CN101953916B

CN101953916B - 一种含嗜酸乳杆菌和中药的组合物及其应用

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Publication number: CN101953916B
Application number: CN2010102794407A
Authority: CN
Inventors: 杜丹; 王晓东; 张彦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-09-13
Also published as: CN101953916A

Abstract

本发明涉及一种含嗜酸乳杆菌和中药的组合物及其应用，所用嗜酸乳杆菌L acidophilus1.1878具有较强耐酸、耐胆盐特性，并有较好粘附性。该组合物中含有嗜酸乳杆菌Lacidophilus 1.1878，还含有低聚糖和中草药等。该组合物可作为食品、保健品或药品，适于长期食用，主要用于防治抗生素相关腹泻、调节肠道菌群、保护肠粘膜和增强免疫力。

Description

一种含嗜酸乳杆菌和中药的组合物及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种含嗜酸乳杆菌和中药的组合物，该组合物可作为保健品或药品，适于长期食用，主要用于防治抗生素相关腹泻、调节肠道菌群、保护肠粘膜和增强免疫力。

(二)背景技术

抗生素相关腹泻(antibiotic-associated diarrhea，AAD)是抗生素治疗最常见的不良反应。接受抗生素治疗者5％～25％会发生抗生素相关腹泻。随着抗生素应用的日益广泛，AAD病例逐年增多。此种肠源性感染仅以常规抗生素治疗不但难以治愈，而且可能引发更进一步的菌群失调，导致病情恶化和蔓延，严重者可发展至菌血症，甚至死亡。AAD的发病致病机理尚不明确，但这种腹泻与肠道菌群在数量和种类上的变化直接相关。肠道菌群是构筑肠道粘膜屏障的主要组成部分，在维持肠道功能及机体的健康方面发挥着重要的生理意义。在大量应用广谱抗生素、严重烧伤、外科急重症或肠炎等慢性疾病时，由正常菌群所组成的防御机制会遭到严重破坏，导致肠道菌群失调，肠道屏障功能损害，肠腔中的大量细菌及其内毒素由肠系膜淋巴结进入内脏器官及体循环，引起菌血症、脓毒血症等重症感染。

微生态制剂作为一种有效的抗生素替代品，通过“以菌治菌”的原理，改善肠道微生态平衡，对急慢性腹泻和抗生素引起的肠道菌群失调有一定的预防和治疗作用。正常情况下，肠道含有大约30属500种细菌，主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成。这些菌种在种类及数量上的相对恒定是维持肠道细菌微生态平衡的基础，同时也影响着人体的免疫、营养、代谢等功能。益生菌(probiotie)是指能够促进肠道内菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活菌制剂。目前应用较多是双歧杆菌和乳酸杆菌。益生元(prebiotie)指选择性促进宿主肠道原有的一种或几种有益细菌(益生菌)生长繁殖，而不被宿主消化的物质。低聚异麦芽糖(IMO)是近年来备受关注的一种新型益生元，由α一1，6糖苷键结合异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖组成。由于人体内不具有分解α一1，6糖苷键的酶，所以不被人体直接吸收利用，因此可以直接到达肠道，被双歧杆菌、乳酸杆菌所利用，刺激其增殖，而肠内有害菌则很难利用它们。合生元可以理解为是益生菌和益生元的混合物，但其功效并不仅仅是益生菌和益生元的作用之和，益生元的加入可以促进益生菌在肠道的定植和存活，起到“定植佐剂”的作用，使益生菌能够更好的发挥生理作用，进一步加强了对宿主健康的调节作用。有研究显示益生菌制剂可以调节肠道菌群失调、维持肠道正常生理功能；可促进烫伤大鼠、急性肝损伤大鼠受损肠粘膜屏障修复，有效防治肠道菌群或内毒素易位。一个高质量的益生菌制品在菌株的选择上应满足以下基本要求：1.是人体正常菌群成员或是能调节体内正常菌群平衡，对人体无毒无害的外来菌；2.具有较强的细胞粘附性；3.能够耐受强酸、高胆盐环境；4.能保持稳定的活菌状态，适用于大规模工业生产的菌种。

