribue à
maintenir une certaine pression en gaz à l'intérieur du récipient de culture. Selon le procédé, le récipient de culture est avantageusement parcouru par un flux gazeux stérile. Ce flux gazeux peut être constitué d'un gaz, choisi parmi l'air, le diazote (N2), le monoxyde de carbone (CO), le dioxyde de carbone (002), le méthane (C1-14), le sulfure d'hydrogène (H25), l'oxygène (02), le protoxyde d'azote (N20), le dihydrogène (H2) ou un mélange de ces gaz, en fonction des paramètres de cultures choisies.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de culture peut prévoir un moyen d'agitation mécanique de la suspension dans le récipient de culture.
Lors de l'étape c), dès que le stade de croissance déterminé est atteint à
l'étape b), tout ou une partie de la suspension contenue dans au moins un récipient de culture est réuni avec tout ou une partie de la suspension contenue dans au moins un autre récipient de culture. Comme indiqué précédemment, la réunion des suspensions peut être réalisée soit dans l'un des au moins deux récipients de culture, celui-ci servant alors de récipient de mélange, le volume intérieur dudit récipient de culture étant alors suffisant pour accueillir tout ou une partie de la suspension provenant de l'au moins un autre récipient de culture, soit dans au moins un récipient de mélange indépendant ayant un volume intérieur permettant d'accueillir tout ou une partie de chacune des suspensions desdits au moins deux récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, tout ou une partie de la suspension contenue dans au moins trois récipients de culture, avantageusement tout ou une partie de la suspension contenue dans au moins quatre récipients de culture, avantageusement tout ou une partie de la suspension contenue dans au moins n récipients de culture, est transférée vers l'au moins un récipient de mélange.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lors de l'étape c) seule une partie de chacune des suspensions contenues dans au moins deux récipients de culture est réunie. Avantageusement, on entend au sens de la présente invention par une partie de la suspension , au moins 1% de la suspension contenue dans le récipient de culture, avantageusement au moins 2%, avantageusement au moins 3%, avantageusement au moins 4%, avantageusement au moins 5%, avantageusement au moins 6%, avantageusement au moins 7%, avantageusement au moins 8%, avantageusement au moins 9%, avantageusement au moins 10%, avantageusement au moins 11%, avantageusement au moins 12%, avantageusement au moins 13%, avantageusement au moins 14%, avantageusement au moins 15%, avantageusement au moins 16%, avantageusement au moins 17%, avantageusement au moins 18%, avantageusement au moins 19%, avantageusement au moins 20%, avantageusement au moins 21%, avantageusement au moins 22%, avantageusement au moins 23%, avantageusement au moins 24%, avantageusement au moins 25%, avantageusement au moins 26%, avantageusement au moins 27%, avantageusement au moins 28%, avantageusement au moins 29%, avantageusement au moins 30%, avantageusement au moins 31%, avantageusement au moins 32%, avantageusement au moins 33%, avantageusement au moins 34%, avantageusement au moins 35%, avantageusement au moins 36%, avantageusement au moins 37%, avantageusement au moins 38%, avantageusement au moins 39%, avantageusement au moins 40%, avantageusement au moins 41%, avantageusement au moins 42%, avantageusement au moins 43%, avantageusement au moins 44%, avantageusement au moins 45%, avantageusement au moins 46%, avantageusement au moins 47%, avantageusement au moins 48%, avantageusement au moins 49%, avantageusement au moins 50%, avantageusement au moins 51%, avantageusement au moins 52%, avantageusement au moins 53% avantageusement au moins 54%, avantageusement au moins 55%, avantageusement au moins 56%, avantageusement au moins 57%, avantageusement au moins 58%, avantageusement au moins 59%, avantageusement au moins 60%, avantageusement au moins 61%, avantageusement au moins 62%, avantageusement au moins 63%, avantageusement au moins 64%, avantageusement au moins 65%, avantageusement au moins 66%, avantageusement au moins 67%, avantageusement au moins 68%, avantageusement au moins 69(Yo,avantageusement au moins 70%, avantageusement au moins 71%, avantageusement au moins 72%, avantageusement au moins 73%, avantageusement au moins 74%, avantageusement au moins 75%, avantageusement au moins 76%, avantageusement au moins 77%, avantageusement au moins 78%, avantageusement au moins 79(Yo,avantageusement au moins 80%, avantageusement au moins 81%, avantageusement au moins 82%, avantageusement au moins 83%, avantageusement au moins 84%, avantageusement au moins 85%, avantageusement au moins 86%, avantageusement au moins 87%, avantageusement au moins 88%, avantageusement au moins 89%, avantageusement au moins 9%, avantageusement au moins 91%, avantageusement au moins 92%, avantageusement au moins 93%, avantageusement au moins 94%, avantageusement au moins 95%, avantageusement au moins 96%, avantageusement au moins 97%, avantageusement au moins 98%, avantageusement au moins 99% de la suspension contenue dans le récipient de culture.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, et lorsque l'étape c) est réalisée en utilisant un récipient de mélange, alors on procède à un transfert d'au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape b) d'au moins deux récipients de culture vers au moins un récipient de mélange. Selon ce mode de réalisation, les fractions de suspension transférées depuis chacun des récipients de culture vers l'au moins un récipient de mélange peuvent être identiques ou différentes.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'au moins un récipient de mélange est un récipient de culture agencé, c'est-à-dire dont le volume intérieur est suffisant pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture.
Avantageusement, l'au moins un récipient de mélange est un récipient de culture agencé pour recevoir le contenu d'au moins trois récipients de culture, avantageusement d'au moins quatre récipients de culture, avantageusement d'au moins n récipients de culture.
Avantageusement, par contenu d'au moins un récipient de culture , on entend la suspension obtenue à l'étape b) et présente dans au moins un récipient de culture.
Avantageusement, par contenu d'au moins deux récipients de culture , on entend les suspensions obtenues à l'étape b) contenues et présentes dans au moins deux récipients de culture.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'au moins un récipient de mélange est un unique récipient, indépendant de l'ensemble des récipients de culture, et agencé pour recevoir le contenu de l'ensemble des récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, et lorsque l'étape c) comprend une opération de transfert des suspensions vers au moins un récipient de mélange, alors le transfert de tout ou partie de chacune des suspensions desdits au moins deux récipients de culture vers l'au moins un récipient de mélange peut être réalisée par des moyens de transfert, lesdits moyens de transfert pouvant notamment comprendre une ou plusieurs pompes, une ou plusieurs vannes, une ou plusieurs injections d'un flux gazeux, un ou plusieurs robots pipetteur ou une combinaison de ces moyens.
Avantageusement, la ou les pompes peuvent être par exemple mises en uvre de manière mécanique ou peuvent être contrôlées de manière électrique ou électronique, avantageusement de manière automatique en utilisant des moyens de contrôle.

