CA3233528A1 - Procede de production d'alcools par fermentation - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de production d'alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré (2) dans une section réactionnelle (1) comprenant un support (4) sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous l'action desdits micro-organismes un moût (3) enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, tel que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et tel qu'on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports.
Description
\VO 2023/066697 Procédé de production d'alcools par fermentation Domaine technique La présente invention concerne un procédé de production d'alcools par fermentation continue à cellules immobilisées d'un milieu de culture contenant un substrat carboné
sucré.
Technique antérieure Afin de répondre aux enjeux de la transition énergétique, de nombreuses recherches sont menées pour développer des procédés dits verts , permettant d'accéder à des intermédiaires chimiques d'une façon alternative au raffinage du pétrole et/ou à la pétrochimie.
Les alcools issus de procédés fermentaires (par exemple isopropanol et n-butanol) sont parmi les substituts de dérivés pétrochimiques les plus prometteurs. La fermentation ABE (Acétone ¨ Butanol ¨ Ethanol), réalisée par des microorganismes appartenant au genre C/ostndium, est une des plus anciennes fermentations à avoir été industrialisée, et a été
depuis largement étudiée. Plus récemment, la fermentation I BE (Isopropanol ¨ Butanol ¨
Ethanol) produisant un mélange d'isopropanol, butanol et éthanol et réalisée également par des micro-organismes solvantogènes, appartenant notamment au genre Clostridium, a fait l'objet de nombreuses études.
Concernant le mode de conduite fermentaire employé dans ce type de procédé, la production en mode discontinu ( batch selon la terminologie anglo-saxonne) reste la méthode conventionnelle pour les fermentations ABE et I BE, malgré la faible productivité affichée pour ce type de procédé, dans l'intervalle 0,1-0,7 g/L.h (voir, par exemple, Jones D. T., Woods D.R., 1986, Acetone-Butanol Fermentation Revisited. Microbiol. Rew., 50 (4), 484-524 ou Tableau 16.6 Lopez-contreras A. et al chapter book 16, Bioalcohol Production:
Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass, 2010). Mais ces productivités restent trop faibles pour envisager un procédé industriel économiquement viable.
Un procédé continu avec des cellules en suspension dans un réacteur homogène peut également être envisagé. Mais la productivité est également assez faible et peut difficilement être augmentée de façon significative. Un problème technique est la concentration des cellules dans le milieu fermentaire, principalement contrôlée par le taux de dilution appliqué dans le procédé. Celui-ci ne peut pas être élevé pour éviter le lavage cellulaire ( wash out selon la terminologie anglo-saxonne) dans le bioréacteur.
Pour ces raisons, depuis quelques années. un fort intérêt est porté aux méthodes visant une forte rétention de la biomasse microbienne, notamment par immobilisation des micro-organismes dans le bioréacteur. L'utilisation du procédé en continu et à
cellules immobilisées permet une augmentation significative de la productivité volumique en alcool.
puisque le temps de séjour des micro-organismes, dans ces conditions, est décorrélé du temps de séjour hydraulique du bioréacteur étudié. De plus, la concentration en micro-organismes est plus élevée dans le bioréacteur.
La présente invention s'intéressera donc plus particulièrement à la technique d'immobilisation des cellules : Il a ainsi été proposé dans le brevet FR-3 086 670 un procédé
où l'on vient fixer dans le réacteur fermentaire au moins une partie de la biomasse bactérienne par adsorption sous forme de biofilm sur un matériau poreux à base de mousse polymérique, de type mousse de polyuréthane. Ce matériau s'est révélé particulièrement performant, en permettant un procédé fermentaire en continu, la mousse permettant de fixer les bactéries de façon suffisamment importante, c'est-à-dire au-delà du taux de dilution causant le lavage cellulaire.
Ce matériau ouvre une nouvelle voie pour la production de mélanges de type I
BEA, en donnant aussi accès à une production en mode continu par immobilisation de la biomasse bactérienne.
II est utile, pour la conduite du procédé de fermentation, d'évaluer l'efficacité des micro-organismes immobilisés sur des supports dans le réacteur de fermentation. En effet, les micro-organismes sont immobilisés sous forme d'un biofilm sur le support solide. Ce biofilm est composé d'un mélange de cellules de micro-organismes et de polymères extracellulaires. Le processus de formation du biofilm est peu contrôlable et dépend de nombreux facteurs. En effet, les conditions hydrodynamiques dans le bioréacteur, les propriétés physico-chimiques des supports utilisés ainsi que leur nombre, notamment, peuvent influencer son développement. La part de cellules viables et donc productrices de métabolites au sein de cette structure peut également largement varier en fonction de l'âge du biofilm étudié ainsi que des conditions opératoires du procédé. En outre, les micro-organismes immobilisés tendent à
produire du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes, ce qui conduit à devoir augmenter le débit volumique d'entrée du fluide contenant les sucres à
fermenter (et de sortie du fluide contenant les produits de fermentation).
Pour toutes ces raisons, il s'est avéré que le contrôle de la quantité totale de micro-organismes vivants du biofilm qui se dépose sur les supports dans le bioréacteur est un paramètre-clé pour piloter de façon optimale le procédé de fermentation. Or, il est difficile de procéder à son suivi.
En effet, il est délicat d'envisager des prélèvements des supports hors du bioréacteur, car le bioréacteur fonctionne généralement avec des conditions drastiques de stérilité et d'anoxie, qui seraient fortement perturbées par l'ouverture régulière du bioréacteur pour procéder à ces prélèvements. De plus, il est complexe d'avoir un échantillon représentatif à
partir duquel on pourrait quantifier la concentration totale en cellules viables. Enfin les méthodes d'extractions prennent du temps et peuvent introduire un biais important sur la mesure.
sucré.
Technique antérieure Afin de répondre aux enjeux de la transition énergétique, de nombreuses recherches sont menées pour développer des procédés dits verts , permettant d'accéder à des intermédiaires chimiques d'une façon alternative au raffinage du pétrole et/ou à la pétrochimie.
Les alcools issus de procédés fermentaires (par exemple isopropanol et n-butanol) sont parmi les substituts de dérivés pétrochimiques les plus prometteurs. La fermentation ABE (Acétone ¨ Butanol ¨ Ethanol), réalisée par des microorganismes appartenant au genre C/ostndium, est une des plus anciennes fermentations à avoir été industrialisée, et a été
depuis largement étudiée. Plus récemment, la fermentation I BE (Isopropanol ¨ Butanol ¨
Ethanol) produisant un mélange d'isopropanol, butanol et éthanol et réalisée également par des micro-organismes solvantogènes, appartenant notamment au genre Clostridium, a fait l'objet de nombreuses études.
Concernant le mode de conduite fermentaire employé dans ce type de procédé, la production en mode discontinu ( batch selon la terminologie anglo-saxonne) reste la méthode conventionnelle pour les fermentations ABE et I BE, malgré la faible productivité affichée pour ce type de procédé, dans l'intervalle 0,1-0,7 g/L.h (voir, par exemple, Jones D. T., Woods D.R., 1986, Acetone-Butanol Fermentation Revisited. Microbiol. Rew., 50 (4), 484-524 ou Tableau 16.6 Lopez-contreras A. et al chapter book 16, Bioalcohol Production:
Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass, 2010). Mais ces productivités restent trop faibles pour envisager un procédé industriel économiquement viable.
Un procédé continu avec des cellules en suspension dans un réacteur homogène peut également être envisagé. Mais la productivité est également assez faible et peut difficilement être augmentée de façon significative. Un problème technique est la concentration des cellules dans le milieu fermentaire, principalement contrôlée par le taux de dilution appliqué dans le procédé. Celui-ci ne peut pas être élevé pour éviter le lavage cellulaire ( wash out selon la terminologie anglo-saxonne) dans le bioréacteur.
Pour ces raisons, depuis quelques années. un fort intérêt est porté aux méthodes visant une forte rétention de la biomasse microbienne, notamment par immobilisation des micro-organismes dans le bioréacteur. L'utilisation du procédé en continu et à
cellules immobilisées permet une augmentation significative de la productivité volumique en alcool.
puisque le temps de séjour des micro-organismes, dans ces conditions, est décorrélé du temps de séjour hydraulique du bioréacteur étudié. De plus, la concentration en micro-organismes est plus élevée dans le bioréacteur.
La présente invention s'intéressera donc plus particulièrement à la technique d'immobilisation des cellules : Il a ainsi été proposé dans le brevet FR-3 086 670 un procédé
où l'on vient fixer dans le réacteur fermentaire au moins une partie de la biomasse bactérienne par adsorption sous forme de biofilm sur un matériau poreux à base de mousse polymérique, de type mousse de polyuréthane. Ce matériau s'est révélé particulièrement performant, en permettant un procédé fermentaire en continu, la mousse permettant de fixer les bactéries de façon suffisamment importante, c'est-à-dire au-delà du taux de dilution causant le lavage cellulaire.
Ce matériau ouvre une nouvelle voie pour la production de mélanges de type I
BEA, en donnant aussi accès à une production en mode continu par immobilisation de la biomasse bactérienne.
II est utile, pour la conduite du procédé de fermentation, d'évaluer l'efficacité des micro-organismes immobilisés sur des supports dans le réacteur de fermentation. En effet, les micro-organismes sont immobilisés sous forme d'un biofilm sur le support solide. Ce biofilm est composé d'un mélange de cellules de micro-organismes et de polymères extracellulaires. Le processus de formation du biofilm est peu contrôlable et dépend de nombreux facteurs. En effet, les conditions hydrodynamiques dans le bioréacteur, les propriétés physico-chimiques des supports utilisés ainsi que leur nombre, notamment, peuvent influencer son développement. La part de cellules viables et donc productrices de métabolites au sein de cette structure peut également largement varier en fonction de l'âge du biofilm étudié ainsi que des conditions opératoires du procédé. En outre, les micro-organismes immobilisés tendent à
produire du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes, ce qui conduit à devoir augmenter le débit volumique d'entrée du fluide contenant les sucres à
fermenter (et de sortie du fluide contenant les produits de fermentation).
Pour toutes ces raisons, il s'est avéré que le contrôle de la quantité totale de micro-organismes vivants du biofilm qui se dépose sur les supports dans le bioréacteur est un paramètre-clé pour piloter de façon optimale le procédé de fermentation. Or, il est difficile de procéder à son suivi.