嗜酸乳杆菌是乳酸杆菌的一种，是肠道主要益生菌，能帮助肠道抵御疾病并维持肠道正常功能，是重要的健康促进因子，既能抑制外来有害菌的生长，又能促进肠道内有益菌群的生长繁殖，有利于维持肠道内微生态平衡。嗜酸乳杆菌活菌对肠粘膜细胞有强大的粘附作用，能有效定植于肠壁，阻止致病菌对肠粘膜细胞的侵袭。其代谢产物具有广谱抗菌活性，对引起腹泻的多种致病菌均有抑制作用，对婴幼儿和成人腹泻有良好疗效。

笔者通过大量试验筛选了一株具有较强耐酸、耐胆盐，并有较好粘附性的嗜酸乳杆菌Lacidophilus 1.1878，并通过试验证实，该菌株联合低聚异麦芽糖等益生元制成的肠溶胶囊，可以耐受胃酸的侵袭，直接抵达肠道，嗜酸乳杆菌在肠壁定植，抑制有害菌的增长，低聚异麦芽糖等益生元选择性促进双歧杆菌、乳杆菌等有益菌的增殖，长期服用可以有效调节肠道微生态环境，对肠道菌群和肠粘膜屏障具有良好的调节和保护作用，有效预防抗生素相关腹泻的发生。目前国内尚无相关文献及专利报道。

益生菌与中药联合应用是益生菌的发展方向，将多功能益生菌与多功能药食同源中草药复配组合，研制具有中药和益生菌双重作用的益生菌中药组合物，不仅具有天然、多营养、多功能等特性，而且健康、安全、适用人群广。经常食用，对增强机体免疫力，预防常见疾病的发生，提高身体健康有重要作用。对进一步开发和有效利用我国丰富的中药资源，研制具有我国自主知识产权的系列特色功能性食品、乳品、药品或微生态调节剂，具有重要而深远的理论和实践意义。

(三)发明内容

本发明的目的在于嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)在防治抗生素相关腹泻方面的应用，以及用于调节人体肠道菌群和保护肠粘膜方面的应用。

本发明的另一目的在于提供一种含益生菌和中草药的组合物，尤其是嗜酸乳杆菌和中草药的组合物。该组合物不含任何人工合成色素、激素、甜味素、鲜味素和防腐剂，不含任何违禁药物，安全无毒。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)菌株；所述菌株是由中国科学院微生物所菌种库提供，经试验验证是一株耐酸、耐胆盐，具有较高粘附性的益生菌。

一种含嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)和中草药的组合物，其特征在于采用嗜酸乳杆菌、中草药、低聚糖、辅料组成复合配方。

所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于按照重量百分比计，该组合物中嗜酸乳杆菌用量范围为1-20％，益生元用量范围为15-30％，中药用量范围为1-10％，其余为食品辅料。

所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于嗜酸乳杆菌为L acidophilus 1.1878。

所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于该组合物中益生元包括低聚异麦芽糖，低聚果糖，大豆低聚糖中的一种或多种。

所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于该组合物中中药包括山楂6份、茯苓9份、白术6份、甘草6份。

所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于该组合物中辅料包括脱脂奶粉、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠中的一种或多种。

所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，在防治抗生素相关腹泻、调节肠道菌群、保护肠粘膜方面的保健品或药物方面的应用。

(四)附图说明

图1各组小肠粘膜形态学改变(HE染色，×100)

A：正常对照组粘膜无充血、水肿，上皮完好，绒毛形态结构正常，排列规整；B：模型组粘膜糜烂，局部上皮细胞坏死、脱落，绒毛排列紊乱、稀疏；C：自然恢复组粘膜轻度充血、水肿，部分上皮细胞坏死、脱落，绒毛排列较规整；D：合生元低剂量组：粘膜水肿，部分上皮细胞坏死、脱落，绒毛排列较规整；E：合生元中剂量组：粘膜轻度水肿，仅少量上皮细胞坏死、脱落，绒毛排列较规整；F：合生元高剂量组：粘膜无水肿，上皮细胞修复完好，绒毛形态结构正常，排列规整，高度增加

(五)具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明：

实施例1：形态及染色

肉眼观察MRS平板上菌落形态；调取单一菌落涂片，革兰氏染色，镜下观察。结果：菌落无色，直径0.5-2.0mm；镜检见革兰氏染色阳性，无芽孢杆菌，呈短链排列。根据培养及形态染色可初步判定为乳酸杆菌。