Avantageusement, la ou les pompes peuvent être des pompes péristaltiques pilotées par une unité de commande, avantageusement pilotée par un automate ou par un ordinateur.
Avantageusement, la ou les vannes peuvent être par exemple mises en uvre de manière mécanique ou peuvent être contrôlées de manière électrique ou électronique, avantageusement de manière automatique en utilisant des moyens de contrôle.
Avantageusement, la ou les vannes peuvent être des électrovannes pilotées une unité de commande, avantageusement pilotée par un automate ou par un ordinateur.
Avantageusement, l'injection d'un flux gazeux peut être par exemple mise en uvre à partir d'un dispositif d'alimentation en gaz présent sur les récipients de culture ou à partir d'une source de gaz externe.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, et lorsque l'étape c) comprend une opération de transfert, alors ledit transfert est réalisé en utilisant une ou plusieurs pompes et une ou plusieurs vannes.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, et lorsque l'étape c) comprend une opération de transfert, alors ledit transfert est réalisé en utilisant une ou plusieurs vannes et une ou plusieurs injections d'un flux gazeux, par exemple générées par différences de pression.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, et lorsque l'étape c) comprend une opération de transfert, alors ledit transfert est réalisé en utilisant un ou plusieurs robots pipetteur.
L'étape d) du procédé consiste à homogénéiser le mélange résultant de la réunion de tout ou d'une partie des suspensions de cellules vivantes d'au moins 2 récipients de culture selon l'étape c). Selon la présente invention, l'étape d'homogénéisation permet d'aboutir à une suspension de cellules vivantes dans laquelle la distribution dans le volume du récipient de mélange des cellules provenant de chacun des au moins deux récipients de culture est aléatoire.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape d) d'homogénéisation est réalisée en tout ou partie par un moyen d'agitation choisi notamment parmi un agitateur mécanique et une injection d'un flux gazeux.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape d) d'homogénéisation est réalisée en tout ou partie, à l'aide d'une injection d'un flux gazeux, ledit flux gazeux étant injecté sous pression dans le récipient contenant la suspension de cellules mélangées de l'étape c) au moyen d'un dispositif d'alimentation en gaz. Cette injection de flux gazeux permet l'homogénéisation du mélange des suspensions par agitation par bullage (par exemple en utilisant le principe de l'air-lift). Avantageusement, le flux gazeux peut être constitué d'un gaz, choisi parmi l'air, le diazote (N2), le monoxyde de carbone (CO), le dioxyde de carbone (002), le méthane (01-14), le sulfure d'hydrogène (H2S), l'oxygène (02), le protoxyde d'azote (N20), le dihydrogène (H2) ou un mélange de ces gaz, en fonction des paramètres de cultures choisis.
L'étape e) du procédé consiste de préférence à transférer au moins une partie de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées obtenue à l'étape d) vers au moins deux récipients de culture (RCi).
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, l'au moins une partie de la suspension transférée à l'étape e) correspond à une fraction comprise entre 1 et 100% de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées.
Avantageusement, la fraction du volume de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées transférée à l'étape e) représente au moins 1% du volume total de ladite suspension homogénéisée, avantageusement au moins 2%, avantageusement au moins 3%, avantageusement au moins 4%, avantageusement au moins 5%, avantageusement au moins 6%, avantageusement au moins 7%, avantageusement au moins 8%, avantageusement au moins 9%, avantageusement au moins 10%, avantageusement au moins 11%, avantageusement au moins 12%, avantageusement au moins 13%, avantageusement au moins 14%, avantageusement au moins 15%, avantageusement au moins 16%, avantageusement au moins 17%, avantageusement au moins 18%, avantageusement au moins 19%, avantageusement au moins 20%, avantageusement au moins 21%, avantageusement au moins 22%, avantageusement au moins 23%, avantageusement au moins 24%, avantageusement au moins 25%, avantageusement au moins 26%, avantageusement au moins 27%, avantageusement au moins 28%, avantageusement au moins 29%, avantageusement au moins 30%, avantageusement au moins 31%, avantageusement au moins 32%, avantageusement au moins 33%, avantageusement au moins 34%, avantageusement au moins 35%, avantageusement au moins 36%, avantageusement au moins 37%, avantageusement au moins 38%, avantageusement au moins 39%, avantageusement au moins 40%, avantageusement au moins 41%, avantageusement au moins 42%, avantageusement au moins 43%, avantageusement au moins 44%, avantageusement au moins 45%, avantageusement au moins 46%, avantageusement au moins 47%, avantageusement au moins 48%, avantageusement au moins 49%, avantageusement au moins 50%, avantageusement au moins 51%, avantageusement au moins 52%, avantageusement au moins 53% avantageusement au moins 54%, avantageusement au moins 55%, avantageusement au moins 56%, avantageusement au moins 57%, avantageusement au moins 58%, avantageusement au moins 59%, avantageusement au moins 60%, avantageusement au moins 61%, avantageusement au moins 62%, avantageusement au moins 63%, avantageusement au moins 64%, avantageusement au moins 65%, avantageusement au moins 66%, avantageusement au moins 67%, avantageusement au moins 68%, avantageusement au moins 69%,avantageusement au moins 70%, avantageusement au moins 71%, avantageusement au moins 72%, avantageusement au moins 73%, avantageusement au moins 74%, avantageusement au moins 75%, avantageusement au moins 76%, avantageusement au moins 77%, avantageusement au moins 78%, avantageusement au moins 79%,avantageusement au moins 80%, avantageusement au moins 81%, avantageusement au moins 82%, avantageusement au moins 83%, avantageusement au moins 84%, avantageusement au moins 85%, avantageusement au moins 86%, avantageusement au moins 87%, avantageusement au moins 88%, avantageusement au moins 89%, avantageusement au moins 90%, avantageusement au moins 91%, avantageusement au moins 92%, avantageusement au moins 93%, avantageusement au moins 94%, avantageusement au moins 95%, avantageusement au moins 96%, avantageusement au moins 97%, avantageusement au moins 98%, avantageusement au moins 99%, avantageusement 100% du volume total de ladite suspension homogénéisée.
Dans un autre mode de réalisation de l'étape e) selon le procédé de l'invention, lors du transfert d'au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape d) vers n récipients de culture, la fraction du volume de suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangée transférée à chacun des n récipients de culture peut être identique ou différente.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé selon l'invention comprend n récipients de culture (RCi), i allant de 1 à n, n étant au moins égal à 2, et au moins n-1 récipients de mélange (RMj), j allant de 1 à n-1, les au moins n-1 récipients de mélange étant respectivement un récipient de culture (RCi) agencé pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture, ledit procédé étant en outre caractérisé en ce que les étapes c) à e) sont réalisées de la manière suivante :
i) transférer tout ou une partie de la suspension obtenue à l'étape b) depuis un récipient de culture (RCi), dit récipient de culture de départ, vers un récipient de mélange (RMj), dit récipient de destination, de manière à réaliser un transfert de destination, ii) homogénéiser la suspension du récipient de culture de départ (RCi) avec celle du récipient de destination (RMj) dans le récipient de destination (RMj), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, iii) transférer au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape ii) depuis le récipient de destination (RMj), vers le récipient de culture de départ (RCi), de manière à
réaliser un transfert de renvoi, iv) répéter les étapes précédentes i) à iii) en faisant varier RCi et RMj de manière à
ce que toutes les suspensions aient été réunies 2 à 2 au moins une fois.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 3.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 4.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 5.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 6. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 7. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 8. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 9. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 10.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend trois récipients de culture, un premier récipient de culture RC1, un deuxième récipient de culture RC2, un troisième récipient de culture RC3, les trois récipients de culture servant successivement de récipients de mélange RM1, RM2 et RM3, chaque récipient de culture étant agencé pour recevoir le contenu des deux autres récipients de culture, le procédé étant caractérisé en ce que les étapes c) à e) sont réalisées de la manière suivante :
i) transférer la suspension de cellules vivantes depuis le premier récipient de culture RC1 vers le deuxième récipient de culture RC2, qui sert alors également de premier récipient de mélange RM1, de manière à réaliser un transfert de destination, ii) homogénéiser les suspensions du premier récipient de culture RC1 et du deuxième récipient de culture RC2 dans le deuxième récipient de culture RC2 qui sert alors de premier récipient de mélange RM1 (RC2 = RM1), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, iii) transférer au moins une partie de la suspension du premier récipient de mélange .. RM1, vers le premier récipient de culture RC1, de manière à réaliser un transfert de renvoi, iv) transférer la suspension depuis le troisième récipient de culture RC3 vers le premier récipient de culture RC1, qui sert alors de deuxième récipient de mélange RM2, de manière à réaliser un transfert de destination, y) homogénéiser les suspensions du troisième récipient de culture RC3 et du premier récipient de culture RC1 dans le premier récipient de culture RC1 qui sert alors de deuxième récipient de mélange RM2 (RC1 = RM2), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, vi) transférer au moins une partie de la suspension du deuxième récipient de mélange RM2, vers le troisième récipient de culture RC3, de manière à réaliser un transfert de renvoi, vii) transférer la suspension depuis le deuxième récipient de culture RC2 vers le troisième récipient de culture RC3, qui sert alors de troisième récipient de mélange RM3, de manière à réaliser un transfert de destination, viii) homogénéiser les suspensions du deuxième récipient de culture RC2 et du troisième récipient de culture RC3 dans le troisième récipient de culture RC3 qui sert alors de troisième récipient de mélange RM3 (RC3 = RM3), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, ix) transférer au moins une partie de la suspension du troisième récipient de mélange RM3, vers le deuxième récipient de culture RC2, de manière à réaliser un transfert de renvoi.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé selon l'invention comprend n récipients de culture (RCi), i allant de 1 à n, n étant au moins égal à
2, et au moins n-1 récipients de mélange (RMj), j allant de 1 à n-1, les au moins n-1 récipients de mélange étant respectivement un récipient de culture (RCi) agencé pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture, caractérisé en ce que les étapes c) à e) sont réalisées de la manière suivante :
i) transférer tout ou une partie de la suspension de cellules vivantes obtenue à l'étape b) depuis un récipient de culture (RCi), dit récipient de culture de départ, vers un récipient de mélange (RMj), dit récipient de destination, de manière à réaliser un transfert de destination, ii) homogénéiser la suspension du récipient de culture de départ (RCi) avec celle du récipient de destination (RMj) dans le récipient de destination (RMj), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, iii) transférer au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape ii) depuis le récipient de destination (RMj), vers le récipient de culture de départ (RCi), de manière à
réaliser un transfert de renvoi, iv) répéter les étapes précédentes i) à iii) n-(i+1) fois en incrémentant j d'une unité à
chaque répétition de manière à transférer tout ou une partie de la suspension depuis le récipient de culture de départ (RCi) vers un récipient de destination RMj+1 de manière à
réaliser n-(i+1) autres transfert de destination et n-(i+1) autres transfert de renvoi, y) répéter les étapes i) à iv) n-(i+1) fois en incrémentant i d'une unité à
chaque répétition de manière à ce que le récipient de culture de départ devienne RCi+1 après chaque fin d'étape y).
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 3.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 4.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 5.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 6. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 7. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 8. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 9. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 10.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend trois récipients de culture, à savoir un premier récipient de culture RC1, un deuxième récipient de culture RC2, un troisième récipient de culture RC3, les deuxième et troisième récipients de culture (RC2 et RC3) servant successivement de récipients de mélange RM1 et RM2, chaque récipient de culture RC2 et RC3 étant agencé pour recevoir le contenu de deux récipients de culture, le procédé étant caractérisé en ce que les étapes c) à e) sont réalisées de la manière suivante i) transférer la suspension de cellules vivantes obtenue à l'étape b) depuis le premier récipient de culture RC1 vers le deuxième récipient de culture RC2, qui sert alors de premier récipient de mélange RM1, de manière à réaliser un transfert de destination, ii) homogénéiser les suspensions du premier récipient de culture RC1 et du deuxième récipient de culture RC2 dans ledit récipient de culture RC2 qui sert alors de premier récipient de mélange RM1, pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, iii) transférer au moins une partie de la suspension du premier récipient de mélange RM1, vers le premier récipient de culture RC1, de manière à réaliser un transfert de renvoi, iv) transférer la suspension depuis le premier récipient de culture RC1 vers le troisième récipient de culture RC3, qui sert alors de deuxième récipient de mélange RM2, de manière à réaliser un transfert de destination, V) homogénéiser les suspensions du premier récipient de culture RC1 et du troisième récipient de culture RC3 dans ledit troisième récipient de culture qui sert alors de deuxième récipient de mélange RM2, pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, vi) transférer au moins une partie de la suspension du deuxième récipient de mélange RM2, vers le premier récipient de culture RC1, de manière à réaliser un transfert de renvoi, vii) transférer la suspension depuis le deuxième récipient de culture RC2 vers le troisième récipient de culture RC3, qui sert alors de deuxième récipient de mélange RM2, de manière à réaliser un transfert de destination, viii) homogénéiser les suspensions du deuxième récipient de culture RC2 et du troisième récipient de culture RC3 dans ledit troisième récipient de culture RC3 qui sert alors de deuxième récipient de mélange RM2, ix) transférer au moins une partie de la suspension du deuxième récipient de mélange RM2, vers le deuxième récipient de culture RC2, de manière à réaliser un transfert de renvoi.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé selon l'invention utilise n récipients de culture (RCi), i allant de 1 à n, n étant au moins égal à 2, et au moins un récipient de mélange, l'au moins un récipient de mélange étant un unique récipient indépendant de l'ensemble des récipients de culture, et étant agencé
pour recevoir le contenu des n récipients de culture, caractérisé en ce que les étapes c) à
e) sont réalisées de la manière suivante :
c) transférer tout ou une partie de la suspension de cellules vivantes obtenue à l'étape b) d'au moins deux récipients de culture vers l'au moins un récipient de mélange, pour obtenir une suspension de cellules vivantes mélangées, d) homogénéiser la suspension de cellules vivantes mélangées obtenue à l'étape c) dans l'au moins un récipient de mélange (RM), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, e) transférer au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape d) de l'au moins un récipient de mélange vers chacun des au moins deux récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 3.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 4.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 5.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 6. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 7. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 8. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 9. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageusement, n est égal à 10.
L'utilisation d'un unique récipient de mélange, indépendant des récipients de culture et agencé pour recevoir le contenu des n récipients de culture, permet d'accélérer l'étape d) de mélange tout en étant plus simple à mettre en uvre.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, l'au moins une partie de la suspension transférée à l'étape e) vers chacun des au moins deux récipients de culture correspond à une fraction du volume de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, ladite fraction de volume étant comprise en 1 et 100% du volume total de ladite suspension.
Avantageusement, la fraction du volume de suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées transférée à l'étape e) représente au moins 1% du volume total de ladite suspension, avantageusement au moins 2%, avantageusement au moins 3%, avantageusement au moins 4%, avantageusement au moins 5%, avantageusement au moins 6%, avantageusement au moins 7%, avantageusement au moins 8%, avantageusement au moins 9%, avantageusement au moins 10%, avantageusement au moins 11%, avantageusement au moins 12%, avantageusement au moins 13%, avantageusement au moins 14%, avantageusement au moins 15%, avantageusement au moins 16%, avantageusement au moins 17%, avantageusement au moins 18%, avantageusement au moins 19%, avantageusement au moins 20%, avantageusement au moins 21%, avantageusement au moins 22%, avantageusement au moins 23%, avantageusement au moins 24%, avantageusement au moins 25%, avantageusement au moins 26%, avantageusement au moins 27%, avantageusement au moins 28%, avantageusement au moins 29%, avantageusement au moins 30%, avantageusement au moins 31%, avantageusement au moins 32%, avantageusement au moins 33%, avantageusement au moins 34%, avantageusement au moins 35%, avantageusement au moins 36%, avantageusement au moins 37%, avantageusement au moins 38%, avantageusement au moins 39%, avantageusement au moins 40%, avantageusement au moins 41%, avantageusement au moins 42%, avantageusement au moins 43%, avantageusement au moins 44%, avantageusement au moins 45%, avantageusement au moins 46%, avantageusement au moins 47%, avantageusement au moins 48%, avantageusement au moins 49%, avantageusement au moins 50%, avantageusement au moins 51%, avantageusement au moins 52%, avantageusement au moins 53%
avantageusement au moins 54%, avantageusement au moins 55%, avantageusement au moins 56%, avantageusement au moins 57%, avantageusement au moins 58%, avantageusement au moins 59%, avantageusement au moins 60%, avantageusement au moins 61%, avantageusement au moins 62%, avantageusement au moins 63%, avantageusement au moins 64%, avantageusement au moins 65%, avantageusement au moins 66%, avantageusement au moins 67%, avantageusement au moins 68%, avantageusement au moins 69c/o,avantageusement au moins 70%, avantageusement au moins 71%, avantageusement au moins 72%, avantageusement au moins 73%, avantageusement au moins 74%, avantageusement au moins 75%, avantageusement au moins 76%, avantageusement au moins 77%, avantageusement au moins 78%, avantageusement au moins 79c/o,avantageusement au moins 80%, avantageusement au moins 81%, avantageusement au moins 82%, avantageusement au moins 83%, avantageusement au moins 84%, avantageusement au moins 85%, avantageusement au moins 86%, avantageusement au moins 87%, avantageusement au moins 88%, avantageusement au moins 89%, avantageusement au moins 90%, avantageusement au moins 91%, avantageusement au moins 92%, avantageusement au moins 93%, avantageusement au moins 94%, avantageusement au moins 95%, avantageusement au moins 96%, avantageusement au moins 97%, avantageusement au moins 98%, avantageusement au moins 99%, avantageusement 100% du volume total de ladite suspension.
Dans un autre mode de réalisation de l'étape e) selon le procédé de l'invention, lors du transfert d'au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape d) de l'au moins un récipient de mélange vers les n récipients de culture, la fraction du volume de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées transférée à chacun des récipients de culture peut être identique ou différente.
A titre d'exemple, si on utilise quatre récipients de culture, lors de l'étape e) de transfert, il est possible d'attribuer une fraction de 25% de volume total de la suspension homogénéisée de cellules mélangées à chacun des quatre récipients de culture.
A titre d'exemple, si on utilise quatre récipients de culture, lors de l'étape e) de transfert, il est possible de transférer 10% du volume total de la suspension homogénéisée de cellules vivantes contenue dans le récipient de mélange vers le premier récipient de culture, 20% de ce même volume vers le second récipient de culture, 30% de ce même volume vers le troisième récipient de culture et de 5% de ce même volume vers le quatrième récipient de culture.
A titre d'exemple, si on utilise quatre récipients de culture, lors de l'étape e) de transfert, il est possible de transférer 0% du volume total de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées contenue dans le récipient de mélange vers le premier récipient de culture, 20% de ce même volume vers le second récipient de culture, 30% de ce même volume vers le troisième récipient de culture et de 5% de ce même volume vers le quatrième récipient de culture.
Les exemples ci-dessus ne sont pas limitatifs et servent uniquement à
illustrer l'étape e).
L'étape f) du procédé consiste à répéter les étapes b) à e). Au sens de la présente invention, on entend par cycle de culture , la répétition des étapes b) à
e) du procédé.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lors de la répétition de l'étape b), le régime sélectif et/ou les paramètres de culture utilisés au cours d'un cycle de culture peuvent être identiques ou différents de ceux utilisés au cours du cycle de culture précédent. Avantageusement, le régime sélectif et/ou les paramètres de culture utilisés peuvent être identiques ou différents d'un cycle de culture à l'autre.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le régime sélectif, choisi pour chaque récipient de culture, peut être identique ou différent d'un cycle de culture à l'autre.
Avantageusement, le régime sélectif est choisi parmi le groupe comprenant le chemostat, le turbidostat, l'échange de milieux de culture (également appelé medium swap ), l'itération de culture discontinue (également appelé iterated batch ), la liste n'étant pas limitative.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le régime sélectif dans un récipient de culture donné peut être identique d'un cycle à
l'autre. A titre d'exemple, il est possible d'appliquer, dans un récipient de culture donné, un régime sélectif chemostat pendant un cycle de culture, puis appliquer, dans ce même récipient de culture, ce même régime de culture pour le cycle de culture suivant. A titre d'exemple, il est possible d'appliquer, dans un récipient de culture donné, un régime sélectif turbidostat pendant un cycle de culture, puis appliquer, dans ce même récipient de culture, ce même régime de culture pour le cycle de culture suivant. Les exemples décrits ci-dessus ne sont pas limitatifs et s'appliquent à l'ensemble des régimes de culture sélectif.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le régime sélectif dans un récipient de culture donné peut être modifié d'un cycle à l'autre. A
titre d'exemple, il est possible d'appliquer, dans un récipient de culture donné, un régime sélectif chemostat pendant un cycle de culture, puis de modifier pour ce même récipient de culture le régime sélectif en un régime sélectif turbidostat pour le cycle de culture suivant.
A titre d'exemple, il est possible d'appliquer, dans un récipient de culture donné, un régime sélectif chemostat pendant un cycle de culture, puis de modifier, pour ce même récipient de culture, le régime sélectif en un régime sélectif turbidostat pour le cycle suivant de culture, puis de modifier, pour ce même récipient de culture, le régime sélectif en un régime sélectif chemostat pour le cycle de culture suivant. A titre d'exemple, il est possible d'appliquer, dans un récipient de culture donné, un régime sélectif chemostat pendant un cycle de culture, puis de modifier, pour ce même récipient de culture, le régime sélectif en un régime sélectif turbidostat pour le cycle de culture suivant, puis de modifier, pour ce même récipient de culture, le régime sélectif en un régime sélectif d'échange de milieux de culture, pour le cycle de culture suivant. Les exemples décrits ci-dessus ne sont pas limitatifs et s'appliquent à l'ensemble des régimes de culture sélectif.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lors de la répétition de l'étape b), les paramètres de culture utilisés peuvent être, pour chaque récipient de culture, identiques ou différents d'un cycle de culture à l'autre. Avantageusement, les paramètres de culture sont choisis parmi le groupe comprenant le taux de dilution, la température, le pH, la composition du milieu de culture ou des milieux de culture, la composition du flux gazeux et l'une de leurs combinaisons, lesdits paramètres pouvant être identiques d'un cycle à l'autre. Avantageusement, les paramètres de culture sont choisis parmi le groupe comprenant le taux de dilution la température, le pH, la composition du milieu de culture ou des milieux de culture, la composition du flux gazeux et l'une de leurs combinaisons, lesdits paramètres pouvant être modifiés d'un cycle à l'autre. Avantageusement, il est possible de modifier un seul de ces paramètres de culture, c'est-à-dire de modifier uniquement la température ou de modifier uniquement le pH ou de modifier uniquement la composition du milieu de culture, ou de modifier uniquement la composition du flux gazeux.
Avantageusement, il est possible de modifier simultanément plusieurs de ces paramètres de cultures. Avantageusement, il est possible de modifier simultanément au moins deux paramètres de culture, au moins trois paramètres de culture, au moins quatre paramètres de culture.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, la température initiale TOi de chaque récipient de culture RCi, peut être augmentée d'une valeur AT par rapport au premier cycle de culture, puis à
chaque nouveau cycle de culture, peut subir une incrémentation de la température de AT par cycle de culture. Avantageusement, la valeur AT est de 0,1 C, avantageusement de 0,2 C, avantageusement de 0,3 C, avantageusement de 0,4 C, avantageusement de 0,5 C, avantageusement de 0,6 C, avantageusement de 0,7 C, avantageusement de 0,8 C, avantageusement de 0,9 C, avantageusement de 1,0 C, avantageusement de 1,1 C, avantageusement de 1,2 C, avantageusement de 1,3 C, avantageusement de 1,4 C, avantageusement de 1,5 C, avantageusement de 1,6 C, avantageusement de 1,7 C, avantageusement de 1,8 C, avantageusement de 1,9 C, avantageusement de 2,0 C, avantageusement de 2,1 C, avantageusement de 2,2 C, avantageusement de 2,3 C, avantageusement de 2,4 C, avantageusement de 2,5 C, avantageusement de 2,6 C, avantageusement de 2,7 C, avantageusement de 2,8 C, avantageusement de 2,9 C, avantageusement de 3,0 C, avantageusement de 3,1 C, avantageusement de 3,2 C, avantageusement de 3,3 C, avantageusement de 3,4 C, avantageusement de 3,5 C, avantageusement de 3,6 C, avantageusement de 3,7 C, avantageusement de 3,8 C, avantageusement de 3,9 C, avantageusement de 4,0 C. Avantageusement, la valeur de AT peut être identique ou différente à chaque nouveau cycle.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, la température initiale TOi de chaque récipient de culture RCi, peut être diminuée d'une valeur AT par rapport au premier cycle de culture, puis à
chaque nouveau cycle de culture, peut subir une décrémentation de la température de AT par cycle de culture. Avantageusement, la valeur AT est de -0,1 C, avantageusement de -0,2 C, avantageusement de -0,3 C, avantageusement de -0,4 C, avantageusement de -0,5 C, avantageusement de -0,6 C, avantageusement de -0,7 C, avantageusement de -0,8 C, avantageusement de -0,9 C, avantageusement de 1,0 C, avantageusement de -1,1 C, avantageusement de -1,2 C, avantageusement de -1,3 C, avantageusement de -1,4 C, avantageusement de -1,5 C, avantageusement de -1,6 C, avantageusement de -1,7 C, avantageusement de -1,8 C, avantageusement de -1,9 C, avantageusement de -2,0 C, avantageusement de -2,1 C, avantageusement de -2,2 C, avantageusement de -2,3 C, avantageusement de -2,4 C, avantageusement de -2,5 C, avantageusement de -2,6 C, avantageusement de -2,7 C, avantageusement de -2,8 C, avantageusement de -2,9 C, avantageusement de -3,0 C, avantageusement de -3,1 C, avantageusement de -3,2 C, avantageusement de -3,3 C, avantageusement de -3,4 C, avantageusement de -3,5 C, avantageusement de -3,6 Cõ avantageusement de -3,7 C, avantageusement de -3,8 C, avantageusement de -3,9 C, avantageusement de -4,0 C. Avantageusement, la valeur de AT peut être identique ou différente à chaque nouveau cycle.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, le pH initial pH(i,k) peut être augmenté d'une valeur ApH par rapport au premier cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, peut subir une incrémentation de la température de ApH par cycle de culture. Avantageusement, la valeur ApH est de 0,1 unité de pH, avantageusement de 0,2 unité de pH, avantageusement de 0,3 unité de pH, avantageusement de 0,4 unité de pH, avantageusement de 0,5 unité de pH. Avantageusement, la valeur de ApH peut être identique ou différente à
chaque nouveau cycle.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, le pH initial pH(i,k) peut être diminué d'une valeur ApH par rapport au premier cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, peut subir une décrémentation de la température de ApH par cycle de culture. Avantageusement, la valeur ApH est de -0,1 unité de pH, avantageusement de -0,2 unité de pH, avantageusement de -0,3 unité de pH, avantageusement de -0,4 unité de pH, avantageusement de -0,5 unité de pH. Avantageusement, la valeur de ApH peut être identique ou différente à
chaque nouveau cycle.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, la composition du milieu de culture initial MC(i,k) ou des milieux de culture MC(i,k)-relaxant et MC(i,k)-stressant, peut être modifiée, pour chacun des récipients de culture RCi, par rapport au premier cycle de culture, puis à
chaque nouveau cycle de culture, subir une nouvelle modification à chaque nouveau cycle de culture.
Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture ou des milieux de culture peut consister en une augmentation de la teneur en agent toxique, tel que les inhibiteurs de croissance. Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture peut consister en une diminution de la teneur en un facteur de croissance essentiel à la croissance des cellules. Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture peut consister en un remplacement d'un substrat par un autre.
Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture peut consister au remplacement d'un milieu de culture relaxant par un milieu de culture stressant.
Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture peut consister en un remplacement d'un milieu riche par un milieu minimal. Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture peut consister en un remplacement d'un milieu minimal par un milieu riche. Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture peut consister en un remplacement d'un milieu de synthèse (appelé
également milieu défini) par un milieu complexe (appelé également milieu non défini).
Avantageusement, la modification de la composition du milieu de culture peut consister en un remplacement d'un milieu complexe (appelé également milieu non défini) par un milieu de synthèse (appelé également milieu défini). Avantageusement, la composition du milieu de culture peut être identique ou différente à chaque nouveau cycle.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, le taux de dilution Td(i,k) de chaque récipient de culture RCi, peut être augmentée d'une valeur ATd par rapport au premier cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, peut subir une incrémentation de ATd.
Avantageusement, la valeur ATd est de 0,01 h-1, avantageusement de 0,02 h-1, avantageusement de 0,03 h-1, avantageusement de 0,04 h-1, avantageusement de 0,05 h-1, avantageusement de 0,06 h-1, avantageusement de 0,07 h-1 avantageusement de 0,08 h-1 avantageusement de 0,09 h-1 avantageusement de 0,10 h-1 avantageusement de 0,15 h-1 avantageusement de 0,20 h-1 avantageusement de 0,25 h-1 avantageusement de 0,30 h-1 avantageusement de 0,35 h-1 avantageusement de 0,40 h-1 avantageusement de 0,45 h-1 avantageusement de 0,50 h-1 avantageusement de 0,55 h-1 avantageusement de 0,60 h-1 avantageusement de 0,65 h-1 avantageusement de 0,70 h-1 avantageusement de 0,75 h-1 avantageusement de 0,80 h-1 avantageusement de 0,85 h-1 avantageusement de 0,90 h-1 avantageusement de 0,95 h-1 avantageusement de 1,00 h-1 avantageusement de 1,05 h-1 avantageusement de 1,10 h-1 avantageusement de 1,15 h-1 avantageusement de 1,20 h-1 avantageusement de 1,25 h-1 avantageusement de 1,30 h-1 .avantageusement de 1,35 h-1 avantageusement de 1,40 h-1 avantageusement de 1,45 h-1, avantageusement de 1,50 h-1. Avantageusement, la valeur de ATd peut être identique ou différente à chaque nouveau cycle.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, la composition du flux gazeux initial Gi de chacun des récipients .. de culture RCi peut être modifiée par rapport au premier cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, subir une nouvelle modification de la composition du flux gazeux.