En effet, il est délicat d'envisager des prélèvements des supports hors du bioréacteur, car le bioréacteur fonctionne généralement avec des conditions drastiques de stérilité et d'anoxie, qui seraient fortement perturbées par l'ouverture régulière du bioréacteur pour procéder à ces prélèvements. De plus, il est complexe d'avoir un échantillon représentatif à
partir duquel on pourrait quantifier la concentration totale en cellules viables. Enfin les méthodes d'extractions prennent du temps et peuvent introduire un biais important sur la mesure.
2 Par ailleurs, des études se sont intéressées à des moyens pour estimer la vitesse de croissance des biofilms, notamment par voie électro-chimique, comme décrit notamment dans la demande de brevet EP- 3 035 052, sans pour autant parvenir à estimer la proportion de micro-organismes vivants dans ces biofilms. Et la mise en oeuvre de ces solutions est complexe dans une installation à l'échelle industrielle.
L'invention a alors pour but de remédier à ces inconvénients. Elle a notamment pour but la mise au point de procédés de fermentation utilisant des micro-organismes immobilisés sur des supports qui soient plus faciles à piloter. Elle a notamment pour but de quantifier plus facilement et/ou plus précisément l'évolution de l'activité de ces micro-organismes immobilisés.
Résumé de l'invention L'invention a tout d'abord pour objet un procédé de production d'alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré dans une section réactionnelle comprenant un support sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous l'action desdits micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation (CO2/H2), tel que le procédé est opéré
en continu en phase liquide, et tel qu'on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports.
On comprend par section réactionnelle au moins un bioréacteur avec tous les équipements permettant d'opérer une fermentation. Si la section réactionnelle comprend plusieurs bioréacteurs, ils peuvent être opérés en parallèle et/ou en série. Certains peuvent être en fonctionnement pendant que un/plusieurs autres sont en maintenance, notamment pour changer les supports d'immobilisation, afin de ne pas interrompre la production.
On entend par support> un matériau, par exemple du type de celui décrit dans le brevet FR-
L'invention a alors pour but de remédier à ces inconvénients. Elle a notamment pour but la mise au point de procédés de fermentation utilisant des micro-organismes immobilisés sur des supports qui soient plus faciles à piloter. Elle a notamment pour but de quantifier plus facilement et/ou plus précisément l'évolution de l'activité de ces micro-organismes immobilisés.
Résumé de l'invention L'invention a tout d'abord pour objet un procédé de production d'alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré dans une section réactionnelle comprenant un support sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous l'action desdits micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation (CO2/H2), tel que le procédé est opéré
en continu en phase liquide, et tel qu'on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports.
On comprend par section réactionnelle au moins un bioréacteur avec tous les équipements permettant d'opérer une fermentation. Si la section réactionnelle comprend plusieurs bioréacteurs, ils peuvent être opérés en parallèle et/ou en série. Certains peuvent être en fonctionnement pendant que un/plusieurs autres sont en maintenance, notamment pour changer les supports d'immobilisation, afin de ne pas interrompre la production.
On entend par support> un matériau, par exemple du type de celui décrit dans le brevet FR-
3 086 670 précité, sur les parois duquel les micro-organismes peuvent se déposer (et former progressivement des biofilms), on parle alors de micro-organismes immobilisés.
C'est généralement un matériau poreux, qui peut être de nature polymérique, comme une mousse de type mousse à base de polyuréthane, ou de nature minéral, comme un matériau poreux de type céramique ... Il peut se présenter sous forme d'un monobloc, ou sous forme de plusieurs blocs, agencés de manière ordonnée (en couches superposées par exemple)ou désordonnée (en vrac) dans le volume de la section réactionnelle où s'opère la fermentation. Ces blocs peuvent être de forme géométrique régulière et de mêmes taille (des cubes par exemple), ou être de forme irrégulière et/ou de tailles différentes.
On comprend par sans intervention sur lesdits supports le fait que l'invention n'opère pas de manipulation sur les supports, notamment qu'elle s'abstient de faire des prélèvements de support hors de la section réactionnelle, notamment en vue de les analyser Cela signifie que la mise en oeuvre de l'invention se fait sans ouvrir la section réactionnelle, sans ouvrir le ou les bioréacteurs que comporte la section réactionnelle, sachant que dans le domaine de la fermentation les sections réactionnelles (le ou les bioréacteurs) fonctionnent en étant fermées, étanches, sans entrée d'atmosphère extérieure.
On comprend par <(micro-organismes des organismes aptes à convertir des molécules en d'autres molécules d'intérêt par fermentation. Dans la description qui suit, on pourra aussi les désigner sous forme de cellules ou encore de bactéries .
Le terme vivant a la même signification, dans le présent texte, que viable au sujet des micro-organismes : il s'agit des micro-organismes qu'on considère actifs vis-à-vis de la fermentation.
Le terme en suspension a la même signification que le terme libres et désigne des cellules qui sont en suspension dans la phase liquide, par opposition aux cellules immobilisées sur substrat.
On a ainsi choisi selon l'invention de piloter la production d'alcool(s) en fonction des micro-organismes vivants sur support, ce qui est la façon la plus fiable de le faire, tout particulièrement au démarrage de la production. En effet, quand on démarre la production, la première étape consiste, dans le bioréacteur, à disposer des supports, par exemple poreux comme des mousses de polymère, puis à y déposer les micro-organismes en injectant dans le bioréacteur un fluide contenant des micro-organismes appelé préculture. Ces micro-organismes viennent progressivement, pour partie, coloniser les supports en créant des biofilms, qui sont un mélange de micro-organismes et de polymères extra-cellulaires. Une autre part des micro-organismes va rester en phase liquide dans le bioréacteur. La croissance des biofilms est difficile à contrôler, et plus encore la part de micro-organismes vivants qu'ils contiennent.
Les micro-organismes à la fois en suspension et immobilisés sont actifs vis-à-vis de la conversion des sucres en alcools, cependant les micro-organismes en suspension sont susceptibles d'être lessivés (c'est-à-dire soutirés avec les alcools lors de leur extraction du bioréacteur). Et il s'avère que les micro-organismes immobilisés qui sont vivants produisent, eux aussi, du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes.
Concrètement, au fur et à mesure de la croissance du biofilm rendant compte de l'augmentation de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, on doit faire évoluer
C'est généralement un matériau poreux, qui peut être de nature polymérique, comme une mousse de type mousse à base de polyuréthane, ou de nature minéral, comme un matériau poreux de type céramique ... Il peut se présenter sous forme d'un monobloc, ou sous forme de plusieurs blocs, agencés de manière ordonnée (en couches superposées par exemple)ou désordonnée (en vrac) dans le volume de la section réactionnelle où s'opère la fermentation. Ces blocs peuvent être de forme géométrique régulière et de mêmes taille (des cubes par exemple), ou être de forme irrégulière et/ou de tailles différentes.
On comprend par sans intervention sur lesdits supports le fait que l'invention n'opère pas de manipulation sur les supports, notamment qu'elle s'abstient de faire des prélèvements de support hors de la section réactionnelle, notamment en vue de les analyser Cela signifie que la mise en oeuvre de l'invention se fait sans ouvrir la section réactionnelle, sans ouvrir le ou les bioréacteurs que comporte la section réactionnelle, sachant que dans le domaine de la fermentation les sections réactionnelles (le ou les bioréacteurs) fonctionnent en étant fermées, étanches, sans entrée d'atmosphère extérieure.
On comprend par <(micro-organismes des organismes aptes à convertir des molécules en d'autres molécules d'intérêt par fermentation. Dans la description qui suit, on pourra aussi les désigner sous forme de cellules ou encore de bactéries .
Le terme vivant a la même signification, dans le présent texte, que viable au sujet des micro-organismes : il s'agit des micro-organismes qu'on considère actifs vis-à-vis de la fermentation.
Le terme en suspension a la même signification que le terme libres et désigne des cellules qui sont en suspension dans la phase liquide, par opposition aux cellules immobilisées sur substrat.
On a ainsi choisi selon l'invention de piloter la production d'alcool(s) en fonction des micro-organismes vivants sur support, ce qui est la façon la plus fiable de le faire, tout particulièrement au démarrage de la production. En effet, quand on démarre la production, la première étape consiste, dans le bioréacteur, à disposer des supports, par exemple poreux comme des mousses de polymère, puis à y déposer les micro-organismes en injectant dans le bioréacteur un fluide contenant des micro-organismes appelé préculture. Ces micro-organismes viennent progressivement, pour partie, coloniser les supports en créant des biofilms, qui sont un mélange de micro-organismes et de polymères extra-cellulaires. Une autre part des micro-organismes va rester en phase liquide dans le bioréacteur. La croissance des biofilms est difficile à contrôler, et plus encore la part de micro-organismes vivants qu'ils contiennent.
Les micro-organismes à la fois en suspension et immobilisés sont actifs vis-à-vis de la conversion des sucres en alcools, cependant les micro-organismes en suspension sont susceptibles d'être lessivés (c'est-à-dire soutirés avec les alcools lors de leur extraction du bioréacteur). Et il s'avère que les micro-organismes immobilisés qui sont vivants produisent, eux aussi, du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes.
Concrètement, au fur et à mesure de la croissance du biofilm rendant compte de l'augmentation de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, on doit faire évoluer
4 les paramètres du procédé, et on vient généralement augmenter le débit d'entrée des réactifs dans le réacteur (celui du fluide contenant les sucres à convertir), ainsi que le débit de sortie des produits de réaction depuis le réacteur (celui du fluide contenant les alcools obtenus par la fermentation des sucres). On choisit ainsi, pour piloter le procédé, et donc, notamment faire évoluer ces débits d'entrée/sortie, d'évaluer la quantité de micro-organismes vivants immobilisés. Mais ce qui est le coeur de l'invention, c'est que ce suivi se fait sans intervention sur les supports, c'est-à-dire, concrètement, sans avoir à ouvrir le bioréacteur pour faire des manipulations ou des traitements, notamment sans prélever des portions de support. Or c'est extrêmement avantageux de faire cette évaluation sans ouvrir le bioréacteur ni perturber son lo fonctionnement. En effet, ces bioréacteurs fonctionnent en général en conditions stériles et anoxiques : toute ouverture du réacteur, tout prélèvement de support notamment, est très complexe à réaliser pour parvenir à maintenir ces conditions stériles et anoxiques, voire impossibles, tout particulièrement à l'échelle industrielle.