实施例2：生化反应

a.配制无糖MRS培养基；

b.将乳糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖、海藻糖、鼠李糖、葡萄糖以0.22μm微孔滤膜过滤后，按2％的比例分别添加至上述无糖MRS培养基中，制成改良MRS培养基；

c.每10mL改良培养基中加入溴甲酚紫0.5ml，作为指示剂；

d.取L.acidophilus对数生长期培养液，接种于上述各培养基中，37℃厌氧培养36小时，观察发酵情况。

结果判断：指示剂由紫色变为黄色为阳性，绿色为弱阳性。

生化反应结果：

表1L.acidophilus生化反应结果

实施例3：嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)耐酸性能评价

将嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)的对数生长期培养液以2500r/min离心5min，弃上清，以无菌PBS缓冲液洗涤菌体3次，调菌浓度为10⁸CFU/mL，将菌株接种于人工胃液中，用HCl和0.1mol·L^-1的NaOH调pH为2.0、3.0、4.0，置37℃厌氧培养箱中孵育，分别于第60、90、180min，取1mL菌悬液，作活菌记数，pH为6.2的菌悬液作为0min正常对照，计算在各pH条件下菌株的存活率。0min的浓度为：菌悬液浓度×1/20(ml)。

结果：由表2可以看出，在pH为2.0时，嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)的活菌数随着时间的延长呈渐进性降低，处理1h后存活率达46.5％，3h存活率降低到36.1％；在pH为3.0时，嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)的活菌数基本保持不变，在pH为4.0时，菌株在3h内均保持较稳定的存活率，略有增殖。

表2嗜酸乳杆菌L acidophilus 1.1878在不同PH胃液中的存活细菌数量log cfu/ml

pH	0min	60min	90min	180min
					pH2.0	8.6±0.3	4.0±0.3(46.5)*	3.7±0.2(43.2)*	3.0±0.3(36.1)**
pH3.0	8.6±0.4	8.8±0.3(102)	8.8±0.4(102)	8.7±0.1(101)
					pH4.0	8.6±0.4	8.9±0.2(103)	8.8±0.3(102)	8.7±0.1(101)

与0min相比，*p＜0.05，**p＜0.01，括号中数字为存活率％。

实施例4：嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)耐胆盐性能评价

将嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)的对数生长期培养液以2500r/min离心5min，弃上清，以无菌PBS缓冲液洗涤菌体3次，调菌悬液浓度为10⁸CFU/mL；试验开始时，将菌株接种至含人工肠液的MRS培养基中，并调胆盐质量分数分别为0.2％、0.5％；接种比例为5％，设不加人工肠液的MRS培养基为空白对照组，各做3只复管，置37℃厌氧培养箱中孵育。分别于第60、90和240min取样，平板计数法计数活菌数。0min的浓度为：菌悬液浓度×1/20(ml)。

结果：由表3可见，嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)在含胆盐质量分数为0.2％、0.5％的MRS培养基中生长良好，与不加胆盐的对照组相比，4h内活菌数存活率都在90％以上，与对照组相比没有明显差异。

表3L acidophilus 1.1878在人工肠液中的存活细菌数量log cfu/ml

pH	0min	60min	90min	240min
					对照	8.2±0.1	8.2±0.2	8.3±0.2(101)	8.5±0.3(102)
0.2％	8.3±0.1	8.3±0.3	8.1±0.2(97)	7.8±0.1(93)
					0.5％	8.2±0.1	8.2±0.2	8.0±0.1(97.5)	7.5±0.1(91)

括号中数字为存活率％。

实施例5：含嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)的合生元和中药组合物防治抗生素相关腹泻的动物实验

按配方(重量比)：嗜酸乳杆菌(L acidophilus 1.1878)10％，低聚异麦芽糖20％，低聚果糖15％，中药用量范围为5％(山楂6份、茯苓9份、白术6份、甘草6份)，脱脂奶粉30％，乳糖15％，山梨醇5％复配成组合物。