Avantageusement, la modification de la composition du flux gazeux peut consister en une augmentation ou une diminution de la teneur d'un gaz ou de plusieurs gaz constituant le flux, le gaz étant choisi parmi l'air, le diazote (N2), le monoxyde de carbone (CO), le dioxyde de carbone (002), le méthane (01-14), le sulfure d'hydrogène (H2S), l'oxygène (02), le protoxyde d'azote (N20), le dihydrogène (H2), ou une combinaison de ceux-ci.
Avantageusement, la composition du flux gazeux peut être identique ou différente à chaque nouveau cycle.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors du second cycle de culture, les suspensions de chaque récipient de culture RCi peuvent être maintenues à une température TO+AT et à un pH pHk+ApH pendant un cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, peuvent subir une incrémentation de la température de AT et une incrémentation du pH de ApH pour chacun des n récipients de culture par cycle de culture.
Les exemples décrits ci-dessus ne sont pas limitatifs et s'appliquent aussi bien pour la modification d'un seul paramètre de culture ou la modification simultanée de plusieurs paramètres de culture.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lors de la répétition de l'étape b), le régime sélectif et/ou les paramètres de culture utilisés peuvent être modifiés d'un cycle de culture à l'autre, ladite modification étant applicable à l'ensemble des n récipients de culture. Quelle que soit la modification effectuée, celle-ci est applicable à l'ensemble des n récipients de culture.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, lors de la répétition de l'étape b), le régime sélectif et/ou les paramètres de culture utilisés peuvent être modifiés d'un cycle de culture à l'autre, ladite modification n'étant pas applicable à
l'ensemble des n récipients de culture.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lors de la répétition de l'étape b), le régime sélectif peut être modifié d'un cycle de culture à l'autre, ladite modification n'étant pas applicable à l'ensemble des n récipients de culture.
A titre d'exemple, lors de l'étape b), le récipient de culture RC1 peut être soumis à un régime sélectif de type chemostat et les n-1 récipients de culture restant peuvent être soumis à un régime sélectif de type turbidostat pendant un cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, subir une modification du régime sélectif.
A titre d'exemple, lors de l'étape b), le récipient de culture RC1 peut être soumis à un régime sélectif chemostat, le récipient de culture RC2 peut être soumis à un régime sélectif turbidostat et les n-2 récipients de culture restant peuvent être soumis à un régime sélectif d'échange de milieu de culture pendant un cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, subir une modification du régime sélectif.
Les exemples décrits ci-dessus ne sont pas limitatifs et s'appliquent à
l'ensemble des régimes de culture sélectifs.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, lors de la répétition de l'étape b), les paramètres de culture utilisés peuvent être modifiés d'un cycle de culture à l'autre, lesdites modifications n'étant pas applicables à
l'ensemble des n récipients de culture.
A titre d'exemple, lors de l'étape b), le récipient de culture RC1 peut être maintenu à
une température TO + 0,1 C et les n-1 récipients de culture restant peuvent être maintenus à la température initiale TO, pendant un cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, subir une incrémentation de la température de 0,1 C pour chacun des n récipients de culture par cycle de culture. Dans ce cas, lors du second cycle, le récipient de culture RC1 serait maintenu à une température TO + 0,2 C et les n-1 récipients de culture restant .. seraient maintenus à une température TO + 0,1 C, et ainsi de suite.
Selon un autre exemple, lors de l'étape b), le récipient de culture RC1 peut être maintenu à une température TO + 0,2 C, le récipient de culture RC2 peut être maintenu à
une température TO + 0,1 C, et les n-2 récipients de culture restant peuvent être maintenus à la température initiale, dite TO, pendant un cycle de culture, puis à chaque nouveau cycle de culture, subir une incrémentation de la température de 0,1 C pour chacun des n récipients de culture par cycle de culture. Dans ce cas, lors du second cycle, le récipient de culture RC1 serait maintenu à une température TO + 0,3 C, le récipient de culture RC2 serait maintenu à une température TO + 0,2 C et les n-2 récipients de culture restant seraient maintenus à une température TO + 0,1 C, et ainsi de suite.
Les exemples décrits ci-dessus ne sont pas limitatifs et s'appliquent aussi bien pour la modification d'un seul paramètre de culture que pour la modification simultanée de plusieurs paramètres de culture.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les étapes b) à e) sont répétées autant de fois que nécessaire, et cela jusqu'à l'apparition d'une cellule vivante ayant acquis .. un phénotype d'intérêt.
Dans un mode réalisation particulier de l'invention, le régime sélectif et/ou les paramètres de culture peuvent être adaptés automatiquement en réponse à des critères observables/mesurables sur les cultures lors du cycle précédent. A titre d'exemple, un critère de pression sélective comme la température ou la concentration d'une molécule inhibitrice de croissance cellulaire pourra voir sa valeur modifiée pour le cycle en cours si la vitesse de croissance cellulaire est inférieure/supérieure à un certain seuil prédéfini durant le cycle précédent. Ou encore, après plusieurs cycles de d'évolution pour adapter la suspension de cellules vivantes jusqu'à une concentration cible de molécule inhibitrice (mode medium swap ), les paramètres de culture peuvent être modifiés pour augmenter la vitesse de croissance des cellules (mode turbidostat).
L'étape g) du procédé consiste à collecter après plusieurs cycles de culture dans au moins un des n récipients de culture, les cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt.
Avantageusement, le phénotype d'intérêt est acquis par adaptation évolutive, notamment par l'accumulation pendant plusieurs générations de mutations bénéfiques par la cellule vivante, les mutations bénéfiques pouvant être spontanées, ou non spontanée, par exemple suite à une exposition aux rayons ultraviolet, suite à
l'exposition à un ou plusieurs agents mutagènes, ou suite à des modifications génétiques conduisant à un taux de mutation supérieur au taux de mutation naturel de l'organisme.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape g) de collecte est réalisée en utilisant des moyens de prélèvement, qui peuvent être choisis parmi une seringue stérile, une micropipette stérile ou tout autre moyen permettant de prélever les cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt.
Avantageusement, les cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt sont collectées après 2 cycles, avantageusement après 3 cycles, avantageusement après 4 cycles, avantageusement après 5 cycles, avantageusement après 6 cycles, avantageusement après 7 cycles, avantageusement après 8 cycles, avantageusement après 9 cycles, avantageusement après 10 cycles, avantageusement après 20 cycles, avantageusement après 30 cycles, avantageusement après 40 cycles, avantageusement après 50 cycles, avantageusement après 60 cycles, avantageusement après 70 cycles, avantageusement après 80 cycles, avantageusement après 90 cycles, avantageusement après 100 cycles, avantageusement après 150 cycles, avantageusement après 200 cycles, avantageusement après 250 cycles, avantageusement après 300 cycles, avantageusement après 350 cycles, avantageusement après 400 cycles, avantageusement après 450 cycles, avantageusement après 500 cycles, avantageusement après 550 cycles, avantageusement après 600 cycles, avantageusement après 650 cycles, avantageusement après 700 cycles, avantageusement après 750 cycles, avantageusement après 800 cycles, avantageusement après 850 cycles, avantageusement après 900 cycles, avantageusement après 950 cycles, avantageusement après 1000 cycles, avantageusement après 5 000 cycles, avantageusement après 10 000 cycles, avantageusement après 15 000 cycles, avantageusement après 20 000 cycles, avantageusement après 25 000 cycles, avantageusement après 30 000 cycles, avantageusement après 35 000 cycles, avantageusement après 40 000 cycles, avantageusement après 45 000 cycles, avantageusement après 50 000 cycles de culture.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé peut en outre comprendre de manière optionnelle au moins une étape de stérilisation des n récipients de culture et de l'au moins un récipient de mélange. Avantageusement, l'au moins une étape de stérilisation est mise en uvre dès qu'au moins un récipient de culture et/ou dès que l'au moins un récipient de mélange est vide. Avantageusement, l'au moins une étape de stérilisation est mise en uvre après l'étape c) pour le récipient de culture.
.. Avantageusement, l'au moins une étape de stérilisation est mise en uvre après l'étape e) pour l'au moins un récipient de mélange. Dans un mode de réalisation particulier, l'au moins une étape de stérilisation est réalisée par ajout d'une solution stérilisante, choisie parmi une solution contenant une base faible telle que l'ammoniaque, une solution contenant une base forte telle que la soude (NaOH) ou la potasse( KOH), une solution contenant un acide fort tel que l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, une solution contenant un acide faible tel que l'acide acétique, une solution contenant un agent oxydant, tel que le peroxyde d'hydrogène et l'hypochlorite de sodium, un solvant tel que l'éthanol et l'isopropanol, ou une de leurs combinaisons. Avantageusement, dans le cas d'une combinaison des solutions citées ci-dessus, les solutions peuvent être utilisées de manière simultanée ou de manière successive, c'est-à-dire l'une après l'autre. Avantageusement, la solution stérilisante est une solution de soude, de préférence une solution de soude à
au moins 0,1 M et encore plus préférentiellement de plus de 1 M. Avantageusement, l'étape de stérilisation peut être réalisée comme décrit par exemple dans le brevet EP1135460, c'est-à-dire en transférant temporairement tout le volume de suspension de cellules vivantes d'un récipient de culture ou de mélange vers un récipient de stockage, puis en mettant en contact toute la surface intérieure du récipient de culture ou de mélange avec une ou des solutions de stérilisation, suivie par une solution de rinçage. La suspension de cellules vivantes est ensuite transférée à nouveau vers le récipient de culture ou de mélange initial maintenant stérilisé.
Avantageusement, l'étape de stérilisation permet d'une part l'élimination des biofilms et d'autre part, de replacer l'au moins un récipient de culture et l'au moins un récipient de mélange en conditions nominales stériles, conformément à leur état initial respectif.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé peut en outre comprendre de manière optionnelle au moins une étape de nettoyage des n récipients de culture et de l'au moins un récipient de mélange. Avantageusement, l'au moins une étape de nettoyage est mise en uvre après l'au moins une étape de stérilisation.
Dans un mode de réalisation particulier, l'au moins une étape de nettoyage est réalisée par l'ajout d'une solution nettoyante permettant de neutraliser l'agent stérilisant.
Avantageusement, la solution nettoyante est choisie parmi les solutions acides, telles que les solutions d'acides acétique ou sulfurique et les solutions détergentes, en particulier les solutions contenant des tensio-actifs.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé peut en outre comprendre de manière optionnelle au moins une étape de rinçage des n récipients de culture et de l'au moins un récipient de mélange. Avantageusement, l'au moins une étape de rinçage est mise en uvre après l'au moins une étape de nettoyage. Dans un mode de réalisation particulier, l'au moins une étape de rinçage est réalisée par ajout d'une solution de rinçage permettant d'éliminer les résidus de solution de nettoyage.
Avantageusement, la solution de rinçage est de l'eau, préférentiellement de l'eau stérile.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé peut en outre comprendre de manière optionnelle au moins une étape d'exposition aux rayons ultraviolets et/ou une étape d'exposition à un agent mutagène. Avantageusement, l'étape d'exposition aux rayons ultraviolets et/ou l'étape d'exposition à un agent mutagène peut être mise en uvre à n'importe quel moment dans le procédé de l'invention. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, l'étape d'exposition aux rayons ultraviolets est mise en uvre entre les étapes c) et d) du procédé selon l'invention ou entre .. les étapes d) et e) du procédé selon l'invention.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, l'étape d'exposition à un agent mutagène est mise en uvre entre les étapes c) et d) du procédé
selon l'invention ou entre les étapes d) et e) du procédé selon l'invention.
Avantageusement, l'agent mutagène peut être choisi parmi les agents alkylants, tels que le N-nitroso-N-éthylurée (également dénommé N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)) ou le méthanesulfonate d'éthyle (également dénommé ethyl methanesulfonate (EMS)), les agents intercalants, tels que la proflavine et l'acridine orange, et les espèces réactives de l'oxygène, notamment les radicaux libres, les ions oxygénés et les peroxydes.
Le procédé conforme à la présente invention peut être mis en uvre dans un dispositif de culture en continu de cellules vivantes pour l'adaptation évolutive desdites cellules vivantes, ledit dispositif, comprenant :
- n récipients de culture, chaque récipient de culture étant agencé pour recevoir un milieu de culture et des cellules vivantes, - au moins un récipient de mélange et - au moins une unité d'alimentation en fluides stériles comprenant au moins un réservoir de milieu de culture, l'unité d'alimentation en fluides stériles étant reliée aux n récipients de culture et à l'au moins un récipient de mélange via une conduite principale d'alimentation.
Avantageusement, la circulation des fluides de l'unité d'alimentation en fluides stériles, à savoir la circulation du gaz, la circulation des solutions stérilisantes, de nettoyage et de rinçage et la circulation des milieux de cultures, est réalisée grâce à
l'utilisation de pompes et de vannes. Les pompes et les vannes peuvent être par exemple mises en uvre de manière mécanique et peuvent être contrôlées de manière électrique ou électronique, avantageusement de manière automatique en utilisant des moyens de contrôle qui ne sont pas représentés.
Dans un mode de réalisation particulier, l'unité d'alimentation en fluides stériles comprend au moins une source de gaz externe, au moins un réservoir de solution stérilisante, au moins un réservoir de solution nettoyante, au moins un réservoir de solution de rinçage et au moins un réservoir de milieu de culture. Dans un mode de réalisation particulier, l'unité d'alimentation en fluides stériles comprend en outre un moyen de prélèvement, avantageusement une seringue, permettant d'introduire les cellules vivantes dans chacun de n récipients de culture et de prélever les cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt. Dans un mode de réalisation alternatif, les cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt sont collectées au moyen d'une liaison fluidique vers un autre dispositif d'analyse.
Avantageusement, chacun des n récipients de culture peut comprendre en outre au moins un dispositif d"alimentation en gaz. L'au moins un dispositif d'alimentation en gaz permet l'injection d'un flux gazeux sous pression dans le récipient de culture, permettant la fourniture de gaz requis pour la croissance de la suspension et l'homogénéisation de ladite suspension (agitation par bullage). Avantageusement, l'au moins un dispositif d'alimentation en gaz permet l'injection d'un flux gazeux sous pression dans le récipient de culture, dit flux de transfert, ce qui permet d'augmenter la pression dans ledit récipient de culture et ainsi de pousser la suspension, tel un piston de seringue, vers le récipient de mélange.
De manière alternative, en plus de l'au moins un dispositif d'alimentation en gaz, chacun des n récipients de culture peut en outre comprendre au moins un dispositif d'alimentation en gaz de transfert. Dans ce cas, le flux de transfert provient uniquement et directement de l'au moins un dispositif d'alimentation en gaz de transfert, et le flux d'aération et d'agitation provient uniquement de l'au moins un dispositif d'alimentation en gaz. L'utilisation d'un gaz de transfert permet d'augmenter la pression dans ledit récipient de culture et ainsi de pousser la suspension, tel un piston de seringue, vers le récipient de mélange.