Pour ce faire, selon l'invention, on opère le suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support à partir d'analyses réalisées à la fois sur la phase liquide de la section réactionnelle et sur le/les gaz de fermentation produits.
L'invention a ainsi développé un suivi indirect de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, en couplant :
- des mesures sur la phase liquide (qui, elle, peut être facilement prélevée depuis le bioréacteur, voire en ligne), qui vont permettre de déterminer la quantité de micro-organismes vivants en suspension dans le réacteur, - et des mesures sur les gaz fermentaires (qui peuvent également être facilement prélevés depuis le réacteur), qui vont permettre d'estimer la quantité totale de micro-organismes vivants, c'est-à-dire la somme des micro-organismes vivants (actifs) en suspension et 75 immobilisés. Avec ce couplage de données, on peut alors en déduire une estimation de la quantité des micro-organismes vivants immobilisés, et ceci sans toucher au support, sans ouvrir le bioréacteur, sans modifier/perturber le fonctionnement du bioréacteur. Avec cette estimation, l'invention permet de moduler (augmenter) les débits entrants/sortants de façon très précise pour tenir compte et contrer, au plus juste, la formation de butanol inhibiteur. Cette estimation peut aussi permettre de piloter la production selon d'autres critères que la formation de composés inhibiteurs : elle peut permettre par exemple d'évaluer la saturation des supports par les micro-organismes. En effet, au-delà d'une certaine période de temps, le support se trouve largement colonisé par les micro-organismes, et des phénomènes de bouchage apparaissent : quand le matériau support se présente sous forme de blocs ou de particules, le bouchage peut être observé entre les particules/blocs et/ou au sein même des particules/blocs quand leur matériau est poreux, ce qui fait alors chuter la production. En outre, il faut prendre en compte la mortalité des cellules dans le biofilm, la saturation observée étant donc la
Pour ce faire, selon l'invention, on opère le suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support à partir d'analyses réalisées à la fois sur la phase liquide de la section réactionnelle et sur le/les gaz de fermentation produits.
L'invention a ainsi développé un suivi indirect de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, en couplant :
- des mesures sur la phase liquide (qui, elle, peut être facilement prélevée depuis le bioréacteur, voire en ligne), qui vont permettre de déterminer la quantité de micro-organismes vivants en suspension dans le réacteur, - et des mesures sur les gaz fermentaires (qui peuvent également être facilement prélevés depuis le réacteur), qui vont permettre d'estimer la quantité totale de micro-organismes vivants, c'est-à-dire la somme des micro-organismes vivants (actifs) en suspension et 75 immobilisés. Avec ce couplage de données, on peut alors en déduire une estimation de la quantité des micro-organismes vivants immobilisés, et ceci sans toucher au support, sans ouvrir le bioréacteur, sans modifier/perturber le fonctionnement du bioréacteur. Avec cette estimation, l'invention permet de moduler (augmenter) les débits entrants/sortants de façon très précise pour tenir compte et contrer, au plus juste, la formation de butanol inhibiteur. Cette estimation peut aussi permettre de piloter la production selon d'autres critères que la formation de composés inhibiteurs : elle peut permettre par exemple d'évaluer la saturation des supports par les micro-organismes. En effet, au-delà d'une certaine période de temps, le support se trouve largement colonisé par les micro-organismes, et des phénomènes de bouchage apparaissent : quand le matériau support se présente sous forme de blocs ou de particules, le bouchage peut être observé entre les particules/blocs et/ou au sein même des particules/blocs quand leur matériau est poreux, ce qui fait alors chuter la production. En outre, il faut prendre en compte la mortalité des cellules dans le biofilm, la saturation observée étant donc la
5 conjonction de phénomènes de bouchage croissants et de la mort croissante des bactéries au cours du temps. L'invention permet ainsi d'évaluer la diminution progressive de micro-organismes vivants, donc l'augmentation de la quantité de micro-organismes morts, et ainsi aider à la décision de changer les supports, en tout ou partie.
De préférence, l'analyse sur la phase liquide de la section réactionnelle comprend une mesure de viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle.
Avantageusement, on mesure la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle par cytométrie en flux sur un échantillon de ladite phase liquide.
La cytométrie en flux (CM F) est une technologie permettant l'analyse individuelle de cellules.
Les cellules sont alignées selon le principe du centrage hydrodynamique avant de passer devant un faisceau laser. Les phénomènes optiques engendrés permettent une analyse des caractéristiques physiques (taille, structure) des cellules ou biologiques après incubation avec des réactifs le plus souvent.
Cette technique d'analyse est très intéressante dans le cadre de l'invention, dans la mesure où, d'une part, elle est capable de cibler la mesure de la quantité des micro-organismes vivants, et d'autre part parce qu'elle permet d'obtenir rapidement les résultats, notamment en moins de 1 heure (15 ou 30 minutes par exemple).
De préférence, l'échantillon analysé est prélevé dans la section réactionnelle ou dans le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, les prélèvements étant de préférence réalisés selon une fréquence fixe ou évolutive. On peut ainsi choisir une fréquence plus élevée au démarrage de la production, et moins élevée par la suite. La fréquence des prélèvements et des mesures associées peut par exemple être de l'ordre de la dizaine de minutes, de l'heure ou de la journée selon l'avancement de la campagne de production.
L'analyse peut aussi être réalisée en continu, en ligne, sur le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, et être automatisée.
L'analyse sur le/les gaz de fermentation produits comprend de préférence une mesure de leur débit en sortie de section réactionnelle. En effet, dans un bioréacteur, il est généralement prévu en partie haute, au niveau du ciel gazeux, une sortie équipée d'une vanne qui permet facilement de récupérer un échantillon ou de mesurer le débit sortant de gaz, sachant que la fermentation produit des gaz; généralement un mélange d'hydrogène et de gaz carbonique H2/CO2 Evaluer la quantité produite de gaz de fermentation permet d'estimer la quantité de micro-organismes vivants totale dans le bioréacteur (en suspension et immobilisées).
De préférence, l'analyse sur la phase liquide de la section réactionnelle comprend une mesure de viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle.
Avantageusement, on mesure la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle par cytométrie en flux sur un échantillon de ladite phase liquide.
La cytométrie en flux (CM F) est une technologie permettant l'analyse individuelle de cellules.
Les cellules sont alignées selon le principe du centrage hydrodynamique avant de passer devant un faisceau laser. Les phénomènes optiques engendrés permettent une analyse des caractéristiques physiques (taille, structure) des cellules ou biologiques après incubation avec des réactifs le plus souvent.
Cette technique d'analyse est très intéressante dans le cadre de l'invention, dans la mesure où, d'une part, elle est capable de cibler la mesure de la quantité des micro-organismes vivants, et d'autre part parce qu'elle permet d'obtenir rapidement les résultats, notamment en moins de 1 heure (15 ou 30 minutes par exemple).
De préférence, l'échantillon analysé est prélevé dans la section réactionnelle ou dans le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, les prélèvements étant de préférence réalisés selon une fréquence fixe ou évolutive. On peut ainsi choisir une fréquence plus élevée au démarrage de la production, et moins élevée par la suite. La fréquence des prélèvements et des mesures associées peut par exemple être de l'ordre de la dizaine de minutes, de l'heure ou de la journée selon l'avancement de la campagne de production.
L'analyse peut aussi être réalisée en continu, en ligne, sur le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, et être automatisée.
L'analyse sur le/les gaz de fermentation produits comprend de préférence une mesure de leur débit en sortie de section réactionnelle. En effet, dans un bioréacteur, il est généralement prévu en partie haute, au niveau du ciel gazeux, une sortie équipée d'une vanne qui permet facilement de récupérer un échantillon ou de mesurer le débit sortant de gaz, sachant que la fermentation produit des gaz; généralement un mélange d'hydrogène et de gaz carbonique H2/CO2 Evaluer la quantité produite de gaz de fermentation permet d'estimer la quantité de micro-organismes vivants totale dans le bioréacteur (en suspension et immobilisées).
6
7 Selon l'invention, on opère donc l'analyse sur la phase liquide de la section réactionnelle pour déterminer la concentration en micro-organismes viables de ladite phase liquide, on opère l'analyse (notamment l'analyse de débit) sur le/les gaz de fermentation produits pour évaluer la concentration en micro-organismes viables totale de la section réactionnelle, et on déduit de ces analyses une évaluation de la concentration des micro-organismes viables immobilisés sur le support. On comprend la concentration comme la quantité de cellules /micro-organismes par ml de volume réactionnel dans le bioréacteur.
On va ainsi pouvoir, selon l'invention, moduler le débit entrant de flux sucré
dans la section réactionnelle et/ou le débit sortant de moût depuis la section réactionnelle en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui revient en fait à
moduler le taux de dilution de la fermentation dans le bioréacteur.
Comme indiqué plus haut, les micro-organismes forment un biofilm croissant progressivement sur le support, et on peut évaluer la croissance dudit biofilm sur le support en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui peut donner des informations intéressantes en début de production (pour suivre l'accroche initiale des micro-organismes sur le support), et plus avant dans la campagne de production : on peut en effet évaluer au moins en partie le niveau de saturation du support en fonction du suivi de la croissance dudit biofilm.
Avantageusement, on produit selon l'invention un moût fermentaire comprenant de Ilsopropanol, du butanol et de l'éthanol, les micro-organismes étant issus d'une souche appartenant au genre Clostridium.
L'invention a également pour objet un système de production d'alcool(s) à
partir d'un fluide contenant un substrat carboné sucré, afin de produire par fermentation sous l'action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation mettant en uvre le procédé décrit plus haut.
L'invention a également pour objet un système de production d'alcool(s) à
partir d'un fluide sucré, afin de produire par fermentation sous l'action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, tel que ledit système comprend :
- une section réactionnelle comprenant un support, notamment sous forme de mousse de polymère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite section réactionnelle étant munie d'une entrée pour le fluide sucré et d'une sortie pour le moût, - des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports.
De préférence, les moyens de suivi comprennent :
- un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle, - un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section réactionnelle, - des moyens de calcul (tout moyen de type électronique/informatique) déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
La section réactionnelle selon l'invention comprend de préférence un ou plusieurs bioréacteurs fonctionnant en conditions stériles et anoxiques.
L'invention sera décrite plus en détails ci-après, et sera illustrée à l'aide d'exemple(s) et de figures non limitatives de ladite invention.
Liste des figures La figure 1 représente de façon très schématique un bioréacteur mettant en uvre l'invention.
La figure 2 représente de façon très schématique le schéma-bloc du procédé
selon l'invention.