上述组合物经第三军医大学实验动物中心试验证明具有防治抗生素相关腹泻，调节肠道菌群，保护肠粘膜作用，以下为试验结果：

1、动物分组和模型制作

雄性Sprague-Dawley大鼠50只，随机分为5组，每组10只。四组模型组先予盐酸林可霉素4ml/d(0.5g/2ml)灌胃3d，各组大鼠均表现为精神萎靡，体质量减轻，毛色无光，肛周微红，并出现不同程度的腹泻；继续予盐酸林可霉素2ml/d(0.5g/2ml)灌胃3d，各组大鼠持续腹泻。每组随机选取两只大鼠，采集粪便行肠道菌群分析后处死，行肠粘膜形态学观察，提示造模成功。之后，其中一组予0.9％NaCl溶液灌胃7d，作为自然恢复组；另三组分别予低、中、高剂量合生元4ml/d灌胃7d。正常对照组仅予0.9％NaCl溶液4ml/d灌胃7d。采集粪便行肠道菌群分析后处死各组剩余大鼠，行肠粘膜形态学观察和图像分析。

2、肠道菌群分析

逼迫法采集大鼠新鲜粪便0.5～1.0g，置于已称重试管内并再次称重以确定样品重量。将样品置于预先加有稀释液的带玻璃珠的无菌三角瓶中，充分震荡20min使其均质化，再以稀释液行10倍连续系列稀释；选择合适的稀释度取0.1ml分别接种于肠杆菌、肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌选择性培养基中，每一稀释度接种3个平板；接种后前两种培养基37℃需氧培养18～24h，后两种培养基37℃厌氧培养48～72h。培养后以菌落形态、革兰染色、生化反应等鉴定菌落并计数平板上的目的菌菌落个数，结果以lg cfu/g粪便表示。

3、肠粘膜形态学观察

于距回盲部以上5cm处取回肠粘膜标本2cm×2cm，轻微冲洗，4％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，光学显微镜观察并拍照。

4、统计学分析

应用SPSS 10.0统计软件，数据以x±s表示，组间比较采用Student t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1、肠道菌群分析

四组模型大鼠盐酸林可霉素灌胃6d后，除肠球菌外，肠道细菌数量均较正常对照组显著下降。合生元灌胃7d后，除低剂量组肠杆菌外，肠道菌群均恢复正常，与正常对照组相比无明显差异；自然恢复组肠杆菌恢复正常，乳杆菌和双歧杆菌仍显著低于正常对照组(见表4)。

表4各组粪便标本肠道菌群分析结果比较(x±s，lg cfu/g粪便)

与同时间点正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2、肠粘膜形态学

正常对照组小肠粘膜无充血、水肿，上皮完好，绒毛形态结构正常，排列规整(见图1A)。盐酸林可霉素灌胃6d后，模型大鼠小肠粘膜水肿、糜烂、萎缩、坏死、脱落，局部上皮细胞坏死、脱落，绒毛排列紊乱、稀疏(见图1B)；自然恢复组小肠粘膜水肿、萎缩程度略有减轻，部分上皮细胞坏死、脱落，绒毛排列较规整，可见炎性细胞浸润(见图1C)；合生元组尤其是中、高剂量组小肠粘膜病变明显减轻，粘膜厚度和绒毛高度明显增加，绒毛轻度水肿，排列规整、致密，未见上皮细胞脱落(见图1D、1E、1F)。

结论：

上述实验结果表明，该组合物具有防治抗生素相关腹泻作用，可以有效调节肠道菌群，保护肠粘膜完整性。

另外，根据相同实验表明，当该组合物中嗜酸乳杆菌用量范围为1-20％，益生元(包括低聚异麦芽糖、低聚果糖、大豆低聚糖中的一种或多种)用量范围为15-30％，中药(包括山楂、茯苓、白术、甘草中的一种或多种)用量范围为1-10％，其余为食品辅料(包括脱脂奶粉、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠中的一种或多种)的情况下，也都具有防治抗生素相关腹泻作用，可以有效调节肠道菌群，保护肠粘膜完整性，并可用于制作相应保健品或药品。

Claims

1.一种含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于采用嗜酸乳杆菌(L acidophilus1.1878)、益生元、中药、辅料组成的复合配方，按照重量百分比计，该组合物中嗜酸乳杆菌用量范围为1-20％，益生元用量范围为15-30％，中药用量范围为1-10％，其余为食品辅料；该组合物中中药为山楂6份、茯苓9份、白术6份、甘草6份。

2.根据权利要求1所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于该组合物中益生元包括低聚异麦芽糖，低聚果糖，大豆低聚糖中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的含有嗜酸乳杆菌和中药的组合物，其特征在于该组合物中辅料包括脱脂奶粉、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3之一的组合物，可应用在抑制抗生素相关腹泻、调节肠道菌群、保护肠粘膜方面的保健品或药物方面。