Avantageusement, chacun des n récipients de culture peut comprendre en outre au moins une conduite d'alimentation. L'au moins une conduite d'alimentation permet le remplissage du récipient de culture en milieu de culture à partir d'au moins un réservoir de milieu de culture et le remplissage du récipient de culture en solutions de stérilisation, de nettoyage et de rinçage à partir des réservoirs correspondants.
La conduite d'alimentation permet également le transfert de tout ou d'une partie de la suspension du récipient de culture vers un récipient de mélange par la mise sous pression dudit récipient de culture et la vidange du récipient de culture. L'au moins une conduite d'alimentation permet également le remplissage du récipient de culture lors du transfert de tout ou d'une partie de la suspension du récipient de mélange vers l'au moins un récipient de culture. La conduite d'alimentation permet également de vidanger le contenu du récipient de culture vers une poubelle lors des opérations de stérilisation, de nettoyage et de rinçage.
Une vanne d'alimentation contrôle l'accès à la conduite d'alimentation pour permettre le remplissage ou la vidange du récipient de culture.
Avantageusement, chacun des n récipients de culture peut comprendre en outre au moins un dispositif de décharge permettant l'évacuation des gaz de bullage pendant la culture, ainsi que l'évacuation des gaz, du ou des milieux de culture et des solutions de stérilisation, de nettoyage et de rinçage lors des opérations de remplissage du récipient de culture. Avantageusement, le dispositif de décharge est contrôlé via une vanne de décharge.
Avantageusement, chacun des n récipients de culture peut comprendre en outre au moins une conduite de mise à niveau. L'au moins une conduite de mise à niveau permet le contrôle du volume de la suspension dans le récipient de culture.
Avantageusement, une vanne de mise à niveau contrôle l'accès à la conduite de mise à niveau.
Avantageusement, la conduite de mise à niveau se situe à une hauteur inférieure ou égale à la moitié de la hauteur totale du récipient de culture depuis le fond dudit récipient.
De manière encore plus avantageuse, chacun des n récipients de culture peut comprendre en outre :
- au moins un dispositif d'alimentation en gaz, - au moins un dispositif de décharge, - au moins une conduite de mise à niveau, et - au moins une conduite d'alimentation.
Dans un mode de réalisation particulier, chacun des n récipients de culture comprend :
- au moins un dispositif d'alimentation en gaz en partie basse du récipient de culture, - au moins un dispositif de décharge en partie haute du récipient de culture, - au moins une conduite de mise à niveau à une hauteur inférieure ou égale à la moitié
de la hauteur totale du récipient de culture depuis le fond dudit récipient de culture et, - au moins une conduite d'alimentation en partie basse du récipient de culture.
Avantageusement, les récipients de culture sont des récipients de culture fermés. Les récipients de culture peuvent être jetables ou réutilisables. De manière particulièrement avantageuse, les récipients de culture sont des récipients réutilisables.
Dans un mode de réalisation particulier, chacun des n récipients de culture comprend des cellules vivantes dans un milieu de culture. Avantageusement, aucun récipient de culture du dispositif n'est vide.
Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif de culture comprend une seule unité d'alimentation en fluides stériles pour l'ensemble des n récipients de culture et l'au moins un récipient de mélange.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le dispositif de culture comprend une unité d'alimentation en fluides stériles par récipient de culture.
Avantageusement, chacun des n récipients de culture est relié individuellement, et indépendamment les uns des autres, à une unité d'alimentation en fluides stériles. L'unité d'alimentation en fluides stériles est reliée à son récipient de culture via une vanne d'alimentation.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'au moins un récipient de mélange est un récipient de culture agencé pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'au moins un récipient de mélange est un unique récipient, indépendant de l'ensemble des n récipients de culture, et est agencé pour recevoir le contenu de l'ensemble des n récipients de culture.
Avantageusement, lorsque le récipient de mélange est un unique récipient, indépendant de l'ensemble des récipients de culture, ledit récipient de mélange comprend :
- un dispositif d'alimentation en gaz en partie haute dudit récipient de mélange, - un dispositif de décharge en partie haute dudit récipient de mélange, - une conduite d'alimentation en partie basse dudit récipient de mélange.
Avantageusement, le récipient de mélange est un récipient de culture fermé. Le récipient de mélange peut être jetable ou réutilisable. De manière particulièrement avantageuse, le récipient de mélange est un récipient réutilisable.
Dans un mode de réalisation particulier, le récipient de mélange comprend un moyen d'agitation, avantageusement un agitateur mécanique ou par injection de gaz.
Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif de culture comprend en outre une unité de commande, agencée et configurée pour actionner l'ensemble des différents moyens d'alimentation, en particulier les pompes et les vannes ; permettant le transfert du contenu d'au moins un récipient de culture vers l'au moins un récipient de mélange et inversement.
Avantageusement, le dispositif de culture est commandé par l'unité de commande.
Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif de culture comprend en outre une unité de contrôle, agencée et configurée pour mesurer les indicateurs physico-chimiques, dont la densité cellulaire, dans chacun des récipients de culture, mesurer la dynamique de croissance de la suspension, et contrôler le déclenchement automatique des mélanges de suspension dans les n récipients de mélange.
FIGURES
[Fig.1 a] La figure la représente un dispositif de culture en continu de cellules vivantes selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dispositif comprenant une unité
d'alimentation en fluides stériles et trois récipients de culture, l'ensemble des récipients de culture étant agencé pour être respectivement et successivement un récipient de mélange, un récipient de mélange étant agencé pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture.
[Fig.lb] La figure lb représente un dispositif conforme à la figure la et illustre l'étape c) du procédé selon un mode de réalisation particulier de l'invention au cours de laquelle la totalité de la suspension d'un premier récipient de culture est transférée vers un deuxième récipient de culture qui devient un récipient de mélange.
[Fig.lc] La figure lc représente un dispositif conforme à la figure la et illustre l'étape e) du procédé selon un mode de réalisation particulier de l'invention au cours de laquelle au moins une fraction de la suspension obtenue à l'étape d) dans le deuxième récipient de culture est transférée vers le premier récipient de culture.
[Fig.2a] La figure 2a représente un dispositif de culture en continu de cellules vivantes selon un deuxième mode de réalisation, dans lequel le dispositif comprend un unique récipient de mélange, indépendant de l'ensemble des n récipients de culture, et est agencé
pour recevoir le contenu de l'ensemble des n récipients de culture.
[Fig.2b] La figure 2b représente un dispositif conforme à la figure 2a et illustre l'étape c) du procédé selon un mode de réalisation particulier de l'invention au cours de laquelle la totalité de la suspension des n récipient de culture est transférée vers le récipient de mélange.
[Fig.2c] La figure 2c représente un dispositif conforme à la figure 2a et illustre l'étape e) du procédé selon un mode de réalisation particulier de l'invention au cours de laquelle au moins une fraction de la suspension obtenue à l'étape d) du récipient de mélange est transférée vers chacun des n récipients de culture.