La figure 3 est un graphe représentant le débit de gaz (de fermentation) en fonction de la concentration en micro-organismes vivants (en cellules dites actives).
La figure 4 est un graphe représentant l'évolution de la concentration en micro-organismes vivants (cellules dites actives) en fonction du temps.
La figure 5 est un graphe représentant la concentration en micro-organismes vivants (en cellules actives) estimées en fonction de la même concentration mesurée expérimentalement.
La figure 6 est un graphe représentant la variation de concentration en micro-organismes vivants immobilisés sur support en fonction du temps, telle que déduite selon le procédé de l'invention.
Description des modes de réalisation L'invention s'intéresse plus particulièrement aux fermentations de type IBE ou ABE à cellules immobilisées, dont un exemple est décrit dans le brevet FR-3 086 670 précité
auquel on pourra se reporter.
On va ainsi pouvoir, selon l'invention, moduler le débit entrant de flux sucré
dans la section réactionnelle et/ou le débit sortant de moût depuis la section réactionnelle en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui revient en fait à
moduler le taux de dilution de la fermentation dans le bioréacteur.
Comme indiqué plus haut, les micro-organismes forment un biofilm croissant progressivement sur le support, et on peut évaluer la croissance dudit biofilm sur le support en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui peut donner des informations intéressantes en début de production (pour suivre l'accroche initiale des micro-organismes sur le support), et plus avant dans la campagne de production : on peut en effet évaluer au moins en partie le niveau de saturation du support en fonction du suivi de la croissance dudit biofilm.
Avantageusement, on produit selon l'invention un moût fermentaire comprenant de Ilsopropanol, du butanol et de l'éthanol, les micro-organismes étant issus d'une souche appartenant au genre Clostridium.
L'invention a également pour objet un système de production d'alcool(s) à
partir d'un fluide contenant un substrat carboné sucré, afin de produire par fermentation sous l'action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation mettant en uvre le procédé décrit plus haut.
L'invention a également pour objet un système de production d'alcool(s) à
partir d'un fluide sucré, afin de produire par fermentation sous l'action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, tel que ledit système comprend :
- une section réactionnelle comprenant un support, notamment sous forme de mousse de polymère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite section réactionnelle étant munie d'une entrée pour le fluide sucré et d'une sortie pour le moût, - des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports.
De préférence, les moyens de suivi comprennent :
- un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle, - un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section réactionnelle, - des moyens de calcul (tout moyen de type électronique/informatique) déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
La section réactionnelle selon l'invention comprend de préférence un ou plusieurs bioréacteurs fonctionnant en conditions stériles et anoxiques.
L'invention sera décrite plus en détails ci-après, et sera illustrée à l'aide d'exemple(s) et de figures non limitatives de ladite invention.
Liste des figures La figure 1 représente de façon très schématique un bioréacteur mettant en uvre l'invention.
La figure 2 représente de façon très schématique le schéma-bloc du procédé
selon l'invention.
La figure 3 est un graphe représentant le débit de gaz (de fermentation) en fonction de la concentration en micro-organismes vivants (en cellules dites actives).
La figure 4 est un graphe représentant l'évolution de la concentration en micro-organismes vivants (cellules dites actives) en fonction du temps.
La figure 5 est un graphe représentant la concentration en micro-organismes vivants (en cellules actives) estimées en fonction de la même concentration mesurée expérimentalement.
La figure 6 est un graphe représentant la variation de concentration en micro-organismes vivants immobilisés sur support en fonction du temps, telle que déduite selon le procédé de l'invention.
Description des modes de réalisation L'invention s'intéresse plus particulièrement aux fermentations de type IBE ou ABE à cellules immobilisées, dont un exemple est décrit dans le brevet FR-3 086 670 précité
auquel on pourra se reporter.
8 Les procédés de fermentation IBE ou ABE continue à cellules immobilisées sont employés afin de produire de l'isopropanol et du butanol à partir de ressources renouvelables. Les bactéries mises en oeuvre dans ces procédés sont en effet capables de dégrader certains sucres simples afin de former du butanol, de l'isopropanol ainsi que du gaz sous forme d'un mélange H2/CO2.
La toxicité du butanol et le faible taux de croissance des bactéries en phase solvantogène limitent les performances du procédé batch et en continu simple. L'utilisation du procédé en continu à cellules immobilisées permet une augmentation significative de la productivité
volumique, puisque le temps de séjour des bactéries, dans ces conditions, est décorrélé du temps de séjour hydraulique du bioréacteur étudié. De plus, la concentration en bactéries augmente dans le bioréacteur.
Les bactéries sont immobilisées sous forme d'un biofilm sur un support solide.
Ce biofilm est composé d'un mélange de cellules et de polymères extracellulaires. Le processus de formation du biofilm est difficilement contrôlable, et dépend de nombreux facteurs. En effet, les conditions hydrodynamiques dans le bioréacteur, les propriétés physico-chimiques des supports utilisés ainsi que leur nombre, peuvent influencer son développement.
La part de cellules viables, et donc productrices de métabolites au sein de cette structure, peut également largement varier en fonction de l'âge du biofilm étudié. ainsi que des conditions opératoires du procédé.
II est à noter que la biomasse active se trouve à la fois en suspension dans le milieu liquide et sur les solides supports. Ainsi, le contrôle de la quantité totale de cellules actives du biofilm au sein du bioréacteur est un paramètre-clé à connaître afin de piloter le procédé de manière optimale. En effet, les cellules immobilisées viables produisent du butanol, un composé
inhibiteur de la croissance bactérienne. Par conséquent, le débit volumique d'entrée et de sortie du procédé doit être augmenté au fur et à mesure de la croissance du biofilm au sein des supports, dans les exemples qui suivent à base de mousses en polyuréthane.
Néanmoins, les prélèvements de solides supports ne peuvent pas être effectués au cours des procédés de fermentation à cellules immobilisées. En effet, un prélèvement de support pourrait causer des problèmes quant au maintien de la stérilité et des conditions anoxiques du procédé.
Par conséquent, une méthode de suivi indirect du développement du biofilm/ de la quantité de cellules actives immobilisées dans ces biofilms a tout son intérêt.
La mise en oeuvre de l'invention décrite ci-dessous est donc une méthode de mesures de débit de gaz en ligne couplé à des mesures de la concentration en cellules actives en suspension
La toxicité du butanol et le faible taux de croissance des bactéries en phase solvantogène limitent les performances du procédé batch et en continu simple. L'utilisation du procédé en continu à cellules immobilisées permet une augmentation significative de la productivité
volumique, puisque le temps de séjour des bactéries, dans ces conditions, est décorrélé du temps de séjour hydraulique du bioréacteur étudié. De plus, la concentration en bactéries augmente dans le bioréacteur.
Les bactéries sont immobilisées sous forme d'un biofilm sur un support solide.
Ce biofilm est composé d'un mélange de cellules et de polymères extracellulaires. Le processus de formation du biofilm est difficilement contrôlable, et dépend de nombreux facteurs. En effet, les conditions hydrodynamiques dans le bioréacteur, les propriétés physico-chimiques des supports utilisés ainsi que leur nombre, peuvent influencer son développement.
La part de cellules viables, et donc productrices de métabolites au sein de cette structure, peut également largement varier en fonction de l'âge du biofilm étudié. ainsi que des conditions opératoires du procédé.
II est à noter que la biomasse active se trouve à la fois en suspension dans le milieu liquide et sur les solides supports. Ainsi, le contrôle de la quantité totale de cellules actives du biofilm au sein du bioréacteur est un paramètre-clé à connaître afin de piloter le procédé de manière optimale. En effet, les cellules immobilisées viables produisent du butanol, un composé
inhibiteur de la croissance bactérienne. Par conséquent, le débit volumique d'entrée et de sortie du procédé doit être augmenté au fur et à mesure de la croissance du biofilm au sein des supports, dans les exemples qui suivent à base de mousses en polyuréthane.
Néanmoins, les prélèvements de solides supports ne peuvent pas être effectués au cours des procédés de fermentation à cellules immobilisées. En effet, un prélèvement de support pourrait causer des problèmes quant au maintien de la stérilité et des conditions anoxiques du procédé.
Par conséquent, une méthode de suivi indirect du développement du biofilm/ de la quantité de cellules actives immobilisées dans ces biofilms a tout son intérêt.
La mise en oeuvre de l'invention décrite ci-dessous est donc une méthode de mesures de débit de gaz en ligne couplé à des mesures de la concentration en cellules actives en suspension
9 par cytométrie en flux, afin d'estimer la quantité de cellules actives immobilisées sur le solide support (biofilm).
En effet, le débit de gaz mesuré en sortie de réacteur est corrélé à la concentration en cellules actives totale mesurée par cytométrie en flux (voir équation ci-dessous).
Ainsi, lorsque la concentration en cellules actives dans le milieu liquide est mesurée via cette même méthode, la part de cellules actives immobilisées peut être estimée. La présente invention permet ainsi une estimation du développement du biofilm lors des lancements de fermentation, sans pour autant prélever de solides supports, ce qui représente un avantage pour la gestion du démarrage de ce procédé.
rG =qG Xv vitesse de production de gaz productivité spécifique cellulaire cellules actives (laias.h-L) (Lgaz.cel1ules-l.h-1) (cellules) L'invention peut être mise en oeuvre au cours d'une fermentation IBE ou ABE
continue à
cellules immobilisées. Au cours de ce type de fermentation, les cellules sont adsorbées sur un support poreux, préférentiellement des mousses en polyuréthane. Les cellules se multiplient au sein de ce support poreux au fur et à mesure de la fermentation continue.
La figure 1 représente de façon très simplifiée un bioréacteur 1 apte à mettre en oeuvre l'invention. Elle ne détaille pas tous les équipements conventionnels des bioréacteurs, et n'est pas nécessairement à l'échelle. Le bioréacteur 1 délimite un volume intérieur sensiblement SOUS la forme d'un cylindre vertical, se décomposant en un volume V1 inférieur rempli d'une phase liquide et un volume V2 supérieur, qui est le ciel gazeux du réacteur.