[Fig.3] La figure 3 représente un dispositif de culture en continu de cellules vivantes selon un troisième mode de réalisation, dans lequel le dispositif comprend quatre récipients de culture, chacun des récipients de culture étant relié individuellement, et indépendamment les uns des autres, à une unité d'alimentation en fluides stériles, et dans lequel les quatre récipients de culture sont agencés pour pouvoir être respectivement et successivement un récipient de mélange, un récipient de mélange étant agencé
pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture.
[Fig.4] La figure 4 représente un dispositif de culture en continu de cellules vivantes selon un quatrième mode de réalisation, dans lequel le dispositif comprend quatre récipients de culture, chacun des récipients de culture étant relié
individuellement, et indépendamment les uns des autres, à une unité d'alimentation en fluides stériles, et un unique récipient de mélange, indépendant de l'ensemble des 4 récipients de culture, ledit récipient de mélange étant agencé pour recevoir le contenu de l'ensemble des 4 récipients de culture.
[Fig.5] La figure 5 représente l'évolution d'une souche bactérienne de la famille Pseudomonadacea. Sur cette figure, le nombre total de dilutions déclenchées chaque jour est représenté en fonction du nombre de jours [Fig.6] La Figure 6 représente l'adaptation de la souche bactérienne de la famille Pseudomonadacea à 30 C en représentant l'évolution de la température dans chacun des récipients de culture RC1 et RC2 en fonction du nombre de cycles de culture.
[Fig.7] La Figure 7 représente l'adaptation d'une souche bactérienne de la famille Pseudomonadacea à 30 C en représentant l'évolution de la température dans chacun des récipients de culture RC1 et RC2 en fonction du nombre de jours de l'expérience.
[Fig.8] La figure 8 représente l'adaptation du taux de dilution d'une souche bactérienne de la famille Pseudomonadacea cultivée à 25 C soit dans un seul récipient de culture de 15 ml (carrés pleins) soit dans un seul récipient de culture de 80 mL (ronds pleins) selon un procédé non conforme à l'invention. Sur cette figure le taux de dilution en heure-1 est fonction du nombre de jours.
[Fig.9] La figure 9 représente l'évolution adaptative à la température de 25 C
à taux de dilution imposé de 0,2 heures-1 d'une souche bactérienne de la famille Pseudomonadacea cultivée avec réunion et séparation successives des suspensions entre 2 récipients de culture de 15 mL (RC1 : losanges pleins ; RC2 triangles pleins) selon le procédé conforme à l'invention. Sur cette figure la température ( C) est fonction du nombre de jours.

DESCRIPTION DETAILLEE
La conception et la fonctionnalité du dispositif de culture en continu de cellules vivantes pour l'adaptation évolutive desdites cellules vivantes sont décrites dans les figures la à 4.
Le dispositif de culture cellulaire en continu de cellules vivantes, tel que présenté aux figures la à 2c, comprend trois récipients de culture, un premier récipient de culture RC1, un second récipient de culture RC2 et un troisième récipient de culture RC3.
Le premier récipient de culture RC1 est adjacent au second récipient de culture RC2, lui-même étant adjacent au troisième récipient de culture RC3. Les récipients de culture sont agencés pour contenir des cellules vivantes et des milieux de culture, et permettent la culture desdites cellules.
En référence à la figure la, le dispositif de culture comprend une unité
d'alimentation en fluides stériles 10 comprenant une source de gaz externe GS, un réservoir de solution stérilisante AS, un réservoir de solution nettoyante AC, un réservoir de solution de rinçage AR et trois réservoirs de milieu de culture Ml, M2 et M3. La circulation des fluides de l'unité
d'alimentation en fluides stériles 10, à savoir la circulation du gaz, la circulation des solutions stérilisante, de nettoyage et de rinçage et la circulation des milieux de cultures, est réalisée grâce à l'utilisation de moyens d'alimentation, en particulier de pompes et de vannes. Les pompes et les vannes peuvent être par exemple mises en uvre de manière mécanique et/ou peuvent être contrôlées de manière électrique ou électronique, avantageusement de manière automatique en utilisant des moyens de contrôle qui ne sont pas représentés. L'unité d'alimentation en fluides stériles 10 comprend également un moyen de prélèvement, avantageusement une seringue 11, permettant d'introduire les cellules dans les récipients de culture et de prélever les cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt. Pour simplifier les figures lb, lc, 2a, 2b, 2c, 3 et 4, l'unité d'alimentation en fluides stériles 10 est représentée par un bloc ou un carré.
En référence aux figures la, lb, lc, 2a, 2b, 2c, le dispositif de culture comprend une conduite principale d'alimentation 010 et des vannes d'alimentation 1, 2, 3, Val, Va2 et Va3 reliées à la conduite principale d'alimentation 010. Ladite conduite d'alimentation 010 et lesdites vannes sont situées en partie basse des récipients de culture.
L'unité
d'alimentation en fluides stériles 10 est reliée aux trois récipients de culture via ladite conduite d'alimentation 010 et lesdites vannes. Elles permettent le remplissage du gaz, de la solution stérilisante, de la solution nettoyage et de la solution rinçage, des milieux de cultures et des cellules vivantes dans les récipients de culture. Elles permettent en outre le transfert du contenu des récipients de culture, par exemple lors du transfert de tout ou d'une partie de la suspension du récipient de mélange vers un récipient de culture et permettent la vidange du récipient de culture lors du transfert de tout ou d'une partie de la suspension du récipient de culture vers le récipient de mélange. La vanne d'alimentation Val permet le remplissage ou la vidange du récipient de culture RC1. La vanne d'alimentation Va2 permet le remplissage ou la vidange du récipient de culture RC2. La vanne d'alimentation Va3 permet le remplissage ou la vidange du récipient de culture RC3. Les vannes 1, 2, 3, Val, Va2 et Va3 sont normalement en position fermée à l'état inactif. Lorsque la vanne d'alimentation Val est en position ouverte, le remplissage ou la vidange du récipient de culture ROI peut s'effectuer. Lorsque la vanne d'alimentation Val est en position fermée, il n'est pas possible de remplir ou de vidanger le récipient de culture RCi.
Le dispositif de culture comprend trois dispositifs d'alimentation en gaz Gl, G2 et G3.
Chaque récipient de culture RC1, RC2 et RC3 est relié à un dispositif d'alimentation en gaz G1 , G2 ou G3 permettant l'injection d'un flux gazeux sous pression dans le récipient de culture, permettant l'injection de gaz dans la suspension, l'homogénéisation de ladite suspension (agitation par bullage) et la mise sous pression au besoin du récipient de culture. Chaque dispositif d'alimentation en gaz G1 , G2 ou G3 est relié au récipient de culture par sa partie inférieure au moyen d'une conduite d'alimentation en gaz CG
débouchant dans le récipient de culture à une hauteur située à environ un quart de la hauteur totale du récipient depuis le fond dudit récipient.
Le dispositif de culture comprend trois dispositifs de décharge VV1, VV2 et W3. Chaque récipient de culture RC1, RC2 et RC3 est relié à un dispositif de décharge VV1, VV2 ou VV3 permettant l'évacuation des gaz injectés dans la suspension lors de la culture, ainsi que l'évacuation des gaz, du ou des milieux de culture et des solutions de stérilisation, de nettoyage et de rinçage lors des opérations de remplissage du récipient de culture. Le dispositif de décharge est situé en partie haute du récipient de culture. Le dispositif de culture comprend trois vannes de décharge Vd1, Vd2 et Vd3. Chaque récipient de culture RC1, RC2 et RC3 est relié respectivement à une vanne de décharge Vd1, Vd2 et Vd3, de manière à contrôler l'évacuation des gaz injectés pendant la culture, ainsi que l'évacuation des gaz, du ou des milieux de culture et des solutions de stérilisation AS, de nettoyage AC
et de rinçage AR lors des opérations de remplissage du récipient de culture.
Les vannes de décharge Vd1, Vd2 et Vd3 sont normalement en position ouverte à l'état inactif. Lorsque la vanne de décharge est en position ouverte, le remplissage du récipient de culture peut s'effectuer. Lorsque la vanne de décharge est en position fermée, le transfert de tout ou une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture vers le récipient de mélange pourra s'opérer par mise sous pression dudit récipient de culture.
En référence aux figures la, lb, lc, le dispositif de culture comprend trois vannes de mise à niveau Vtl, Vt2 et Vt3. Chaque récipient de culture RC1, RC2 et RC3 est relié