Le bioréacteur 1 comprend une entrée alimentée par un flux de fluide contenant le substrat carboné sucré 2, et une sortie 3 d'où est extrait le moût fermentaire 3 enrichi en alcools. Le volume V1 est muni de support(s) en mousse de polyuréthane 4. Le bioréacteur 1 est muni de moyens d'agitation 5 de la phase liquide, d'une sortie 5 permettant de prélever des échantillons de phase liquide en vue de réaliser dessus des analyses de cytométrie en flux, et d'une sortie 6 dans le volume V2 permettant de prélever des échantillons de la phase gazeuse ou de mesurer le débit sortant de la phase gazeuse Le procédé de l'invention peut être synthétisé sous la forme d'un schéma-bloc représenté à la figure 2.
- étape A: on mesure le débit de gaz (fermentaire) sortant du ciel gazeux V2 (sortie 6, munie d'une vanne et équipée de moyens de mesure de débit conventionnels), dans les exemples suivants on utilise un débitmètre gazeux ou compteur volumétrique, donnant une valeur de débit volumique en gaz d'un mélange H2/CO2. Les débits mesurés peuvent varier entre 0 et 5 L.Lréacteur-1.h-1 mais sont préférentiellement compris entre 0,5 et 3 L.Lréacteur-1.h-1, - étape B: on en déduit une estimation des cellules actives totales (en suspension dans la phase liquide et immobilisés sur les supports 4 dans le volume V1), comme détaillé plus loin - étape C : on analyse la viabilité des cellules en suspension dans la phase liquide V1, par des prélèvements sur la phase liquide (sortie 5), l'analyse se faisant par cytométrie en flux. Cette analyse peut être automatisée. La méthode employée dans les exemples ci-dessous est la suivante : La mesure de viabilité est effectuée en diluant une suspension cellulaire prélevée du bioréacteur dans du tampon mac Ilvaine jusqu'à obtenir une concentration comprise entre 5.105 et 2.106 cellules.mL-1. Une fois cette concentration atteinte, de l'iodure de propidium ainsi que du diacétate de carboxyfluoresceine sont ajoutés à la suspension cellulaire à une concentration finale de 10 pg.mL-1. La suspension cellulaire est ensuite analysée à l'aide d'un cytomètre en flux équipé d'un laser à argon (A: 488 nm). La lumière diffusée aux angles et dans l'axe du laser sont récoltées et analysées pour chaque particule détectée. La lumière diffusée perpendiculairement à l'axe du laser passe à travers un filtre passe bande (530 15 nm) pour collecter la fluorescence verte ainsi qu'a travers un filtre passe haut (> 630 nm) pour collecter la fluorescence dans le rouge. La cytométrie en flux, contrairement à la mesure de la concentration en masse sèche, permet de mesurer les cellules actives parmi la biomasse totale, ce qui permet de calculer avec plus de précision les productivités spécifiques du procédé, -- étape D: on en déduit le nombre de cellules actives en suspension dans la phase liquide - étape E: on déduit des résultats des étapes C et D une estimation de la concentration en cellules actives immobilisées sur les supports 4, - étape F: on exploite les résultats de l'étape E pour la conduite du procédé de fermentation (choix des débits entrant 2 et sortant 3 notamment).
Ce procédé est itératif, à une fréquence donnée qui peut évoluer au cours du procédé de fermentation.
On décrit ci-dessous le type de flux carboné sucré, le type de micro-organisme et le type de support qu'on peut utiliser.
Le fluide contenant le substrat carboné sucré 2 Selon un ou plusieurs modes de réalisation, le fluide contenant le substrat carboné sucré
comprend une solution aqueuse de sucres issus de la lignocellulose en C5 et/ou C6, et/ou de sucres issus des plantes saccharifères (par exemple glucose, fructose et saccharose), et/ou de sucres issus des plantes amylacées (par exemple dextrines, maltose et autres oligomères, voire d'amidon). Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la solution aqueuse de sucres en C5 et/ou C6 provient du traitement d'une source renouvelable. Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la source renouvelable est du type biomasse lignocellulosique qui peut notamment comprendre les substrats ligneux (par exemple feuillus et résineux), les sous-produits de l'agriculture (par exemple de la paille) ou ceux des industries génératrices de déchets lignocellulosiques (provenant d'industries agroalimentaires, papeteries). La source renouvelable peut également provenir de plantes sucrières, comme par exemple la betterave sucrière et la canne à sucre ou encore les plantes amylacées comme le maïs et le blé. La solution aqueuse de sucres en C5 etiou C6 peut également provenir d'un mélange de différentes sources renouvelables. Selon un mode de conduite, cette solution est stérilisée pendant 20 minutes à 120µC.
La biomasse produite par la souche appartenant au genre Clostridium La biomasse bactérienne est principalement adsorbée sous forme de biofilm sur un support solide. Préférablement, les bactéries sont des souches appartenant à l'espèce Clostridium beijennckii et/ou Clostridium acetobutylicum. Les bactéries utilisées dans le procédé peuvent être des souches génétiquement modifiées ou non et naturellement productrices d'isopropanol, et/ou des souches de Clostridium naturellement productrices d'acétone génétiquement modifiées pour les faire produire de l'isopropanol. Dans les exemples suivants, il s'agit de Clostridium beijerinckii DSM 6423.
Le support solide Le support solide comprend une mousse en polyuréthane. La mousse en polyuréthane est particulièrement avantageuse car elle donne accès non seulement à la production de mélanges de type I BEA, mais elle donne aussi accès à la production de type continu par immobilisation de la biomasse bactérienne. En effet, la mousse en polyuréthane est capable de fixer les bactéries du genre Clostridium de façon suffisamment importante (i.e., au-delà du taux de dilution causant le lavage cellulaire) permettant de produire en continu des mélanges de type IBEA. De plus, la mousse en polyuréthane est adaptée pour être immobilisée par immersion dans un réacteur. Alternativement, on peut utiliser une mousse à
base de matériau(x) céramique(s).
Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la mousse en polyuréthane présente :
- des cavités volumiques (i.e., pores ou cellules) dont le diamètre de sphère équivalent est compris entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,25 mm et 1,1 mm, de préférence entre 0,55 et 0,99 mm, et/ou - une densité apparente (i.e., masse sur volume apparent) mesurée dans l'air comprise entre et 90 g/L, de préférence entre 10 et 80 g/L, de préférence entre 15 et 45 g/L, tel qu'entre et 45 g/L ou entre 25 et 45 g/L.
Dans le cas d'une fermentation batch avec Clostridium beijerinckii DSM6423, la corrélation entre cellules actives en suspension et débit de gaz de fermentation a premièrement été
5 établie et est présentée à la figure 3, qui est un graphe qui représente en abscisse la concentration en cellules actives en cellules. mL-1, et en ordonnée le débit de gaz sortant du bioréacteur en L.h-1.
Ces essais ont été réalisés sur milieu GAPES, à 34 C et sans régulation pH.
Les conditions opératoires de ces essais sont les suivantes :
En effet, le débit de gaz mesuré en sortie de réacteur est corrélé à la concentration en cellules actives totale mesurée par cytométrie en flux (voir équation ci-dessous).
Ainsi, lorsque la concentration en cellules actives dans le milieu liquide est mesurée via cette même méthode, la part de cellules actives immobilisées peut être estimée. La présente invention permet ainsi une estimation du développement du biofilm lors des lancements de fermentation, sans pour autant prélever de solides supports, ce qui représente un avantage pour la gestion du démarrage de ce procédé.
rG =qG Xv vitesse de production de gaz productivité spécifique cellulaire cellules actives (laias.h-L) (Lgaz.cel1ules-l.h-1) (cellules) L'invention peut être mise en oeuvre au cours d'une fermentation IBE ou ABE
continue à
cellules immobilisées. Au cours de ce type de fermentation, les cellules sont adsorbées sur un support poreux, préférentiellement des mousses en polyuréthane. Les cellules se multiplient au sein de ce support poreux au fur et à mesure de la fermentation continue.
La figure 1 représente de façon très simplifiée un bioréacteur 1 apte à mettre en oeuvre l'invention. Elle ne détaille pas tous les équipements conventionnels des bioréacteurs, et n'est pas nécessairement à l'échelle. Le bioréacteur 1 délimite un volume intérieur sensiblement SOUS la forme d'un cylindre vertical, se décomposant en un volume V1 inférieur rempli d'une phase liquide et un volume V2 supérieur, qui est le ciel gazeux du réacteur.
Le bioréacteur 1 comprend une entrée alimentée par un flux de fluide contenant le substrat carboné sucré 2, et une sortie 3 d'où est extrait le moût fermentaire 3 enrichi en alcools. Le volume V1 est muni de support(s) en mousse de polyuréthane 4. Le bioréacteur 1 est muni de moyens d'agitation 5 de la phase liquide, d'une sortie 5 permettant de prélever des échantillons de phase liquide en vue de réaliser dessus des analyses de cytométrie en flux, et d'une sortie 6 dans le volume V2 permettant de prélever des échantillons de la phase gazeuse ou de mesurer le débit sortant de la phase gazeuse Le procédé de l'invention peut être synthétisé sous la forme d'un schéma-bloc représenté à la figure 2.
- étape A: on mesure le débit de gaz (fermentaire) sortant du ciel gazeux V2 (sortie 6, munie d'une vanne et équipée de moyens de mesure de débit conventionnels), dans les exemples suivants on utilise un débitmètre gazeux ou compteur volumétrique, donnant une valeur de débit volumique en gaz d'un mélange H2/CO2. Les débits mesurés peuvent varier entre 0 et 5 L.Lréacteur-1.h-1 mais sont préférentiellement compris entre 0,5 et 3 L.Lréacteur-1.h-1, - étape B: on en déduit une estimation des cellules actives totales (en suspension dans la phase liquide et immobilisés sur les supports 4 dans le volume V1), comme détaillé plus loin - étape C : on analyse la viabilité des cellules en suspension dans la phase liquide V1, par des prélèvements sur la phase liquide (sortie 5), l'analyse se faisant par cytométrie en flux. Cette analyse peut être automatisée. La méthode employée dans les exemples ci-dessous est la suivante : La mesure de viabilité est effectuée en diluant une suspension cellulaire prélevée du bioréacteur dans du tampon mac Ilvaine jusqu'à obtenir une concentration comprise entre 5.105 et 2.106 cellules.mL-1. Une fois cette concentration atteinte, de l'iodure de propidium ainsi que du diacétate de carboxyfluoresceine sont ajoutés à la suspension cellulaire à une concentration finale de 10 pg.mL-1. La suspension cellulaire est ensuite analysée à l'aide d'un cytomètre en flux équipé d'un laser à argon (A: 488 nm). La lumière diffusée aux angles et dans l'axe du laser sont récoltées et analysées pour chaque particule détectée. La lumière diffusée perpendiculairement à l'axe du laser passe à travers un filtre passe bande (530 15 nm) pour collecter la fluorescence verte ainsi qu'a travers un filtre passe haut (> 630 nm) pour collecter la fluorescence dans le rouge. La cytométrie en flux, contrairement à la mesure de la concentration en masse sèche, permet de mesurer les cellules actives parmi la biomasse totale, ce qui permet de calculer avec plus de précision les productivités spécifiques du procédé, -- étape D: on en déduit le nombre de cellules actives en suspension dans la phase liquide - étape E: on déduit des résultats des étapes C et D une estimation de la concentration en cellules actives immobilisées sur les supports 4, - étape F: on exploite les résultats de l'étape E pour la conduite du procédé de fermentation (choix des débits entrant 2 et sortant 3 notamment).