respectivement à une vanne de mise à niveau Vtl, Vt2 et Vt3 par une conduite de mise à
niveau CT. Chaque conduite de mise à niveau CT débouche dans un récipient de culture à
une hauteur inférieure ou égale à la moitié de la hauteur totale du récipient de culture depuis le fond dudit récipient. Chaque vanne de mise à niveau Vt1 , Vt2 et Vt3 est en outre reliée à la conduite principale C10. Chaque vanne de mise à niveau contrôle le volume contenu dans chacun des récipients de culture, de manière à ce que le volume reste constant lors de l'ajout de milieu de culture. Les vannes de mise à niveau Vtl, Vt2 et Vt3 sont normalement en position fermée à l'état inactif. Lorsque la vanne de mise à
niveau est en position ouverte, un volume de suspension excédent le volume de suspension défini par la position de la conduite de mise à niveau est évacué du récipient de culture vers la conduite d'alimentation C10.
Les figures la, lb et lc représentent un premier mode de réalisation particulier dans lequel les trois récipients de culture sont agencés pour devenir respectivement et successivement un récipient de mélange lors du procédé de culture cellulaire.
On va maintenant décrire le procédé de culture cellulaire en continu de cellules vivantes associé au dispositif de culture représenté par les figures la, lb et lc.
Selon la figure la, chacun des trois récipients de culture RC1, RC2 et RC3 comprend des cellules vivantes dans un milieu de culture. Chaque récipient de culture RC1, RC2 et RC3 est rempli environ à la moitié de sa capacité. Les cellules vivantes sont mises en .. culture selon un régime sélectif donné, utilisant des paramètres de culture définis, jusqu'à
atteindre un stade de croissance déterminé, afin d'obtenir une suspension de cellules vivantes dans chacun des trois récipients de culture. Pour cela, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans chacun des trois récipients de culture respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz G1 , G2 ou G3 permettant l'injection de gaz et l'homogénéisation de la suspension (agitation par bullage) à l'intérieur de chacun des trois récipients de culture. Les vannes 1, 2, 3, 4, les vannes de mise à niveau Vt1 , Vt2 et Vt3, et les vannes d'alimentation Val, Va2 et Va3 sont en position fermée. Seules les vannes de décharge Vd1, Vd2 et Vd3 sont en position ouvertes.
Ensuite, La figure lb représente l'étape c) du procédé selon l'invention consistant à
transférer toute la suspension obtenue à l'étape b) d'au moins un récipient de culture (RCi) vers l'au moins un récipient de mélange et l'étape d) consistant à mélanger la suspension à l'étape c) dans l'au moins un récipient de mélange.
Selon la figure lb, la totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC1 est transférée vers le récipient de culture RC2, comme représenté par la flèche f12.
Les vannes d'alimentation Val, 2, Va2 sont en position active (en noir sur la figure lb) et donc ouvertes, de manière à ce que la suspension du premier récipient RC1 traverse lesdites vannes pour parvenir au deuxième récipient de culture RC2. La vanne de décharge Vd1 du premier récipient est en position active (en noir sur la figure lb) et donc fermée, de manière à mettre sous pression le premier récipient de culture. La vanne de décharge Vd2 du deuxième récipient reste en position inactive et donc ouverte, de manière à
permettre le remplissage dans le deuxième récipient de culture RC2. Afin de permettre la vidange du récipient de culture RC1, le dispositif d'alimentation en gaz G1 injecte, via la conduite d'alimentation en gaz CG, un flux gazeux sous pression, dit flux de transfert, ce qui permet d'augmenter la pression dans le récipient de culture RC1 et ainsi de pousser la suspension tel un piston de seringue. Le récipient de culture RC2 devient alors le récipient de mélange et comprend à la fois la suspension contenue initialement dans le deuxième récipient de culture RC2 et la suspension provenant du premier récipient de culture RC1.
De manière non représentée, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans le deuxième récipient de culture RC2 permettant via le dispositif d'alimentation en gaz G2 permettant l'injection de gaz de la suspension et l'homogénéisation de la suspension de cellules (agitation par bullage) à l'intérieur du récipient de culture RC2.
Concernant le troisième récipient de culture RC3, l'étape de culture est maintenue par injection de flux gazeux sous pression dans le récipient de culture RC3 et par maintien en position ouverte de la vanne Vd3.
Concernant le récipient de culture RC1, il est procédé aux étapes de stérilisation, de nettoyage et de rinçage, via l'ouverture des vannes 1, Val. On commence tout d'abord par l'étape de stérilisation en ajoutant une solution stérilisante provenant du réservoir de solution stérilisante AS vers le récipient de culture RC1. La vidange de la solution stérilisante est réalisée par la vanne Val. On applique ensuite une solution nettoyante provenant du réservoir de solution nettoyante AC vers le récipient de culture RC1. La vidange de la solution nettoyante est réalisée par la vanne Val. On applique ensuite une solution de rinçage provenant du réservoir de solution de rinçage AR vers le récipient de culture RC1. La vidange de la solution de rinçage est réalisée par la vanne Val. Ces étapes ne sont pas représentées.
Selon la figure lc, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC2 est transférée vers le récipient de culture RC1, comme représenté par la flèche f21.
La vanne de mise à niveau Vt2 et les vannes d'alimentation Val et 2 sont en position active (en noir sur la figure 1c) et donc ouvertes, de manière à ce qu'une partie de la suspension du deuxième récipient RC2 traverse lesdites vannes pour parvenir au premier récipient de culture RC1. La vanne de décharge Vd2 du deuxième récipient est en position active (en noir sur la figure 1c) et donc fermée, de manière à permettre la pressurisation de RC2 et permettre le transfert de la moitié de la suspension vers RC1. La vanne de décharge Vd1 du premier récipient reste en position inactive et donc ouverte, de manière à
permettre le remplissage du premier récipient de culture RC1. Afin de de permettre la vidange du récipient de culture RC2, le dispositif d'alimentation en gaz G2 injecte, via la conduite d'alimentation en gaz CG, un flux gazeux sous pression, dit flux de transfert, ce qui permet d'augmenter la pression dans le deuxième récipient de culture RC2 et ainsi de pousser la suspension tel un piston de seringue via la conduite de transfert.
De manière non représentée, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans chacun des récipients de culture RC1 et RC2 respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz G1 et G2, permettant l'injection de gaz dans la suspension et l'homogénéisation de la suspension (agitation par bullage) à l'intérieur des récipients de culture RC1 et RC2.
Selon la figure lb, la totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC3 est transférée vers le récipient de culture RC1, comme suggéré par la flèche f31. Les vannes d'alimentation Va3, 3, 2, Val sont en position active et donc ouvertes, de manière à ce que la suspension du premier récipient RC3 traverse lesdites vannes pour parvenir au deuxième récipient de culture RC1. La vanne de décharge Vd3 du troisième récipient est en position active et donc fermée, de manière à mettre sous pression le troisième récipient de culture. La vanne de décharge Vd1 du premier récipient reste en position inactive et donc ouverte, de manière à permettre le remplissage dans le premier récipient de culture RC1. Afin de permettre la vidange du récipient de culture RC3, le dispositif d'alimentation en gaz G3 injecte, via la conduite d'alimentation en gaz CG, un flux gazeux sous pression, dit flux de transfert, ce qui permet d'augmenter la pression dans le récipient de culture RC3 et ainsi pousser la suspension tel un piston de seringue. Le récipient de culture RC1 devient alors le récipient de mélange et comprend à la fois la suspension contenue initialement dans le premier récipient de culture RC1 et la suspension provenant du troisième récipient de culture RC3.
De manière non représentée, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans le premier récipient de culture RC1 permettant via le dispositif d'alimentation en gaz G1 permettant l'injection de gaz de la suspension et l'homogénéisation de la suspension (agitation par bullage) à l'intérieur du récipient de culture RC1.
Concernant le deuxième récipient de culture RC2, l'étape de culture est maintenue par injection de flux gazeux sous pression dans le récipient de culture RC2 et par maintien en position ouverte de la vanne Vd2.
Concernant le récipient de culture RC3, il est procédé aux étapes de stérilisation, de nettoyage et de rinçage, via l'ouverture des vannes 1, 2, 3, et Va3. On commence tout d'abord par l'étape de stérilisation en ajoutant une solution stérilisante provenant du réservoir de solution stérilisante AS vers le récipient de culture RC3. La vidange de solution stérilisante est réalisée par la vanne Va3. On applique ensuite une solution nettoyante provenant du réservoir de solution nettoyante AC vers le récipient de culture RC3. La vidange de la solution nettoyante est réalisée par la vanne Va3. On applique ensuite une solution de rinçage provenant du réservoir de solution de rinçage AR vers le récipient de culture RC3. La vidange de la solution de rinçage est réalisée par la vanne Va3. Ces étapes ne sont pas représentées.
Selon la figure lc, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC1 est transférée vers le récipient de culture RC3, comme suggéré par la flèche f13. La vanne de mise à niveau Vtl et les vannes d'alimentation 2,3 et Va3 sont en position active et donc ouvertes, de manière à ce qu'une partie de la suspension du premier récipient RC1 traverse lesdites vannes pour parvenir au troisième récipient de culture RC3.
La vanne de décharge Vd1 du premier récipient est en position active et donc fermée, de manière à
permettre la pressurisation de RC1 et permettre le transfert de la moitié de la suspension vers RC3. La vanne de décharge Vd3 du troisième récipient reste en position inactive et donc ouverte, de manière à permettre le remplissage du troisième récipient de culture RC3.
Afin de permettre la vidange du récipient de culture RC1, le dispositif d'alimentation en gaz G1 injecte, via la conduite d'alimentation en gaz CG, un flux gazeux sous pression, dit flux de transfert, ce qui permet d'augmenter la pression dans le premier récipient de culture RC1 et ainsi de pousser la suspension tel un piston de seringue via la conduite de transfert.
De manière non représentée, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans chacun des récipients de culture RC1 et RC3 respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz G1 et G3, permettant l'injection de gaz dans la suspension et l'homogénéisation de la suspension de cellules (agitation par bullage) à
l'intérieur des récipients de culture RC1 et RC3.
Selon la figure lb, la totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC2 est transférée vers le récipient de culture RC3, comme suggéré par la flèche f23. Les vannes d'alimentation Va2, 3, Va3 sont en position active et donc ouvertes, de manière à
ce que la suspension du deuxième récipient RC2 traverse lesdites vannes pour parvenir au troisième récipient de culture RC3. La vanne de décharge Vd2 du deuxième récipient est en position active et donc fermée, de manière à mettre sous pression le deuxième récipient de culture. La vanne de décharge Vd3 du troisième récipient reste en position inactive et donc ouverte, de manière à permettre le remplissage dans le troisième récipient de culture RC3. Afin de permettre la vidange du récipient de culture RC1, le dispositif d'alimentation en gaz G1 injecte, via la conduite d'alimentation en gaz CG, un flux gazeux sous pression, dit flux de transfert, ce qui permet d'augmenter la pression dans le récipient de culture RC1 et ainsi de pousser la suspension tel un piston de seringue. Le récipient de culture RC3 devient alors le récipient de mélange et comprend à la fois la suspension contenue initialement dans le troisième récipient de culture RC3 et la suspension provenant du deuxième récipient de culture RC2.
De manière non représentée, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans le deuxième récipient de culture RC3 permettant via le dispositif d'alimentation en gaz G3 permettant l'injection de gaz de la suspension et l'homogénéisation de la suspension de cellules (agitation par bullage) à l'intérieur du récipient de culture RC3.
Concernant le premier récipient de culture RC1, l'étape de culture est maintenue par injection de flux gazeux sous pression dans le récipient de culture RC1 et par maintien en position ouverte de la vanne Vd1.
Concernant le récipient de culture RC2, il est procédé aux étapes de stérilisation, de nettoyage et de rinçage, via l'ouverture des vannes 1, 2, et Va2. On commence tout d'abord par l'étape de stérilisation en ajoutant une solution stérilisante provenant du réservoir de solution stérilisante AS vers le récipient de culture RC2. La vidange de solution stérilisante est réalisée par la vanne Va2. On applique ensuite une solution nettoyante provenant du réservoir de solution nettoyante AC vers le récipient de culture RC2. La vidange de la solution nettoyante est réalisée par la vanne Va2. On applique ensuite une solution de rinçage provenant du réservoir de solution de rinçage AR vers le récipient de culture RC2.
La vidange de la solution de rinçage est réalisée par la vanne Va2. Ces étapes ne sont pas représentées.
Selon la figure 1c, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC3 est transférée vers le récipient de culture RC2, comme suggéré par la flèche f32. La vanne de mise à niveau Vt3 et les vannes d'alimentation Va2 et 3 sont en position active et donc ouvertes, de manière à ce qu'une partie de la suspension du troisième récipient RC3 traverse lesdites vannes pour parvenir au deuxième récipient de culture RC2.
La vanne de décharge Vd3 du troisième récipient est en position active et donc fermée, de manière à
permettre la pressurisation de RC3 et permettre le transfert de la moitié de la suspension vers RC2. La vanne de décharge Vd2 du deuxième récipient reste en position inactive et donc ouverte, de manière à permettre le remplissage du deuxième récipient de culture RC2.
Afin de permettre la vidange du récipient de culture RC3, le dispositif d'alimentation en gaz G3 injecte, via la conduite d'alimentation en gaz CG, un flux gazeux sous pression, dit flux de transfert, ce qui permet d'augmenter la pression dans le troisième récipient de culture RC3 et ainsi de pousser la suspension tel un piston de seringue via la conduite de transfert.
De manière non représentée, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans chacun des récipients de culture RC2 et RC3 respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz G2 et G3, permettant l'injection de gaz dans la suspension et l'homogénéisation de la suspension de cellules (agitation par bullage) à
l'intérieur des récipients de culture RC2 et RC3.
Une injection de flux gazeux sous pression est à nouveau réalisée dans chacun des trois récipients de culture respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz Gl, G2 ou G3 permettant l'injection de gaz dans la suspension et l'homogénéisation de la suspension de cellules (agitation par bullage) à l'intérieur de chacun des trois récipients de culture. Les vannes d'alimentation 1, 2, 3 les vannes de mise à niveau Vt1 , Vt2 et Vt3, et les vannes d'alimentation Val, Va2 et Va3 sont en position fermée. Seules les vannes de décharge Vd1, Vd2 et Vd3 sont en position ouverte.
Les étapes précédentes sont répétées autant de fois que nécessaire, jusqu'à
l'obtention de cellules ayant acquis un phénotype d'intérêt dans les récipients de culture.
Lorsque les cellules ont acquis un phénotype d'intérêt, l'étape de collecte est réalisée, cette étape n'étant pas représentée. L'étape de collecte peut aussi être réalisée après plusieurs cycles de mélange. De préférence, l'étape de collecte est réalisée en utilisant un moyen de prélèvement, en particulier par la seringue 11.
Une fois l'étape de collecte effectuée, l'ensemble des récipients de culture est vidangé, via la fermeture des vannes de décharge Vd1, Vd2 et Vd3, l'injection de flux gazeux sous pression en provenant de la source de gaz externe GS et l'ouverture des vannes d'alimentation Val, va2, Va3 et 2, 3. On procède ensuite aux étapes de stérilisation, de nettoyage et de rinçage, via l'ouverture des vannes 1, Val, Vd1, 2, Va2, Vd2, 3, Va3, Vd3. On commence tout d'abord par l'étape de stérilisation en ajoutant une solution stérilisante provenant du réservoir de solution stérilisante AS vers chacun des récipients de culture RC1, RC2 et RC3. La vidange de la solution stérilisante est réalisée par les vannes respectives Val, Va2 et Va3. On applique ensuite une solution nettoyante provenant du réservoir de solution nettoyante AC vers chacun des récipients de culture RC1, RC2 et RC3. La vidange de la solution nettoyante est réalisée par les vannes respectives Val, Va2 et Va3. On applique ensuite une solution de rinçage provenant du réservoir de solution de rinçage AR vers chacun des récipients de culture RC1, RC2 et RC3. La vidange de la solution de rinçage est réalisée par les vannes respectives Val, Va2 et Va3.
Ces étapes ne sont pas représentées sur les figures la, lb et lc.
Les figures 2a, 2b et 2c représentent un second mode de réalisation particulier dans lequel le dispositif de culture comprend un unique récipient de mélange, indépendant des récipients de culture, et est agencé pour recevoir le contenu de l'ensemble des récipients de culture.

Le dispositif de culture de la figure 2a ne sera décrit que par rapport à ses différences par rapport au dispositif de culture de la figure la. Le dispositif de culture de la figure 2a comprend en outre un unique récipient de mélange RM, indépendant des récipients de culture RC1, RC2 et RC3, et agencé pour recevoir le contenu desdits récipients de culture.
Le dispositif de culture comprend un dispositif d'alimentation en gaz GM relié
au récipient de mélange RM en partie haute dudit récipient de mélange. Le dispositif d'alimentation en gaz GM permet la mise sous pression du récipient de mélange par injection d'un flux gazeux. Le dispositif comprend une vanne d'alimentation en gaz Vgm contrôlant l'alimentation en gaz du dispositif d'alimentation en gaz GM. Le dispositif de culture comprend un dispositif de décharge VVm relié au récipient de mélange RM en partie haute dudit récipient de mélange. Le dispositif de décharge (VVm) permet l'évacuation des gaz pendant le mélange. Le dispositif comprend une vanne de décharge Vdm contrôlant l'évacuation des gaz pendant le mélange. La vanne de décharge Vdm est normalement en position fermée à l'état inactif. Lorsque la vanne de décharge Vdm est en position ouverte, le remplissage du récipient de mélange et/ou l'évacuation des gaz pendant le mélange peuvent être réalisés. Le dispositif de culture comprend une vanne d'alimentation Vam contrôlant le remplissage et la vidange du récipient de mélange. Elle est située en partie basse du récipient de mélange et est reliée à la conduite principale d'alimentation 010, permettant le remplissage du récipient de mélange lors du transfert de tout ou d'une partie de la suspension des récipients de culture vers le récipient de mélange et permettant la vidange du récipient de mélange lors du transfert de tout ou d'une partie de la suspension du récipient de mélange vers un récipient de culture. La vanne d'alimentation Vam est normalement en position fermée à l'état inactif. Lorsque la vanne d'alimentation Vam est en position ouverte, le remplissage ou la vidange du récipient de mélange peut s'effectuer.
Lorsque la vanne d'alimentation Vam est en position fermée, il n'est pas possible de remplir ou de vidanger le récipient de mélange.
On va maintenant décrire le procédé de culture cellulaire en continu de cellules vivantes associé au dispositif de culture représenté par les figures 2a, 2b et 2c.
Selon la figure 2a, chacun des trois récipients de culture RC1, RC2 et RC3 comprend des cellules vivantes dans un milieu de culture. Ils sont remplis environ à
75% de leur capacité totale. Le récipient de mélange RM est vide et les vannes Vdm, Vam et Vgm sont en position fermée.
Selon la figure 2b, les suspensions contenues dans les récipients de culture RC1, RC2 et RC3 sont transférées vers le récipient de mélange RM, comme représenté
par les flèches f1m, f2m, f3m et fmp. Pour cela, le transfert de la suspension du récipient de culture RC1 vers le récipient de mélange RM est réalisé via l'ouverture des vannes d'alimentation Val, 2, 3, Vam et de la vanne de décharge Vdm. Le transfert de la suspension du récipient de culture RC2 vers le récipient de mélange RM est réalisé via l'ouverture des vannes d'alimentation Va2, 3, Vam et de la vanne de décharge Vdm. Le transfert de la suspension du récipient de culture RC3 vers le récipient de mélange RM est réalisé via l'ouverture des vannes d'alimentation Va3, Vam et de la vanne de décharge Vdm. L'ouverture de la vanne de décharge Vdm permet le remplissage du récipient de mélange RM. Le transfert des suspensions est réalisé grâce aux dispositifs d'alimentation en gaz Gl, G2 et G3, comme décrit précédemment.
Une fois le récipient de mélange rempli avec l'ensemble des suspensions provenant des récipients de culture RC1, RC2 et RC3, la vanne d'alimentation Vam est placée en position fermée.
Concernant les récipients de culture RC1, RC2 et RC3, il est procédé aux étapes de stérilisation, de nettoyage et de rinçage, via l'ouverture des vannes 1, Val, Vd1, 2, Va2, Vd2, 3, Va3, Vd3. On commence tout d'abord par l'étape de stérilisation en ajoutant une solution stérilisante provenant du réservoir de solution stérilisante AS vers chacun des récipients de culture R1C, RC2 et RC3. La vidange de la solution stérilisante est réalisée par les vannes respectives Val, Va2 et Va3. On applique ensuite une solution nettoyante provenant du réservoir de solution nettoyante AC vers chacun des récipients de culture RC1, RC2 et RC3. La vidange de la solution nettoyante est réalisée par les vannes respectives Val, Va2 et Va3. On applique ensuite une solution de rinçage provenant du réservoir de solution de rinçage AR vers chacun des récipients de culture RC1, RC2 et RC3. La vidange de la solution de rinçage est réalisée par les vannes respectives Val, Va2 et Va3. Ces étapes ne sont pas représentées sur la figure 2b.
Selon la figure 2c, une partie de la suspension contenue dans le récipient de mélange RM est transférée vers le premier récipient de culture RC1, comme représenté
par les flèches fms et fml. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Vgm, Vam, 3, 2, Val et Vd1. La vanne Vdm est en position fermée et une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans le récipient de mélange Rm, via l'ouverture de la vanne d'alimentation en gaz Vgm, permettant la vidange du récipient de mélange RM.
L'ouverture de la vanne de décharge Vd1 permet le remplissage du récipient de culture RC1.
Les vannes Va2 et Va3 sont en position fermée.
Tel que suggéré par la figure 2c, une partie de la suspension contenue dans le récipient de mélange RM est ensuite transférée vers le deuxième récipient de culture RC2, comme représenté par les flèches fms et fm2 en pointillé. Pour cela, le transfert est réalisé
.. via l'ouverture des vannes Vgm, Vam, 3, Va2 et Vd2. La vanne Vdm est en position fermée et une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans le récipient de mélange Rm, via l'ouverture de la vanne d'alimentation en gaz Vgm, permettant la vidange du récipient de mélange RM. L'ouverture de la vanne de décharge Vd2 permet le remplissage du récipient de culture RC2. Les vannes Val et Va3 sont en position fermée.
Tel que suggéré par la figure 2c, une partie de la suspension contenue dans le récipient de mélange RM est ensuite transférée vers le troisième récipient de culture RC3, comme représenté par les flèches fms et fm3 en pointillé. Pour cela, le transfert est réalisé
via l'ouverture des vannes Vgm, Vam, Va3 et Vd3. La vanne Vdm est en position fermée et une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans le récipient de mélange Rm, via l'ouverture de la vanne d'alimentation en gaz Vgm, permettant la vidange du récipient de mélange RM. L'ouverture de la vanne de décharge Vd3 permet le remplissage du récipient de culture RC3. Les vannes Val et Va2 sont en position fermée.
Une fois le transfert terminé et le récipient de mélange entièrement vidangé, on procède ensuite aux étapes de stérilisation, de nettoyage et de rinçage, via l'ouverture des vannes 1, 2, 3, Vam et Vdm. On commence tout d'abord par l'étape de stérilisation en ajoutant une solution stérilisante provenant du réservoir de solution stérilisante AS vers le récipient de mélange RM. La vidange de la solution stérilisante est réalisée par la vanne Vam. On applique ensuite une solution nettoyante provenant du réservoir de solution nettoyante AC vers le récipient de mélange RM. La vidange de la solution nettoyante est réalisée par la vanne Vam. On applique ensuite une solution de rinçage provenant du réservoir de solution de rinçage AR vers le récipient de mélange RM. La vidange de la solution de rinçage est réalisée par la vanne Vam. Ces étapes ne sont pas représentées sur les figures 2a à 2c.
Une injection de flux gazeux sous pression est à nouveau réalisée dans chacun des trois récipients de culture RC1, RC2 et RC3 respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz Gl, G2 ou G3 permettant l'injection de gaz et l'homogénéisation de la suspension (agitation par bullage) à l'intérieur de chacun des trois récipients de culture. Les vannes d'alimentation 1, 2, 3, les vannes de mise à niveau Vtl, Vt2 et Vt3, et les vannes d'alimentation Val, Va2 et Va3 sont en position fermées. Seules les vannes de décharge Vd1, Vd2 et Vd3 sont en position ouvertes.
L'étape de collecte, après plusieurs cycles de culture des cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt dans les récipients de culture est ensuite réalisée, cette étape n'étant pas représentée.
Une fois l'étape de collecte effectuée, l'ensemble des récipients de culture est vidangé
de la même manière que pour le premier mode de réalisation. Ces étapes ne sont pas représentées sur les figures 2a à 2c.

Le dispositif de culture de la figure 3 ne sera décrit que par rapport à ses différences par rapport au dispositif de culture de la figure la.
Le dispositif de culture cellulaire en continu de cellules vivantes tel que présenté à la figure 3 comprend quatre récipients de culture, un premier récipient de culture RC1, un second récipient de culture RC2, un troisième récipient de culture RC3 et un quatrième récipient RC4. Dans ce mode de réalisation, l'ensemble des récipients de culture est agencé pour devenir respectivement et successivement un récipient de mélange lors du procédé de culture cellulaire, chaque récipient de mélange étant agencé pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture. Chacun des récipients de culture RC1, RC2, RC3 et RC4 est relié individuellement, et indépendamment les uns des autres, à
une unité
d'alimentation en fluides stériles 10 décrite ci-dessus. L'unité
d'alimentation en fluides stériles (10) est reliée à son récipient de culture via une vanne d'alimentation 1.
Selon la figure 3, chacun des quatre récipients de culture comprend des cellules vivantes dans un milieu de culture. Les cellules vivantes sont mises en culture afin d'obtenir .. une suspension. Pour cela, une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans chacun des quatre récipients de culture respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz Gl, G2, G3 ou G4 permettant l'injection de gaz et l'homogénéisation de la suspension (agitation par bullage) à l'intérieur de chacun des quatre récipients de culture RC1, RC2, RC3 et RC4. Les vannes d'alimentation 1, les vannes de mise à niveau Vtl, Vt2, Vt3 et Vt4, et les vannes d'alimentation Val, Va2, Va3 et Va4 sont en position fermées.
Seules les vannes de décharge Vd1, Vd2, Vd3 et Vd4 sont en position ouvertes.
Le dispositif de culture comprend des vannes V10, V20, V30 et V40 permettant l'interconnexion des quatre récipients de culture, et sont normalement en position fermée à
l'état inactif.
Le procédé de culture cellulaire en continu de cellules vivantes associé au dispositif de culture représenté par la figure 3 est similaire au procédé de culture associé aux figures la, lb et lc.
Tout d'abord, la totalité de la suspension contenue dans le premier récipient de culture RC1 est transférée vers le récipient de culture RC2, comme suggéré par la flèche f12. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Val, V10, V20, Va2 et Vd2. La vanne Vd1 est en position fermée, permettant la vidange du récipient de culture RC1 grâce au dispositif d'alimentation en gaz comme décrit précédemment. L'ouverture de la vanne de décharge Vd2 permet le remplissage du récipient de culture RC2. Le récipient de culture RC2 devient alors le récipient de mélange et comprend à la fois la suspension contenue initialement dans le récipient de culture RC2 et la suspension provenant du récipient de culture RC1. Une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans le récipient de culture RC2 via le dispositif d'alimentation en gaz G2 permettant l'injection de gaz dans la suspension et l'homogénéisation de la suspension de cellules (agitation par bullage) à
l'intérieur du récipient de culture RC2. Concernant les récipients de culture RC3 et RC4, l'étape de culture est maintenue par injection de flux gazeux sous pression dans le récipient de culture RC3 et RC4 et par maintien en position ouverte des vannes Vd3 et Vd4.
Concernant le récipient de culture RC1, il est ensuite procédé aux étapes de stérilisation, de nettoyage et de rinçage, via l'ouverture des vannes 1, Val, Vd1. On commence tout d'abord par l'étape de stérilisation en ajoutant une solution stérilisante provenant du réservoir de solution stérilisante AS vers le récipient de culture RC1. La .. vidange de la solution stérilisante est réalisée par la vanne Val. On applique ensuite une solution nettoyante provenant du réservoir de solution nettoyante AC vers le récipient de culture RC1. La vidange de la solution nettoyante est réalisée par la vanne Val. On applique ensuite une solution de rinçage provenant du réservoir de solution de rinçage AR
vers le récipient de culture RC1. La vidange de la solution de rinçage est réalisée par la vanne Val. Ces étapes ne sont pas représentées sur la figure 3.
Puis, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC2 est transférée vers le récipient de culture RC1, comme représenté par la flèche f21. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Vt2, V20, V10, Val et Vd1.
La vanne Vd2 est en position fermée, permettant la vidange du récipient de culture RC2 par application .. d'une pression sur la suspension à l'aide du gaz injecté par GC2.
L'ouverture de la vanne de décharge Vd1 permet le remplissage du récipient de culture RC1. Une injection de flux gazeux sous pression est réalisée dans chacun des récipients de culture RC1 et respectivement via le dispositif d'alimentation en gaz G1 ou G2 permettant l'injection de gaz dans la suspension et l'homogénéisation de la suspension de cellules (agitation par bullage) à l'intérieur des récipients de culture RC1 et RC2. Concernant les récipients de culture RC3 et RC4, l'étape de culture est maintenue par injection de flux gazeux sous pression dans les récipients de culture RC3 et RC4 et par maintien en position ouverte des vannes Vd3 et Vd4.
Ensuite, la totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC3 est transférée vers le premier récipient de culture RC1, comme suggéré par la flèche f13 en pointillée. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Val, V10, V30, Va3 et la fermeture de la vanne Vd3. Ensuite, la stérilisation, le nettoyage, et le rinçage du récipient RC3 sont réalisés comme décrit précédemment pour le récipient RC1.
Puis, après le mélange, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC1 est transférée vers le récipient de culture RC3, comme représenté par la flèche f31. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Vt1 , V30, V10, Val et la fermeture de la vanne Vd1.
La totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC1 est transférée vers le quatrième récipient de culture RC4, comme suggéré par la flèche f14 en pointillée.
Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Val, V10, V40, Va4 et la fermeture de la vanne Vd1. Puis, après le mélange, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC4 est transférée vers le récipient de culture RC1, comme représenté par la flèche f41. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Vt4, V40, V10 Val et la fermeture de la vanne Vd4.
Ensuite, la totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC2 est transférée vers le troisième récipient de culture RC3, comme suggéré par la flèche f23 en pointillée. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Va2, V20, V30, Va3 et la fermeture de la vanne Vd2. Ensuite, la stérilisation, le nettoyage, et le rinçage du récipient RC2 sont réalisés comme décrit précédemment pour le récipient RC1.
Puis, après le mélange, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC3 est transférée vers le récipient de culture RC2, comme suggéré par la flèche f32.
Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Vt3, V30, V20, Va2 et la fermeture de la vanne Vd3.
La totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC4 est transférée vers le récipient de culture RC2 comme suggéré par la flèche f24. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Va2, V20, V40, Va4 et la fermeture de la vanne Vd4.
Ensuite, la stérilisation, le nettoyage, et le rinçage du récipient RC4 sont réalisés comme décrit précédemment pour le récipient RC1. Puis, après le mélange, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC2 est transférée vers le récipient de culture RC4, comme suggéré par la flèche f42 en pointillé. Pour cela, le transfert est réalisé
via l'ouverture des vannes Vt4, V40, V20, Va2 et la fermeture de la vanne Vd2.
Enfin, la totalité de la suspension contenue dans le récipient de culture RC3 est transférée vers le quatrième récipient de culture RC4, comme suggéré par la flèche f34 en pointillée. Pour cela, le transfert est réalisé via l'ouverture des vannes Va3, V30, V40, Va4 et la fermeture de la vanne Vd3. Puis, après le mélange, une partie de la suspension contenue dans le récipient de culture RC4 est transférée vers le troisième récipient de culture RC3, comme suggéré par la flèche f43 en pointillée. Pour cela, le transfert est réalisé
via l'ouverture des vannes Vt4, V40, V30, Va3 et la fermeture de la vanne Vd4.
Le dispositif de culture de la figure 4 ne sera décrit que par rapport à ses différences par rapport au dispositif de culture de la figure 3. La figure 4 représente un quatrième mode de réalisation particulier comprenant quatre récipients de culture et un unique récipient de mélange RM, indépendant de l'ensemble des récipients de culture, et qui est agencé pour recevoir le contenu de l'ensemble des récipients de culture RC1, RC2, RC3 et RC4. Chacun des récipients de culture RC1, RC2, RC3 et RC4 est relié individuellement, et indépendamment les uns des autres, à une unité d'alimentation en fluides stériles 10 décrite ci-dessus. L'unité d'alimentation en fluides stériles (10) est reliée à son récipient de culture via une vanne d'alimentation 1.
Le procédé de culture cellulaire en continu de cellules vivantes associé au dispositif de culture représenté par la figure 4 est similaire au procédé de culture associé aux figures 2a, 2b et 2c.
Avantageusement, les suspensions contenues dans les récipients de culture RC1, RC2, RC3 et RC4 sont transférées vers le récipient de mélange RM.
Sont ensuite appliquées les opérations de stérilisation, nettoyage et rinçage des récipients RC1, RC2, RC3 et RC4.
Une fois l'étape de mélange réalisée, une partie de la suspension contenue dans le récipient de mélange RM est ensuite transférée vers le premier récipient de culture RC1.
Une partie de la suspension contenue dans le récipient de mélange RM est ensuite transférée vers le deuxième récipient de culture RC2. Une partie de la suspension contenue dans le récipient de mélange RM est ensuite transférée vers le troisième récipient de culture RC3. Une partie de la suspension contenue dans le récipient de mélange RM est ensuite transférée vers le quatrième récipient de culture RC4.
Sont ensuite appliquées les opérations de stérilisation, nettoyage et rinçage du récipient de mélange RM.
EXEMPLES
Dans tous les exemples décrits par la suite, le régime de croissance est celui du turbidostat pour lequel on définit le taux de dilution (en heure-1) comme étant le rapport entre le débit de milieu de croissance, pour maintenir une concentration constante de microorganismes dans la chambre de culture au cours de l'évolution, et le volume de la chambre de culture. Dans ces expériences, le turbidostat a été implémenté de telle sorte que le taux de dilution soit équivalent au taux de croissance de la population.
Exemple 1 : Adaptation évolutive d'une souche bactérienne à une température de 30 C.
A une température sous-optimale, c'est-à-dire inférieure à la température optimale, le taux de croissance d'un organisme est plus faible que celui à la température optimale.
Lorsque l'organisme est destiné à une utilisation dans un contexte où la température est inférieure à la température optimale, il est pertinent d'adapter cet organisme à ladite température.