Ce procédé est itératif, à une fréquence donnée qui peut évoluer au cours du procédé de fermentation.
On décrit ci-dessous le type de flux carboné sucré, le type de micro-organisme et le type de support qu'on peut utiliser.
Le fluide contenant le substrat carboné sucré 2 Selon un ou plusieurs modes de réalisation, le fluide contenant le substrat carboné sucré
comprend une solution aqueuse de sucres issus de la lignocellulose en C5 et/ou C6, et/ou de sucres issus des plantes saccharifères (par exemple glucose, fructose et saccharose), et/ou de sucres issus des plantes amylacées (par exemple dextrines, maltose et autres oligomères, voire d'amidon). Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la solution aqueuse de sucres en C5 et/ou C6 provient du traitement d'une source renouvelable. Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la source renouvelable est du type biomasse lignocellulosique qui peut notamment comprendre les substrats ligneux (par exemple feuillus et résineux), les sous-produits de l'agriculture (par exemple de la paille) ou ceux des industries génératrices de déchets lignocellulosiques (provenant d'industries agroalimentaires, papeteries). La source renouvelable peut également provenir de plantes sucrières, comme par exemple la betterave sucrière et la canne à sucre ou encore les plantes amylacées comme le maïs et le blé. La solution aqueuse de sucres en C5 etiou C6 peut également provenir d'un mélange de différentes sources renouvelables. Selon un mode de conduite, cette solution est stérilisée pendant 20 minutes à 120µC.
La biomasse produite par la souche appartenant au genre Clostridium La biomasse bactérienne est principalement adsorbée sous forme de biofilm sur un support solide. Préférablement, les bactéries sont des souches appartenant à l'espèce Clostridium beijennckii et/ou Clostridium acetobutylicum. Les bactéries utilisées dans le procédé peuvent être des souches génétiquement modifiées ou non et naturellement productrices d'isopropanol, et/ou des souches de Clostridium naturellement productrices d'acétone génétiquement modifiées pour les faire produire de l'isopropanol. Dans les exemples suivants, il s'agit de Clostridium beijerinckii DSM 6423.
Le support solide Le support solide comprend une mousse en polyuréthane. La mousse en polyuréthane est particulièrement avantageuse car elle donne accès non seulement à la production de mélanges de type I BEA, mais elle donne aussi accès à la production de type continu par immobilisation de la biomasse bactérienne. En effet, la mousse en polyuréthane est capable de fixer les bactéries du genre Clostridium de façon suffisamment importante (i.e., au-delà du taux de dilution causant le lavage cellulaire) permettant de produire en continu des mélanges de type IBEA. De plus, la mousse en polyuréthane est adaptée pour être immobilisée par immersion dans un réacteur. Alternativement, on peut utiliser une mousse à
base de matériau(x) céramique(s).
Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la mousse en polyuréthane présente :
- des cavités volumiques (i.e., pores ou cellules) dont le diamètre de sphère équivalent est compris entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,25 mm et 1,1 mm, de préférence entre 0,55 et 0,99 mm, et/ou - une densité apparente (i.e., masse sur volume apparent) mesurée dans l'air comprise entre et 90 g/L, de préférence entre 10 et 80 g/L, de préférence entre 15 et 45 g/L, tel qu'entre et 45 g/L ou entre 25 et 45 g/L.
Dans le cas d'une fermentation batch avec Clostridium beijerinckii DSM6423, la corrélation entre cellules actives en suspension et débit de gaz de fermentation a premièrement été
5 établie et est présentée à la figure 3, qui est un graphe qui représente en abscisse la concentration en cellules actives en cellules. mL-1, et en ordonnée le débit de gaz sortant du bioréacteur en L.h-1.
Ces essais ont été réalisés sur milieu GAPES, à 34 C et sans régulation pH.
Les conditions opératoires de ces essais sont les suivantes :
10 Après réduction du milieu CALAM dont la composition est donnée dans le tableau 1 ci-dessous, les spores sont activées par un choc thermique à 100 C pendant une minute, et une inoculation du milieu à 2% est réalisée. La préculture est ensuite incubée à 34'C, en anaérobie et sous agitation à 100 rpm pendant 24 h.
Tableau 1 Composant Concentration (g.L-1) Pomme de terre 250 (NH4)2SO4 2,0 CaCO3 2,0 Glucose 10,0 Une seconde préculture en milieu GAPES, dont la composition est donnée dans le tableau 2 ci-dessous, est ensuite réalisée avant l'ensemencement final du fermenteur.
Une inoculation du milieu GAPES est cette fois-ci effectuée à 10% puis la préculture incubée à
34 C, en anaérobie et sous agitation à 100 rpm pendant 24 h.
Tableau 2 Composant Concentration (g.L-1) FeSO4, 71120 0,0066 MgSO4, 7H20 1,0 KI-12PO4 1,0 K2H PO4 0,6 CH3COONH4 2,9 Acide p-amino-benzoïque 0,1 Extrait de levure granulé 2,5 Glucose 45 ou 60 Enfin la fermentation en réacteur est réalisée avec du milieu GAPES
préalablement réduit et avec une inoculation à 10%. Les conditions de cultures employées sont :
température à 34 C, agitation de 200 rpm, sans bullage à l'azote et sans régulation de pH.
Dans le cas des fermentations continues, une première phase de croissance en batch a lieu pendant 8h puis le réacteur est connecté à une bouteille d'alimentation (milieu GAPES) et une bouteille de soutirage. L'alimentation est démarrée et progressivement augmentée.
Le débit de gaz a été mesuré à l'aide d'un compteur volumétrique Ritter et la quantité de cellules actives par marquage au cFDA et analyse par cytométrie en flux.
Le protocole de mesure est le suivant :
Tampon Mac Ilvaine pH 4 1. Préparer une solution d'acide citrique à 0,1 M (soit 19,21 g/L) et une solution de Na2HPO4 à 0,2 M (soit 28,38 g/L).
2. Pour obtenir un pH égal à 4, mélanger 307,25 mL de la solution d'acide citrique à 0,1 M
avec 192,75 mL de la solution de Na2HPO4 à 0,2 M. Vérifier le pH de la solution tampon obtenue.
3. Filtrer la solution et la conserver à 4 C.
Marqueur de viabilité
Iodure de propidium : 1,4986 mM dans de l'eau milliQ ¨ à conserver à 4 C
Chemchrome V8 commercialisé par Biomérieux (cFDA : diacétate de carboxyfluoresceine ) :
0,217 pM dans de l'acétone ¨ à conserver à -20 C
Marquage des cellules 1. Diluer la suspension cellulaire dans du tampon Mac Ilvaine afin d'obtenir une concentration d'environ 1.106 cellules/mL.
2. Ajouter 10 pL de Chemchrome V8 et 10 pL d'iodure de propidium dans 1 mL de la suspension cellulaire diluée 3. Incuber 10 min à 40 C.
4. Passer l'échantillon au cytomètre en flux.
La figure 3 est un graphe représentant le débit de gaz (de fermentation) tel que mesuré, exprimé en L.h-1 , en fonction de la concentration en micro-organismes vivants (en cellules dites actives),exprimée en nombre de cellules viables par ml de volume V1 (volume utile) de bioréacteur. Cette figure démontre qu'une relation linéaire entre débit de gaz et concentration en cellules actives mesurée par cytométrie en flux est obtenue. Cette dernière permet ainsi d'estimer la productivité spécifique cellulaire en gaz de fermentation selon la relation suivante :
rG =qG X1., vitesse de production de gaz productivité spécifique cellulaire cellules actives (Lgaz-h-1) (Lga2.cellules-l.h-1) (cellules) La valeur du paramètre qG correspond en effet au coefficient directeur de la droite de régression 5,54.10-1 3,5.10-11 L cellules-1.h-1. En faisant l'hypothèse que la productivité
spécifique cellulaire qG est constante dans le temps, cette même relation peut ensuite être utilisée afin de calculer la quantité totale de cellules actives à partir des débits de gaz mesurés lors de fermentation continue. Cette méthode a ainsi été utilisée dans un second temps pour estimer la concentration en cellules actives au cours d'une fermentation continue à cellules libres.
Les résultats sont illustrés aux figures 4 et 5 - La figure 4 est un graphe représentant en abscisse le temps exprimé en heure, et en ordonné la concentration en cellules actives au cours d'une fermentation IBE à
34 C à
cellules libres exprimée en cellules actives. mL-l.
- La figure 5 est un graphe représentant en abscisse la concentration en cellules actives estimées au cours d'une fermentation IBE à 34 C à cellules libres exprimée en cellules actives. mL-1, et en ordonnée les cellules actives mesurées expérimentalement avec la même unité.
Les résultats de l'estimation de la concentration en cellules libres sont présentés sur la figure 4. Les traits continus représentent l'estimation de la concentration en cellules actives au cours du temps à partir du débit de gaz mesuré.
Les points blancs à la figure 5 représentent la concentration en cellules actives mesurée par cytométrie en flux : La figure 5 montre que les données estimées à partir de la productivité
spécifique cellulaire qG calculées expérimentalement au cours des fermentation batch sont proches des données expérimentales (R2 = 0,87). Cet essai permet de valider l'hypothèse de constance de la productivité spécifique cellulaire qG (5,54.10-1 i.cellules-i.h-1).
Il est donc bien possible d'estimer la concentration en cellules actives totales au cours de la fermentation. Cette relation peut alors être employée de manière inventive afin d'estimer la concentration en cellules actives du biofilm d'un procédé continu à cellules immobilisées, à
condition que la productivité spécifique cellulaire en gaz des cellules immobilisée soit égale à
celle mesurée en suspension.
rG =qG .( X,, suspension + Xv bio film) vitesse de production de gaz productivité spéci figue cellulaire cellules actives totales (Lgas.h-a) (Lga2-CRIJul9s-1.h-1) (cellules) Ainsi :
Xi, bio film ---- ¨ Xõ suspension CIG
Dans ce cas-là, une mesure de la quantité de cellules actives en suspension par cytométrie en flux est réalisée. Il est ainsi possible de suivre la colonisation du biofilm sans prélèvement et analyses de solides supports.
L'avantage de cette invention est qu'elle permet d'opérer le taux de dilution de la fermentation, afin que la concentration en cellules actives immobilisées soit maximale, sans prélèvement invasif dans le bioréacteur pendant la production. Le procédé développé dans le cadre de la présente invention permet ainsi de limiter les biais entraînés par le prélèvement des solides supports lors de l'étude de la cinétique de croissance de Clostridium (C.
beijerinckii ou acetobutylicum) en biofilm : perte de stérilité (c'est-à-dire risques de contaminations) et des conditions anoxiques (entrée d'oxygène) affectant la croissance des bactéries étudiées.
Ce procédé peut être extrapolé/appliqué de façon analogue à d'autres types de fermentations à cellules immobilisées, tant qu'on a recours qu'à un seul type de souche bactérienne tout au moins, et que les souches bactériennes employées possèdent une productivité
spécifique en gaz fixe/peu changeante tout au long de la fermentation étudiée.
Exemple -I
Le système décrit est composé du bioréacteur 1 d'un volume utile de 0,35 L. La platine de ce bioréacteur est équipée d'une entrée pour l'alimentation en substrat 2, d'un plongeant pour les prélèvements, la sortie liquide est assurée par un système de débordement. Les mousses en polyuréthane 4 sont placés dans le bioréacteur 1 de manière à avoir 0,24 L de mousse par litre de bioréacteur. Le système est stérilisé à vide à 120 C pendant 20 min.
Un volume de 0,315 Lde substrat carboné stérile (milieu GAPES) et anoxique est introduit dans le bioréacteur. La cuve d'alimentation (non représentée à la figure 1) contenant du substrat carboné stérile (milieu GARES) est raccordée au bioréacteur 1. La fermentation est réalisée par la souche Clostridium beijerinckii DSM6423. L'inoculation est effectuée à
partir de 0,035 L
de préculture de cette souche préalablement incubée pendant 24 h à 34 C et sous conditions anoxiques.
Une fois l'inoculation réalisée, une période d'incubation de 8 h en batch est respectée. L'essai a été effectué à 34 C, avec une agitation de 200 rpm et le pH de la fermentation n'est pas contrôlé. Le substrat carboné 2 est ensuite amené de manière continue dans la partie réactionnelle V1 du bioréacteur 1 à l'aide d'une pompe péristaltique. Le débit volumique d'entrée du substrat carboné 2 et de sortie du jus fermenté, appelé aussi moût de fermentation 3 sont égaux tout au long de l'essai. Le débit normalisé par le volume utile du bioréacteur 1 est appelé taux de dilution. Comme indiqué sur la figure 1, ce dernier est augmenté au fur et à mesure de l'essai afin de ne pas accumuler des concentrations inhibitrices en butanol au fur et à mesure de la croissance du biofilm. Le débit de gaz produit par la souche utilisée est mesuré à l'aide d'un compteur volumétrique.
La figure 6 représente en abscisse le temps exprimé en heure, et en ordonnées, selon l'axe vertical gauche la concentration en micro-organismes vivants par ml de volume réactionnel du bioréacteur, et selon l'axe vertical droit le débit en litre/heure des flux entrant 2 et sortant 3 (identiques) du bioréacteur.
- Les losanges représentent les micro-organismes vivants en suspension/ ml de volume V1 du bioréacteur, - Les ronds représentent la concentration en micro-organismes vivants sur biofilm / ml de volume V1 du bioréacteur telle qu'estimée selon l'invention, - La courbe en trait plein représente la mesure du débit de gaz de fermentation, - La courbe en pointillés l'évolution du taux de dilution en h-1 tel que défini plus haut.
Comme indiqué sur la figure 6, le débit volumique de gaz mesuré peut servir à
estimer la concentration totale en cellules actives dans le milieu de fermentation.
Ainsi, il est possible, à
partir de la mesure de gaz, et de la mesure de la viabilité des cellules en suspension par cytométrie en flux, d'estimer la concentration en cellules viables qui sont immobilisées dans le bioréacteur.
Ces données montrent que lorsque le taux de dilution appliqué au système est faible en début d'essai, la majorité des cellules viables (c'est-à-dire les micro-organismes vivants) sont en suspension. Lorsque le taux de dilution est augmenté, les cellules viables en suspension sont lessivées du bioréacteur, bien que le débit volumique en gaz reste constant.
Le dénombrement des cellules viables en suspension ainsi que l'analyse du débit volumique de gaz de fermentation permettent alors de vérifier que la majorité des cellules viables sont alors immobilisées sur les mousses en polyuréthane. Ces analyses peuvent alors servir à mieux comprendre où se situent les cellules viables dans le bioréacteur considéré, et ainsi à optimiser le procédé de fermentation.
On peut ainsi moduler au mieux le taux de dilution au long du procédé de fermentation, ce qui est tout particulièrement intéressant au démarrage du procédé.
Tableau 1 Composant Concentration (g.L-1) Pomme de terre 250 (NH4)2SO4 2,0 CaCO3 2,0 Glucose 10,0 Une seconde préculture en milieu GAPES, dont la composition est donnée dans le tableau 2 ci-dessous, est ensuite réalisée avant l'ensemencement final du fermenteur.
Une inoculation du milieu GAPES est cette fois-ci effectuée à 10% puis la préculture incubée à
34 C, en anaérobie et sous agitation à 100 rpm pendant 24 h.
Tableau 2 Composant Concentration (g.L-1) FeSO4, 71120 0,0066 MgSO4, 7H20 1,0 KI-12PO4 1,0 K2H PO4 0,6 CH3COONH4 2,9 Acide p-amino-benzoïque 0,1 Extrait de levure granulé 2,5 Glucose 45 ou 60 Enfin la fermentation en réacteur est réalisée avec du milieu GAPES
préalablement réduit et avec une inoculation à 10%. Les conditions de cultures employées sont :
température à 34 C, agitation de 200 rpm, sans bullage à l'azote et sans régulation de pH.
Dans le cas des fermentations continues, une première phase de croissance en batch a lieu pendant 8h puis le réacteur est connecté à une bouteille d'alimentation (milieu GAPES) et une bouteille de soutirage. L'alimentation est démarrée et progressivement augmentée.
Le débit de gaz a été mesuré à l'aide d'un compteur volumétrique Ritter et la quantité de cellules actives par marquage au cFDA et analyse par cytométrie en flux.
Le protocole de mesure est le suivant :
Tampon Mac Ilvaine pH 4 1. Préparer une solution d'acide citrique à 0,1 M (soit 19,21 g/L) et une solution de Na2HPO4 à 0,2 M (soit 28,38 g/L).
2. Pour obtenir un pH égal à 4, mélanger 307,25 mL de la solution d'acide citrique à 0,1 M
avec 192,75 mL de la solution de Na2HPO4 à 0,2 M. Vérifier le pH de la solution tampon obtenue.
3. Filtrer la solution et la conserver à 4 C.
Marqueur de viabilité
Iodure de propidium : 1,4986 mM dans de l'eau milliQ ¨ à conserver à 4 C
Chemchrome V8 commercialisé par Biomérieux (cFDA : diacétate de carboxyfluoresceine ) :
0,217 pM dans de l'acétone ¨ à conserver à -20 C
Marquage des cellules 1. Diluer la suspension cellulaire dans du tampon Mac Ilvaine afin d'obtenir une concentration d'environ 1.106 cellules/mL.
2. Ajouter 10 pL de Chemchrome V8 et 10 pL d'iodure de propidium dans 1 mL de la suspension cellulaire diluée 3. Incuber 10 min à 40 C.
4. Passer l'échantillon au cytomètre en flux.
La figure 3 est un graphe représentant le débit de gaz (de fermentation) tel que mesuré, exprimé en L.h-1 , en fonction de la concentration en micro-organismes vivants (en cellules dites actives),exprimée en nombre de cellules viables par ml de volume V1 (volume utile) de bioréacteur. Cette figure démontre qu'une relation linéaire entre débit de gaz et concentration en cellules actives mesurée par cytométrie en flux est obtenue. Cette dernière permet ainsi d'estimer la productivité spécifique cellulaire en gaz de fermentation selon la relation suivante :
rG =qG X1., vitesse de production de gaz productivité spécifique cellulaire cellules actives (Lgaz-h-1) (Lga2.cellules-l.h-1) (cellules) La valeur du paramètre qG correspond en effet au coefficient directeur de la droite de régression 5,54.10-1 3,5.10-11 L cellules-1.h-1. En faisant l'hypothèse que la productivité
spécifique cellulaire qG est constante dans le temps, cette même relation peut ensuite être utilisée afin de calculer la quantité totale de cellules actives à partir des débits de gaz mesurés lors de fermentation continue. Cette méthode a ainsi été utilisée dans un second temps pour estimer la concentration en cellules actives au cours d'une fermentation continue à cellules libres.
Les résultats sont illustrés aux figures 4 et 5 - La figure 4 est un graphe représentant en abscisse le temps exprimé en heure, et en ordonné la concentration en cellules actives au cours d'une fermentation IBE à
34 C à
cellules libres exprimée en cellules actives. mL-l.
- La figure 5 est un graphe représentant en abscisse la concentration en cellules actives estimées au cours d'une fermentation IBE à 34 C à cellules libres exprimée en cellules actives. mL-1, et en ordonnée les cellules actives mesurées expérimentalement avec la même unité.
Les résultats de l'estimation de la concentration en cellules libres sont présentés sur la figure 4. Les traits continus représentent l'estimation de la concentration en cellules actives au cours du temps à partir du débit de gaz mesuré.
Les points blancs à la figure 5 représentent la concentration en cellules actives mesurée par cytométrie en flux : La figure 5 montre que les données estimées à partir de la productivité
spécifique cellulaire qG calculées expérimentalement au cours des fermentation batch sont proches des données expérimentales (R2 = 0,87). Cet essai permet de valider l'hypothèse de constance de la productivité spécifique cellulaire qG (5,54.10-1 i.cellules-i.h-1).