Dans les expériences 1 et 2 décrites ci-dessous, la souche utilisée est une bactérie du sol de la famille Pseudomonadaceae. Le taux de croissance spécifique de cette souche sur un milieu de croissance synthétique contenant 20g/L de saccharose comme source de carbone est de 0,315 h-1 à la température optimale de 35 C.
Pour chacune des deux expériences, l'objectif est l'adaptation de cette souche à une température de 30 C, avec pour objectif un taux de croissance à 30 C
comparable à celui de la souche de départ à 35 C.
Pour atteindre cet objectif, deux expériences d'évolution adaptative ont été
conduites à partir de la même souche décrite plus haut, au sein du même dispositif et en utilisant le même milieu de référence décrit plus haut.
1/ Expérience 1 : Procédé comparatif ne faisant pas partie de l'invention :
turbidostat à la température cible de 30 C
L'expérience 1 consistait en l'adaptation évolutive de la bactérie mentionnée plus haut selon un protocole d'évolution simple et non conforme à la présente invention, mettant en uvre le seul régime sélectif de type turbidostat dans un seul récipient de culture.
En début d'expérience, le récipient de culture est inoculé avec la souche décrite plus haut.
Au cours de l'expérience, la température est maintenue fixe et égale à 30 C.
Le régime sélectif est implémenté de manière discontinue comme suit : toutes les dix minutes, la transparence mesurée par mesure optique est comparée à un seuil arbitrairement fixé à 80:
= Si la valeur mesurée est supérieure au seuil, aucune action n'est déclenchée, = Si la valeur mesurée est inférieure au seuil, une dilution de la suspension est réalisée par ajout d'un volume de 4mL du milieu de croissance décrit plus haut dans le récipient de culture, en maintenant constant le volume de la suspension à 13.5 mL dans le récipient de culture, soutirage du même volume V de suspension présente dans le récipient de culture.
Résultats obtenus :
Les résultats obtenus sont présentés en figure 5.
Le nombre de 29 dilutions quotidiennes, équivalent à un taux de dilution théorique ou taux de croissance de 0,358 h-1, est atteint après 20 jours d'évolution adaptative en turbidostat à 30 C.
2/ Expérience 2: Procédé selon l'invention utilisant deux récipients de culture L'expérience 2 consistait en l'adaptation évolutive de la même bactérie mentionnée plus haut selon le procédé de l'invention et mettant en uvre deux récipients de culture RC1 et RC2 à des températures distinctes. Ce protocole est implémenté dans le même dispositif que celui utilisé pour l'expérience 1.
En début d'expérience, chaque récipient de culture RC1 et RC2 est inoculé avec la même souche décrite plus haut et ayant servi à l'inoculation au début de l'expérience 1 et la température initiale est de 35 C dans les deux récipients RC1 et RC2.
Dans chacun des deux récipients de culture RC1 et RC2, le régime sélectif est le turbidostat, implémenté de manière discontinue telle que décrite dans l'expérience 1, avec les mêmes paramètres que ceux utilisés lors de l'expérience 1 :
= Milieu de croissance tel que défini plus haut = Seuil de transparence = 80, = Dilution de la suspension par ajout d'un volume de 4mL du milieu de croissance dans le récipient de culture, en maintenant constant le volume de la suspension à 13,5 mL
dans le récipient de culture, soutirage du même volume V de suspension présente dans le récipient de culture.
Le stade de croissance est défini par une durée fixée arbitrairement à 12h au terme de laquelle l'étape c) est réalisée par transfert de la totalité du contenu du récipient de culture RC1 vers le récipient de culture RC2, qui devient le récipient de mélange. Chaque cycle a par conséquent une durée de 12h et il y a deux cycles par jour.
A chaque nouveau cycle, la température dans chacun de ces deux récipients de culture RC1 et RC2 est ajustée automatiquement en fonction du calcul du taux de dilution moyen dans le récipient RC1, avec pour consigne de diminuer la température de culture dès lors que le taux de dilution dans le récipient de culture RC1, moyenné sur le cycle venant de s'achever, est supérieur à un seuil fixé arbitrairement à la valeur de 0,358 h-1 obtenue lors de l'expérience 1 après 20 jours en turbidostat à 30 C.
Le tableau 1 ci-dessous liste les températures appliquées dans chacun des deux récipients de culture RC1 et RC2 au cours des cycles successifs, en tenant compte qu'un seul cycle a eu lieu au 7ème jour de l'expérience.

[Tableau 1]
Température Température Durée de Cycle Récipient 1 ( C) au Récipient 2 ( C) au l'expérience (jours) début du cycle début du cycle 1 2 34,9 34,8 2 3 34,9 34,8 2 4 34,8 34,9 3 5 34,6 34,8 3 6 34,4 34,6 4 7 34,1 34,4 4 8 33,7 34,1 5 9 33,3 33,7 5 10 32,5 33,3 6 11 31,7 32,5 6 12 30,1 31,7 7 13 28,5 30,1 8 14 28,5 30,1 8 15 29,3 30,1 9 16 29,7 30,1 9 17 29,9 30,1

10 18 30 30,1 10 19 29,9 30

11 20 29,8 29,9 11 21 29,6 29,8 Résultats obtenus :
Les résultats obtenus sont présentés aux figures 6 et 7.
Lors du 18ème cycle de culture, soit après 10 jours d'évolution adaptative, la température dans le récipient de culture RC1 est de 30 C. Au cours de ce cycle, le taux de dilution moyen est de 0,387 h-1, supérieur au taux de dilution moyen obtenu après 20 jours d'évolution adaptative en turbidostat à 30 C dans le même dispositif.
Pour comparer les taux de croissance, il est légitime de comparer le taux de dilution sur un cycle de l'expérience 2 à celui mesuré dans l'expérience 1 car, pendant chaque cycle, la suspension est exposée au régime sélectif de type turbidostat implémenté selon le même protocole discontinu, avec les mêmes paramètres et dans le même dispositif (le récipient de culture RC1 de l'expérience 2 étant très précisément le même récipient de culture que celui utilisé pour l'expérience 1).
On peut donc affirmer que la suspension cultivée lors du 18ème cycle, au 1 Oème jour de l'expérience 2 affiche un taux de croissance à 30 C légèrement supérieur à
celui obtenu au 20ème jour de l'expérience 1 de turbidostat à 30 C.

Conclusion :
Par conséquent, le protocole de l'expérience 2, qui met en uvre l'adaptation évolutive en parallèle de deux sous-populations qui sont régulièrement mélangées et redistribuées dans les deux récipients de culture conformément au procédé de l'invention, a permis d'adapter une bactérie à une température sous-optimale deux fois plus rapidement qu'avec un régime conventionnel de type turbidostat où une seule population est cultivée dans un seul récipient.
Exemple 2 : Adaptation évolutive d'une souche bactérienne à une température de 25 C.
Pour chacune des deux expériences, l'objectif est l'adaptation de cette souche à une température de 25 C tout en augmentant le taux de croissance.
Pour atteindre cet objectif, deux expériences d'évolution adaptative ont été
conduites à partir de la même souche que celle utilisée dans l'exemple 1, initialement évoluée à 35 C
avec un taux de dilution 0,315 heure5-1, au sein du même dispositif et en utilisant le même milieu de référence.
1/ Expérience 3: Procédé comparatif ne faisant pas partie de l'invention :
turbidostat à la température cible de 25 C
Cette expérience a été réalisée dans les mêmes conditions que celles indiquées ci-dessus à l'exemple 1 pour l'expérience 1/ mais à une température de 25 C.
Les expériences ont été réalisées avec des récipients de culture unique, soit d'un volume de 15 mL, soit d'un volume de 80 mL.
Résultats obtenus :
Les résultats sont présentés sur la figure 8 annexée. Sur cette figure, le taux de dilution (heures-1) est fonction du nombre de jours. La courbe avec les ronds pleins correspond à l'expérience réalisée dans le récipient de 80 mL et la courbe avec les carrés pleins correspond à l'expérience réalisée dans le récipient de 15 mL.
On observe que le taux de dilution ou taux de croissance de 0,2 heures-1 à 25 C est obtenu en 18 jours aussi bien dans le récipient de culture d'un volume de 15 mL que dans le récipient d'un volume de 80mL, indiquant que le volume du récipient de culture n'est pas un paramètre critique pour l'évolution des microorganismes.
2/ Expérience 4: Procédé selon l'invention utilisant deux récipients de culture avec un taux de dilution imposé de 0,2 heures-1 L'expérience 4 a consisté en l'adaptation évolutive de la même bactérie selon le procédé de l'invention mettant en uvre deux récipients de culture RC1 et RC2, ayant chacun un volume de 15 mL, selon le protocole décrit dans l'expérience 2 de l'exemple 1, mais en faisant varier la température de 35 C à 25 C.

En début d'expérience, chaque récipient de culture RC1 et RC2 est inoculé avec la même souche que dans l'exemple 1 et la température initiale est de 35 C dans les deux récipients RC1 et RC2.
A chaque nouveau cycle, la température dans chacun de ces deux récipients de culture RC1 et RC2 est ajustée automatiquement en fonction du calcul du taux de dilution moyen dans le récipient, avec pour consigne de diminuer la température de culture dès lors que le taux de dilution dans le récipient de culture RC1, moyenné sur le cycle venant de s'achever, est supérieur à un seuil fixé arbitrairement à la valeur de 0,2 heure5-1, valeur obtenue lors de l'expérience 3 après 18 jours en turbidostat à 25 C.
Le tableau 2 ci-dessous liste les températures appliquées dans chacun des deux récipients de culture RC1 et RC2 au cours des cycles successifs.
[Tableau 2]
Température Température Durée de Cycle Récipient 1 ( C) au Récipient 2 ( C) au l'expérience (jours) début du cycle début du cycle 0,0 1 35 35 0,5 2 34,9 34,6 1,0 3 34,6 34,4 1,5 4 34,4 34 2,0 5 34,4 34 2,5 6 34 33,6 3,0 7 33,6 32,8 3,5 8 32,8 31,9 4,0 9 31,9 30,9 4,5 10 30,9 29,9 5,0 11 29,9 28,9 5,5 12 28,9 27,9 6,0 13 27,9 26,9 6,5 14 26,9 25,9 7,0 15 25,9 24,9 Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 9 annexée.
Sur cette figure, la température (en C) est fonction du nombre de jours. La courbe avec les losanges pleins correspond à l'expérience réalisée dans le récipient RC1 et la courbe avec les triangles pleins correspond à l'expérience réalisée dans le récipient RC2.
Ces résultats montrent que l'adaptation des bactéries à 25 C pour un taux de dilution ou taux de croissance de 0.2 heures-1 est obtenue en 7 jours selon le procédé
de l'invention mettant en uvre le mélange répété du contenu de 2 récipients de culture, soit 2,6 fois plus rapidement que selon le procédé de l'expérience 3/ non conforme à l'invention.
Le bénéfice observé sur le procédé d'adaptation évolution est bien provoqué
par le procédé conforme à l'invention consistant à réunir et séparer périodiquement les suspensions provenant d'au moins deux récipients de culture.

Claims

REVENDICATIONS

1.
Procédé d'évolution adaptative de cellules vivantes, à l'exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, par culture en continu desdites cellules vivantes, dans lequel on utilise n récipients de culture (RCi), i allant de 1 à n, avec n

2, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes consistant à :
a) introduire au moins un milieu de culture liquide et des cellules vivantes dans chacun des n récipients de culture, b) dans chacun des n récipients de culture, cultiver lesdites cellules vivantes selon un régime sélectif donné, en utilisant des paramètres de culture prédéfinis, jusqu'à
atteindre un stade de croissance déterminé dans au moins un des n récipients de culture, de manière à obtenir, dans chacun des n récipients de culture, une suspension de cellules vivantes dans ledit milieu de culture liquide, c) réunir ensemble au moins une partie des suspensions de cellules vivantes d'au moins deux récipients de culture (RCi) obtenues à l'étape b) pour obtenir une suspension de cellules vivantes mélangées, d) homogénéiser la suspension de cellules vivantes mélangées obtenue à l'étape c) pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, e) répartir, dans au moins deux récipients de culture (RCi), au moins une partie de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées obtenue à l'étape d), f) répéter l'enchainement des étapes b) à e), g) collecter après plusieurs cycles de culture des cellules vivantes ayant acquis un phénotype d'intérêt dans au moins un des n récipients de culture.
2.
Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules vivantes sont choisies parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes, humaine, animale ou végétale.

3.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le régime sélectif de l'étape b) est choisi parmi : le chemostat, le turbidostat, l'échange de milieux de culture, et l'itération de culture discontinue.

4.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les paramètres de culture prédéfinis de l'étape b) sont choisis parmi : la température, le pH, la densité cellulaire, la composition du milieu de culture, la composition du gaz, l'exposition à un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde particulière, l'exposition à un agent mutagène ou une combinaison de celles-ci.

5.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape c) consistant à réunir ensemble au moins une partie des suspensions de cellules vivantes d'au moins deux récipients de culture (Ri) obtenues à
l'étape b) est réalisée soit en utilisant l'un desdits au moins deux récipients de culture comme récipient de mélange, soit dans un récipient de mélange indépendant des au moins deux récipients de culture et permettant d'accueillir tout ou partie du contenu desdits au moins deux récipients de culture.

6. Procédé
selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape c) est réalisée en utilisant un récipient de mélange, et en ce que l'on procède à un transfert d'au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape b) d'au moins deux récipients de culture vers au moins un récipient de mélange.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape d) d'homogénéisation est réalisée en tout ou partie par un moyen d'agitation choisi parmi un agitateur mécanique et une injection d'un flux gazeux.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape e) consiste à transférer au moins une partie de la suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées obtenues à l'étape d) vers au moins deux récipients de culture (RCi).

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'au moins une partie de la suspension transférée à l'étape e) correspond à une fraction comprise entre 1 et 100% du volume de ladite suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lors de la répétition de l'étape b), le régime sélectif et/ou les paramètres de culture utilisés au cours d'un cycle de culture peuvent être identiques ou différents de ceux utilisés au cours du cycle de culture précédent.

11. .
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on utilise n récipients de culture (RCi), i allant de 1 à n, n étant au moins égal à 2, et au moins n-1 récipients de mélange (RMj), j allant de 1 à n-1, les au moins n-1 récipients de mélange étant respectivement un récipient de culture (RCi) agencé pour recevoir le contenu d'au moins deux récipients de culture, ledit procédé
étant en outre caractérisé en ce que les étapes c) à e) sont réalisées de la manière suivante :
i) transférer tout ou une partie de la suspension obtenue à l'étape b) depuis un récipient de culture (RCi), dit récipient de culture de départ, vers un récipient de mélange (RMj), dit récipient de destination, de manière à réaliser un transfert de destination, ii) homogénéiser la suspension du récipient de culture de départ (RCi) avec celle du récipient de destination (RCj) dans le récipient de destination (RMj), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, iii) transférer au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape ii) depuis le récipient de destination (RMj), vers le récipient de culture de départ (RCi), de manière à réaliser un transfert de renvoi, iv) répéter les étapes précédentes i) à iii) en faisant varier RCi et RMj de manière à ce que toutes les suspensions aient été réunies 2 à 2 au moins une fois.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que l'au moins un récipient de mélange est un unique récipient, indépendant de l'ensemble des récipients de culture, et est agencé pour recevoir le contenu des n récipients de culture.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on utilise n récipients de culture (RCi), i allant de 1 à n, n étant au moins égal à 2, et au moins un récipient de mélange (RM), l'au moins un récipient de mélange étant un unique récipient, indépendant de l'ensemble des récipients de culture et étant agencé pour recevoir le contenu des n récipients de culture, caractérisé en ce que les étapes c) à e) sont réalisées de la manière suivante :
c) transférer tout ou une partie de la suspension de cellules vivantes obtenue à
l'étape b) d'au moins deux récipients de culture (RCi) vers l'au moins un récipient de mélange (RM), pour obtenir une suspension de cellules vivantes mélangées, d) homogénéiser la suspension de cellules vivantes mélangées obtenue à l'étape C) dans l'au moins un récipient de mélange (RM), pour obtenir une suspension homogénéisée de cellules vivantes mélangées, e) transférer au moins une partie de la suspension obtenue à l'étape d) de l'au moins un récipient de mélange (RM) vers chacun des au moins deux récipients de culture (RCi).