Il est donc bien possible d'estimer la concentration en cellules actives totales au cours de la fermentation. Cette relation peut alors être employée de manière inventive afin d'estimer la concentration en cellules actives du biofilm d'un procédé continu à cellules immobilisées, à
condition que la productivité spécifique cellulaire en gaz des cellules immobilisée soit égale à
celle mesurée en suspension.
rG =qG .( X,, suspension + Xv bio film) vitesse de production de gaz productivité spéci figue cellulaire cellules actives totales (Lgas.h-a) (Lga2-CRIJul9s-1.h-1) (cellules) Ainsi :
Xi, bio film ---- ¨ Xõ suspension CIG
Dans ce cas-là, une mesure de la quantité de cellules actives en suspension par cytométrie en flux est réalisée. Il est ainsi possible de suivre la colonisation du biofilm sans prélèvement et analyses de solides supports.
L'avantage de cette invention est qu'elle permet d'opérer le taux de dilution de la fermentation, afin que la concentration en cellules actives immobilisées soit maximale, sans prélèvement invasif dans le bioréacteur pendant la production. Le procédé développé dans le cadre de la présente invention permet ainsi de limiter les biais entraînés par le prélèvement des solides supports lors de l'étude de la cinétique de croissance de Clostridium (C.
beijerinckii ou acetobutylicum) en biofilm : perte de stérilité (c'est-à-dire risques de contaminations) et des conditions anoxiques (entrée d'oxygène) affectant la croissance des bactéries étudiées.
Ce procédé peut être extrapolé/appliqué de façon analogue à d'autres types de fermentations à cellules immobilisées, tant qu'on a recours qu'à un seul type de souche bactérienne tout au moins, et que les souches bactériennes employées possèdent une productivité
spécifique en gaz fixe/peu changeante tout au long de la fermentation étudiée.
Exemple -I
Le système décrit est composé du bioréacteur 1 d'un volume utile de 0,35 L. La platine de ce bioréacteur est équipée d'une entrée pour l'alimentation en substrat 2, d'un plongeant pour les prélèvements, la sortie liquide est assurée par un système de débordement. Les mousses en polyuréthane 4 sont placés dans le bioréacteur 1 de manière à avoir 0,24 L de mousse par litre de bioréacteur. Le système est stérilisé à vide à 120 C pendant 20 min.
Un volume de 0,315 Lde substrat carboné stérile (milieu GAPES) et anoxique est introduit dans le bioréacteur. La cuve d'alimentation (non représentée à la figure 1) contenant du substrat carboné stérile (milieu GARES) est raccordée au bioréacteur 1. La fermentation est réalisée par la souche Clostridium beijerinckii DSM6423. L'inoculation est effectuée à
partir de 0,035 L
de préculture de cette souche préalablement incubée pendant 24 h à 34 C et sous conditions anoxiques.
Une fois l'inoculation réalisée, une période d'incubation de 8 h en batch est respectée. L'essai a été effectué à 34 C, avec une agitation de 200 rpm et le pH de la fermentation n'est pas contrôlé. Le substrat carboné 2 est ensuite amené de manière continue dans la partie réactionnelle V1 du bioréacteur 1 à l'aide d'une pompe péristaltique. Le débit volumique d'entrée du substrat carboné 2 et de sortie du jus fermenté, appelé aussi moût de fermentation 3 sont égaux tout au long de l'essai. Le débit normalisé par le volume utile du bioréacteur 1 est appelé taux de dilution. Comme indiqué sur la figure 1, ce dernier est augmenté au fur et à mesure de l'essai afin de ne pas accumuler des concentrations inhibitrices en butanol au fur et à mesure de la croissance du biofilm. Le débit de gaz produit par la souche utilisée est mesuré à l'aide d'un compteur volumétrique.
La figure 6 représente en abscisse le temps exprimé en heure, et en ordonnées, selon l'axe vertical gauche la concentration en micro-organismes vivants par ml de volume réactionnel du bioréacteur, et selon l'axe vertical droit le débit en litre/heure des flux entrant 2 et sortant 3 (identiques) du bioréacteur.
- Les losanges représentent les micro-organismes vivants en suspension/ ml de volume V1 du bioréacteur, - Les ronds représentent la concentration en micro-organismes vivants sur biofilm / ml de volume V1 du bioréacteur telle qu'estimée selon l'invention, - La courbe en trait plein représente la mesure du débit de gaz de fermentation, - La courbe en pointillés l'évolution du taux de dilution en h-1 tel que défini plus haut.
Comme indiqué sur la figure 6, le débit volumique de gaz mesuré peut servir à
estimer la concentration totale en cellules actives dans le milieu de fermentation.
Ainsi, il est possible, à
partir de la mesure de gaz, et de la mesure de la viabilité des cellules en suspension par cytométrie en flux, d'estimer la concentration en cellules viables qui sont immobilisées dans le bioréacteur.
Ces données montrent que lorsque le taux de dilution appliqué au système est faible en début d'essai, la majorité des cellules viables (c'est-à-dire les micro-organismes vivants) sont en suspension. Lorsque le taux de dilution est augmenté, les cellules viables en suspension sont lessivées du bioréacteur, bien que le débit volumique en gaz reste constant.
Le dénombrement des cellules viables en suspension ainsi que l'analyse du débit volumique de gaz de fermentation permettent alors de vérifier que la majorité des cellules viables sont alors immobilisées sur les mousses en polyuréthane. Ces analyses peuvent alors servir à mieux comprendre où se situent les cellules viables dans le bioréacteur considéré, et ainsi à optimiser le procédé de fermentation.
On peut ainsi moduler au mieux le taux de dilution au long du procédé de fermentation, ce qui est tout particulièrement intéressant au démarrage du procédé.
Claims (13)
1. Procédé de production d'alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré (2) dans une section réactionnelle (1) comprenant un support (4) sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous Faction desdits micro-organismes un moût (3) enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, caractérisé en ce que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et en ce qu'on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports, à partir d'analyses réalisées à la fois sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) et sur le/les gaz de fermentation produits.
2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'analyse sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) comprend une mesure de viabilité
des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle.
des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle.
3. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'on mesure la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) par cytométrie en flux sur un échantillon de ladite phase liquide.
4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'échantillon analysé est prélevé dans la section réactionnelle (1) ou dans le flux du moût (3) de fermentation sortant de la section réactionnelle. les prélèvements étant de préférence réalisés selon une fréquence fixe ou évolutive.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse sur le/les gaz de fermentation produits comprend une mesure de leur débit en sortie de section réactionnelle (1).
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) détermine la concentration en micro-organismes viables de ladite phase liquide, en ce que l'analyse sur le/les gaz de fermentation produits évalue la concentration en micro-organismes viables totale de la section réactionnelle, et en ce qu'on déduit de ces analyses une évaluation de la concentration des micro-organismes viables immobilisés sur le support.
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on module le débit entrant de flux sucré (2) dans la section réactionnelle et/ou le débit sortant de moût (3) depuis la section réactionnelle (1) en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les micro-organismes forment un biofilm croissant progressivement sur le support (4), et en ce qu'on évalue la croissance dudit biofilm sur le support en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on évalue le niveau de saturation du support (4) en fonction du suivi de la croissance dudit biofilm.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on produit un moût fermentaire (3) comprenant de l'isopropanol, du butanol et de l'éthanol, les micro-organismes étant issus d'une souche appartenant au genre Clostridium.
11. Système de production d'alcool(s) à partir d'un fluide contenant un substrat carboné sucré, afin de produire par fermentation sous l'action de rnicro-organisrnes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, caractérisé en ce que ledit système comprend :
- une section réactionnelle (1) comprenant un support (4), notamment sous forme de mousse de polyrnère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite section réactionnelle étant munie d'une entrée pour le fluide sucré et d'une sortie pour le moût, - des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports, par analyses réalisées à la fois sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) et sur le/les gaz de fermentation produits.
- une section réactionnelle (1) comprenant un support (4), notamment sous forme de mousse de polyrnère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite section réactionnelle étant munie d'une entrée pour le fluide sucré et d'une sortie pour le moût, - des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports, par analyses réalisées à la fois sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) et sur le/les gaz de fermentation produits.
12. Système selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les moyens de suivi comprennent :
- un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle, - un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section réactionnelle, - des moyens de calcul déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
- un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle, - un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section réactionnelle, - des moyens de calcul déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
13. Système selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que la section réactionnelle (1) comprend un ou plusieurs bioréacteurs fonctionnant en conditions stériles et anoxiques.
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| FR2111141A FR3128226A1 (fr) | 2021-10-20 | 2021-10-20 | Procédé de production d’alcools par fermentation |
| FRFR2111141 | 2021-10-20 | ||
| PCT/EP2022/078032 WO2023066697A1 (fr) | 2021-10-20 | 2022-10-10 | Procédé de production d'alcools par fermentation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA3233528A1 true CA3233528A1 (fr) | 2023-04-27 |
Family
ID=80786448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA3233528A Pending CA3233528A1 (fr) | 2021-10-20 | 2022-10-10 | Procede de production d'alcools par fermentation |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4419642A1 (fr) |
| CN (1) | CN118139964A (fr) |
| CA (1) | CA3233528A1 (fr) |
| FR (1) | FR3128226A1 (fr) |
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Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101268179A (zh) * | 2005-09-15 | 2008-09-17 | 尼克弗公司 | 连续培养产醇细菌的装置和培养该细菌的方法 |
| EP3035052A1 (fr) | 2014-12-18 | 2016-06-22 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Procédé et dispositif de mesure pour la détermination de la vitesse de croissance d'un biofilm |
| FR3086670B1 (fr) | 2018-09-28 | 2024-05-31 | Ifp Energies Now | Procede de production d’alcools avec clostridium sur support solide |
| EP3856890A4 (fr) * | 2018-10-03 | 2022-07-06 | Pluristem Ltd. | Bioréacteur modulaire |
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2021
- 2021-10-20 FR FR2111141A patent/FR3128226A1/fr active Pending
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2022
- 2022-10-10 WO PCT/EP2022/078032 patent/WO2023066697A1/fr active Application Filing
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- 2022-10-10 CN CN202280070677.5A patent/CN118139964A/zh active Pending
- 2022-10-10 CA CA3233528A patent/CA3233528A1/fr active Pending
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| CN118139964A (zh) | 2024-06-04 |
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| WO2023066697A1 (fr) | 2023-04-27 |
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